JPH08320324A - 口蹄疫診断用ペプチドおよび当該ペプチドを含有する口蹄疫診断用抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を
有する口蹄疫診断用ペプチドＡ、配列表の配列番号２に
記載のアミノ酸配列を有する口蹄疫診断用ペプチドＢ並
びにこれらをキャリアーと結合させた口蹄疫診断用抗原
ＡまたはＢ。 【効果】 本発明により、口蹄疫に感染した多くの動物
の診断を高感度、かつ高い特異性で行なうことができる
口蹄疫診断用ペプチドおよび抗原が提供される。これら
を用いることにより、迅速かつ簡便な診断方法に利用す
ることができ、口蹄疫の診断、予防に貢献することがで
きる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、口蹄疫診断用ペプチド
および当該ペプチドを含有する口蹄疫診断用抗原に関
し、詳しくは世界的に最も重要な国際家畜伝染病である
口蹄疫の診断に利用できる口蹄疫診断用のペプチドおよ
び当該ペプチドを含有する抗原に関するものである。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】口蹄
疫(Foot and Mouth Disease)は家畜に最も大きな被害を
与えている重要な国際伝染病で、一部の地域を除いてア
ジア，アフリカ，南米大陸など、世界各地に広く流行し
ている。現在のところ、幸いにして日本には侵入してい
ないが、万一その侵入を許すと、極めて伝染性が強いた
め、これを制圧することが困難で、国内の畜産業は壊滅
的な打撃を受けるものと予想される。口蹄疫はウイルス
性の伝染病であり、このＦＭＤウイルスは７種類にも及
ぶ血清型を有し、６０数種類のサブタイプの存在が知ら
れている。そのため、ＦＭＤウイルスに感染した動物の
血液中には、ウイルス構成蛋白質に対する抗体が産生さ
れるが、これらの抗体は極めて多くの種類のウイルス変
異に対応して産生されるため、ＦＭＤウイルスの感染の
有無の診断（判定）に際して、異なる血清型のＦＭＤウ
イルスでは検出が不可能となることが多い。

【０００３】一方、ＦＭＤウイルスは、非構造蛋白質と
して自らの遺伝子を合成するＲＮＡ依存性のＲＮＡポリ
メレースを始めとして多数の非構造蛋白質を持っている
が、これらの非構造蛋白質は、ＦＭＤウイルスの全ての
血清型に共通のものが多い。また、精製程度の高いワク
チンを投与した場合は、非構造蛋白質に対する抗体は殆
ど産生されないが、実際にウイルスに感染した動物の血
液中には（非構造蛋白質に対する抗体が）顕著に認めら
れる。そのため、ＦＭＤウイルスの感染の有無を診断す
るためには、被検動物の血液中に存在する非構造蛋白質
（３Ｄ；ＲＮＡポリメレース、３Ｃ；プロテアーゼ、
Ｌ；プロテアーゼ、その他の２Ａ，２Ｂ，２Ｃ，３Ａ，
３Ｂ蛋白質）に対する特異的な抗体を検出することは非
常に重要なことと考えられる。

【０００４】現在までに、多くの研究者により、３Ｄ蛋
白質であるＲＮＡポリメレース部位を抗原として用いる
ＦＭＤウイルス感染の診断法の試みがなされている。し
かし、酵素抗体法などの比較的検出感度が高い反応系で
は、ＦＭＤウイルスに近縁のピコルナ・ウイルスとかな
り共通したアミノ酸配列をもつ当該部位を抗原に用いた
場合に、非特異的な反応がしばしば生起し、問題となっ
ている。また、これまでの報告では、３Ｄ蛋白質部位に
ついては感染陽性血清との反応性もあまり優れていない
ことが知られている。

【０００５】そこで、非特異的な反応が除去され、かつ
高感度な非構造蛋白質に対する特異抗体の検出法が開発
されれば、自然感染した抗体陽性動物をワクチン投与を
受けた抗体陽性動物群から容易に選択することが可能に
なる。これにより、日本のような口蹄疫の非常在国にお
いては、口蹄疫の侵入防止策が提供されると共に、口蹄
疫の常在国においては、ワクチン等の投与による口蹄疫
の汚染地域の縮小，ひいては口蹄疫の撲滅に極めて重要
な診断技術を提供するものとなることが考えられる。

