RU2684325C1 - Способ получения конъюгата на основе магнитных металл-углеродных наночастиц, пригодного для диагностических и аналитических целей, с использованием ЯМР-релаксометрии в качестве метода детекции - Google Patents
Способ получения конъюгата на основе магнитных металл-углеродных наночастиц, пригодного для диагностических и аналитических целей, с использованием ЯМР-релаксометрии в качестве метода детекции Download PDFInfo
- Publication number
- RU2684325C1 RU2684325C1 RU2018116527A RU2018116527A RU2684325C1 RU 2684325 C1 RU2684325 C1 RU 2684325C1 RU 2018116527 A RU2018116527 A RU 2018116527A RU 2018116527 A RU2018116527 A RU 2018116527A RU 2684325 C1 RU2684325 C1 RU 2684325C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- particles
- molecules
- magnetic
- nanoparticles
- nmr
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 239000011852 carbon nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 238000000679 relaxometry Methods 0.000 title abstract description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 24
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims abstract 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 claims abstract 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000001935 peptisation Methods 0.000 claims description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 6
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 22
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 22
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 22
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 17
- 102000007066 Prostate-Specific Antigen Human genes 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- QMQXDJATSGGYDR-UHFFFAOYSA-N methylidyneiron Chemical compound [C].[Fe] QMQXDJATSGGYDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 3
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000605534 Homo sapiens Prostate-specific antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000592517 Homo sapiens Puromycin-sensitive aminopeptidase Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- -1 antibodies Proteins 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229910052714 tellurium Inorganic materials 0.000 description 1
- PORWMNRCUJJQNO-UHFFFAOYSA-N tellurium atom Chemical compound [Te] PORWMNRCUJJQNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 230000034005 thiol-disulfide exchange Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
- G01N33/553—Metal or metal coated
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/34—Size selective separation, e.g. size exclusion chromatography, gel filtration, permeation
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
- B82B3/00—Manufacture or treatment of nanostructures by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
- B82B3/0009—Forming specific nanostructures
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области молекулярной иммунобиотехнологии и предназначено для функционализации поверхности магнитных металл-углеродных наночастиц. Проводят сорбцию в условиях интенсивного механического перемешивания содержащего функциональные группы водорастворимого полимера на поверхности магнитных наночастиц. Молекулы полимера ковалентно сшивают между собой, формируя прочный химически структурированный «каркас», что сопровождается одновременной химической активацией пептизированных частиц. Пептизированные активированные частицы смешивают с раствором, содержащим молекулы стрептавидина и биотинилированного зонда, специфичного определяемому соединению, или G белка стрептококков и антител, специфичных определяемому соединению, для конъюгирования, после чего готовый конъюгат освобождают от непрореагировавших молекул смеси гель-проникающей хроматографией. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности и информативности способа и может служить основой для создания систем высокочувствительного диагностического тестирования с использованием метода ЯМР-релаксометрии. 2 ил., 1 табл., 6 пр.
Description
Изобретение относится к области молекулярной иммунобиотехнологии и может быть использовано в производстве высокочувствительных тест-систем для количественного определения любых соединений способных к стереоспецифическим взаимодействиям (антигенов, антител, нуклеиновых кислот, биологически активных макромолекул), а также в технологии изготовления наночастиц с функционально модифицированной поверхностью, пригодных для использования в фармакологии, косметологии, медицине.
