JP2017514481A - 標的細胞を単離する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
細胞または他の生物学的材料、例えば細胞小器官またはウイルスなどの標的生物学的実体の単離方法に関する。本方法は、カラムクロマトグラフィー方法を含むクロマトグラフィー方法を規定すると解釈しうる。本方法は、試料から標的細胞を単離するための新しい構成および対応する機器にも関係する。本発明は、標的細胞を単離するための、表面にリガンドを有する固定相の使用にも関係する。
所望の細胞タイプの純粋かつ機能的な細胞集団の単離は、さまざまな治療的、診断的、および生物工学的応用における前提条件である。
- i)標的細胞表面上の受容体分子に特異的に結合する能力を有する結合部位Bと、多量体化試薬上の結合部位Zに可逆的に結合する能力を有する結合パートナーCとを含む、受容体分子結合試薬、
ii)受容体分子結合試薬に含まれる結合パートナーCに可逆的に結合する能力を有する2つ以上の結合部位Zを含み、リガンドLに特異的に結合する能力を有するリガンド結合パートナーLBをさらに含む、(可溶性)多量体化試薬、
および
iii)標的細胞を含む試料
を接触させ、
それによって、受容体分子結合試薬、多量体化試薬、および標的細胞が、多量体化試薬に結合した2つ以上の受容体分子結合試薬に結合している標的細胞を含む多価結合複合体を形成することを可能にする工程、および
- 標的細胞、受容体分子結合試薬および多量体化試薬の多価結合複合体を、リガンドLを含む固相と接触させ、
それによって、リガンドLとリガンド結合パートナーLBとの間の結合による固相上での標的細胞の可逆的固定化を可能にする工程であって、固相上での標的細胞の固定化が、少なくとも受容体分子結合試薬に含まれる結合パートナーCと多量体化試薬の結合部位Zとの間の結合を破壊すると可逆的である、工程。
(i)標的細胞表面上の受容体分子に特異的に結合する能力を有する結合部位Bと、多量体化試薬上の結合部位Zに可逆的に結合する能力を有する結合パートナーCとを含み、さらにリガンドLに特異的に結合する能力を有するリガンド結合パートナーLBを含む、受容体分子結合試薬、
ii)受容体分子結合試薬に含まれる結合パートナーCに可逆的に結合する能力を有する2つ以上の結合部位Zを含む、(可溶性)多量体化試薬、
および
iii)標的細胞を含む試料
を接触させ、
それによって、受容体分子結合試薬、多量体化試薬、および標的細胞が、多量体化試薬に結合した2つ以上の受容体分子結合試薬に結合している標的細胞を含む多価結合複合体を形成することを可能にする工程、固相上での標的細胞の固定化が、
- 標的細胞、受容体分子結合試薬および多量体化試薬の多価結合複合体を、リガンドLを含む固相と接触させ、
それによって、リガンドLとリガンド結合パートナーLBとの間の結合による固相上での標的細胞の可逆的固定化を可能にする工程であって、固相上での標的細胞の固定化が、
a)受容体分子結合試薬に含まれる結合パートナーCと多量体化試薬の結合部位Zとの間の結合、および/または
b)固相のリガンドLと受容体分子結合試薬に含まれるリガンド結合パートナーLBとの間の結合
を破壊すると可逆的である、工程。
- (i)標的細胞表面上の受容体分子に特異的に結合する能力を有する結合部位Bと、多量体化試薬上の結合部位Zに可逆的に結合する能力を有する結合パートナーCとを含む、受容体分子結合試薬、
ii)受容体分子結合試薬に含まれる結合パートナーCに可逆的に結合する能力を有する2つ以上の結合部位Zを含み、リガンドLに特異的に結合する能力を有するリガンド結合パートナーLBをさらに含む、(可溶性)多量体化試薬、
および
iii)標的細胞を含む試料
を接触させ、
それによって、受容体分子結合試薬、多量体化試薬、および標的細胞が、多量体化試薬に結合した2つ以上の受容体分子結合試薬に結合している標的細胞を含む多価結合複合体を形成することを可能にする工程、
- 標的細胞、受容体分子結合試薬および多量体化試薬の多価結合複合体を、リガンドLを含む固相と接触させ、
それによって、リガンドLとリガンド結合パートナーLBとの間の結合による固相上での標的細胞の可逆的固定化を可能にする工程であって、固相上での標的細胞の固定化が、少なくとも受容体分子結合試薬に含まれる結合パートナーCと多量体化試薬の結合部位Zとの間の結合を破壊すると可逆的である、工程。
i)標的細胞表面上の受容体分子に特異的に結合する能力を有する結合部位Bと、多量体化試薬上の結合部位Zに可逆的に結合する能力を有する結合パートナーCとを含み、さらにリガンドLに特異的に結合する能力を有するリガンド結合パートナーLBを含む、受容体分子結合試薬、
ii)受容体分子結合試薬に含まれる結合パートナーCに可逆的に結合する能力を有する2つ以上の結合部位Zを含む、(可溶性)多量体化試薬、
および
iii)標的細胞を含む試料
を接触させ、
それによって、受容体分子結合試薬、多量体化試薬、および標的細胞が、多量体化試薬に結合した2つ以上の受容体分子結合試薬に結合している標的細胞を含む多価結合複合体を形成することを可能にする工程、