【０００６】本発明者らは、口蹄疫の各血清型に共通
し、近縁のピコルナ・ウイルスとは構造の異なる非構造
蛋白質のアミノ酸配列の一部を種々のペプチド断片とし
て作成し、特異性が高く、かつ高い反応性を示す優れた
抗原部位を見出すため、口蹄疫に感染した牛の血清を用
いて、これらの試作ペプチドがＦＭＤウイルス感染の有
無の診断に使用可能かどうかの評価・検討を行なった。
その結果、口蹄疫診断に使用可能なペプチドＡおよびペ
プチドＢを見出した。さらに、直接ペプチド単体を抗原
として用いる場合と、キャリアー蛋白質（血漿中のグロ
ブリン，アルブミンなど）と試作ペプチドを共有結合さ
せたものを抗原として用いる場合とを検討したところ、
ペプチド単体の場合よりも、キャリアー蛋白質とペプチ
ドを共有結合させたものの方が抗原の反応性が向上する
ことを見出し、本発明を完成したのである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】すなわち、請求項１に記
載の発明は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列
を有する口蹄疫診断用ペプチドＡである。請求項２に記
載の発明は、請求項１記載のペプチドＡをキャリアーと
結合させた口蹄疫診断用抗原Ａである。請求項３に記載
の発明は、キャリアーが馬グロブリンまたはラテックス
粒子である請求項２記載の口蹄疫診断用抗原Ａである。
請求項４に記載の発明は、請求項２記載の口蹄疫診断用
抗原Ａを用いる口蹄疫の診断方法である。請求項５に記
載の発明は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列
を有する口蹄疫診断用ペプチドＢである。請求項６に記
載の発明は、請求項５記載のペプチドＢをキャリアーと
結合させた口蹄疫診断用抗原Ｂである。請求項７に記載
の発明は、キャリアーが馬グロブリンまたはラテックス
粒子である請求項２記載の口蹄疫診断用抗原Ｂである。
請求項８に記載の発明は、請求項６記載の口蹄疫診断用
抗原Ｂを用いる口蹄疫の診断方法である。

【０００８】以下に本発明を詳細に説明する。 （１）試作ペプチドの調製 各種データベースのコンピューター検索により、ＦＭＤ
ウイルスに共通し、近縁のウイルスとは共通部分が少な
く、かつ動物個体に抗原認識されやすいと考えられる、
比較的親水アミノ酸に富む５０数箇所のアミノ酸配列部
位を選択し、それぞれの領域を固相化学合成法により合
成し、鎖長１０〜２０数個の試作ペプチドとした。な
お、このペプチドはすべての非構造蛋白質（３Ｄ；ＲＮ
Ａポリメレース，３Ｃ；プロテアーゼ，Ｌ；プロテアー
ゼ，その他の２Ａ，２Ｂ，２Ｃ，３Ａ，３Ｂ蛋白質）に
由来する部位について試作した。 （２）試作ペプチドの評価・検討 ＦＭＤウイルスを実験感染させて得られた牛血清を用い
て、間接酵素抗体法により試作ペプチドの反応性を評価
した。なお、評価は、直接ペプチド単体を抗原として用
いる場合と、キャリアー蛋白質と共有結合させたものを
抗原として用いる場合について実施した。また、対照と
して天然の３Ｄ蛋白質を用いた。

【０００９】（３）口蹄疫診断用ペプチドの選定 各種試作ペプチドの中で、配列表の配列番号１に記載し
たアミノ酸配列を持つペプチドが口蹄疫感染動物の抗体
と極めて強く反応することが確認された。これを口蹄疫
診断用ペプチドＡと称する。この配列は、ＦＭＤウイル
スに共通するものであり、かつ単エピトープ抗原と考え
られるので、その特異性は極めて高いものと思われる。
また、口蹄疫診断用ペプチドＡより若干反応性は低い
が、同様に口蹄疫診断に使用できるペプチドを口蹄疫診
断用ペプチドＢと称する。これは、配列表の配列番号２
に記載したアミノ酸配列を持つペプチドであり、配列中
の１１番目のアミノ酸はセリンまたはグリシンのいずれ
かである。

