JPS60501241A - ウイルス抗原、その製法および診断と治療（ワクチン）におけるその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ウィルス抗原、その製法および診断と 治療（ワクチン）におけるその使用 ウィルス血症の検出、即ち循環血液中における遊離ウィルスの検出の際の診断上 の困難は知られている。たとえばＢ型肝炎のような少数のウィルス感染を除いて は血液中の遊離ウィルスの検出は原則として成功しない。

ウィルス病の多くの病原ウィルスは知られており、そして形成された抗体につい ての診断と一部処置は可能である。

しかしいわゆる非Ａ−非Ｂ型肝炎において一般に一つのウィルスが病原体として 受け入れられるかどうかは未だ明らかでない。なぜならそのようなウィルスは未 だがって一度も同定され得なかったからである。従って診断用の抗体または接種 血清すら製造することも今まで不可能であった。

非Ａ−非Ｂ型肝炎病は文献に詳しく多数記載されている。

たとえばＧｆ３　ｒ　８　ｔ７　Ｒ、Ｊ　、　Ｎ　Ｏｎ　Ａ　−Ｎ　Ｏｎ　−Ｂ 　Ｈ８ｐａ　ｔｉｔｉ８　ｅ　ＡＱ　ａ　（ｌ　ｅｍ　ｌ　（！Ｐｒｅｓｓ　、 　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　、　１９８１を参照されたい。

たとえば非へ−非Ｂ型肝炎は主としてフィブロネクチン高含有量の血液誘導体に よって移行されるという確認から出発して、ウィルス抗原またはウィルスはフィ ブロネクチンに結合され、それによってマスクされるということが見出され、た ・この５悴血液中０遊離抗原またはライ二″を　、検出する診断上の困難を説明 する。

更にまた、循環血液からおよび体液からのフィブロネクチンの接縮または単離は 、フィブロネクチンに結合された（　２　） 抗原またはウィルスの製造に、従ってそのような抗原またはウィルスの製造とウ ィルス病の診断に用いられ得ることが見出された。

フィブロネクチンは４４００００ドルトンの分子量を有する糖蛋白質である。そ れは殆んどすべての体細胞中で生産され、そして特に内皮細胞および空洞で被わ れた他の細胞ならびに結合組織系の細胞によって細胞表面に沈着される。細胞表 面の糖蛋白質は人間の血液中に見出されるフィブロネクチンとわずかに異なる。

フィブロネクチンの同類は冷不溶性のグロブリン、オプソニン化された糖蛋白質 、細胞接着要素、細胞表面蛋白質、抗膠質要素である。

フィブロネクチンはコラーゲンおよび結合組織の多くの成分のための結合固定蛋 白質として役立つことが今日では知られている。細胞表面における濃度の範囲は 腫瘤細胞の拡大に一つの役割を演じる。血液中のフィブロネクチンはオプソニン の主蛋白質として、肝臓、肺臓、肺臓および骨髄の網内皮組織系の細胞によって ファゴチトーゼを支持することが臨床実施のため重要であることが示された。単 −糸条および二重糸条のＤＮＳ　、ヘパリン、コラーゲン、フィブリンおよびそ の分解物、グロテオグリカン、細胞および細胞層ならびにぶとう状球菌のフィブ ロネクチンへの結合は次の文献に記載された： ＨｏＧ、Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ　：　Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ　；　Ｄｉｅ　ｇ ｅｌ＋ｅ　Ｈｅｆｔｅ　（Ｂｅｈｒｉｎｇ　ＸＸエエ、１９Ｂ２）８．１５４− １６１　、Ｇ、Ｐｏｔｔ、Ｐ。

Ｚ荘ｎｄｏｒｆ　、　Ｕ、（）ｅｒｌａｃｈ　、　Ｂ、　Ｖｏｓｓ　、　Ｊ、　 Ｒａｕｔｅｎｂｅｒｇ　：　Ｄｉｅ（３） Ｂｅｄｅｕｔｕｎｇ　５ｔｒｕｋｔｕｒｅ’１ｌｅｒ　Ｇｌｙｋｏｐｒｏｔｅｉ ｎｅ　、ｄａｒｇｅｓｃｈｔａｌｌｔａｍ　Ｂｅ１ｓｐｉｅｌ　ｄｅｒ　Ｆｉｂ ｒｏｎｅｃｔｉｎｅ−ｂｉｓｃｈｅｍｉｓｃｈｅ　Ｇｒｕｎｄｌａｇｅｎｕｎｉ 　Ｋ１１ｎｉｓｃｈｅ　Ａｕｓｗｅｒｔｕｎｇ、　Ｚ、Ｇａｓｔｒｓｅｎｔｅｒ ｏｌｏｇｉｅ　２０　（１９８２）Ｓ、６４９−６５８゜ 網内皮組織系の緩やかな診断のだめの血液中のフィブロネクチンの測定、および 敗血症と遅れた傷治癒におけるフィブロネクチンの臨床利用は現在では治療に受 け入れられている。

