JP2007003312A - 安定保存された担体微小粒子 - Google Patents

Abstract

【課題】 微小粒子の表面にカルボン酸活性エステル基を固定化することで加工プロトコルを短縮し、副反応を制御することおよびカルボン酸活性エステル基を有するビーズを安定に保持する。
【解決手段】 少なくとも１つ以上の蛍光染料により標識された所定量のナノ粒子が担体微小粒子に結合され、該担体微小粒子を低級アルコール中で保存する。
【選択図】 図４

Description

本発明は一般的にフローサイトメトリーに応用され、直径が通常１００μｍよりも小さい多色蛍光染色された担体微小粒子に関するものである。より詳細には１つ以上の蛍光染料で染色されたポリマー分子の色素が退色することなく表面に保持された活性エステルが安定化された担体微小粒子に関するものである。

蛍光ポリマー粒子はしばしば様々な生物医学的アッセイにおいてマーカーおよびインジケーターとして使用されている。本明細書で以下に使用しているところの微小粒子、マイクロスフェア、ビーズという用語は互換的に使用され、全体の直径が基本的にマイクロメーターの範囲内であるより小さな粒子を示す意味をもつ。微小粒子は手動または当技術分野で知られている他の方法で分析することができるが、好ましくは例えばＭａｎｓｏｕｒらに付与された下記特許文献１に開示されたようなフローサイトメトリー等の自動化技術を用いて分析できる。

これまで、少なくとも１色以上の蛍光染料で染色された微小粒子を用いて抗原や抗体などのタンパク質や核酸・ペプチド・糖鎖などの生体分子を固定化し、生体分子の定量解析や遺伝子多系解析を行ってきた。この微小粒子の蛍光染料の量を調整した複数の微小粒子にそれぞれ別々の生体分子を固定化することで複数項目を同時に測定できる。

この微小粒子表面はカルボキシル基で覆われている。カルボキシル基は生体分子中のアミノ基と脱水縮合反応によりアミド結合を形成する。微小粒子に生体分子を固定化するためにこの反応を用いている。しかしカルボキシル基は反応性が低いためカルボキシル基を何らかの形で活性化する必要がある。カルボキシル基を活性化することができる試薬は様々存在するがこの微小粒子は少なくとも１つ以上の蛍光染料で染色されており、蛍光染料は有機溶媒に溶解させて染色しているため水溶液中で反応を行う必要がある。水溶液中でカルボキシル基を活性化できる試薬はＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ＣａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）のみである。また、活性カルボン酸エステルと生体分子が反応するためには生体分子中にアミノ基を有することが必要となる。特に核酸や糖鎖など末端にアミノ基を有していないため末端をアミノ化しておく必要がある。

ＥＤＣは酸性溶媒でカルボキシル基を活性化することができる試薬である。したがってＥＤＣを用いる限り反応溶媒は酸性条件に限られてしまう。しかし生体分子の中には塩基性条件でしか安定に存在できない物質も存在するため固定化できる生体分子が限られてきてしまう。また、核酸を用いた場合酸性条件下ではＥＤＣと核酸塩基とが反応してしまうため一定の箇所で核酸を微小粒子表面に固定化することができない。

従来このような蛍光染料で染色した微小粒子に生体分子を固定化する方法はａ）微小粒子表面に担持したカルボキシル基をスクシンイミドエステルに活性化させた後生体分子を固定化する方法と、ｂ）微小粒子表面に担持したカルボキシル基をカルボジイミドエステルに活性化し同時に生体分子を固定化する方法がある。

ａ）のスクシンイミドエステルに活性化する方法は、懸濁させた微小粒子に対してＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）とＥＤＣを加えカルボキシル基をヒドロキシスクシンイミドエステルに活性化する。表面を活性化した微小粒子に対して即座に生体分子を固定化する方法である。

ｂ）のカルボジイミドエステルに活性化する方法は、懸濁させた微小粒子に対してＥＤＣと生体分子を同時期に加える。これにより微小粒子表面のカルボキシル基がカルボジイミドエステルに活性化され、活性エステル体に即座に生体分子が反応し微小粒子に生体分子が固定化できる。

