JPH0587810A

JPH0587810A - 担体無機粒子の保存方法

Info

Publication number: JPH0587810A
Application number: JP24962291A
Authority: JP
Inventors: Hisahiko Iwamoto; 久彦岩本; Noboru Ishibashi; 昇石橋; Takashi Maehara; 喬前原; Masato Okada; 昌人岡田
Original assignee: Tokuyama Corp
Current assignee: Tokuyama Corp
Priority date: 1991-09-27
Filing date: 1991-09-27
Publication date: 1993-04-06

Abstract

(57)【要約】【構成】免疫学的凝集反応用担体無機粒子を低級アル
コールの７０〜１００％水溶液中で保存することを特徴
とする担体無機粒子の保存方法。【効果】抗原叉は抗体を感作するための担体無機粒子
を特定の溶液中で保存することにより、長期にわたって
安定的に無機粒子を保存できる。この結果、該粒子を用
いて長期間、感度を低下させることなく、各種診断に用
いる凝集反応試薬を作製できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫学的凝集反応試薬
の担体として有用な無機粒子の保存方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】臨床検査の分野では、近年種々の疾患を
血清学的に診断することが重要視されている。そして、
この診断のためには、抗原あるいは抗体を正確、迅速且
つ簡便に定量することが極めて重要な課題となってい
る。そこで、抗原あるいは抗体を不溶性担体に感作して
抗体あるいは抗原を検出する凝集反応が、操作が簡単で
あることに加え、反応が肉眼的に観察し易いことから臨
床検査や研究分野で広く用いられている。

【０００３】かかる凝集反応は原理的には一種類である
が、不溶性担体の種類によって分類される。即ち、不溶
性担体としては、ラテックス、カオリン、炭末、有機無
機複合粒子などの非生物学的粒子、動物赤血球、細菌菌
体などの生物学的粒子が用いられる。

【０００４】生物学的粒子は、同種類の生物を用いても
個体間差がみられ、又、例えば、動物赤血球に於いて
は、赤血球表面に固有の抗原を有しており、非特異的反
応を起こして目的とする凝集反応に誤りを与える可能性
が大きい。

【０００５】したがって、最近では化学的に安定で、そ
れ自身抗原活性を有しない等の利点のある非生物学的粒
子を使用する傾向にあるが、生物学的粒子を用いた場合
と同程度の感度、凝集像が得られにくいという欠点があ
る。

【０００６】非生物学的粒子のうち、特に、免疫学的凝
集反応用担体無機粒子（以下、無機粒子とも言う。）
が、例えば特開昭６２―１１５３６６号公報に示されて
いるように、人工担体であるため、該粒子表面を目的に
応じて化学的処理でき、また、極めて非特異的反応が起
こりにくいので好適に用いられている。

【０００７】しかし、従来、このような無機粒子を、例
えばリン酸、酢酸、叉はグリシン等の緩衝液中で長期間
保存した場合、生物学的粒子を用いた場合と同程度の感
度、凝集像を安定的に得ることが困難であった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、不溶性
担体として無機粒子を用いた場合、生物学的粒子を用い
た場合と同程度の感度、凝集像を長期に渡り、安定的に
得ることを目的として鋭意研究を重ねた。

【０００９】

【課題を解決するための手段】その結果、抗原あるいは
抗体を無機粒子へ感作し、診断試薬とするにあたり、該
無機粒子を特定の低級アルコール水溶液中で保存するこ
とで、生物学的粒子を用いた場合と同程度の感度、凝集
像を長期に渡り安定的に得ることを見い出し、本発明を
完成するに至った。

【００１０】即ち、本発明は、免疫学的凝集反応用担体
無機粒子を低級アルコールの７０〜１００容量％水溶液
中で保存すること特徴とする担体無機粒子の保存方法で
ある。

【００１１】本発明において用いられる低級アルコール
は、炭素数の少ないアルコールであればよく、具体的に
は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロ
パノール、ブタノールなどが例示され、１種類、又は２
種類以上を混合して用いられる。これらのうち、特に、
メタノール、エタノールが好適に用いられる。