- 標的細胞、受容体分子結合試薬および多量体化試薬の多価結合複合体を、リガンドLを含む固相と接触させ、
それによって、リガンドLとリガンド結合パートナーLBとの間の結合による固相上での標的細胞の可逆的固定化を可能にする工程であって、固相上での標的細胞の固定化が、
a)受容体分子結合試薬に含まれる結合パートナーCと多量体化試薬の結合部位Zとの間の結合、および/または
b)固相のリガンドLと受容体分子結合試薬に含まれるリガンド結合パートナーLBとの間の結合
を破壊すると可逆的である、工程。
- リガンドLを含む固相であって、リガンドLは、標的細胞を単離するために使用される受容体分子結合試薬または(可溶性)多量体化試薬中に存在するリガンド結合パートナーLBに特異的に結合する能力を有し、リガンドLはそれによって、固相上での標的細胞の可逆的固定化を可能にする、固相、
- a)細胞分離に適した第1固定相であって、ゲル濾過マトリックスおよび/またはアフィニティークロマトグラフィーマトリックスであり、前記マトリックスが、受容体分子結合試薬に含まれる結合パートナーCに特異的に結合する結合部位Zを有するアフィニティー試薬を含み、それによって、第1固定相上での受容体分子結合試薬の固定化と、標的細胞を含む溶出液からの受容体分子結合試薬の除去とを可能にする、第1固定相、
または
b)リガンドLを含む第2固定相であって、リガンドLは、標的細胞を単離するために使用される受容体分子結合試薬または多量体化試薬中に存在するリガンド結合パートナーLBに特異的に結合する能力を有し、リガンドLはそれによって、第2固定相上での受容体分子結合試薬または多量体化試薬の固定化と、標的細胞を含む溶出液からの受容体分子結合試薬または多量体化試薬の除去とを可能にする、第2固定相
のうちの少なくとも1つ
を含む。
(SEQ ID NO:13、「Twin-Strep-tag(登録商標)」というその商標名でも知られている)である。結合パートナー(C)は、受容体分子結合試薬に融合またはコンジュゲートすることができる。受容体分子結合試薬(1)がFabフラグメントである場合は、結合パートナーCを、その抗体フラグメントの重鎖または軽鎖のいずれかのC末端に融合してもよいだろう。
可溶性多量体化試薬(2)は、結合パートナー(C)に可逆的に結合する能力を有する複数の結合部位Zを含有している。受容体結合試薬(1)は、結合パートナー(C)を介して多量体化試薬(2)上の結合部位(Z)に結合する。多量体化試薬(2)と複数の受容体結合試薬(1)とが互いに結合すると、それらは、受容体分子結合試薬の結合部位(B)に関して、多価結合複合体を形成する。したがって、例えば国際特許出願WO 02/054065または米国特許第7,776,562号に記載されているように、この多価結合複合体は、(一価)受容体分子結合試薬のみの結合と比較して、アビディティ効果をもたらし、それにより、単一型では標的細胞に安定に結合せず、受容体分子から迅速に解離してしまうであろう低アフィニティー一価受容体分子結合試薬を使用することが可能になる。この多価複合体中に含まれる、そのように多量体化した受容体分子結合試薬(1)は、その後(下記参照)、標的細胞(3)に結合することができる。結合パートナー(C)としてストレプトアビジン結合ペプチドを使用する場合、多量体化試薬(2)は、図1に模式的に示すその(ビオチン)結合部位Zを介してストレプトアビジンペプチド(=結合パートナーC1)が可逆的に結合する任意のストレプトアビジンムテインであることができる。そのような多量体化試薬は、野生型ストレプトアビジンの配列位置44〜47にアミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:19)を含むストレプトアビジンムテイン(類似体)、または野生型ストレプトアビジンの配列位置44〜47にアミノ酸配列Ile44-Gly45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:20)を含むストレプトアビジンムテイン(類似体)でありうる。そのようなムテインは例えば米国特許第6,103,493号に記載されており、ムテイン「m1」およびムテイン「m2」の形態で、IBA GmbH(ドイツ・ゲッチンゲン)から、Strep-Tactin(登録商標)という商標で市販されている。
多量体化試薬(2)は、リガンド(L)に特異的に結合する能力を有するリガンド結合パートナー(LB)も含んでいる。図1に示す例において、リガンド結合パートナー(LB)は、例えばヘキサ-ヒスチジンタグまたはグルタチオン-S-トランスフェラーゼでありうる。この場合、ストレプトアビジンムテイン(単量体)は、ヘキサ-ヒスチジンタグまたはグルタチオン-S-トランスフェラーゼのどちらかを融合パートナーとする融合タンパク質として組換え生産することができる。