ヒドロキシスクシンイミドエステル基のような活性カルボン酸エステル基は水溶液中で水中の水酸基と反応し元のカルボキシル基に戻ってしまう。特に塩基性条件下ではその反応は顕著に見られる。しかしヒドロキシスクシンイミドエステル基は有機溶媒中では比較的安定に存在することができる。

微小粒子（マイクロスフェア）は芳香族炭化水素類やピリジン、ジオキサンといった疎水性有機溶媒に溶解できる蛍光染料によって染色されている。

蛍光染色された微小粒子の製造方法及び使用方法に関連する公知技術文献としては下記特許文献２、３が挙げられる。

米国特許第４，６６５，０２４号明細書 特表２００１−５２０３２３号公報 特表２００２−５０１１８４号公報

微小粒子（マイクロスフェア）表面に抗原や抗体などのタンパク質や核酸・糖鎖・ペプチドなどいわゆる生体分子を固定化する際に、大気中で不安定な取り扱いが難しい化学物質であるＥＤＣやＮＨＳを使わなければならない。

ＥＤＣのみを用いたマイクロスフェア表面に生体分子を固定化する反応は酸性条件で行わなければならない。したがって塩基性溶媒にしか溶けないペプチドなどを固定化することができず固定化できる物質に制限を与えている。

ＥＤＣのみを用いたマイクロスフェア表面に核酸を固定化する反応では、反応条件が過酷であるため末端のアミノ基以外への副反応を制御することができない。この副反応により核酸塩基の配列認識能が低下し一塩基多系の識別に多大な影響を与えている。

ＥＤＣとＮＨＳ（またはｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ））を用いてマイクロスフェア表面に生体分子を固定化する反応ではカルボン酸活性エステル基が不安定であるため活性後即座に固定化反応を行わなければならない。また、ＮＨＳの変わりに２，３，５，６−ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｏｌおよび４−ｓｕｌｆｏ−２，３，５，６−ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｏｌを用いることによって活性エステル状態で安定化することが可能である。

有機溶媒中でカルボン酸活性エステル基を保持できるが、微小粒子の蛍光染料が溶出してしまう。これは微小粒子の蛍光染料が疎水的であるためである。

本発明の目的は微小粒子の表面にカルボン酸活性エステル基を固定化することで加工プロトコルを短縮し、副反応を制御することおよびカルボン酸活性エステル基を有するビーズを安定に保持することが出来る技術を提供することである。

本発明者らは，マイクロスフェア表面のカルボキシル基を予め活性エステルに活性化させ、低級アルコール中で保存することによって上記課題が解決されることを見出し本発明に到達した。

即ち、本発明は、安定化された担体微小粒子の発明であり、少なくとも１つ以上の蛍光染料により標識された所定量のナノ粒子が担体微小粒子に結合され、該担体微小粒子が低級アルコール中で保存されたことを特徴とする。

特に、前記担体微小粒子がカルボキシル基を活性化する官能基を有する場合が好ましい。

更に、前記カルボキシル基がヒドロキシスクシンイミドエステルに活性化されていることが好ましい。

又、前記低級アルコールとしては、１−ブタノール、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノ−ル、イソプロパノールなどが挙げられるが、この中でイソプロパノール、１−ブタノールが好ましい。

前記カルボキシル基を活性化する官能基の具体例としては、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌエステル基、Ｓｕｌｆｏ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌエステル基、２，３，５，６−ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｏｌエステル基、及び４−ｓｕｌｆｏ−２，３，５，６−ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｏｌエステル基が好ましく例示される。

少なくとも１つ以上の蛍光染料により標識された所定量のナノ粒子が結合された担体微小粒子を低級アルコール中で保存することにより、カルボキシル基が、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌエステル基、Ｓｕｌｆｏ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌエステル基、２，３，５，６−ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｏｌエステル基、及び４−ｓｕｌｆｏ−２，３，５，６−ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｏｌエステル基などによって活性化された担体微小粒子を長期に安定化することができる。