【００１２】該低級アルコールの濃度は７０〜１００容
量％であることが必要である。７０容量％以下だと該無
機粒子を用いて試薬化した場合、長期に渡り、安定的に
感度、凝集像を得ることが出来ず、低級アルコール水溶
液中に保存させた効果がない。

【００１３】低級アルコールの希釈には、水が用いられ
るが、該水としてはイオン交換水、蒸留水、超純水が好
ましく、特に蒸留水、超純水が好適に用いられる。

【００１４】免疫学的凝集反応無機粒子としては、シリ
カ、アルミナ、チタニア、ジルコニア或はこれらを主な
構成成分とする複合酸化物等が一般的である。これらの
金属酸化物、半金属酸化物は公知な化合物であり、その
製法も特に制限されるものではない。代表的なこれらの
化合物の製法は、例えば、ジャーナルオブコロイド
アンドサイエンス２６６２〜６９（１９６８）、
特開昭５２―１３８０９４号公報等に記載された手段又
はこの手段に準じて製造すればよい。尚、これら無機粒
子の表面をアルキル基、カルボニル基、またはフェニル
基を含む有機物で処理して、該有機物が物理的、または
化学的に結合した有機無機複合粒子も本発明の無機粒子
の範疇に入る。

【００１５】上記無機粒子のアルコール水溶液中での保
存方法は何等制限されず、通常、液中に無機粒子を攪拌
しながら投入した後静置する方法が採用される。この場
合、無機粒子は凝集することなく個々に分散しているも
のの、比重が大きいものは速やかに沈澱し、比重が小さ
いものは比較的長期間沈澱することなく浮遊している。

【００１６】無機粒子を保存する場合、該水溶液が液体
状態を保つ温度であればよいが、通常、室温乃至それ以
下の温度で保存される。

【００１７】また、無機粒子を保存する場合、該無機粒
子を作製直後にアルコール水溶液に入れることが好まし
い。該無機粒子を水溶液に入れるまでの時間が長くなる
ほど免疫学的凝集反応に供される担体としての性能は劣
化する。

【００１８】かかる無機粒子に感作する物質としては免
疫学的凝集反応を起こすものであればよく、該物質とし
て抗原及び抗体が挙げられる。抗原は、抗体を産生させ
て、体液性免疫や細胞性免疫を誘発する物質であれば特
に制限されず、例えば蛋白、糖蛋白、脂質蛋白、脂質、
核酸等が挙げられる。抗体は、抗原と特異的に結合する
活性を持つものであれば特に制限されずＩｇＧ，Ｉｇ
Ｍ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ等が挙げられる。

【００１９】抗原又は抗体を無機粒子上へ感作して得る
免疫学的凝集反応粒子の製造方法については、一般に、
リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液等の緩衝
液中に前記無機粒子と、担体１ｇ当たり０．０１〜５０
ｍｇの抗原あるいは抗体を混合して感作する。具体的に
は、通常、感作は室温で約１時間放置すればよいが、４
〜５６℃の広い温度範囲で感作が可能である。

【００２０】上記方法で製造された免疫学的凝集反応粒
子（以下、凝集反応粒子とも言う）を蛋白質、塩等とと
もに水媒体中に分散し、これら全成分を含有した分散液
を、免疫学的凝集反応試薬（以下、凝集反応試薬とも言
う）と言い、診断薬に供される。

【００２１】凝集反応試薬中の凝集反応粒子の濃度は、
通常０．３〜１重量％である。下限値より小さいと、凝
集像が不鮮明となり判定できない。上限値より大きいと
感度が悪くなる。

【００２２】凝集反応試薬中の蛋白質は、凝集反応を起
こすために必要な成分であり、抗原抗体反応を阻害しな
いものであれば特に制限されない。該蛋白質として、例
えば、牛血アルブミン、ヤギ血清、ウサギ血清、ゼラチ
ン、スキムミルク等が挙げられる。凝集反応試薬中の
塩には、一般的に、無機塩あるいはアミノ酸塩が用いら
れ、該無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム、アジ化ナトリウム等が挙げられる。また、該アミノ
酸塩としては、アスパラギン酸ナトリウム、グルタミン
酸ナトリウム等が挙げられる。