К настоящему времени достаточно хорошо известны системы анализа с прямым мечением специфичных аналиту соединений (анти-аналитов) оптически плотными частицами или водорастворимыми цветными полимерами различной природы и размеров. Среди таких меток - латексы, в том числе цветные (Tarcha et al., Abbot Labs., Eur. pat. appl. 89116594.6), эритроциты (Guesdon J-L., AvrameasS., Ann. Immunol., 1980, v. 131 C, p. 389-396), неметаллические коллоиды серы, селена, теллура (Yost et al., Eur. pat. appl. 88110459.0), полимеризованные красители Конго красный, Трипановый голубой, Lissamine blue (Henry Robert P., US Pat. 4.452.886), коллоидное золото (Roth J., Heitz P.U., Immunolabeling with the Protein A - Gold Technique: An Overview, Ultrastructural Pathology, 1989, 13:467-484.). Использование данных меток позволяет визуально определять присутствие аналита как в гомогенных системах анализа (без разделения реагирующих компонентов) - например, по агглютинации довольно крупных частиц (с размерами от 0,2 до нескольких микрометров) или изменению спектральных характеристик (цвета) специфически агглютинирующих коллоидов, так и в многочисленных гетерогенных системах -ЭритроИммуноАдсорбции и, более широко, Седиментационно-Адсорбционном (Иммуно)Анализе; дот-, Вестерн-, Саузерн-, Нозерн-блотинге; иммуно- и гибридофильтрации (Flow-Through анализах), иммуномиграции (иммунохроматографии) и ряде других - по окрашиванию зоны специфического связывания аналита на непористом или пористом твердофазном носителе. Учитывая, что основным преимуществом перечисленных методов является прямое визуальное определение аналита, без участия регистрирующей аппаратуры, условно их можно выделить в группу так называемых безынструментальных способов анализа.
Вместе с тем, не утрачивают своего значения методы, основанные на инструментальной регистрации результатов диагностического тестирования. Их востребованность диктуется значимостью в определенных ситуациях сверх высокочувствительного определения либо следовых количеств веществ и/или низких концентраций соединений, являющихся маркерами опасных заболеваний, например, опухолевых маркеров, либо веществ, даже малые количества которых могут представлять опасность для жизни. Разработка таких систем анализа может способствовать своевременному вмешательству в онкологический процесс, значение которого трудно переоценить, контролировать и своевременно вносить коррекцию в процесс терапии, предупреждать риски событий потенциально опасных для жизнедеятельности. В любом случае безусловно важным является не только высокие чувствительность и специфичность анализа, но и воспроизводимость и надежность. Уровень последних весьма зависит от возможности максимально стандартизовать процедуру анализа, что напрямую зависит от степени простоты форматной аранжировки. Очевидно, что достичь успеха здесь можно за счет сокращения числа операционных процедур в структуре теста, а это становится возможным в результате совершенствования реагентного обеспечения теста.
Наиболее близким к заявляемому объекту по технической сущности и достигаемому результату являются способ получения конъюгатов на основе магнитных наночастиц, представляющих собой железо-углеродные композиции (М.Б. Раев, М.С. Бочкова, П.В. Храмцов, А.В. Тюленев. «Способ функционализации поверхности магнитных наночастиц». Патент РФ №2543631 от 02.002.2015).
Задача, описанная в прототипе, состояла в разработке способа получения прочных функциональных конъюгатов, основой которых являются магнитные наночастицы.
Основой для решения поставленной задачи было применение магнитных полей, создаваемых вращающимся и/или неподвижным магнитами на определенных этапах технологии.
Поставленную задачу решали путем введения магнитных наночастиц в раствор полимера, сорбируемого на их поверхности, в непосредственной близости от вращающегося магнита. При этом частицы вводимого материала приобретают вращательное движение, что способствует практически мгновенной пептизации частиц. Введение в суспензию пептизированных частиц бифункционального реагента способствует активации поверхности для дальнейшего конъюгирования частиц с молекулами аффинных соединений (анти-аналитов). Единственной промежуточной стадией является удаление избытка сорбируемого полимера и бифункционального реагента, которое осуществляется в ходе последовательного осаждения-ресуспендирования частиц на неподвижном магните. Последняя процедура повторяется после конъюгирования активированных частиц с молекулами анти-аналита.
Описанный способ объективно привлекателен, как с позиции экономии времени, так и в части затрат на осуществление процедур освобождения от непрореагировавших соединений.
С позиции критики следует отметить лишь два обстоятельства. Первое заключается в существенном уровне потерь материала вследствие образования агрегатов при осаждении частиц в поле действия постоянного магнита. И без того склонные к агрегации магнитные наночастицы в условиях магнитного поля многократно усиливают реализацию этой склонности, что однозначно влияет на количество удаляемого материала в виде агрегатов. Потери могут составлять в конечном итоге до 50%. Вторым существенным моментом является получение конъюгата, применение которого требует включение в форматную аранжировку конструируемой тест-системы стадию использования зонда (промежуточного участника аналитической процедуры), специфичного определяемому лиганду и одновременно биоспецифическим молекулам конъюгата. Структура аналитической процедуры при этом выглядит следующим образом: твердофазный реагент с сорбированным на его поверхности анти-аналитом - определяемое соединение (аналит) - зонд - конъюгат. При этом время аналитической процедуры без учета стадии инструментальной детекции превышает три часа. То есть, сокращение времени и упрощение технологии синтеза с учетом серьезных потерь используемых материалов, компенсируется усложнением и удлинением процедуры аналитического тестирования с использованием получаемых реагентов.
