JPH0445784B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ コレステロールと、ジアシルホスフアチジル
コリンおよびハロゲン化アルキルトリメチルアン
モニウムからなる群より選択された成分とのエタ
ノール溶液を、生物液体に加えて巨大分子凝集錯
塩の懸濁液をつくり、 前記巨大分子凝集錯塩溶液を、水性緩衝媒質中
の燐脂質に対する抗体分子に加えて、凝集反応を
起こさせ、 さらに生物液体を燐脂質の存在を決定できる量
だけ加えることを含む生物液体中の燐脂質の存在
の決定方法。

２ 前記燐脂質は、ホスフアチジルコリン、ホス
フアチジルイノシツト、ホスフアチジルセリン、
ホスフアチジルエタノールアミンおよびホスフア
チジルグリセロールからなる群より選択された成
分である請求の範囲第１項記載の生物液体中の燐
脂質の存在の決定方法。

３ 前記生物液体は羊水を含むことを特徴とする
請求の範囲第１項記載の生物液体中の燐脂質の存
在の決定方法。

４ 前記燐脂質は、ホスフアチジルグリセロール
を含むことを特徴とする請求の範囲第３項記載の
生物液体中の燐脂質の存在の決定方法。

５ 前記燐脂質を含む巨大分子凝集物が抗体分子
に結合するのに十分なハロゲン化アルキルトリメ
チルアンモニウムおよびコレステロールを生物液
体に加えることを特徴とする請求の範囲第１項記
載の生物液体中の燐脂質の存在の決定方法。

６ 前記ハロゲン化アルキルトリメチルアンモニ
ウムは臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム
であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の
生物液体中の燐脂質の存在の決定方法。

７ 前記錯塩溶液はさらに塩化ナトリウムを含む
ことを特徴とする請求の範囲第１項記載の生物液
体中の燐脂質の存在の決定方法。

８ 前記塩化ナトリウムの含有量は約0.05−2.0
重量％であることを特徴とする請求の範囲第７項
記載の生物液体中の燐脂質の存在の決定方法。

９ 前記ホスフアチジルコリンは鶏の卵黄レシチ
ンを含むことを特徴とする請求の範囲第１項記載
の生物液体中の燐脂質の存在の決定方法。

１０ コレステロールと、ジアシルホスフアチジ
ルコリンおよびハロゲン化アルキルトリメチルア
ンモニウムからなる群より選択された成分とのエ
タノール溶液を生物液体に加えて巨大分子凝集錯
塩の懸濁液をつくり、 前記巨大分子凝集錯塩溶液を、水性緩衝媒質中
の燐脂質に対する抗体分子に加えて、凝集反応を
起こさせ、 さらに緩衝剤と、ジアシルホスフアチジルコリ
ンおよびハロゲン化アルキルトリメチルアンモニ
ウムからなる群より選択された成分とを含む緩衝
試薬を燐脂質の存在を決定できる量だけ加えるこ
とを含む生物液体中の燐脂質の存在の決定方法。

１１ 前記燐脂質は、ホスフアチジルコリン、ホ
スフアチジルイノシツト、ホスフアチジルセリ
ン、ホスフアチジルエタノールアミンおよびホス
フアチジルグリセロールからなる群より選択され
た成分である請求の範囲第１０項記載の生物液体
中の燐脂質の存在の決定方法。

１２ 前記生物液体は羊水を含むことを特徴とす
る請求の範囲第１０項記載の生物液体中の燐脂質
の存在の決定方法。

１３ 前記燐脂質は、ホスフアチジルグリセロー
ルを含むことを特徴とする請求の範囲第１２項記
載の生物液体中の燐脂質の存在の決定方法。

１４ 前記燐脂質を含む巨大分子凝集物が抗体分
子に結合するのに十分なハロゲン化アルキルトリ
メチルアンモニウムおよびコレステロールを生物
液体に加えることを特徴とする請求の範囲第１０
項記載の生物液体中の燐脂質の存在の決定方法。