【００１０】（４）口蹄疫診断用抗原の調製 口蹄疫診断用ペプチドを各種の蛋白質やラテックス粒子
等のキャリアーと共有結合させて口蹄疫診断用抗原を調
製する。この目的に使用することが可能な蛋白質として
は、アルブミン，グロブリン，ヘモシアニンなどがあ
り、特に馬グロブリンが好適である。また、口蹄疫診断
用ペプチドと共有結合させることが可能なラテックス粒
子としては、カルボキシル化ポリスチレン等が挙げられ
る。 （５）口蹄疫診断用抗原の評価・選定 ＦＭＤウイルスを実験感染させて得られた牛血清を用い
て、間接酵素抗体法により口蹄疫診断用抗原の抗体価を
評価した。なお、対照として天然の３Ｄ蛋白質を用い
た。その結果、馬グロブリンを結合させた口蹄疫診断用
ペプチドＡおよびペプチドＢは、天然の３Ｄ蛋白質を用
いた場合よりはるかに高い抗体価を示すことを見出し、
口蹄疫診断用の抗原として利用できることを確認した。

【００１１】このようにして調製された抗原を口蹄疫診
断に用いる場合、様々な方法が適用可能である。例え
ば、間接酵素抗体法，時間分解蛍光測定法，ラテックス
凝集反応法などに用いることが可能であり、この場合、
複雑で高価な測定機器等の設備が不要なので、迅速で簡
易な診断法としての利用が考えられる。また、ペプチド
自体が極めて安定なので、熱帯や亜熱帯地方での利用も
可能である。本発明の方法は、口蹄疫に罹患する各種動
物、例えば牛，羊，山羊，水牛，鹿，象等の広範な動物
の口蹄疫診断に利用できる。

【００１２】

【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。 実施例１ Ｆｍｏｃペプチド固相合成法[Atherton, E. et al.,: A
mild procedure forsolid phase peptide synthesis.
Use of fluorenylmethyloxycarbonyl amino acids. J.
Chem. Soc. Chem. Commun. 13, 539-540 (1978)] によ
り、配列表の配列番号１および２に記載したアミノ酸配
列を持つペプチドの合成を行なった。なお、合成にはＦ
ｍｏｃ−Ｌ保護アミノ酸（スイス国、Ｎｏｖａ社製）、
その他の一般試薬は関東化学または半井化学製特級試薬
を用いた。合成は、目的とするペプチドのカルボキシル
末端のアミノ酸−樹脂化合物に、順次アミノ末端側へ１
個ずつ保護アミノ酸を dicyclohexyl carbodiimido (DC
C)[Chang, C.D. & Meienhofer, J.: Solid-phase pepti
de Synthesis using mildBase cleavage of N-Alpha-Fl
uorenylmethyloxycarbonyl amino acids, exemplified
by a Synthesis of Dihydrosomatostation. Int. J. Pe
ptide Protein Res. 11, 246-249 (1978)] による脱水
・縮合反応を行なって結合し、目的とするペプチドが完
成されるまで繰り返した。アミノ末端側に新しいアミノ
酸を結合させる際、完全な反応を行なうために、毎回遊
離のアミノ基の有無を各反応段階で確認し、遊離のアミ
ノ基が認められた場合には、複数回の繰り返し反応を行
ない、反応の完了しない遊離のアミノ基が存在しないこ
とを確認した後、新たな保護アミノ酸の導入を行なって
反応の万全を期した。最終的に、目的とする全ペプチド
が合成された時点で、すべての側鎖保護基および樹脂と
の結合を三弗化酢酸（ＴＦＡ）で切断した。Ｆｍｏｃ−
Ｌ保護アミノ酸のうち、アルギニンのグアニジノ保護基
については、脱離の容易なＰｍｃ基を使用した。樹脂よ
り切断されたペプチドは、ガラスフィルターにより濾過
し、次いでバキュームエバポレーターによりＴＦＡを除
去した後、冷エーテルによって数回洗浄して側鎖保護基
などの分解物を取り除き、少量の酢酸に溶解して凍結乾
燥した。