Заявляемый способ решает две принципиальные задачи, существенным образом сокращая потери материала (металл-углеродная матрица, сорбируемый полимер, аффинные соединения), а также позволяя конструировать системы анализа в аранжировке, при которой длительность процедуры сокращается не менее, чем на 30%. Это имеет существенное значение, особенно в ситуациях, когда определяемый лиганд (маркер), является индикатором быстро протекающего процесса и/или в ситуациях, когда требуется быстрое принятие решений, а также, когда количество анализируемых образцов достаточно велико.
Описание разработанного способа.
Заявляемый способ конъгирования предоставляет возможность для очень широкого выбора конкретных сорбируемых полимеров и активирующих/конъюгирующих реагентов. Данное обстоятельство вынуждает заявителя представить формулу изобретения, составленную в принципиальных терминах, попытка конкретизации которых неминуемо привела бы к сужению области действия заявляемого объекта.
В представленных ниже конкретных примерах описан способ получения детектирующих конъюгатов, осуществляемый с использованием глутарового альдегида в качестве сшивающего (гомо)бифункционального реагента. Использование данного вещества не является принципиальным для осуществления способа. Вместо глутаральдегида могут быть использованы другие известные гомо- и гетеробифункциональные соединения, которые в реакциях второго порядка способны реагировать предпочтительно с наиболее универсально представленными в возможных анти-аналитах и анти-анти-аналитах первичными аминогруппами (хотя, для ковалентного конъюгирования с суспензоидными метками таких анти-аналитов, как Fab'-фрагменты антител, более оптимальными могут оказаться, например, малеимидные реагенты, участвующие в реакциях тиол-дисульфидного обмена).
Использование глутаральдегида является предпочтительным, поскольку дополнительно отвечает требованию универсальности предлагаемого способа и является гомо-бифункциональным реагентом, относительно специфично реагирующим с первичными аминогруппами белков. Кроме того, немаловажным обстоятельством является доступность и практически самая низкая стоимость глутаральдегида, что также выгодно отличает его от возможных других, использование которых в рамках предлагаемого способа с экономической точки зрения, очевидно, является менее выгодной возможностью.
ПРИМЕРЫ КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ
Нижеследующие примеры приводятся только с целью демонстрации возможностей настоящего изобретения, но никоим образом не ограничивают как спектр возможных технологических приемов синтеза конкретных реагентов, так и область возможного применения изобретения в целом.
Приводимые в примерах конкретные количественные параметры, даже в области указываемых диапазонов, не фиксируются формулой изобретения, потому что не являются принципиальными условиями осуществления заявляемого способа.
Пример 1. Получение активированных магнитных наночастиц.
К 20 мл раствора бычьего сывороточного альбумина (1-50 мг/мл в 0,01-0,2М фосфатном буферном растворе (ФБР) рН 6,0-8,5 добавляют 1-2 грамма металл-углеродных магнитных частиц. Смесь перемешивают на магнитной мешалке или роторном встряхивателе типа "Vortex" в течение времени, достаточного для полной предварительной пептизации (смачивания) частиц углерода. Полученную суспензию озвучивают при помощи ультразвуков jго дезинтегратора. Условия ультразвуковой обработки суспензии (интенсивность и мощность, количество и продолжительность циклов озвучивания) подбирают таким образом, чтобы озвучиваемая суспензия при одновременном (возможном) охлаждении не разогревалась до температуры свыше 40°С. Полученную в результате эффективной ультразвуковой дезинтеграции суспензию центрифугируют при 6000 g в течение 5-10 минут с целью удаления оставшихся относительно крупных агрегатов частиц. Покрытые БСА магнитные наночастицы с размерами 90-100 нм, содержащиеся в супернатанте, в дальнейшем активируют раствором глутаральдегида, взятым в объеме, равном объему активируемых частиц. Диапазон эффективных концентраций реагента - 1-25%, время активации - от 20 до 120 минут. Суспензию активированных частиц освобождают от избытка глутаральдегида и несвязанного БСА гель-фильтрацией на колонке с Сефарозами (6В, 4В, 2В; CL-6B, CL-4B, CL-2B), Сефакрилом S-300 или другими подходящими гелями (Тойоперлы, Ультрагели и др.), имеющими предел исключения не ниже одного миллиона Дальтон для глобулярных белков. Полученный после хроматографии объем активированной суспензии концентрируют в диализных мешка до примерного объема суспензии, взятой на активацию.