１５ 前記緩衝剤は燐酸ナトリウムを含むことを
特徴とする請求の範囲第１０項記載の生物液体中
の燐脂質の存在の決定方法。

１６ 前記緩衝試薬のPHは約５−７であることを
特徴とする請求の範囲第１０項記載の生物液体中
の燐脂質の存在の決定方法。

１７ 前記生物液体を含む溶液中の緩衝試薬の濃
度は約0.001−0.5モルであることを特徴とする請
求の範囲第１０項記載の生物液体中の燐脂質の存
在の決定方法。

１８ 前記ジアシルホスフアチジルコリンまたは
ハロゲン化アルキルトリメチルアンモニウムは緩
衝試薬中に１−200mg／１の濃度で存在すること
を特徴とする請求の範囲第１０項記載の生物液体
中の燐脂質の存在の決定方法。

１９ 前記ハロゲン化アルキルトリメチルアンモ
ニウムは臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウ
ムであることを特徴とする請求の範囲第１０項記
載の生物液体中の燐脂質の存在の決定方法。

２０ 前記錯塩溶液はさらに塩化ナトリウムを含
むことを特徴とする請求の範囲第１０項記載の生
物液体中の燐脂質の存在の決定方法。

２１ 前記塩化ナトリウムの含有量は約0.05−
2.0重量％であることを特徴とする請求の範囲第
２０項記載の生物液体中の燐脂質の存在の決定方
法。

２２ 前記ホスフアチジルコリンは鶏の卵黄レシ
チンを含むことを特徴とする請求の範囲第１０項
記載の生物液体中の燐脂質の存在の決定方法。

２３ コレステロールと、ジアシルホスフアチジ
ルコリンおよびハロゲン化アルキルトリメチルア
ンモニウムからなる群より選択された成分とのエ
タノール溶液を、羊水試料に加えて、コレステロ
ールと、ホスフアチジルグリセロールと、ジアシ
ルホスフアチジルコリンおよびハロゲン化アルキ
ルトリメチルアンモニウムからなる群より選択さ
れた成分との巨大分子凝集錯塩の懸濁液をつく
り、 さらに羊水試料をホスフアチジルグリセロール
の存在を決定できる量だけ加え 前記ホスフアチジルグリセロール巨大分子凝集
錯塩を含む懸濁液を、水性緩衝媒質中のホスフア
チジルグリセロールに対する抗体分子に加えて、
凝集反応を起こさせることを含む羊水試料中のホ
スフアチジルグリセロールの存在の決定方法。

２４ 前記錯塩溶液はさらに塩化ナトリウムを含
むことを特徴とする請求の範囲第２３項記載の羊
水試料中のホスフアチジルグリセロールの存在の
決定方法。

２５ 前記塩化ナトリウムの含有量は約0.05−
2.0重量％であることを特徴とする請求の範囲第
２４項記載の羊水試料中のホスフアチジルグリセ
ロールの存在の決定方法。

２６ 前記ホスフアチジルコリンは鶏の卵黄レシ
チンを含むことを特徴とする請求の範囲第２３項
記載の羊水試料中のホスフアチジルグリセロール
の存在の決定方法。

２７ 前記ハロゲン化アルキルトリメチルアンモ
ニウムは臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウ
ムであることを特徴とする請求の範囲第２３項記
載の羊水試料中のホスフアチジルグリセロールの
存在の決定方法。

２８ コレステロールと、ジアシルホスフアチジ
ルコリンおよびハロゲン化アルキルトリメチルア
ンモニウムからなる群より選択された成分とのエ
タノール溶液を、羊水試料に加えて、コレステロ
ールと、ホスフアチジルグリセロールと、ジアシ
ルホスフアチジルコリンおよびハロゲン化アルキ
ルトリメチルアンモニウムからなる群より選択さ
れた成分との巨大分子凝集錯塩の懸濁液をつく
り、 さらに緩衝剤と、ジアシルホスフアチジルコリ
ンまたはハロゲン化アルキルトリメチルアンモニ
ウムを含む緩衝試薬をホスフアチジルグリセロー
ルの存在を決定できる量だけ加え、 前記ホスフアチジルグリセロール巨大分子凝集
錯塩を含む懸濁液を、水性緩衝媒質中のホスフア
チジルグリセロールに対する既知量の抗体分子に
加えることにより、凝集反応を起こさせることを
含む羊水試料中のホスフアチジルグリセロールの
存在の決定方法。

２９ 前記錯塩溶液はさらに塩化ナトリウムを含
むことを特徴とする請求の範囲第２８項記載の羊
水試料中のホスフアチジルグリセロールの存在の
決定方法。

３０ 前記塩化ナトリウムの含有量は約0.05−
2.0重量％であることを特徴とする請求の範囲第
２９項記載の羊水試料中のホスフアチジルグリセ
ロールの存在の決定方法。