図1の方法では、次に、標的細胞(3)を含む試料を多価結合複合体と接触させると、標的細胞(3)が多価結合複合体に結合する。クロマトグラフィーマトリックス(5)は固相(固定相)として用意される。クロマトグラフィーマトリックス(5)は、リガンド結合パートナー(LB)が結合するリガンド(L)を含有し、それによって標的細胞は、標的細胞/多価結合複合体の一部として固定相(5)上に固定化される。図1の例において、リガンドLは、例えば、遷移金属が錯化していて、ヘキサ-ヒスチジンタグなどのオリゴヒスチジンペプチドに結合する能力を有する、キレート基でありうる。固相または固定相(5)は、TALON(登録商標)樹脂(Westburg、オランダ・ルースデン)などの固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)樹脂であってもよいだろう。あるいは、グルタチオン-S-トランスフェラーゼをリガンド結合パートナーLBとして使用するなら、リガンドLはグルタチオンであってもよいだろう。この場合、固相(5)は、グルタチオンがカップリングされたセファロースマトリックスでありうる。
リガンドLへのリガンド結合パートナー(LB)の結合の結果として、標的細胞(3)は固相上に固定化され、試料からは標的細胞(3)が枯渇していく。標的細胞(3)はこうして試料中の他の構成要素から分離されていく。所望であれば、次に、適切な洗浄緩衝液で固相を洗浄してもよい(図1には示していない)。その後、競合試薬(6)を固定相(5)と接触させる。競合試薬(6)はリガンド(L)に特異的に結合して、リガンド(L)とリガンド結合パートナー(LB)との間の結合を破壊しうる。加えて、受容体分子結合試薬の結合パートナー(C)と多量体化試薬(2)の結合部位(Z)との間の結合も破壊される。これは、例えば、多量体化試薬の結合部位(Z)に結合することによって受容体分子結合試薬(2)の結合パートナーCを多量体化試薬(2)の結合部位(Z)から解離させる競合試薬(12)によって達成されうる。この例では低アフィニティー受容体分子結合試薬(1)を使用しているので、受容体分子結合試薬(1)は受容体分子(4)から解離する(図1には示していない)。結果として、標的細胞(3)は、単離に使用した試薬を一切含まずに、固定相(5)から放出されてくる。リガンドLが、遷移金属が錯化しているキレート基であり、リガンド結合パートナーLBがオリゴヒスチジンタグである例では、リガンドLとリガンド結合パートナーLBとの間の結合を、EDTAまたはEGTAなどの金属キレーターによって破壊しうる。この例は、競合試薬が競合剤そのものである必要はなく、リガンド結合パートナーLBとリガンドLとの間または結合パートナーCと多量体化試薬の結合部位Zとの間のいずれかに形成された結合を破壊できる任意の化合物であることができることを示している。多量体化試薬(2)がストレプトアビジンムテインであり、結合パートナーCがストレプトアビジン結合ペプチドである、図1のこの例では、各競合試薬(12)は、ストレプトアビジンのビオチン結合部位に結合する任意の化合物、例えば遊離のストレプトアビジン結合ペプチド、またはビオチンもしくはビオチン誘導体、例えばイミノビオチンまたはデスチオビオチンでありうる。同様に、競合試薬はpHのシフトであることもできる。というのも、ストレプトアビジンへのストレプトアビジン結合ペプチドの結合は、pH4などの低pHによって破壊することができるからである。加えて、ここで、図1に示すように固形支持体上に固定化された標的細胞(3)の溶出/単離には、リガンド結合パートナーLBとリガンドLとの間の結合を破壊する必要はないことに注意されたい。むしろ、固形支持体から標的細胞を放出するには、多量体化試薬の結合部位Zへの受容体分子結合試薬(1)の結合パートナーCの結合を破壊すれば十分である。したがって、これに関連して、リガンド結合パートナーLBとリガンドLとの間に形成される結合は可逆的である必要さえなく、不可逆的であることもでき、標的細胞(3)が受容体分子結合試薬(1)の結合パートナーCと多量体化試薬の結合部位Zとの間に形成された可逆的結合を介して結合している多量体化試薬(2)の固定化に役立つことしかできなくてもよいことに注意されたい。ただし、リガンド結合パートナーLBとリガンドLとの間に形成される結合も可逆的であれば、有利でありうる。というのも、それにより、固相の再生が可能になるからである。これに関連して、リガンド結合パートナーLBは多量体化試薬(2)に含まれるのではなく受容体分子結合試薬(1)に含まれていてもよいことにも注意されたい。多量体化試薬がストレプトアビジンムテインであり、かつリガンドLがそこに遷移金属が錯化していて、オリゴヒスチジンペプチドに結合する能力を有するキレート基である、図1のこの具体例において、受容体分子結合試薬は、その2つのポリペプチド鎖の一方(例えば重鎖)のC末端に結合パートナーCとしてストレプトアビジン結合ペプチドを持ち(上記参照)、かつ他方のポリペプチド鎖(例えば軽鎖)のC末端にリガンド結合LBとしてヘキサヒスチジンタグを持つ、Fabフラグメントなどの抗体フラグメントでありうる。ヘキサヒスチジンタグが立体的にアクセス可能であることを確実にするために、Fabフラグメントの軽鎖は、定常ドメインのC末端とヘキサヒスチジンタグとの間に「延長部分(extender)」として、人工的リンカーを有してもよいだろう。