活性化させた微小粒子（マイクロスフェア）を任意の固定化反応液で溶媒置換を行った後、生体分子と反応させ微小粒子表面に生体分子を固定化する。これにより抗原、抗体、核酸、糖鎖、ペプチドなどの生体分子をそれぞれ最適の条件で固定化できる。また核酸で生じる副反応を大幅に抑えることができる。

図１は、従来のタンパク質を固定化するために微小粒子表面を活性化するプロトコルである。タンパク質をビーズに固定化するためには微小粒子表面のカルボキシル基をＥＤＣとＮＨＳ（またはｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）を用いて活性カルボン酸エステル基に活性化させた後、タンパク質と反応させる。このとき活性カルボン酸エステル基形成反応に用いるバッファとして０．１Ｍリン酸ナトリウム水溶液ｐＨ６．０や０．０５ＭＭＥＳ溶液 ｐＨ６．０などを用いる。活性エステル形成反応終了後、即座に図２のタンパク質固定化反応を行わなければならない。

図２は、従来の微小粒子表面の活性カルボン酸エステルとタンパク質固定化反応の一般的なプロトコルである。タンパク質のアミノ基と活性カルボン酸エステル基が反応しアミド結合を形成することでビーズ表面にタンパク質を固定化できる。タンパク質固定化反応を行う際のバッファとしてＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ） ｐＨ７．４や０．０５ＭＭＥＳ（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ） ｅｔｈａｎｅ Ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ） ｐＨ６．０溶液を用いて行う。固定化反応終了後、ＰＢＳ−ＴＢＮ（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ（ＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）、０．０２％Ｔｗｅｅｎ（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ社の登録商標）２０、０．０５％ Ａｚｉｄｅ）溶液でブロッキングおよび洗浄を行う。最後に加工したビーズをＰＢＳ−ＴＢＮ溶液で保存する。図１の手順でマイクロスフェア表面を活性化し即座に溶媒置換を行った上でタンパク質を固定化しなければならないため、手順が煩雑であり手間が掛かる。

図３は、従来の核酸を固定化するための微小粒子加工プロトコルである。核酸の場合核酸のどちらか一方の末端を、リンカーを介したアミノ基で修飾する必要がある。ＥＤＣとアミノ化された核酸を反応させることによりカルボジイミドエステルを経て核酸をビーズ表面に固定化できる。このときの反応溶液には０．１ＭＭＥＳ ｐＨ４．５溶液を用いる。固定化反応後０．０２％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０溶液で非特異反応をブロック後０．１％ ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）溶液で洗浄を行う。最後に加工したビーズをＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）ｐＨ８．０溶液で保存する。ただし、この反応では末端のアミノ基以外の部分でビーズ表面に固定化される副反応を制御することができない。

図４は活性カルボン酸エステル基をビーズ表面に固定化させたビーズの作成法である。活性カルボン酸エステル基を形成させる反応は従来法とほぼ同じであるが、活性カルボン酸エステル基を有したビーズをイソプロパノール中で保存している点と活性化させる際のバッファとして０．１ＭＭＥＳ （ｐＨ４．５）を用いている点が大きく異なる。これは、酸性条件で活性化することによりＥＤＣの活性が向上し、カルボン酸活性エステル基への反応を促進させるためである。

図５は本発明により作成したビーズを用いたタンパク質加工プロトコルである。カップリングバッファにＰＢＳｐＨ７．４などを用いている。これにより溶媒置換を行うだけで速やかにタンパク質をビーズ表面に固定化することができるため、図１および図２より大幅に手順を短縮することができる。

図６は、本発明により作成したビーズを用いた核酸加工プロトコルである。核酸を固定化する際のカップリングバッファには０．１Ｍリン酸バッファ ｐＨ８．０などを用いる。塩基性条件で反応を行うことにより図３で生じる副反応を抑えることができる。