３１ 前記ホスフアチジルコリンは鶏の卵黄レシ
チンを含むことを特徴とする請求の範囲第２８項
記載の羊水試料中のホスフアチジルグリセロール
の存在の決定方法。

３２ 前記ハロゲン化アルキルトリメチルアンモ
ニウムは臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウ
ムであることを特徴とする請求の範囲第２８項記
載の羊水試料中のホスフアチジルグリセロールの
存在の決定方法。

関連出願 本出願は「生物液体の分析」という表題の1982
年２月２日の出願番号第344930号の米国出願の部
分継続出願である。

背景技術 一般に生物液体中の燐脂質（ホスホリピド）の
レベルを知ることはきわめて有用であることがわ
かつている。たとえば、燐脂質、特にレシチンは
種々の生物膜中にある。さらに、以下にもつと詳
しく説明するように、ホスフアチジルグリセロー
ル燐脂質は羊水中にあり、胎児の肺の成熟度の指
標として用いることができる。レシチン（ホスフ
アチジルコリン）およびホスフアチジルグリセロ
ール以外のここに述べる方法で検出される燐脂質
はたとえばホスフアチジルイノシツト、ホスフア
チジルセリン、およびホスフアチジルエタノール
アミンである。本発明は最も好ましい実施例によ
つて、すなわち羊水中のホスフアチジルグリセロ
ールのレベルの決定について説明するが、一般に
本発明は生物液体中の上記の燐脂質の任意のもの
のレベルを決定するのに用いることができる。

肺系統の適正な機能は胎児が子宮外の環境で存
在するのに本質的なことである。呼吸困難で生ま
れた小児は呼吸困難症候群（RDS）を持つとい
われる。呼吸困難症候群におけるおもな病因学的
欠陥は、成熟した肺の機能に本質的な表面活性物
質、すなわちリピド（脂質）、蛋白質、および炭
水化物の錯混合物の不足である。成熟した肺にお
いては燐脂質は90−95％のリピドを含む。表面活
性物質中にある主要な表面活性燐脂質はジパルミ
トイルレシチンである。第２の主要な表面活性燐
脂質はホスフアチジルグリセロールである。

胎児の肺の成熟度を出生前に検査する最も直接
的な手段はホスフアチジルコリン（（レシチン）
やホスフアチジルグリセロールのような肺の表面
活性燐脂質の生成を測定することである。

妊娠が進行しても表面活性物質中のスフインゴ
ミエリンのレベルは比較的一定のままであるが、
レシチンのレベルは増大しつづけ、妊娠35週の後
きわめて際立つた増大を示すことがわかつてい
る。成熟した肺においては、レシチンは全表面活
性リピドの少なくとも50％を含む。スフインゴミ
エリンの一定レベルによつて表面活性レシチンと
の比較用の内部基準が得られ、したがつて米国産
婦人科学会誌、1971年、109巻、440ページに記載
のグルツク他（（Gluck et al.）が開発したレシ
チン対スフインンゴミエリン比（Ｌ／Ｓ）試薬の
基礎が得られる。

米国産科学会誌、1977年、125巻、613ページに
報告されたハルマン他（Hallman et al.）、臨床
化学、1979年、25巻、682ページに報告されたツ
アイ他（Tsai et al.）、臨床化学、1978年、24
巻、1144ページに報告されたゴテリ他（Gotelli
et al.）、および米国産婦人科学会誌、1978年、
131巻、719ページに報告されたカニンガム他
（Cunningham et al.）の最近の研究によるとホ
スフアチジルグリセロールの測定は胎児の肺の成
熟度の決定に価値があるようである。上記に言及
したように、ホスフアチジルグリセロールは妊娠
35−38週の間に現われ、Ｌ／Ｓ比と良好な線形相
関を持つ。もつと適切には、臨床化学、1977年、
23巻、1107ページに報告されたように、グルツク
（Gluck）は羊水中にホスフアチジルグリセロー
ルが現わた後にだけ糖尿病の母親は分娩が安全で
あると指摘している。羊水中に血液または胎便が
存在するとレシチン対スフインゴミエリン（Ｌ／
Ｓ）比に影響が及ぶがホスフアチジルグリセロー
ルのレベルには影響が及ばないことも発見され
た。Ｌ／Ｓ比検査はたいていの妊娠における胎児
の肺の成熟度の最も信頼性のある予後指数として
広く受け入れられたが、この結果は、糖尿病、高
血圧、重度貧血、および内部腎臓疾患のような或
る種の母親の合併症はＬ／Ｓ比の読みに悪影響を
与えるので、注意深く解釈しなければならない。