Описанный конкретный способ получения активированных магнитных металл-углеродных наночастиц позволяет в дальнейшем синтезировать конъюгаты.
Пример 2. Получение конъюгатов магнитных металл-углеродных наночастиц с функциональными комплексами.
Активированные частицы вносят в ФБР, содержащий стрептавидин и биотинилированный аптамер в концентрации 10 мг/мл по белку. Соотношение по объему частиц и белка - 9 к 1. Соотношение стрептавидина и биотинилированного аптамера 1 к 4 по молекулярной массе. После инкубации в течение ночи при мягком перемешивании суспензию центрифугируют при 6000 g в течение 5-10 минут с целью удаления возможно образовавшихся агрегатов частиц и освобождают от молекул несвязавшихся стрептавидина и аптамера гель-фильтрацией на колонке с Сефарозами (6В, 4В, 2В; CL-6B, CL-4B, CL-2B), Сефакрилом S-300 или другими подходящими гелями (Тойоперлы, Ультрагели и др.), имеющими предел исключения не ниже одного миллиона Дальтон для глобулярных белков. В полученный конъюгат вносят глицерин и БСА до конечных концентраций 20% и 1% соответственно.
Конъюгаты магнитных металл-углеродных частиц с комплексом, состоящим из G белка и антител в соотношении 1 к 2 по молекулярной массе, получают аналогичным способом.
По данным оптического контроля концентрации наночастиц на всех стадиях синтеза суммарные потери не превышают 10%. (Табл. 1).
Эффективность полученных с помощью предлагаемого способа реагентов оценивали в прямом сравнении с реагентами, представляющими собой конъюгаты магнитных металл-углеродных наночастиц со стрептавидином и биотинилированными зондами, а также с G белком и моноклональними антителами соответственно, использование которых предполагает введение в формат аналитической процедуры дополнительную стадию взаимодействия промежуточного аффинного соединения с иммунным комплексом на твердой фазе. Примеры сравнительных экспериментов представлены далее.
Пример 3. Двухсайтное определение стандарта простатспецифического антигена (ПСА) на пористой твердой фазе с использованием конъюгата железо-углеродных наночастиц со стрептавидином в комплексе с биотинилированным аптамером, специфичным к ПСА человека (Fe@C-Str/Bi-Apt).
На полоски из нитроцеллюлозной мембраны (Bio-Rad, США) с диаметром пор 0,45 мкм размером 5×10 мм сорбировали в виде точек (3 мкл на точку) мышиные моноклональные антитела (МКА) из клона 3А6 (производитель - Биалекса, Россия), специфичные к простатспецифическому антигену (ПСА), разведенные в 0.15М растворе NaCl, забуференном 0,015М Na-фосфатами, содержащем 0,1% азида натрия рН 7,25 (ЗФР) до концентрации 0,05 мг/мл. Тест-полоски высушивали, помещали в пластиковые планшеты и промывали трехкратно (3×5 мин) 200 мкл ЗФР + 0,1% Твина-20 (ЗФРТ), затем промывочный раствор удаляли, а в лунки вносили по 200 мкл двукратных разведений ПСА в ЗФРТ, начиная с концентрации 0,01 мг/мл. После инкубации при +37°С в течение 60 мин, тест-полоски трехкратно промывали ЗФРТ и вносили в лунки конъюгат, разведенный в ЗФРТ таким образом, что конечная концентрация наночастиц составляла 0,03%. После инкубации при +37°С в течение 60 мин тест-полоски трехкратно промывали ЗФРТ. Оценку результатов анализа производили визуально по последней различимой невооруженным глазом точке в ряду разведений и с использованием ЯМР-релаксометра (Ecotek Corporation, Houston, USA). (Рис. 1). Общее время анализа 2 ч 15 мин.