これに関連して、前記2つの結合の破壊、すなわち多量体試薬(2)と受容体分子結合試薬(1)の結合パートナーCとの間の結合および固相のリガンドLと多量体化試薬のリガンド結合パートナーLBとの間の結合の破壊は、競合試薬としてビオチンとEDTAの両方を含有する緩衝液の添加によって、都合よく同時に達成できることにも注意されたい。ビオチンは結合パートナーC(ストレプトアビジン結合ペプチド)を多量体化試薬から解離させ、金属キレーターとしてのEDTAは、リガンドLへのヘキサヒスチジンタグの結合を媒介する金属イオンを錯化することによってヘキサヒスチジンタグを放出させ、よって受容体分子結合試薬を固相から放出させるであろう。
(図2)標的細胞表面上に受容体分子(4)を有する標的細胞(3)を単離する方法のさらなる一態様を表す。受容体分子(4)に特異的に結合することができる結合部位(B)を有する受容体分子結合試薬(1)を用意する。受容体分子結合試薬(1)は、可溶性多量体化試薬(2)の結合部位(Z)に可逆的に結合することができる結合パートナー(C)も含んでいる。多量体化試薬(2)は、受容体結合試薬(1)に含まれる結合パートナー(C)に特異的に結合する複数の結合部位(Z)を有する。標的細胞(3)に結合することができる多価結合複合体が形成される。多量体化試薬(2)の結合部位(Z)は、固相に含まれるリガンド(L)に結合する能力を有するリガンド結合パートナー(LB)も規定する。したがって、図2の例では、リガンド結合パートナーLBは結合部位Zと同一である。標的細胞(3)を含む試料を多価結合複合体と接触させると、標的細胞(3)が前記結合複合体に結合する。リガンド結合パートナー(LB)をも規定する結合部位(Z)に結合することができるリガンド(L)を含む、クロマトグラフィー用の固定相またはビーズなどの固相(5)を用意する。結果として、多量体化試薬(2)上の遊離の結合部位(Z)はリガンド(L)に結合し、それにより、標的細胞/多価結合複合体の一部として標的細胞を固定相(5)上に固定化する。これにより、試料からは標的細胞(3)が枯渇し、標的細胞(3)は試料の他の構成要素から分離される。
図2に図解する本発明の方法の例において、受容体分子結合試薬(1)は、ここでも、受容体分子(4)に対してその結合部位(B)が低アフィニティー結合を呈するFabフラグメントなどの抗体フラグメントでありうる。受容体分子結合試薬の結合パートナーCはストレプトアビジン結合ペプチドでありうる。例えば結合パートナーCは、Junttila et al., Proteomics 5(2005), 1199-1203または米国特許第7,981,632号に記載の、配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:3、「Strep-tag(登録商標)」)、配列
(SEQ ID NO:11、「di-tag3」としても知られている)、または配列
(SEQ ID NO:12、「di-tag2」としても知られている)のストレプトアビジン結合ペプチドであることができる。CD3、CD4、CD8(T細胞マーカー)、CD8、CD62L、CD45RA(メモリーT細胞のマーカー)、CD4、CD25、CD45RA(調節性T細胞のマーカー)、CD56(ナチュラルキラー細胞のマーカー)、CD19(B細胞マーカー)およびCD34(幹細胞マーカー)などの細胞表面受容体に結合するような組換えFabフラグメントは、例えば「Streptamer(登録商標)」試薬として、IBA GmbH(ドイツ・ゲッチンゲン)から市販されており、したがって、本発明の方法を使ってそれぞれの細胞を単離するための受容体結合分子として使用することができる。ここで言及するストレプトアビジン結合ペプチドはいずれも、同じ結合部位、すなわちストレプトアビジンのビオチン結合部位に結合する。そのようなストレプトアビジン結合ペプチドの1種または複数種を結合パートナーCとして使用するなら、多量体化試薬(2)は、野生型ストレプトアビジンの配列位置44〜47にアミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:19)を含むストレプトアビジンムテイン「m1」、または野生型ストレプトアビジンの配列位置44〜47にアミノ酸配列Ile44-Gly45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:20)を含むストレプトアビジンムテイン(類似体)「m2」などといった、ストレプトアビジンムテインである。典型的には可溶性の多量体化試薬(2)が使用される。ストレプトアビジンムテインの場合、この可溶性多量体化試薬は、例えば、ストレプトアビジンもしくはアビジンまたはストレプトアビジンもしくはアビジンの任意のムテイン(類似体)のオリゴマーまたはポリマーでありうる。そのような多量体化試薬は、例えば、IBA GmbH(ドイツ・ゲッチンゲン)から「Strep-Tactin(登録商標)PE for Fab Streptamers」(カタログ番号6-5001-010または6-5011-010)として市販されている。