したがつて、高精度で正確な結果を得るのに比
較的迅速かつ特殊で、技量、経験および込み入つ
た機器が最少でよい胎児の肺の成熟度の他の検査
法を見付け出すことが望ましかつた。生物液体中
に燐脂質が存在することを決める本発明に導いた
のはこれらの他の方法の開発である。従来技術は
羊水の表面活性物質を評価する技術として生物化
学的定量と生物物理学的測定とを用いた。しかし
すべての従来の方法は、または単に一般的な方法
を得るのには全体として時間がかかり退屈で、か
なりの高精度をるのに熟練と専門的知識とを必要
とし、面倒な化学物質と高度に込み入つた高価な
機器とを必要とする。本発明はこれらの欠点のい
ずれをも持たない方法を提供する。

発明の開示 本発明は生物液体中の燐脂質の存在を決定する
免疫学的評価法を含む。たとえば鶏の卵黄のレシ
チンのようなジアシルホスフアチジルコリンまた
はたとえば臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニ
ウムのようなハロゲン化アルキルトリメチルアン
モニウムおよびコレステロールの一定の混合物を
生物液体に添加することにより生物液体中に存在
する燐脂質はレシチンまたはハロゲン化アルキル
トリメチルアンモニウム、コレステロール、およ
び他の生物液体成分の巨大分子凝集錯塩に合体さ
れる。測定中の燐脂質に特有の受容体分子を用い
ることにより特定の燐脂質のレベルを評価する感
度がよく迅速な技法が得られる。巨大分子凝集錯
塩の形の燐脂質、ジアシルホスフアチジルコリン
またはハロゲン化アルキルトリメチルアンモニウ
ム、コレステロール、および生物液体成分と緩衝
水性媒質中の燐脂質の特別の受容体との両方を供
給することにより凝集反応が起こる。この技法は
羊水中のホスフアチジルグリセロールの存在を決
定するのに特に有利である。

方法の簡単な説明 本方法を実施するには既知量のコレステロール
のエタノール溶液と鶏の卵黄のレシチンのような
ジアシルホスフアチジルコリンとまたは既知量の
コレステロールのエタノール溶液と臭化ヘキサデ
シルトリメチルアンモニウムのようなハロゲン化
アルキルトリメチルアンモニウムとを既知量の生
物液体に加える。羊水を生物液体として用いると
きは先ず遠心分離し、エタノール溶液を遠心分離
物の一部に加える。混合の後さらに既知量の遠心
分離された羊水または既知量のジアシルホスフア
チジルコリン（レシチン）またはハロゲン化アル
キルトリメチルアンモニウムを含む緩衝試薬を加
え、羊水試料中にホスフアチジルグリセロールが
存在するとジアシルホスフアチジルコリンまたは
ハロゲン化アルキルトリメチルアンモニウム、コ
レステロール、ホスフアチジルグリセロール、お
よび他の羊水成分の巨大分子凝集物が形成され
る。既知量のホスフアチジルグリセロールの巨大
分子凝集錯塩溶液をの緩衝水性媒質中のホスフア
チジルグリセロールに対する抗体分子に加える凝
集反応が起こつてホスフアチジルグリセロールの
存在を示す。

上記の方法は比較的少量の生物液体を用いて実
施することができる。たとえば、羊水中のホスフ
アチジルグリセロールのレベルは外から腹部を通
しての羊水穿刺によつて得られた3.0ml未満の羊
水から決定することができる。実際、上記の方法
は通常１ml以下の生物液体を用いて行なうことが
できる。

コレステロールとジアシルホスフアチジルコリ
ンとのエタノール溶液は約0.5−12mg／ml、もつ
と普通には５−10mg／ml、最も好ましくは８−９
mg／mlの範囲のコレステロールと0.05−10mg／
ml、もつと普通には0.5−３mg／ml、最も好まし
くは約1.5−2.0mg／mlのジアシルホスフアチジル
コリンとを含むであろう。