フィブロネクチンの他物質を結合する能力についての研究において、述べられた ように、フィブロネクチンが分子の特定の場所において種々なウィルス抗原また はウィルス、たとえばＡ型およびＢ型肝炎ウィルスの抗原を結合することが思い がけなく示された。蛋白質を断片に分解し高圧液体クロマトグラフィーで分析す ることにより、そのようなペプチド、即ち種々な抗原またはウィルスに対する高 い結合力を有するコラーゲン不結合フィブロネクチン断片が見出された。

精製されたフィブロネクチンとその断片は、必要ならば放射能でマークされたウ ィルス懸濁液゛と共に培養され、そして低温で遠心分離で沈澱せしめられた。上 澄と沈澱は放射能について検査された。またマークされてないウィルス使用の場 合は、個々のフラクションが、放射線免疫学的検出法により、使用されたウィル スの存在について検査された。フィブロネクチンに結合されたウィルスのそれら の結合場所の置換反応は、他のウィルスたとえばＡ型肝炎ウイ（４） ルスにより可能であった。

これらの研究は種々なウィルス特に肝炎ウィルスはフィブロネクチンまだはフィ ブロネクチン分解物に見出さレルことを示した。同時にウィルスの一部はフィブ ロネクチン結合により、免疫学的にもはや（たとえば普通の抗原−抗体反応によ り）確認されないようにマスクされたことが明らかになった。

そのようにマークされた抗原またはウィルス、特に非Ａ−非Ｂ型肝炎ウィルスま たは抗原の遊離と取得は、抗原またけウィルスの単離の可能性、ウィルスと抗体 の目的とする培養の可能性、したがって一方ではワクチンの製造他方では診断上 の利用の可能性を提供する。

ウィルスの取得と遊離はウィルス保菌者のフィブロネクチンから行なわれる。し かしこの方法はフィブロネクチンに結合されたウィルスを得るために利用される たけでなく、ウィルスによって占領されないでいるフィブロネクチンも捷た利用 される。たとえばウィルス保菌者の大便からウィルスを結合するために、そして それを分離してそしてそれを得るために利用される。これは親和力クロマトグラ フィーの原理と比較されるべきものである。結合機構の破壊は公知の方法により 、特に特別の酵素および／または洗剤により、または置換反応または加熱により 行なわれる。そのような公知の例として、抗原／抗体結合の破壊（ｐＨの低下に よる。Ｔ、Ａ）または基体／受容体結合の破壊を参照するのが望ましい。

（５）　符表昭ＧＯ−５０１２４１（３）原則的工程手順は次の如くである： ｌａ）体液特に血漿からの低温沈旅法による、例えば０°〜４℃における血漿の 遠心分離によるフィブロネクチンの濃縮、 １’ｂ）その際得られた沈澱からフィブロネクチンの精製と鍵縮、低温法減法に よるフィブロネクチンの精製と濃縮は公知である。

Ｉｃ）必要ならばフィブロネクチンから分解物の製造（プロテアーゼ処理による 、たとえばズブチリシンで）および所望のウィルスのだめの結合場所を含有する この分解物の探索調査。

上述の如くこの方法は生物学的材料からの、たとえば大便からの、ウィルスの単 離にもまた応用される。その際次の原則的工程手順が用いられる。

Ａ）大便または組織の均等質の食塩膨張物の製造、および粗大成分の遠心分離に よる分離（８０００Ｇ）、Ｂ）上澄液にフィブロネクチンまたは対応するフィブ ロネクチン断片の添加、および／または上澄液にあるウィルス／またはウィルス 抗原の結合、 Ｃ）ここに結合されたウィルスおよび／またけウィルス抗原と一緒にフィブロネ クチンまたはフィブロネクチン断片の分離。

このフィブロネクチンまたは断片はｌａ）とｌｂ）に述べたように濃縮され精製 される。後続の処理は２）から５）まで（こ引用されたように行なわれる。

（６） フィブロネクチンまたはその断片からのウィルスの取得は次のようになる。

２ａ）特別の酵素および／または洗剤、特にノイラミニダーゼまたはキモトリプ シンのような受容体破壊酵素の添加による、または必要ならば加熱による、フィ ブロネクチンまたはフィブロネクチン断片とウィルス間の結合の破壊。

２１））　２ａ）の代りとして、結合されたウィルスの、他のウィルスたとえば Ａ型肝炎ウィルスによる、および／またはこのフィブリネクチン結合場所のあた りで競争する物質による置換。