［比較例１］
従来法のプロトコルを用いて末端をアミノ化されていないＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔのビオチン化ホモオリゴヌクレオチド２０量体を微小粒子に固定化した。固定化反応後４μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−フェコエリスリンと反応させ、その蛍光強度を測定した。その結果Ａ、Ｃ、Ｔのビオチン化ホモオリゴヌクレオチド２０量体ではほとんど末端をアミノ化したオリゴヌクレオチドと同程度微小粒子に固定化された（図７）。

［実施例１］
本発明で作成したマイクロスフェアを用いて図６の通りに末端をアミノ化されていないビオチン化オリゴヌクレオチド２０量体の固定化反応を行った。その結果を従来法と比較したところ、従来法より副反応を抑制することができた（図８）。

［実施例２］
本発明で作成したマイクロスフェアを用いて図６の通りに核酸を固定化した。またイソプロパノール中で蛍光色素が退色していないかおよびカルボン酸活性エステル基の活性が保持されているかを確認するためにイソプロパノール溶媒置換前、溶媒置換直後、３日後、１週間後、１ヵ月後に図６のプロトコルを用いて核酸をマイクロスフェアに固定した（図９）。

［実施例３］
本発明で作成したマイクロスフェアを用いて図６の通りに核酸を固定化した。またエタノール中で蛍光色素が退色していないかおよびカルボン酸活性エステル基の活性が保持されているかを確認するためにエタノール溶媒置換前、溶媒置換直後、３日後に図６のプロトコルを用いて核酸をマイクロスフェアに固定した（図１０）。

［実施例４］
本発明で作成したマイクロスフェアを用いて図６の通りに核酸を固定化した。また１−ブタノール中で蛍光色素が退色していないかおよびカルボン酸活性エステル基の活性が保持されているかを確認するために１−ブタノール溶媒置換前、溶媒置換直後、５日後に図６のプロトコルを用いて核酸をマイクロスフェアに固定した（図１１）。

本発明により、微小粒子の表面にカルボン酸活性エステル基を固定化することで加工プロトコルを短縮し、副反応を制御することおよびカルボン酸活性エステル基を有する微小粒子（ビーズ）を安定に保持することが出来るようになった。この結果、微小粒子の生物化学分野での利用が促進された。

従来のタンパク質を固定化する際のマイクロスフェア表面を活性化するプロトコルのフローチャートである。 従来のマイクロスフェア表面活性後のタンパク質固定化プロトコルのフローチャートである。 従来の核酸を用いたマイクロスフェア加工プロトコルのフローチャートである。 カルボン酸活性エステルを有するマイクロスフェア作成方法のフローチャートである。 本発明によるタンパク質固定化におけるマイクロスフェア加工プロトコルのフローチャートである。 本発明による核酸固定化におけるマイクロスフェア加工プロトコルのフローチャートである。 従来法のプロトコルを用いてＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔのビオチン化ホモオリゴヌクレオチド２０量体を微小粒子に固定化させた結果である。 実施例１の結果を示すグラフである。 実施例２の結果を示すグラフである。 実施例３の結果を示すグラフである。 実施例４の結果を示すグラフである。

Claims (6)

1. 少なくとも１つ以上の蛍光染料により標識された所定量のナノ粒子が担体微小粒子に結合され、該担体微小粒子が低級アルコール中で保存されたことを特徴とする担体微小粒子。
2. 前記担体微小粒子がカルボキシル基を活性化する官能基を有することを特徴とする請求項１に記載の担体微小粒子。
3. 前記カルボキシル基がヒドロキシスクシンイミドエステルに活性化されていることを特徴とする請求項２に記載の担体微小粒子。
4. 前記低級アルコールがイソプロパノール又は１−ブタノールであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の担体微小粒子。
5. 前記カルボキシル基を活性化する官能基が、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌエステル基及び／又はＳｕｌｆｏ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌエステル基であることを特徴とする請求項２乃至４のいずれかに記載の担体微小粒子。
6. 前記カルボキシル基を活性化する官能基が、２，３，５，６−ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｏｌエステル基及び／又は４−ｓｕｌｆｏ−２，３，５，６−ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｏｌエステル基であることを特徴とする請求項２乃至４のいずれかに記載の担体微小粒子。

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