コレステロールとハロゲン化アルキルトリメチ
ルアンモニウムとのエタノール溶液は約0.5−12
mg／ml、もつと普通には５−10mg／ml、最も好ま
しくは８−９mg／mlのコレステロールと0.1−５
mg／ml、もつと普通には0.5−３mg／ml、最も好
ましくは約１−２mg／mlのハロゲン化アルキルト
リメチルアンモニウムとを含むであろう。

緩衝試薬はPH約４−８の範囲、もつと普通には
５−７、最も好ましくは６で緩衝された燐酸塩を
含む。緩衝剤の濃度は一般に約0.001−0.5モルの
範囲、もつと普通には約0.005−0.1モルの範囲、
最も好ましくは約0.0175−0.05モルであろう。緩
衝試薬はまた約１−200mg／の範囲、もつと普
通には10−100mg／の範囲、最も好ましくは40
−80mg／のジアシルホスフアチジルコリンまた
はハロゲン化アルキルトリメチルアンモニウムを
含むであろう。

ホスフアチジルグリセロールに対する抗体はPH
約５−10、もつと普通には約5.5−8.0、最も好ま
しくは約6.0−7.0の範囲に緩衝されるであろう。
トリス（Tris）、燐酸塩、その他のような種々の
緩衝剤を用いることができるが、好ましい緩衝剤
は燐酸塩である。緩衝剤の濃度は一般に約0.001
−0.5モルの範囲、もつと普通には約0.005−0.1モ
ルの範囲、好ましくは約0.0175−0.05モルであろ
う。

個々の成分または試薬を保存または保護するの
に、または効力検定の性能特性を助けるのに用い
る他の添加物も効力検定媒質中にあつてもよい。
特に、塩化ナトリウムを約0.01−５重量パーセン
ト、もつと普通には約0.05−2.0重量パーセント、
好ましくは約0.5−1.0重量パーセントの量で用い
ることができる。

生物液体に添加されるジアシルホスフアチジル
コリンまたはハロゲン化アルキルトリメチルアン
モニウムおよびコレステロールは、燐脂質が生物
液体試料中にあると燐脂質が巨大分子凝集物に分
布して燐脂質に対する抗体分子が燐脂質に効果的
に結合するのに十分な量加えなければならない。
用いる燐脂質に対する抗体の量はいろいろで、所
望の凝集反応を起こすように選ぶ。

実施例 Ａ ホスフアチジルグリセロール免疫原 複合物の調製 クロロホルム中の約45mgのＬ−ホスフアチジル
−DL−グリセロール（0.058ミリモル）とメタノ
ール中の約270mgの鶏の卵黄レシチン（0.34ミリ
モル）とを窒素ガス流で乾燥させ、約10mlの無水
エタノールに溶解し、500mlのアーレンマイヤフ
ラスコに入れた。Ｌ−ホスフアチジル−DL−グ
リセロール−レシチン溶液に約135mlの無水エタ
ノールに溶解した1.35ｇのコレステロールを加え
た。

上記の混合物にPH6.0、0.0175モルの燐酸ナト
リウム緩衝剤を145ml加えた。これによつて白い
コロイドの乳濁液が得られ、これを室温で15分間
撹拌し、それから約13000xgにおいて４℃で10分
間遠心それから約13000xgにおいて４℃で10分間
遠心分離した。得られたペレツトをPH6.0、0175
モルの燐酸ナトリウム緩衝剤中の２％のメチル化
した牛の血清アルブミン溶液中に再懸濁させた。
得られたＬ−ホスフアチジル−DL−グリセロー
ル：レシチン：コレステロール：ｍ−BSA錯塩
を40℃で１晩放置した。

４mlのＬ−ホスフアチジル−DL−グリセロー
ル−免疫原溶液を凍結乾燥し、得られた粉末を−
20℃で保存した。

Ｂ 抗ホスフアチジルグリセロール抗体 上記のようにして調製した凍結乾燥ホスフアチ
ジルグリセロール−免疫原複合物を撹拌し完全に
混合しながら４mlの無菌の蒸留水に懸濁させ、免
疫原蛋白質の最終的濃度を20mg／mlとした。