Пример 4. Двухсайтное определение стандарта ПСА на пористой твердой фазе с использованием конъюгата железо-углеродных наночастиц со стрептавидином (Fe@C-Str), в качестве примера сравнения с аналитической процедурой предлагаемого способа.
На полоски из нитроцеллюлозной мембраны (Bio-Rad, США) с диаметром пор 0,45 мкм размером 5×10 мм сорбировали в виде точек (3 мкл на точку) мышиные моноклональные антитела (МКА) из клона 3А6 (производитель - Биалекса, Россия), специфичные к простатспецифическому антигену (ПСА), разведенные в 0.15М растворе NaCl, забуференном 0,015М Na-фосфатами, содержащем 0,1% азида натрия рН 7,25 (ЗФР) до концентрации 0,05 мг/мл. Тест-полоски высушивали, помещали в пластиковые планшеты и промывали трехкратно (3×5 мин) 200 мкл ЗФР + 0,1% Твина-20 (ЗФРТ), затем промывочный раствор удаляли, а в лунки вносили по 200 мкл двукратных разведений ПСА в ЗФРТ, начиная с концентрации 0,01 мг/мл. После инкубации при +37°С в течение 60 мин, тест-полоски трехкратно промывали ЗФРТ и в лунки вносили по 200 мкл раствора аптамера, специфичного ПСА в ЗФРТ концентрации 130 нМ. После 60 минутной инкубации при, 37°С и мягком перемешивании удаляли растворы из лунок, трижды промывали тест-полоски. ЗФРТ и вносили конъюгат, разведенный в ЗФРТ таким образом, что конечная концентрация наночастиц составляла 0,03%. После инкубации при +37°С в течение 60 мин тест-полоски трехкратно промывали ЗФРТ.
Оценку результатов анализа производили визуально по последней различимой невооруженным глазом точке в ряду разведений и с использованием ЯМР-релаксометра (Рис. 1). Общее время анализа 3 ч 30 мин.
Визуально определяемая концентрация ПСА в обоих вариантах - 0,625 мкг/мл. Чувствительность ЯМР-релаксометрии -0,15 мкг/мл.
Пример 5. Прямое определение ПСА на пористой твердой фазе с использованием конъюгата железо-углеродных наночастиц с G белком стрептококка в комплексе с моноклональными антителами, специфичными к ПСА человека (Fe@C-G белок/МкАТ).
На полоски из нитроцеллюлозной мембраны (Bio-Rad, США) с диаметром пор 0,45 мкм размером 5×10 мм сорбировали в виде точек (3 мкл на точку) двукратные разведения ПСА в ЗФР, начиная с концентрации 0,01 мг/мл. Тест-полоски высушивали, помещали в пластиковые планшеты и промывали трехкратно (3×5 мин) 200 мкл ЗФРТ, затем промывочный раствор удаляли, а в лунки вносили, разведенный в ЗФРТ таким образом, что конечная концентрация наночастиц составляла 0,03%. После инкубации при +37°С в течение 60 мин тест-полоски трехкратно промывали ЗФРТ.
Оценку результатов анализа производили визуально по последней различимой невооруженным глазом точке в ряду разведений и с использованием ЯМР-релаксометра (Рис. 2). Общее время анализа 1 ч 30 мин.
Пример 6. Прямое определение ПСА на пористой твердой фазе с использованием конъюгата железо-углеродных наночастиц с G белком стрептококка (Fe@C-G белок).
На полоски из нитроцеллюлозной мембраны (Bio-Rad, США) с диаметром пор 0,45 мкм размером 5×10 мм сорбировали в виде точек (3 мкл на точку) двукратные разведения ПСА в ЗФР, начиная с концентрации 0,01 мг/мл. Тест-полоски высушивали, помещали в пластиковые планшеты и промывали трехкратно (3×5 мин) 200 мкл ЗФРТ, затем промывочный раствор удаляли, а в лунки вносили по 200 мкл раствора моноклональных антител, специфичных к ПСА в ЗФРТ в концентрации 10 мкг/мл. После 60 минутной инкубации при 37°С и мягком перемешивании удаляли растворы из лунок, трижды промывали тест-полоски ЗФРТ и вносили конъюгат, разведенный в ЗФРТ таким образом, что конечная концентрация наночастиц составляла 0,03%. После инкубации при +37°С в течение 60 мин тест-полоски трехкратно промывали ЗФРТ.