【００２３】該凝集反応試薬に使用する水は、超純水あ
るいは蒸留水を使用することが好ましく、更には、例え
ばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、生理
食塩水などのｐＨ４〜９の緩衝液を用いるほうが、抗原
抗体反応が速やかに進行するのでより好ましい。

【００２４】凝集反応粒子を、より長期にわたって保存
するためには乾燥状態で保存する。乾燥方法としては、
何ら制限されないが凍結乾燥方法が好適である。

【００２５】かかる乾燥した凝集反応粒子は、臨床検査
に用いる前に、前記分散液を用いて分散状態に復元され
る。

【００２６】

【作用及び効果】無機粒子に抗原又は抗体を感作するに
当たり、該無機粒子を低級アルコールの７０〜１００容
量％水溶液からなる保存液中に該無機粒子を分散させて
保存することで、長期に渡り安定的に診断試薬を作製で
きる。

【００２７】長期に渡り安定的に診断試薬を作製できる
理由は明確ではないが、無機粒子表面の疎水度が、高濃
度の低級アルコールの存在により変化しないためと考え
られる。

【００２８】

【実施例】本発明を以下に示す実施例により具体的に説
明するが、本発明は、その実施例により何ら限定される
ものではない。

【００２９】実施例１凝集反応試薬として、免疫学的梅毒診断薬を作成する為
に、まず梅毒の病原菌であるトレポネーマ・パリダム１
×１０⁹個を１ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶液に
分散させた。次いで、このトレポネーマ・パリダムが分
散した塩化ナトリウム水溶液を超音波破砕器により２０
０Ｗで３０分間破砕した。

【００３０】次いで、３０℃で１年間７０容量％のメタ
ノール水溶液にて保存していた、表面をモノフェニルト
リエトキシシランおよびエチレンジアミン三酢酸ソーダ
で処理したシリカ粒子である有機無機複合粒子（徳山曹
達株式会社製商品名：イムノティクルスＨＤＰ）を０．
１Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍのリン酸緩衝液
（ｐＨ７．２）で２回洗浄した後、該緩衝液にて２．５
重量％になるようにこの粒子を分散させた。

【００３１】前記破砕されたトレポネーマ・パリダムを
含んだ塩化ナトリウム水溶液に、上記有機無機複合粒子
を含んだ緩衝液を等量加えて１時間放置し、次いで、
０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で２回洗浄し、
凍結乾燥して、トレポネーマ・パリダム由来の抗原が感
作された凝集反応粒子を調製した。その後、２ヶ月間、
４℃で放置した。０．０２Ｍリン酸緩衝液に、５重量％
になるように牛血アルブミンを加えて粒子溶解液を調製
し、この粒子溶解液に、前記期間保存した凝集反応粒子
を凝集反応試薬基準で０．５重量％濃度となるように溶
解して凝集反応試薬を調合した。

【００３２】次に、この免疫学的梅毒診断薬の性能を以
下に示すように測定した。

【００３３】被検液として梅毒患者血清を用い、該血清
の１０倍希釈液を原液として、倍数希釈法に従って上記
リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて希釈を行い、各希
釈液をマイクロタイタープレートのウェル中に２５μｌ
ずつ加えた。次いで、前記調合した凝集反応試薬を該ウ
ェル中に２５μｌずつ加えて行き、１分間の攪拌の後、
室温で放置した。３０分後、粒子の凝集状態を観察し、
被検液で粒子リングが明らかに大きく、且つリング内に
凝集粒子が一様に広がっているのが認められるウェルに
於ける希釈液の最高希釈倍数を求め感度を評価した。