手順２ａ）または２ｂ）において用いられた助剤の、吸着法によるまたは種々な 物質の密度、分子量および荷電による分離法による除去により、更にウィルス単 離が公知の如く続行される。

手１１１２ａ）および２ｂ）において得られたウィルス懸濁液または必彼ならば 精製された懸濁液からウィルスが検出されそして ３ａ）好ましくはウィルス抗原−抗体結合反応により３ｂ）まだは血球凝集反応 により、検出される。

精製されたウィルスおよび／またはウィルス抗原は、抗体の検出のために、従っ てたとえばウィルス感染の診断のために用いられることができる、そして４、． １．ａ）好捷しくは抗原−抗体結合反応によυ４、Ｉｂ）−ｊたはそれに加えて 中和法により（７） 用いられることができる。

ウィルス抗原に対する抗体の検出は、 ５、Ｉａ）好壕しくはウィルス抗原−抗体結合反応または”’＋１ｂ）それに加 えて中和法即ち抗原を積載している粒子の凝集の中止または特殊抗体による細胞 破壊効果の中止により、行なわれる。

それからウィルスおよび／またはウィルス抗原は、５．２ａ）実験室動物の活性 免疫化による抗体の製造に用いられることができ、従って診断用の特殊抗体の製 造に用いられることができる。

５　、２ｂ）更に、殺されたウィルスおよび／またはウィルス抗原の使用は人間 における接種用の特殊抗体の製造に可能テする。ウィルスの遊離と取得は従って まだワクチンの製造を可能にする。

５．３）フィブロネクチン−ウィルス結合の切断は、マスクされたウィルスの検 出のだめの一つの診断キットを可能にする。

フィブロネクチンに結合されたマスクされたウィルスの検出に適した診断キット は、（診断キットの構成に応じて）主として単にマークされたまたけマークされ ていない抗原ならびにマークされた筐たはマークされていない抗体をこれら抗原 （ウィルス）に対して含有している普通の診断キットとは異なり、それに加えて 、結合されたウィルスのフィブロネクチンからの遊離を可能にする指薬をそれら が検（８） よる抗原の製造および次のウィルス培養は、ワクチン製造に公知の方法に従って 行なわれる。

すでに述べた如く、低温沈澱によるフィブロネクチンのｎ製法と濃縮は知られて いる。

フィブロネクチン分子とその分解物中のウィルス結合場所によるウィルスまたは 抗原のフィブロネクチンへの結合、ウィルスまたは抗原のフィブロネクチンおよ びフィブロネクチン分解物への結合によるマスキングは知られていない。

それ故それらはもはや免疫学的には検出され得ない。同様に、結合されたウィル スを結合から遊離させる可能性、従って公知の精製法の使用、置換反応またはウ ィルスまたはウィルス抗原の単離のだめの酵素によるまたは熱による分解と組合 わせた低温沈澱法によるフィブロネクチンの濃縮の使用、フィブロネクチンまた はフィブロネクチン分解物の添加によるウィルス抗原含有懸濁液からのウィルス またはウィルス抗原の単離の可能性、そして特に非Ａ−非Ｂ型肝炎ウィルスがフ ィブロネクチンおよびその分解物への結合によシマスフされることおよび非Ａ− 非Ｂ型肝炎ウィルス懸濁液の製造、従って今まで仰られていないウィルスおよび 抗体の懸濁液の製造は知られていなかった。

免疫学的試験法と診断キットは原則的には知られている。

非へ−非Ｂ型肝炎の診断のだめの試験法は今まで知られていない。なぜならそれ に必要なウィルス（＝抗原と、従って抗体）が欠けていたからである。この診断 法とそのための一つの試験キットは今や可能である。

（９）　符表昭ＧＯ−５０１２４１（４）次の実施例は本発明を説明する。

実施例　１ 工程の概要 実施例においては血液からフィブロネクチンおよびウィルスまたは抗原を取得す る個々の段階が１−次記載されている： １、血液を０．１１モルのクエン酸＋トリウムと１０：１（容積：容積）の割合 で混ぜる。

２、血漿を遠心分離（１００ＯＧ）で分離する。

３、次に０℃で２０００Ｇの遠心分離により血漿からフィブロネクチンを低温沈 澱する。

３ａ、上澄液を傾瀉する。

３Ｊ沈澱は濃縮されたフィブロネクチンを含有する。これを室温で放置する。そ のとき、沈澱した低温沈澱物は再び溶解する。

４所望ならば続いてフィブロネクチンの精製とフィブロネクチン分解物の製造を 行なう。

４ａ、低温沈澱物は血漿の２０倍の出発容量を含有するカラム上でＡｍｐｈｏｌ ｉｎｅ　（ｐＨ勾配３がら９）を加えられ、９０分、１５０ｏｖ、３０ｗで電気 集中される。ｐＨ４，９で濃縮された蛋白質は集められ、０．１　ＭＮａＣ！１ に対し透析される。このフラクションのフィブロネクチンの濃度は公知の方法（ レーザー比濁計、マンチェ法）で測定される。