これらのオリゴマーはストレプトアビジン、アビジンまたはそれらのムテインの四量体を3つまたはそれ以上含みうる。これらのオリゴマーまたはポリマーは多糖によって架橋されていてもよい。ストレプトアビジンもしくはアビジンまたはストレプトアビジンもしくはアビジンのムテインのそのようなオリゴマーまたはポリマーは、第1工程として、本質的にNoguchi, A., Takahashi, T., Yamaguchi, T., Kitamura, K., Takakura, Y., Hashida, M. & Sezaki, H.(1992)「Preparation and properties of the immunoconjugate composed of anti-human colon cancer monoclonal antibody and mitomycin C dextran conjugate」Bioconjugate Chemistry 3, 132-137に記載されているように、多糖、例えばデキストランにカルボキシル残基を導入することによって、調製することができる。第2工程では、ストレプトアビジンもしくはアビジンまたはそれらのムテインを、内部リジン残基および/または遊離N末端の1級アミノ基を介して、デキストラン主鎖中のカルボキシル基に、従来のカルボジイミドケミストリーを使ってカップリングする。あるいは、グルタルジアルデヒド(glutardialdehyde)などの二官能性リンカーで架橋することによって、または文献記載の他の方法によって、ストレプトアビジンもしくはアビジンまたはストレプトアビジンもしくはアビジンの任意のムテインの適切な架橋オリゴマーまたはポリマーを得てもよい。「クリックケミストリー」によって、例えば、アジドと末端アルキン基との間の1,3-双極子付加環化反応によって、ストレプトアビジンのオリゴマーまたはポリマーを得ることも可能である。この目的のために、アジド基とアルキン基をそれぞれ、アジドスクシンイミジルエステル(Life Technologiesから入手可能、カタログ番号A10280)およびアルキンスクシンイミジルエステル(Life Technologiesから入手可能、カタログ番号A10279)などといった市販の試薬によって、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン中に導入することができる。次に、アジド基を持つストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインを、通常は化学量論的モル量の、アルキン基を持つストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインと反応させることで、オリゴマー状(すなわち3つ以上の個別ストレプトアビジン四量体)またはポリマー状の多量体化試薬を得る。
図2の例において、固相のリガンドLは、例えば、固相に共有結合で取り付けられたビオチンであることができる。固相のビオチンは多量体化試薬(2)の遊離結合部位(Z)に結合し、それによって、標的細胞を、標的細胞/多価結合複合体の一部として固相(5)上に固定化する。そのような固相は、例えば、Affiland S.A.(ベルギー・アンス-リエージェ(Ans-Liege))から入手できる(d)-ビオチンSepharose(商標)、IBA GmbH(ドイツ・ゲッチンゲン)から入手できるビオチン-アガロース、または本明細書の実験項に記載する実験プロトコールを使って得られるビオチンが共有結合されたSuperflow(登録商標)アガロースでありうる。この例において、固相のリガンドLは、もう1つの選択肢として、デスチオビオチン、イミノビオチン、2-(4'-ヒドロキシアゾベンゼン)安息香酸(HABA)またはストレプトアビジン結合ペプチドなどといった、ビオチンの誘導体であってもよい。
次に、固定相(5)を競合試薬(7)と接触させる。競合試薬(7)はそれ自体が(全体として)多量体化試薬(2)の結合部位(Z)に結合できるものであってよい。あるいは、競合試薬(7)は、受容体分子結合試薬(1)の結合部位(C)に結合する結合部位(8)を有しうる。多量体化試薬(2)への競合試薬(7)の競合的結合により、競合試薬は、受容体分子結合試薬(1)の結合部位Cと多量体化試薬(2)の結合部位(Z)との間の結合を、例えば解離によって、破壊する。上に説明したように、固相のリガンドLも、多量体化試薬(2)の結合部位(Z)に結合する。したがって競合試薬は、結合しているリガンドLも、多量体化試薬(2)から解離させる。そうすることにより、多量体化試薬(2)は、固相(5)から放出されていく。標的細胞(3)は多量体化した受容体分子結合試薬(1)に結合していたので、標的細胞(3)も、固相(固定相)(5)から放出されていき、例えば、固定相(5)をクロマトグラフィーマトリックスとするカラムから溶出する。図2のこの例では、競合試薬(7)は、多量体化試薬(2)の結合部位(Z)に「全体として」結合するビオチンであってもよいだろう。