【００１３】実施例２ 実施例１で合成したペプチドの反応性を評価するため、
Ｏ型のＦＭＤウイルスを実験感染させて得られた牛血清
を用いて、間接酵素抗体法を実施した。なお、対照陰性
血清としては、それぞれウイルス感染前のものを使用し
た。ここで、間接酵素抗体法は、抗原用のペプチドまた
はペプチド結合抗原をコードしたプレートに被検血清を
適宜希釈して添加後、３７℃で１時間反応させたのち、
結合しなかった抗体を十分に洗浄、除去し、第二抗体で
ある抗牛ペルオキシダーゼ・コンジュゲートを加えてさ
らに１時間同温度下で反応させ、結合しない第二抗体を
洗浄、除去後、基質を加えて発色させて測定することに
より行なった。プレートはＩｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ Ｍ
ＡＸＩＳＯＲＰ（デンマーク国、Ｎｕｎｃ社製）、抗牛
ペルオキシダーゼ・コンジュゲートには抗牛ＩｇＧ山羊
ＩＧ・ペルオキシダーゼ（米国、キルガード＆ペリー社
製）を使用した。陽性対照用の天然抗原は、Ｏ型のＦＭ
Ｄウイルスに感染したハムスター腎臓由来のＢＨＫ−２
１細胞より部分精製した。この抗原を酵素抗体法で検定
したところ、２００倍以上の希釈での使用に耐えるもの
であった。また、寒天ゲル内沈降反応により、ヘテロな
型であるＦＭＤウイルス・アジア１型感染動物血清の
１：１６倍希釈にて明瞭な沈降線を形成するものであっ
た。

【００１４】実施例３ 馬グロブリン（米国、シグマ社製）３０ｍｇを２ｍｌの
燐酸緩衝液に溶解し、透析膜に入れた後、約５００ｍｌ
の０．７％グルタルアルデヒドを含有する燐酸緩衝液中
に３０分間置き、活性化を行なった。次いで、実施例１
で合成したペプチド１０〜２０ｍｇを加えて室温下で４
時間反応させ、過剰量のリシン塩酸塩を加えて反応を中
和後、再度透析を行ない、グルタルアルデヒドを完全に
除去したのち、凍結乾燥し、馬グロブリン結合ペプチド
約３５ｍｇを得た。

【００１５】実施例４ 実施例２と同様に調製した口蹄疫診断用抗原ＡおよびＢ
を用いて、口蹄疫感染試験牛（＃４）の感染４週間後の
血清との反応を血清希釈１：８００から２倍段階希釈に
より１：１２８００倍までのものについて、前記間接酵
素抗体法で調べた結果を図１に示した。図から明らかな
ように、口蹄疫診断用抗原ＡおよびＢともに極めて高い
反応を示したが、抗体希釈が大きくなると、抗原Ａの方
が反応性に優れていることが示された。なお、１：８０
０倍希釈では、天然の３Ｄ蛋白質抗原は０．０１以下の
値を示す。

【００１６】実施例５ 実施例２と同様に調製した口蹄疫診断用抗原ＡおよびＢ
を用いて、口蹄疫感染試験牛（＃３）の感染９週間後の
血清との反応について、間接酵素抗体法で調べた結果を
図２に示した。なお、対照として天然の３Ｄ蛋白質を用
いた。図示したように、天然の３Ｄ蛋白質を用いた場合
には、血清希釈倍数１：２０で約１．１５の吸光度を示
したが、１：４０で約０．５５の吸光度を示した。この
図には示していないが、３Ｄ蛋白質の部分ペプチド−馬
グロブリン結合抗原でもほぼこれと同じ成績が得られ
た。一方、口蹄疫診断用抗原ＡおよびＢともに極めて高
い反応を示すことが明らかになった。特に口蹄疫診断用
抗原Ａでは、天然の３Ｄ蛋白質の数千倍という極めて高
い反応が認められた。なお、実施例１で得られた他の試
作ペプチドを用いて、実施例３と同様に調製したペプチ
ド−馬グロブリン結合抗原では、このような高い反応性
は見られなかった。

【００１７】実施例６ 実施例２と同様に調製した口蹄疫診断用抗原Ａを用い
て、口蹄疫感染試験牛（＃３，＃８）の感染前および感
染１６週間後までの抗体価の推移を、前記間接酵素抗体
法により調べた結果を図３に示した。なお、牛＃３は抗
血清希釈１：６００、牛＃８は抗血清希釈１：１００で
実施した。いずれの牛においても感染２週間後から有意
な抗体価の上昇が認められ、１６週間後まで高い抗体価
が維持されていた。