４ｂ、４ａ、項において得られた予め精製されたフィブロネクチンフラクション は血漿の４倍の出発容量を含有するカ（１０） ラムへ加えられる。このカラムはブロムシアン法でカップリングされた１型のコ ラーゲン・セファローゼを含有する。このセファローゼラムは予め０．０５Ｍの Ｔｒｉ日−Ｉｉｏｌｏ、ＩＭのＮａ１ｌ　、　０．４　Ｍのニブシロンアミノカ プロン酸で平衝されたものである。結合された蛋白質の溶離はＩＭの臭化カリ、 ０．０５　ＭのＴｒｉｓ−ＨＯＩ　、　０．０２５（Ｄｘプシロンカプロン酸で ｐＨ５，３で行なわれる。

溶離した蛋白質は圧力瀘過で濃縮され、フィブロネクチン含有量はレーザー比濁 計またはマンチェ法で測定され、純度はＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動で公 知の方法で検査される。上述の如くこれら操作方法は公知である。

４０、フィブロネクチン分解物の製造のためにはフィブロネクチンを１／１ｏｏ 重量部のズブチリシフ　（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ■型）と共に０．０１モルのＴｒ ｉｓ−緩衝液中ｐＨｓ、　０で２Ｔｒａｓｙｌ（，１，０，０２モルのＣａ１ｌ の存在下で３７℃６０分消化する。酵素反応を終了させるためには深冷した後、 ２０■のフィブロネクチンを４ｂ、）に記載したコラーゲン・セファローゼ上で 分離し、コラーゲンを結合しない断片は圧力を過による濃縮によ’）　６８　Ｘ 　１５　ｃｍのカラムのセファクリル３００上で溶出液から分離される。カラム の平衝は０．０５　Ｍ　（Ｄ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　テｐＨ７，６”Ｃ’行すわレ ル。

フィブロネクチン断片含有フラクションは集められ、普通の方法で濃縮される。

蛋白質の測定はＬｏｗｒｙに従って行なわれる。断片はウィルス結合のために用 いられる。

結合されたウィルスの遊離と取得。

（１１） ５、濃縮されたフィブロネクチン、精製されたフィブロネクチンまたはフィブロ ネクチン分解物を含有する溶液は、５ａ、特殊酵素、特にノイラミナーゼまたは キモトリプシンおよび／または洗剤たとえばＳＤＳと混ぜられるが、または８０ ℃で（１０分間）加熱され、そしてそのようにしてフィブロネクチンとウィルス 間の結合機構は破壊される。

５Ｊまたそれの別法として、濃縮されたフィブロネクチン、精製されたフィブロ ネクチンまたはフィブロネクチン分解物を含有する溶液は同じウィルス結合場所 でフィブロネクチンと競争する物質またはウィルスたとえばＡ型肝炎ウィルスと 混ぜられる。これは一種の競争置換を起こし、従ってフィブロネクチン結合場所 に結合されたウィルスの遊離を起こす。

６、所望の場合はフィブロネクチンからまたは遊離されたウィルスのフィブロネ クチン分解物から同様な精製が行なわれ、そして遊離に用いられた助剤たとえば 酵素、洗剤またはウィルスの除去はセシウムクロライド勾配中で密度勾配遠心分 離により、公知の方法にしたがって行なわれる。

７、勾配の個々のフラクションは、 ａ）溶出され、 ｂ）その密度は測定され ｃ）０．１５モルのＭａｉｌに対して透析される。

８、それらの智度に応じて個々の７ラクシヨン中に含有され（１２） るウィルスの検出は抗原−抗体結合反応により行なわれる。

次の諸例は製造の原則と個々の工程を説明する：実施例　２ フィブロネクチンおよびその分解物によるフィブロネクチン−抗体反応における ウィルス結合の検出。

Ａｍ肝炎ウィルス抗体を装入されたポリスチロール球カＡ型肝炎ウィルス懸濁液 中に入れられた。そしてＡ型肝炎ウィルスの結合は＋′ＪでマークされたＡ型肝 炎抗体の添加による公知の方法で検出された。Ａ型肝炎ウィルスのこの放射能免 疫学的検出は、ウィルス懸濁液にコラーゲンを結合しない特殊なフィブロネクチ ンの断片が添加されたときもはや成功しない。これに反し、フィブロネクチンま たは該断片が抗原−抗体結合の前に抗体と接触せしめられるとき放射能免疫学的 検出は成功する。だからフィブロネクチン筐たはその断片は抗体の結合能力を妨 げない。それらはしかし抗原をマスクする。それ故それはもはや抗体によって結 合されず、従って、またもはや放射能免疫学的に検出され得ない。