Оценку результатов анализа производили визуально по последней различимой невооруженным глазом точке в ряду разведений и с использованием ЯМР-релаксометра (Рис. 2). Общее время анализа 2 часа 45 мин.
Визуально определяемая концентрация ПСА в обоих вариантах - 1,25 мкг/мл. Чувствительность ЯМР-релаксометрии - 0,150 мкг/мл.
Технологический результат от использования предлагаемого изобретения заключается, прежде всего, в том, что технология получения конъюгатов магнитных частиц независима от уникального или дорогостоящего оборудования и объективно дефицитных или дорогих реагентов. Предлагаемые конъюгаты могут служить основой создания эффективных систем как для упрощенного инструментально независимого диагностического тестирования с высокой чувствительностью и надежностью, так и для систем, предполагающих использование чувствительной детектирующей аппаратуры, в частности, ЯМР_релаксометра. В качестве соединений, придающих функциональные качества магнитным частицам, могут быть использованы практически любые биологически активные молекулы, несущие в своей структуре хотя бы одну свободную аминогруппу и обладающие при этом способность связывать биологически активные соединения с аффинными свойствами по отношению к таргетным, диагностически значимым маркерам. Применение разработанного способа может найти свою реализацию не только в области высоко эффективного диагностического тестирования минимальных количеств маркеров, позволяющих прогнозировать возникновения различных заболеваний (в частности, онкологических) или оценивать эффективность принятых мер терапевтического характера, но и в решении таких актуальных проблем, как адресная доставка целого комплекса (более одного вида молекул) биологически активных соединений. Широкомасштабное применение различных магнитных носителей с целью адресной доставки биологически активных соединений в современной практике ограничивается нестабильностью конъюгатов. В основе этой нестабильности лежат прежде всего проблемы, связанные с природой связи биомолекул с частицами. В большинстве случаев - это нековалентные связи, что и является основным ограничением в применении подобных конъюгатов. Предлагаемая разработка решает проблему нестабильности, причем в отношении сразу нескольких компонентов комплекса металл-углеродных частиц и биологически активных молекул, а применение ЯМР-релаксометрии делает тест, первоначально неинструментальный с ограниченным возможностями визуальной оценки результатов порогом чувствительности, существенно более чувствительным.
Claims (1)
- Способ функционализации поверхности магнитных металл-углеродных наночастиц, включающий сорбцию в условиях интенсивного механического перемешивания содержащего функциональные группы водорастворимого полимера на поверхности магнитных наночастиц (пептизацию), молекулы которого затем ковалентно сшивают между собой, формируя прочный химически структурированный «каркас» обработкой глутаровым альдегидом, что сопровождается одновременной химической активацией пептизированных частиц, после чего пептизированные активированные частицы освобождают от избытка несвязанного полимера и глутарового альдегида при помощи гель-проникающей хроматографии, отличающийся тем, что полученные активированные частицы смешивают с раствором, содержащим смесь молекул стрептавидина и биотинилированного зонда, специфичного определяемому соединению, или G белка стрептококков и антител, специфичных определяемому соединению, для конъюгирования, после чего готовый конъюгат освобождают от непрореагировавших молекул смеси гель-проникающей хроматографией.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018116527A RU2684325C1 (ru) | 2018-05-03 | 2018-05-03 | Способ получения конъюгата на основе магнитных металл-углеродных наночастиц, пригодного для диагностических и аналитических целей, с использованием ЯМР-релаксометрии в качестве метода детекции |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018116527A RU2684325C1 (ru) | 2018-05-03 | 2018-05-03 | Способ получения конъюгата на основе магнитных металл-углеродных наночастиц, пригодного для диагностических и аналитических целей, с использованием ЯМР-релаксометрии в качестве метода детекции |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2684325C1 true RU2684325C1 (ru) | 2019-04-08 |