約0.5mlの上記ホスフアチジルグリセロール−
免疫原錯塩を３週間の間１匹の兎につき２日ごと
に静脈注射した。全投与量は１mlにつき20mgの免
疫原蛋白質量で約4.5mlであつた。最後の注射の
後、５−７日を経過して兎を心臓穿刺によつて採
血した。所望量の血液（約20−30ml）が集つた
後、血液を凝固させ、凝塊を除去した。残つた溶
液を2000RPMで10分間遠心分離した。浮遊して
いる赤血球のない血清を集めて抗ホスフアチジル
グリセロール抗血清を集めた。

それから免疫性のあることがわかつた兎に月に
１回、以下の注入実験を施した。兎に１週間にわ
たつて２日ごとに１回、0.5mlの上記のホスフア
チジルグリセロール−免疫原を静脈注射し、最後
の注射から５−７日後に心臓穿刺によつて採血し
た。血液を集めて上記のように処理した。

Ｃ 抗ホスフアチジルグリセロール抗血清の精製 高い抗ホスフアチジルグリセロール活性価を持
つ既知量の兎の血清に半量の、２規定のNaOH
で約7.8のPHに調節された硫酸アンモニウムの新
規に調製された飽和溶液をゆつくり加えた。この
溶液を室温において約２時間撹拌し、それから約
４℃において30分間1400xgで遠心分離した。ペ
レツトを最小限0.85％のNaClに溶解し、それか
ら、上記の緩衝剤といくぶん違う、0.85％の
NaClを含むPHが6.5の0.0175モルの硫酸ナトリウ
ム緩衝剤に対して４℃で２日間透析した。透析バ
ツグの内容物を1400xgで30分間遠心分離し、IgG
に富んだ上澄液が得られた。

それから上記のIgG分画から以下の方法で邪魔
な抗コレステロール抗体を除去した。無菌の25ml
のフラスコ内の約6.8mlの緩衝試薬に磁気撹拌し
ながら8.8mlのレシチン−コレステロール試薬
（試薬Ａ）を滴下して加えた。得られた乳濁液を
さらに２分間撹拌し、それからこの乳濁液を無菌
の250mlのフラスコ中の160mlのIgG分画に加え
る。この混合物を５分間ゆつくり撹拌し、それか
ら室温に４時間置き、その間に１時間につき１度
２分間ゆつくりと混合して２−４℃において１晩
放置した。２分間ゆつくり混合した後乳濁液を４
℃において10000xgで10分間遠心分離した。得ら
れた上澄液を抗ホスフアチジルグリセロールIgG
（抗PG IgG）と呼ぶ。抗体溶液を適当に薄めて
既知量のホスフアチジルグリセロールを含む標準
の対照溶液と所望の凝集反応を行なわせる。抗ホ
スフアチジルグリセロール抗体の希釈剤は1.0％
のNaClを含むPH6.0の0.0175モル燐酸ナトリウム
緩衝剤であつた。

Ｄ レシチン−コレステロール試薬の調製 約90mgのコレステロールを加熱水道水流で加熱
して約9.5mlの無水エタノールに溶解した。冷却
後、最終量を約0.5mlの無水エタノール中のジア
シルホスフアチジルコリンを15mg加えて10.0mlと
した。

Ｅ 臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム−
コレステロール試薬の調製 約90mgのコレステロールを加熱水道水流で加熱
して約9.5mlの無水エタノールに溶解させた。冷
却後、最終量を約0.5mlの無水エタノール中の臭
化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムを10mg加
えて10.0mlとした。

Ｆ 緩衝試薬の調製 20mg／mlの鶏の卵黄レシチンまたは20mg／mlの
臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムを含む
約0.9mlのエタノール溶液を440mlのPH6.0の0.0175
モル燐酸ナトリウム緩衝溶液に磁気撹拌しながら
加えた。最後にレシチンまたは臭化ヘキサデシル
トリメチルアンモニウムを加えた後、混合物をさ
らに２分間撹拌した。

Ｇ （） ホスフアチジルグリセロール試薬の
凝集試験（実施例） 1a レシチン−コレステロール試薬： 約0.15％のレシチン、 約0.9％のコレステロール（試薬Ａ） または ｂ 臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム
−コレステロール試薬： 約0.1％の臭化ヘキサデシルトリメチルア
ンモニウム、 約0.9％のコレステロール（試薬Ａ）。