更に別のウィルス抗原（オルガノン社のＲ６ｔθ１ｎ抗原）が、血液凝集反応阻 止試験における結合とマスキングについて試験された。このウィルス学における 通常の血液凝集反応阻止試験は公知の方法にしたがって実施された。特に、予め 処置された羊の赤血球がウィルス抗原（この場合Ｒｉ：１ｔｅｌｎ抗原）の添加 により凝集される。この凝集反応は、羊の赤血球の添加前に抗体含有血清がウィ ルス抗原（Ｒ′６ｔθ１ｎアグルチニン）と−緒にされることにより阻止される 。それにもとづいてこの抗原の抗体への結合は赤血球の凝集を阻止する。非特異 阻止成分を除去するために血清は先づカオリンと羊の赤血球に吸着される。同様 に、吸着されたフィブロネクチンならびに吸着されなかったフィブロネクチン捷 たはその分解物のＲＸ６ｔθ１ｎ−アグリチニンへの添加または抗体不含有血清 への添加はＲａｔθＩｎ抗原特有の指薬−赤血球凝集を阻止する。抗体と非特有 抑制因子の排除を許す対応する対照が実施された。

フィブロネクチンの結合によるＡ型肝炎およびＢ型肝炎のウィルス抗原の非特異 検出。

直径６５団のポリスチロール球はフィブロネクチン溶液（３０μｒフイブロネク チン／ｒｎｌ！、０．１Ｍの炭酸緩衝液ｐＨ９２）の中へ入れられ１６時間室温 で培養された。十分な洗浄後、フィブロネクチンを積載した球は２００／（μの Ａ型肝炎ウィルス懸濁液と共に培養された。Ａ型肝炎ウィルス懸濁液は放射能免 疫分析アッセイ中でＡ型肝炎ウィルスの存在下で検査され、そしてＡ型肝炎ウィ ルス精製のだめの公知の方法（Ｓｉｅｇｅｌ　、　Ｇ、ｕｎｄ　Ｆｒ′６ｓｎｅ ｒ　、　Ｇ、、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ上で室温で培養した後、Ａ型肝炎ウィル スを含有する大便の懸濁液は燐酸で緩衝された生理学的食塩水（００５％のＴｗ ｅｅｎ　２０を混ぜた）で十分に洗浄された。その後、２００μμのトレイサー （Ａ型肝灸ウィルスに対し放射能活性Ｊ″′（１４） でマークされた抗体）が添加され、そして更に３〜４時間室温で培養された。こ の培養時間の後、トレーサーは蒸溜水による十分な洗浄により除去され、そして 球に結合された放射能はガンマ−カウンター中で測定された。対照として、装入 されなかった球および大便中にＡ型肝炎ウィルスを全く持たない同様に製造され た患者の大便懸濁液が用いられた。

Ｂ型肝炎ウィルスまたはＢ型肝炎つィルス表面抗原の非特異結合の検出に同様な 査定が行々われだ。Ａ型肝炎ウィルス懸濁液の代シに、２００μの精製されたＢ 型肝炎表面抗原（商業的に得られるＬＡＢＡＺ社の精製ワクチン）またはＢ型肝 炎ウィルス含有血清が用いられた。

実施例　３ ウィルスを結合しているフィブロネクチンの断片の製造。

フィブロネクチンはズブチリシンにより酵素的に多くの断片に分解されることが できる。コラーゲンの結合場所を含有する断片は肝炎ウィルス抗原の結合に不適 当であることが判明した。ウィルス結合に不適当な、即ちコラーゲンを結合して いる断片はコラーゲン・セファローゼへの吸着により簡単に分離される。ウィル スを結合している断片はクロマトグラフィ一方法による公知の方法で分子量に従 つって分離される。ここで得られた断片は１００００と１０００００の間の分子 量を持っている。

実施例　４ フィブロネクチンに結合されたウィルスの遊離。

（１５） フィブロネクチンに結合された肝炎ウィルス抗原は受容体破壊酵素（ノイラミニ ダーゼ、キモトリプシン）の添加により、置換反応により、または加熱により達 成される。