Family
ID=66090049
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018116527A RU2684325C1 (ru) | 2018-05-03 | 2018-05-03 | Способ получения конъюгата на основе магнитных металл-углеродных наночастиц, пригодного для диагностических и аналитических целей, с использованием ЯМР-релаксометрии в качестве метода детекции |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2684325C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2743426C1 (ru) * | 2020-03-26 | 2021-02-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук (ПФИЦ УрО РАН) | Способ определения биологических макромолекул на основе ЯМР-релаксометрии |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2543631C2 (ru) * | 2013-07-23 | 2015-03-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН | Способ функционализации поверхности магнитных наночастиц |
WO2017054750A1 (zh) * | 2015-09-29 | 2017-04-06 | 上海氪励铵勤科技发展有限公司 | 纳米粒子及其制备方法 |
-
2018
- 2018-05-03 RU RU2018116527A patent/RU2684325C1/ru active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2543631C2 (ru) * | 2013-07-23 | 2015-03-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН | Способ функционализации поверхности магнитных наночастиц |
WO2017054750A1 (zh) * | 2015-09-29 | 2017-04-06 | 上海氪励铵勤科技发展有限公司 | 纳米粒子及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MASOTTI A. et al. Preparation of magnetic carbon nanotubes (Mag-CNTs) for biomedical and biotechnological applications. Int J Mol Sci. 2013 Dec 18; 14(12): 24619-42. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2743426C1 (ru) * | 2020-03-26 | 2021-02-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук (ПФИЦ УрО РАН) | Способ определения биологических макромолекул на основе ЯМР-релаксометрии |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5656339B2 (ja) | タンパク質固定化担体およびその製造方法 | |
Wang et al. | Advances in epitope molecularly imprinted polymers for protein detection: a review | |
FI102921B (fi) | Menetelmä biologisesti aktiivisten reagenssien valmistamiseksi sukkiin i-imidiä sisältävistä polymeereistä, analyysielementti ja menetelmiä n iiden käyttämiseksi | |
Piletsky et al. | Development of molecularly imprinted polymers specific for blood antigens for application in antibody-free blood typing | |
CN107607498B (zh) | 一种荧光纳米分子印记仿生传感器及其制备方法和应用 | |
JP2005517899A (ja) | コロイド状磁気粒子を使用した分析物の検出方法 | |
AU724475B2 (en) | Synthetic particles as agglutination reagents | |
Garcia-Cruz et al. | Molecularly imprinted nanoparticles-based assay (MINA)–detection of leukotrienes and insulin | |
CN111474356A (zh) | 一种双免疫磁珠分选试剂及其制备方法和在体液外泌体富集中的应用 | |
RU2684325C1 (ru) | Способ получения конъюгата на основе магнитных металл-углеродных наночастиц, пригодного для диагностических и аналитических целей, с использованием ЯМР-релаксометрии в качестве метода детекции | |
WO1987004794A1 (en) | Latex agglutination using avidin/biotin system | |
JP2007211076A (ja) | 有機ポリマー粒子およびその製造方法、ならびにプローブ結合粒子 | |
Marquette et al. | Protein microarrays enhanced performance using nanobeads arraying and polymer coating | |
US20220205993A1 (en) | Detection method of multiple analytes | |
RU2543631C2 (ru) | Способ функционализации поверхности магнитных наночастиц | |
Luchini et al. | Nanoparticle technology: Addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery | |
Battersby et al. | Optically encoded particles and their applications in multiplexed biomedical assays | |
US11366108B2 (en) | Method of producing probe-bound carrier, probe-bound carrier and method of detecting or separating target substance | |
Li et al. | Preparation of a sandwich-like complex “MIPs-target molecule-magnetic SERS probe” and SERS determination of immunoglobulin G | |
JP2004144687A (ja) | 物質の測定方法 | |
JP2001305139A (ja) | 特異的結合体 | |
RU2314827C2 (ru) | Способ получения конъюгата для стереоспецифического анализа | |
JP7436838B2 (ja) | 抗体-デンドリマー複合体を用いるヘモグロビンA1cの測定方法 | |
WO2000067027A1 (en) | Augmented agglutination assay | |
JP5720318B2 (ja) | 検出対象の検出方法および定量方法 |