【００１８】実施例７ 実施例２と同様に調製した口蹄疫診断用抗原Ａを用い
て、口蹄疫Ｏ，Ａ，Ａｓｉａ−１型ウイルスに実験感染
させた牛および同型の３種類のワクチン（タイ国口蹄疫
ワクチン製造センターで試作されたもの）を接種した牛
について、前記間接酵素抗体法により求めた抗体価を図
４に示した。ワクチン接種牛については、接種後最も抗
体価の高くなる接種３週間後におけるものを、また実験
感染牛については、Ｏ型口蹄疫ウイルスの場合は、感染
９週間後、Ａ型およびＡｓｉａ−１型ウイルスの場合
は、感染５週間程度経過したものを用いた。いずれのウ
イルス型においても、感染抗体はワクチン抗体に比較し
て有意に高いことが認められた。また、さらに精製の進
んだワクチンを使用した場合は、両者間の差がより明瞭
になることが容易に考えられる。このことは、口蹄疫侵
入防止のための口蹄疫特異抗体の検出のみならず、現在
ワクチンを使用して口蹄疫流行地域を縮小させ、ひいて
は撲滅を目指している諸国においても、極めて有効な診
断技術を提供し得るものと考えられる。

【００１９】実施例８ カルボキシル化ポリスチレン（米国、シグマ社製）約
０．０１ｍＥｑに、この２倍当量の実施例１で得たペプ
チドＡを加え、さらに５倍当量に相当する１−エチル，
３−ジメチルアミノプロピル・カルボジイミド塩酸塩を
加え、４℃下で２４時間反応させた後、ラテックス粒子
に結合しない遊離のペプチドを洗浄、除去したのち、１
ｍｌの燐酸緩衝液に懸濁した。この懸濁液を２０倍に希
釈し、その０．０５ｍｌに同量の希釈した牛＃４感染４
週間後の血清との反応を試みたところ、１：６４倍ま
で、室温下で３０分以内に凝集が認められ、間接酵素抗
体法よりも遙かに低い感度ではあるが、簡易な診断法が
行なえる可能性が示された。

【００２０】実施例９ 馬グロブリン以外の蛋白質（ウサギグロブリン，ウサギ
アルブミン，馬アルブミンなど）について実施例３と同
様にして結合ペプチドを得た。これらについて馬グロブ
リン結合ペプチドと同様に試験を行ない、診断用抗原と
して使用できることを確認した。

【００２１】

【発明の効果】本発明により、口蹄疫に感染した多くの
動物の診断を高感度、かつ高い特異性で行なうことがで
きる口蹄疫診断用ペプチドおよび抗原が提供される。こ
れらを用いることにより、迅速かつ簡便な診断方法に利
用することができ、口蹄疫の診断、予防に貢献すること
ができる。

【００２２】

【配列表】

【００２３】配列番号：１ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Arg Ser Thr Pro Glu Asp Leu Glu Arg Ala Glu Lys Gln 1 5 10

【００２４】配列番号：２ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Leu Glu Lys Gln Arg Asp Leu Asn Asp Pro Ser(Gly) Lys Tyr Lys Glu Ala 1 5 10 15 Lys Glu

【図面の簡単な説明】

【図１】 口蹄疫感染４週間後の牛陽性血清と口蹄疫診
断用抗原ＡおよびＢとの反応性を示した図である。

【図２】 口蹄疫感染９週間後の牛陽性血清と口蹄疫診
断用抗原ＡおよびＢとの反応性を示した図である。

【図３】 口蹄疫感染牛の感染後の抗体価の推移を示し
た図である。

【図４】 口蹄疫感染牛およびワクチン接種牛の抗体価
を示した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 49/00 Ａ６１Ｋ 49/00 Ｚ

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列を有する口蹄疫診断用ペプチドＡ。
2. 【請求項２】 請求項１記載のペプチドＡをキャリアー
   と結合させた口蹄疫診断用抗原Ａ。
3. 【請求項３】 キャリアーが馬グロブリンまたはラテッ
   クス粒子である請求項２記載の口蹄疫診断用抗原Ａ。
4. 【請求項４】 請求項２記載の口蹄疫診断用抗原Ａを用
   いる口蹄疫の診断方法。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配
   列を有する口蹄疫診断用ペプチドＢ。
6. 【請求項６】 請求項５記載のペプチドＢをキャリアー
   と結合させた口蹄疫診断用抗原Ｂ。
7. 【請求項７】 キャリアーが馬グロブリンまたはラテッ
   クス粒子である請求項２記載の口蹄疫診断用抗原Ｂ。
8. 【請求項８】 請求項６記載の口蹄疫診断用抗原Ｂを用
   いる口蹄疫の診断方法。