求められた非Ａ−非Ｂウィルス抗原（まだは非Ａ−非Ｂ肝炎と関連する物質）に おいて独特なのは、特に有効な遊離がノイラミニダーゼ（いわゆる受容体破壊酵 素）の添加により、ならびに８０℃（１０分間）の単なる加熱によシ達成され得 ることである。Ａ型肝炎ウィルスには加熱による遊離は適しない。なぜならこの ウィルスの抗原性はこの比較的高い温度において破壊されるからである。同様に 、Ａ型肝炎ウィルスの場合にはキモ）　ＩＪプシンは遊離には適しない。なぜな らこの酵素はＡ型肝炎ウィルスの抗原性質を破壊するからである。Ａ型肝炎ウィ ルスの遊離にはノイラミニダーゼが条件付きで適している。要するに、特殊なウ ィルスの性質（熱安定性、酸安定性、大きさ、被膜、酵素と洗剤に対する安定性 ）にそれぞれ適した遊離方法が選ばれなければならないことに留意すべきである 。

実施例　５ ウィルス懸濁液のｎ製。

ウィルス抗原の遊離後に存在する懸濁液は一般に抗原のほかにフィブロネクチン またはフィブロネクチン断片または変性フィブロネクチンならびに遊離に用いら れた物質（たとえばノイラミニダーゼ）を含有する。この懸濁液からウィルス抗 原を単離することまたは妨害物質を除去するこ（１６） 反応）において邪魔であるときに必要であるに過ぎない。

そのような精製は公知の方法に従って行なわれる。たとえは変性フィブロネクチ ンは遠心分離にょシウィルス懸濁液から除去される。それ以上の精製はクロマト グラフィーによる分離または勾配遠心分離によって行なわれる。

実施例　６ フィブロネクチンによるウィルス抗原のマスキンク。

確認され得る限りでは、すべての結合されたウィルス抗原がマスクされるもので はない。このことは（マスクされた）Ａ型肝炎抗原とは反対にフィブロネクチン 含有血清中に検出されるＢ型肝炎の表面抗原に特に当てはまる。Ａ型肝炎ウィル ス抗原のように、非Ａ−非Ｂ型ウィルス抗原（または非Ａ−非Ｂ肝炎と関連する 粒子）もまたフィブロネクチンによってマスクされる。Ａ型肝炎ウィルスのマス キングは、Ａ型肝炎ウィルスに対する特異抗原が形成されるように、それらが抗 原として有効になるのを妨げない。

実施例　７ フィブロネクチンからの非Ａ−非Ｂ型肝炎ウィルス抗原の遊離の証明。

フィブロネクチンからの非Ａ−非Ｂ型肝炎ウィルス抗原の遊離の直接証明は、遊 離された物質で適当な動物を感染させることまたは非Ａ−非Ｂ型肝炎感染を妨げ る抗体を作成することによってのみもたらされることができよう。非Ａ−非Ｂ肝 炎ウィルスによる動物の感染の診断は肝臓細胞壊死と炎症性の浸潤（組織学的検 出）の形態学的検出、血清中の肝臓の特異酵素の増大による臨床化学的検出、な らびに他の肝臓病の同時的防止、特にＡ型肝炎とＢ型肝炎の防止によシ行なわれ る。

非へ−非Ｂ型肝炎ウィルスの遊離の間接的証明は次の方法での研究でもたらされ た。

血液中の遊離形の非Ａ−非Ｂ型ウィルスは放射能免疫アツセーによる普通の試験 法では検出されないこと、及び血漿誘導体の服用量による感染の頻度は、非径口 的に移植された非Ａ非Ｂ型肝炎の場合、用いられた血漿誘導体のフィブロネクチ ン含有量と直接相関することの考慮から、非Ａ−非Ｂ型肝炎に伴なう物質の存在 下におけるフィブロネクチン不含有の生理学的液体が研究された。棟々な体液、 分泌物と排せつ物中のウィルスの分離は知られており、ウィルス学においてウィ ルスの検出に用いらる（唾液、大便などの中のウィルスの検出）。

特発性および非径口的に得られた非Ａ−非Ｂ型肝炎を有する患者ならびに健康な 対照人および他のウィルス肝炎と他の起原の肝臓病を患っている患者についての ３０００件以上の研究により、非へ−非Ｂ型肝炎の経過においである特殊な物質 がフィブロネクチンを含まない大便瀘液中で検出されることを示すことができた 。この物質の検出は非Ａ−非Ｂ型肝炎の臨床診断と相関する。この非へ−非Ｂ型 肝炎と関連する粒子はその化学的および物理学的性質について研究された。それ には有機溶剤に対する安定性、加熱活性化、種々な洗剤に対する安定性、塩化セ シウム勾配とす（１８） ツカローズ勾配における密度勾配遠心分離が研究された。