この場合、遊離のビオチンは、多量体化試薬(2)において、固相(5)に共有結合でカップリングされているビオチンを(競合的に)解離させることになり、受容体分子結合試薬として作用しかつストレプトアビジン結合ペプチドを持つFabフラグメントと共に、リガンドLとして作用する。したがって、固相(5)がクロマトグラフィー材料である場合、固定化標的細胞(3)を遊離のビオチンと接触させた後に、結果として得られる溶出液は、単離された標的細胞(3)、遊離の受容体分子結合試薬(1)、(可溶性)ストレプトアビジン多量体化試薬(2)ならびに遊離のビオチンを含有する。このように、この単離混合物は、国際特許出願WO 2013/124474に記載の「選択カートリッジ(selection cartridge)」の溶出液と同じ試薬を含有する。これは、もし固相(5)がクロマトグラフィー用の固定相(5)であるなら、本発明の方法は、国際特許出願WO 2013/124474の「選択カートリッジ」で実施される標的細胞の単離方法に取って代わることができることを意味している。したがって、本発明の方法は、それをカラムクロマトグラフィーに実装した場合には、国際特許出願WO 2013/124474の「選択カートリッジ」に取って代わることができる。加えて、そのようなクロマトグラフィーカラムの溶出液の試薬は、国際特許出願WO 2013/124474に記載の「除去カートリッジ(removal cartridge)」によって除去することができる。これに関連して、ビオチン-Sepharose(商標)などの固相は、滅菌された形態で入手できることに注意されたい。したがって、滅菌ビオチン-Sepharose(商標)含有カートリッジを使用することにより、本発明の方法は、GMP条件下で細胞を単離するための自動化閉鎖系に容易に実装することができる。したがって、本発明は、細胞ベースの治療法のためのT細胞またはB細胞などといった関心対象の標的細胞を得るための、簡単でしかもエレガントなアプローチを提供する。これに関連して、本発明には、同じ(標準化された)多量体化試薬を、所望する任意の細胞タイプの単離に使用することができるという、追加の利点があることにも注意されたい。本多量体化試薬は同じ固相(例えばビオチン-Sepharose(商標))と一緒に使用することができるので、a)固相上での固定化のために十分な遊離結合部位Zとb)受容体分子結合試薬の多価複合体を形成するために同じ所定の(過剰な)数の遊離結合部位Zとを提供するオリゴマー状ストレプトアビジンムテインなどといった同じ多量体化試薬を、常に使用することが可能である。したがって本発明は、ある特定細胞タイプの単離に使用される特異的受容体分子結合試薬とは無関係に、多価結合複合体の形成のために十分な数の結合部位Zが確実に提供されるようにすることを可能にする。加えて、固相上での細胞の固定化に先だって標的細胞が多量体化試薬および受容体分子結合試薬と共にインキュベートされることは、本発明の方法のさらなる利点である。結合した細胞を含有する多価複合体を形成させるためのこのインキュベーションは、a)所定の小体積において行うことができ、それによって形成される複合体の濃度が増加し、かつb)ここでも単離しようとする細胞タイプとは無関係に、所定の時間内に行うことができる。したがって本発明により、標的細胞の性質に依存することなく、標的細胞の単離を標準化することが可能になる。
(図3)受容体分子結合試薬(1)が2つ以上の試薬またはサブユニットから形成される、標的細胞を分離/単離する方法の一態様を示す。アダプター試薬(9)と受容体分子結合プレ試薬(pre-reagent)(100)とを互いに接触させていく。受容体分子結合プレ試薬(100)は、アダプター試薬(9)に含まれる結合部分(10)のための結合部位(11)を有する。アダプター試薬(9)と受容体結合プレ試薬(100)は結合部位(11)および結合部分(10)を介して互いに結合する。こうして形成された受容体結合試薬(1)は結合部位(B)を有し、これは、受容体結合プレ試薬(100)に含まれていたものでありうる。受容体結合試薬(1)は、多量体化試薬(2)の結合部位(Z)に特異的かつ可逆的に結合することができる結合パートナー(C)も含む。結合パートナー(C)は、アダプター試薬(9)に含まれていたものでありうる。後は、図1に表したように、本方法を行いうる。結合パートナー(C)に結合する能力を有する複数の結合部位(Z)を含有する多量体化試薬(2)を加えうる。多量体化試薬(2)は、リガンド(L)に特異的に結合する能力を有するリガンド結合パートナー(LB)も含む。受容体分子結合試薬(1)は、結合パートナー(C)を介して、多量体化試薬(2)上の結合部位(Z)に結合する。標的細胞(3)に結合することができる多価結合複合体が形成される。標的細胞(3)を含有する試料をこの多価結合複合体と接触させると、標的細胞(3)は多価結合複合体に結合する。リガンド結合パートナー(LB)が結合するリガンド(L)を含有する固定相(5)を用意する。結果として、標的細胞/多価結合複合体が、固定相(5)上に固定化されていく。リガンド(L)に特異的に結合する競合試薬(6)を加える。これにより、リガンド(L)とリガンド結合パートナー(LB)との間の結合が破壊され、標的細胞/多価結合複合体は固定相(5)から放出されていく。