【００３４】同様に、上記の方法に従って、被検液とし
て健常者血清を希釈したものを用い、感度を評価した。
表１にこれらの結果を示した。

【００３５】

【表１】

【００３６】比較例１作製したばかりの有機無機複合粒子を用いたこと以外は
すべて実施例１と同様に行ったところ表２に示す抗体価
を得た。該有機無機複合粒子を１年間５０容量％のメタ
ノール水溶液で保存した後、実施例１と同様に行って抗
体価を測定した。感度の評価のための梅毒患者血清及び
健常者血清は、実施例１で用いたものを使用した。表３
にこれらの結果を示す。別途前記有機無機複合粒子を１
年間０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中で保存
し、同様に行って得た坑体価を表４に示す。いずれも、
長期間保存していた場合粒子そのものが劣化し、これを
担体として用いて調整した凝集反応試薬は感度が大幅に
低下する。

【００３７】

【表２】

【００３８】

【表３】

【００３９】

【表４】

【００４０】実施例２オキシ塩化ジルコニウムをエタノール中で水酸化ナトリ
ウム水溶液を用いて加水分解してジルコニア粒子を作製
し、次いで遠心分離、エタノール洗浄を行った後、ジル
コニア粒子を１００容量％エタノール中に投入し１０℃
で保存した。

【００４１】凝集反応試薬として、免疫学的成人Ｔ細胞
白血病診断薬を作成する為に、成人Ｔ細胞白血病ウイル
ス由来の抗原を０．１重量％のドデシル硫酸ナトリウム
を含む０．０７５Ｍの塩化ナトリウム水溶液１ｍｌ当り
１００μｇ溶解した。次いで、前記方法で３ヶ月間保存
していたジルコニア粒子を０．０７５Ｍの塩化ナトリウ
ムを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で２回
洗浄した後、２．５重量％になるように同緩衝液に分散
させた。

【００４２】前記抗原溶液にこの無機粒子を分散させた
液を等量加えて１時間放置し、次いで０．０２Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７．２）で２回洗浄して成人Ｔ細胞白血病
ウイルス由来の抗原が感作された凝集反応粒子を調製し
た。０．０２Ｍリン酸緩衝液に、１重量％になるように
牛血アルブミンを加えて粒子溶解液を調製した。この粒
子溶解液に、上記凝集反応粒子を凝集反応試薬基準で
０．５重量％濃度となるように溶解して凝集反応試薬を
調合した。

【００４３】次に、この免疫学的成人Ｔ細胞白血病診断
薬の性能を以下に示すように測定した。

【００４４】被検液として成人Ｔ細胞白血病患者血清を
用い、該血清を原液として、倍数希釈法に従って上記リ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて希釈を行い、各希釈
液をマイクロタイタープレートのウェル中に２５μｌず
つ加えた。次いで、前記調合した凝集反応試薬を該ウェ
ル中に２５μｌずつ加えて行き、１分間の攪拌の後室温
で放置した。３０分後、粒子の凝集状態を観察し、被検
液で粒子リングが明らかに大きく、且つリング内に凝集
粒子が一様に広がっているのが認められるウェルに於け
る希釈液の最高希釈倍数を求め感度を評価した。

【００４５】同様に、上記の方法に従って、被検液とし
て健常者血清を希釈したものを用い、感度を評価した。
表５にこれらの結果を示した。

【００４６】

【表５】

【００４７】比較例２作製したばかりのジルコニア粒子を用いたこと以外はす
べて実施例２と同様に行ったところ、表６に示す抗体価
を得た。該ジルコニア粒子を３ヶ月間２５容量％のエタ
ノール水溶液で保存した後、実施例２と同様にして抗体
価を測定した。感度の評価のための成人Ｔ細胞白血病患
者血清及び健常者血清も、実施例２で用いたものを使用
した。表７にこれらの結果を示す。

【００４８】

【表６】

【００４９】

【表７】

【００５０】実施例３３カ月間９０容量％のブタノール水溶液で保存したジル
コニア粒子を用いた以外は実施例２と同様にして抗体価
を測定した。表８に結果を示す。

【００５１】

【表８】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者岡田昌人山口県徳山市御影町１番１号徳山曹達株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】免疫学的凝集反応用担体無機粒子を低級
アルコールの７０〜１００容量％水溶液中で保存するこ
とを特徴とする担体無機粒子の保存方法。