この粒子はＡ型肝炎ウィルスと同様にフィブロネクチンによってマスクされ、そ してＡ型肝炎ウィルスの添加によりそのフィブロネクチン結合から追出される。

卵白分解酵素と有機溶剤に対するその挙動は対応する。その沈澱挙動に対応して 、季節的頻度で冬期と春期に分泌されるウィルス類似の安定な粒子状物質が重要 である。

方法：１：１０（重量：容量）にうすめられた非Ａ−非Ｂ型肝炎の患者の大便懸 濁液は１０％のＰＥＧ　−６００による二回の沈澱とＤＮａｓｅ　、　ＲＮａｓ ｅおよび５ａｒｃｏｓｙｌ　（１％）によるＦｒｅｕｎｃｌ抽出の後、培養され た。沈澱物は１２〜１４（２／−）の密度の塩化カルシウム勾配上に運ばれ６． ２４および４２時間遠心分離された（　３００００　ＲＰＭ　）。正のフラクシ ョンは（５〜３０％）のサッカローズ勾配中で更に精製された（　４００００　 ＲＰＭ　）。そしてＳＤＳ　−ＰＡＧＥ　テ分析された。酵素と洗剤に対する安 定性はキモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、パパイン、ペプシン、プロ ナーゼ、ＤＮａａｅ　、　ＲＮａｓｅ　、ノイラミニダーゼとＳＤＳで検査され た。熱安定性は３７℃から１００′ｃまでの範囲で検査された。物質１−につき ５０声ｔづつの蛋白質が完全なＦｒθｕｎｄ補助液と共に、うさぎの免疫化のた め用いられた。物質の結合親和性の検査は１２５Ｊ・マーキングと普通人間の血 清による培養および後続のクロマトグラフィーによる分離（ビオゲルＡＣ３４） の後に行なわれた。

結果：物質の一つの主ピークは１．２５〜１．２６　（’ｒ／＋＋ｇ）（１９） の密度に恒常的に存在した。ＳＤＳ　−、ＰＡＧＥ中には４００００Ｄの分子量 を有するポリペプチツドが現われた。′２″Ｊでマークされた物質は、クロマト グラフィーで分離し得るすべての血清フラクションに対して強い親和性を示した 。プロナーゼ、パパインおよびペプシン処理ならびに０１チのＳＤＳの添加は、 他の酵素ならびに７０℃４５分間の加熱に対し安定性を示す精製された物質の結 合親和力を妨げた。この物質で免疫されたうさぎは特異な抗体を形成した。

非Ａ−非Ｂ肝炎に関連するある物質の存在下における大便の研究を含む輸注後の 肝炎の問題に対する期待される研究において、患者の２１％は大便中で陽性の診 断結果を示し、そのうちの６３チは明らかに肝炎を患っていることが一連の研究 で確認された。更に２５％は予定日までにガンマＧＴの増大を示した。５．５チ のみが全く変化を示さなかった。それで、陽性試験の観点から非へ−非Ｂ型肝炎 に関連する大便中の物質は、輸血が先行する場合、感染によると推定される肝臓 傷害の症例の９７５％を数える。輸血後研究目的に応じた診断が下され得るに十 分長い期間があった患者の総数ｎは３８であった。

本発明方法のそのほかの応用可能性は、ウィルスまたは抗原の遊離前の血漿から フィブロネクチンが除去されることができ従ってウィルスを全く含まない血漿が 得られるという一つの修正にある。この更変は、血漿フラクション、たとえばガ ンマグロブリンまたはファクター８の製造の際一層重要である。そのような血漿 フラクションの普通の製（２０） 造ではフィブロネクチンのある種の濃縮が起こり、フィブロネクチンの除去はす べてのウィルスまたは結合可能な抗原を同時に除去するのでウィルスを含まない 血漿フラクションが得られる。

ここで用いられた「フィブロネクチン」なる表現は特に人間のフィブロネクチン と霊長類のフィブロネクチンを指す。フィブロネクチンは種（しゆ）に特有なも のであるから、ウィルス特に非Ａ・非Ｂ型ウィルス捷だは対応する抗原への結合 能力を現わさないフィブロネクチン構造のある種の活性基の相違が現れることが ある。しかし上記明細書を考慮すれば、霊長類のフィブロネクチン以外の他のフ ィブロネクチンを用いて研究するとしても、そのことは場合場合に応じて決定し てもよいことである。

手続補正書（多病り 昭和／θ年！月と日 特許庁表　官　志賀学　殿　嘱 ：３．補正をする者 事件との関係　３４仔Ｌオ負人 乙、褌会灯を ９〜者職んび′縛家−、：４１ｉＥ１４翻％＆更ｑ末九番撃休」く り、　補゛ゴーθｆつ１Ｆ オリ含分Ｑ力１甘りであ′）、口角うｌノｃｇ！（ｉａ％ぼρＮ％Ｌｔ、ｚ；ｒ ｌ　Ｌｖ’１ｔ４ｔｒｔしｈｒ−ｔ＋ａｔ”Ｍ（ｉ’。