(図4)受容体分子結合試薬が、例えば図2の例で言及したストレプトアビジン結合ペプチドを持つFabフラグメント(111)である、標的細胞を分離/単離する方法の一態様をさらに図解している。Fab分子は、標的細胞表面上の受容体分子、例えばT細胞上に存在するCD3またはCD8などの細胞表面受容体に結合する。多量体化試薬は多量体型ストレプトアビジンムテイン(12)、例えば野生型ストレプトアビジンの配列位置44〜47にアミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:19)を含むストレプトアビジンムテイン「m1」のオリゴマー、または野生型ストレプトアビジンの配列位置44〜47にアミノ酸配列Ile44-Gly45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:20)を含むストレプトアビジンムテイン「m2」のオリゴマーである。このオリゴマーは、複数のストレプトアビジンムテイン分子を化学的にカップリングすることによって形成されうる。この多量体型ストレプトアビジンムテイン(12)は、Fabフラグメント(111)のストレプトアビジン結合ペプチドに対して、複数の結合部位Zを含有する。多量体型ストレプトアビジンムテイン(12)は、Ni Sepharose(商標)、NTA-アガロース、His60 Ni、HisPur樹脂またはTALON樹脂など(ここに挙げたものは市販されている固相の一部でしかない)の金属アフィニティーマトリックスに結合することができる6×Hisタグも含有する。ストレプトアビジン結合ペプチドを持つFabフラグメント(111)、多量体型ストレプトアビジンムテイン(12)および標的細胞表面上に受容体分子を有する標的細胞を接触させていると、標的細胞/多価結合複合体が形成される。この標的細胞/多価結合複合体を、固定化金属イオンを含む固定相と接触させると、複合体が、そしてそれによって標的細胞が、固定相上に固定化されていく。次に、例えばビオチンおよびEDTAまたはイミダゾールを加えることによって、標的細胞を溶出させることができる。
(図5)オリゴヒスチジンタグに結合することができる多量体化試薬のアセンブリを可能にする適切な部分を表す。図5A〜図5Dに示す部分は、Schmidt, J. et al., J. Biol. Chem. [2011]286, 48, 41723-41735から採用したものである。これらの化合物はビオチンと、オリゴヒスチジンタグに結合する能力を有する複数のニトリロ三酢酸(NTA)部分とを含有する。多量体化剤は、これらの試薬のいずれかをストレプトアビジンと反応させることによって得られる。ストレプトアビジンはホモ四量体であり、したがってビオチンに対する結合部位を4つ提供し、ビオチンはストレプトアビジンに不可逆的に結合するので、これらのビオチン化化合物の反応は複数(4〜16個)のキレート基Kを持つ試薬を生成させ、ここでは、各キレート基KがNi2+またはCo2+などの遷移金属イオンに結合する能力を有することにより、オリゴヒスチジンペプチドに結合する能力を多量体化試薬に与える。したがって、図5中の部分のキレート基をそのような遷移金属と錯化させると、多量体化試薬は、オリゴヒスチジンタグを持つ受容体分子結合試薬との多価複合体を形成することができる。Schmidtら(2011、前記)が記載しているように、受容体分子結合試薬は、例えば、オリゴヒスチジンタグがN末端に融合している可溶性主要組織適合遺伝子複合体(MHC)ペプチドでありうる。単なる一具体例として、そのようなMHCペプチドは、Schmidtら(2011、前記)が記述しているように、His-6タグ、His-12タグまたは2_His-6タグを含有するHLA-A0201ペプチドでありうる。そのような受容体結合試薬は「Histamer」とも呼ばれ、TC Metrix SA(スイス・エパランジュ)から、多量体型ニトリロ三酢酸(NTA)部分を結合部位Zとして使用する本明細書に記載の多量体化試薬と共に市販されている。
(図6)末梢血からCD4+細胞を濃縮するための実験の結果を示す。多量体型Strep-Tactin(登録商標)を多量体化試薬として使用し、ストレプトアビジン結合ペプチドを持つ抗CD4 Fabフラグメントを受容体分子結合試薬として使用した。ヒト血液からのCD4+白血球を例示的な標的細胞とした。固定相はビオチンをリガンドLとして含有した。蛍光活性化細胞選別法(FACS)を使って、細胞をフローサイトメトリー分析によって特徴づけた。図6Aは、全細胞のプロット(Accuri C6フローサイトメーター)を表す(ゲーティングなし)。細胞をCD3-PEおよびCD4-APCで染色した。図6Bは全細胞のプロット(ゲートP1)を表す。細胞をCD3-PEおよびCD4-APCで染色した。図6Cは全細胞のプロット(ゲートP1)を表す。細胞を染色しなかった。図6Dは、フラクションD+Wの細胞のプロット(ゲートP1)を表す。細胞をCD3-PEおよびCD4-APCで染色した。図6EはフラクションEのプロット(ゲートP1)を表す。細胞をCD3-PEおよびCD4-APCで染色した。図6FはフラクションRの細胞のプロット(ゲートP1)を表す。細胞をCD3-PEおよびCD4-APCで染色した。