２ 抗ホスフアチジルグリセロール抗体溶液
（試薬Ｂ）。

３ 負、弱正、および強正対照溶液 負対照溶液はPH6.0の0.0175モル燐酸ナトリウ
ム緩衝剤に約１−200mg／、もつと普通には10
−100mg／、最も好ましくは約40−80mg／の
範囲の鶏の卵黄レシチンまたは臭化ヘキサデシル
トリメチルアンモニウムを含む。

弱正対照溶液はPH6.0の0.0175モル燐酸ナトリ
ウム緩衝剤に約２mg／のホスフアチジルグリセ
ロールと約１−200mg／、もつと普通には10−
100mg／、最も好ましくは約40−80mg／の範
囲の鶏の卵黄レシチンまたは臭化ヘキサデシルト
リメチルアンモニウムとを含む。

強正対照溶液はPH6.0の0.0175モル燐酸ナトリ
ウム緩衝剤に約４mg／のホスフアチジルグリセ
ロールと約１−200mg／、もつと普通には10−
100mg／、最も好ましくは約40−80mg／の範
囲の鶏の卵黄レシチンまたは臭化ヘキサデシルト
リメチルアンモニウムとを含む。

４ 緩衝試薬：PH6.0の0.0175モル燐酸ナトリ
ウム緩衝剤中の約40mg／の鶏の卵黄レシチ
ンまたは40mg／の臭化ヘキサデシルトリメ
チルアンモニウム。

Ｇ （） ホスフアチジルグリセロールの凝集
試験（実施例） 1a レシチン−コレステロール試薬： 約0.15％のレシチン 約0.9％のコレステロール（試薬Ａ） または ｂ 臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウ
ム： 約0.1％の臭化ヘキサデシルトリメチルア
ンモニウム、 0.9％のコレステロール（試薬Ａ）。

２ 抗ホスフアチジルグリセロール抗体溶液
（試薬Ｂ）。

３ 実施例のような負、弱正、および強正対
照溶液。

４ 遠心分離した羊水の上澄液。

効力検定すべき各試料と対照試料に対する適切
な大きさの試験管に適当に印をつけた。各試験管
に羊水の遠心分離された試料からの上澄液と約
0.005−1.0ml、もつと普通には0.01−0.5ml、最も
好ましくは約0.025−0.2mlの範囲の負、弱正、ま
たは強正試料とを加えた。それから各試験管に可
能なときには試薬Ａを約0.005−1.5ml、もつと普
通には約0.01−0.5ml、最も好ましくは約0.025−
0.2mlの範囲で試験管を指でたたいて内容物を十
分に混合しながら滴下して加えた。それから各試
験管にさらに遠心分離した羊水試料からの上澄液
または緩衝試薬を約0.045−10ml、もつと普通に
は約0.2−５ml、最も好ましくは約0.3−１mlの範
囲で加えた。

約0.005−0.1ml、もつと普通には約0.01−0.75
ml、最も好ましくは約0.025−0.05mlの抗PG溶液
（試薬Ｂ）を効力検定すべき各試料と対照試料と
に対する凝集スライドの別々の試験リングの中心
にピペツトで加えた。次に各負、弱正、強正対照
試料と羊水試料との巨大分子凝集物懸濁液を凝集
スライドの別々の試験リングの中心にある抗PG
滴の中心に約0.002−0.05ml、もつと普通には約
0.005−0.04ml、最も好ましくは約0.01−0.03mlの
範囲でピペツトで加えた。各巨大分子凝集物懸濁
液はその一部をピペツトで取り去る前に十分混合
した。それから凝集スライドを血清学的ロータの
プラツトホーム上に置き、一定速度、たとえば約
60RPMで約10分間回転させた。それからスライ
ドを鏡の上に置いて各試験リング内の滴を検査し
た。ホスフアチジルグリセロールの存在に対する
正反応は弱正および強正対照試料を含むリングに
おけるように明瞭に澄んだバツクグラウンドを持
つ比較的大きい凝集した粒子によつて示される。
負反応はわずかに粒状の外観を持ち、明瞭な澄ん
だバツクグラウンドはない。

上記の実施例は特に羊水の試料中のホスフアチ
ジルグリセロールの存在の決定に向けられている
が、説明した技法は一般に生物液体中の燐脂質の
存在を決定するのにも等しく有効である。