と串づ者麹−銖 ｚ）　’＝ｐｉｉｌ−Ｌに！Ｊ　／Ｉｌｎ話Ｌ　（Ｊｌｖ２４．ｎ　）　／　Ｊ １国際調査報告 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、４　−　識別記号　庁内整理番号＠発明者　シーリンク、ハン ス　ベーター　ド９ ０発　明　者　リール、ハインリツヒ　トン ０発　明　者　ポット、ゲルハルト　ドセ ＠出願人　リール、ハインリツヒ　ド ■出　願人　ポット、ゲルハルト　ド セ イツ連邦共和国、　７５００　カルルスルー、グーグスシュトラツセイツ連邦共 和国、　６６０１　ザールブルツケンービュービンゲン、アデル　スタインコー ル　１４ イツ連邦共和国、　４４００　ミュンステル、ドルボウム　シュトラツ４ イツ連邦共和国、　６６０１　ザールブルツケンービュービンゲン、アスタイン コール　１４ イツ連邦共和国？　４４００　ミュンステル、ドルボウム　シュトラツ４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生理学的材料、特に体液からウィルスまたはウィルス抗原を製造する方法に おいて、出発原料としてフィブロネクチン含有体液またはフィブロネクチンを混 合された生理学的材料を用い、そしてウィルスまたはウィルス抗原を、結合様構 の公知の破壊によシ、特に特別の酵素および／または洗剤によシ、または置換反 応または加熱により遊離し、必要ならば得られた懸濁液からウィルスまたはウィ ルス抗原を単離し、そして所望ならば公知の方法で更に精製することを特徴とす る上記の生理学的材料よシウイルスまたはウィルス抗原を製造する方法。 ２　フィブロネクチンの代りに、一定のウィルスまたはウィルス抗原の結合に能 力を有するフィブロネクチン断片を用いることを特徴とする請求の範囲第１項に 記載の方法。 ３、非Ａ−非Ｂ型肝炎ウィルスまたはウィルス抗原をフィブロネクチンまたはそ の断片から得ることを特徴とする請求の範囲第１項捷たは第２項に記載の方法。 ４、体液として血液を、または生理学的材料として大便を用いることを特徴とす る請求 法。 ５　ウィルスまたはウィルス抗原の遊離をノイラミニーゼ櫨たはキモトリプシン で行なうことを特徴とする前記請求の範囲の一つに記載の方法。 ６　ウィルスまたはウィルス抗原の遊離を加熱によって行なうことを特徴とする 前記請求の範囲の一つに記載の方法。 （２２） ７、　フィブロネクチンまたはその断片から製造する際に生じるような懸濁液状 の非Ａ−非Ｂ型肝炎ウィルスまたはウィルス抗原、または単離された状態の、必 要ならば精製後の非Ａ一非Ｉ！ｌ型肝炎ウイルスまたはウィルス抗原。 ８、抗体の製造へ、および非へ一非Ｂ型肝炎の免疫学的（実験室）診断へ、なら びにワクチンの製造へ請求の範囲第７項記載の非Ａ−非Ｂ型肝炎ウィルスまたは ウィルス抗原の使用。 ９、選別試験、特にウィルス感染の大便検査による早期診断のだめの、特に輸血 後の肝炎の早期診断のだめの選別試験へ、請求の範囲第１項から第６項までの一 つ特に請求の範囲第４項の方法の応用。 １０　フイプロネクチ／を、それに結合されたウィルスまたは抗原と共に血漿か ら、ウィルスまたはウイルス抗原ヲ遊離の前に、除去することによるウィルスま たは抗原を含まない血漿フラクションの製造へ請求の範囲第１項に証載の方法の 応用。 １１、マスクされた抗原ならびにこの抗原に対してマスクされたおよびマスクさ れてない特殊抗体、それに加えて、結合されたウィルスまたはウィルス抗原を７ イプロネクチンまたはその断片から遊離することができる指薬を含有する、フィ ブロネクチンまたはその断片によシマスフされたウィルスまたはウィルス抗原の 診断用の診断セット。 １２、結合されたウィルスまたは抗原の遊離のために、ノイラミニダーゼまたは キモトリプシンおよび必要ならばコラ（２３） 一ゲン・セファローゼフィルターが含有されていることを特徴とする請求の範囲 第１１項に記載の診断キット。 浄書（内容に変更なし）（１）