(図7)図6に表したFACS分析の結果を要約した表を示す。全細胞の分析により、ゲーティングされたリンパ球の集団内で39.56%のCD4+細胞濃度が明らかになった。フロースルーフラクションおよび洗浄液フラクション中の細胞は、4.01%というCD4+細胞濃度まで枯渇する。ビオチンによる溶出により、95.04%というCD4+細胞の純度が明らかになった。カラム樹脂のピペット処理後に、物理的に溶出させた細胞は依然として88.26%の純度を示した。
(図8)実施例において行われる細胞精製カラムの例示的な組み立てを示す。市販のスピンカラムの下端を切除する(図8A)。次にカラムの上部を、メンブレンを含む市販遠心管の適切なキャップに挿入する(図8B)。上部カラム部分を持つキャップを、付属チューブ上に置く(図8C)。
(図9)国際特許出願WO 2013/124474に記載されているようにピペットチップをカラムとして使用するクロマトグラフィー精製(実施例10.1)、または細胞をCD8結合Fabフラグメントおよびビオチン化固相と共にプレインキュベートする本発明の方法の一態様を使用するクロマトグラフィー精製(実施例10.2)のどちらか一方によって、末梢血単核球(PBMC)の調製物からCD8+細胞を単離するための比較実験の結果を示す。図9Aは、国際特許出願WO 2013/124474に記載されている単離における、標的細胞を選択(単離)する前の初期PBMC調製物の、ウォッシュスルー(wash through)フラクションの、および溶出フラクション(CD8+細胞陽性フラクション)の、蛍光活性化細胞選別法(FACS)を使ったフローサイトメトリー分析のAccuri C6プロットを示し、一方、図9Bは、本発明の方法の一態様を使った単離における、標的細胞を選択(単離)する前の初期PBMC調製物の、ウォッシュスルーフラクションの、および溶出フラクション(CD8+細胞陽性フラクション)の、FACS分析のAccuri C6プロットを示す。図9Cは、単離されたCD8+細胞の収率および純度を両方法について比較した、棒グラフを示す。図9Cにおいて、0015という数字は国際特許出願WO 2013/124474による方法の結果を表し、一方、0016という数字は本発明の方法のこの態様の結果を表す。図9Cにおいて%で示す収率および純度に関する数値は、3回の独立した実験の平均値である。
(図10)国際特許出願WO 2013/124474に記載されているようにピペットチップをカラムとして使用するクロマトグラフィー精製、または細胞をCD3結合Fabフラグメントおよびビオチン化固相と共にプレインキュベートする本発明の方法の一態様を使用するクロマトグラフィー精製のどちらか一方によって、末梢血単核球(PBMC)の調製物からCD3+細胞を単離するための比較実験の結果を示す。図10Aは、国際特許出願WO 2013/124474に記載されている単離における、標的細胞を選択(単離)する前の初期PBMC調製物の、ウォッシュスルーフラクションの、および溶出フラクション(CD3+細胞陽性フラクション)の、蛍光活性化細胞選別法(FACS)を使ったフローサイトメトリー分析のAccuri C6プロットを示し、一方、図10Bは、本発明の方法の一態様を使った単離における、標的細胞を選択(単離)する前の初期PBMC調製物の、ウォッシュスルーフラクションの、および溶出フラクション(CD8+細胞陽性フラクション)の、FACS分析のAccuri C6プロットを示す。図10Cは、単離されたCD3+細胞の収率および純度を両方法について比較した、棒グラフを示す。図10Cにおいて、0015という数字は国際特許出願WO 2013/124474による方法の結果を表し、一方、0016という数字は本発明の方法のこの態様の結果を表す。図10Cにおいて%で示す収率および純度に関する数値は、3回の独立した実験の平均値である。
本明細書では、表面上の共通する特異的受容体分子によって規定される細胞および他の生物学的実体、例えば細胞小器官、ウイルス、リポソームまたはプリオンなどを、一般的には(バッチ方式または連続方式で行うことができる)流体クロマトグラフィーによって、単離または分離するための方法を提供する。以下で使用する「標的細胞」という用語は、一般に、そのような生物学的実体(細胞、細胞小器官、ウイルス、リポソームまたはプリオン)のすべてを指す。
a)-Trp-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa-(SEQ ID NO:1)、配列中、Xaaは任意のアミノ酸であり、YaaおよびZaaはどちらもGlyであるか、または、YaaがGluであり、かつZaaがLysもしくはArgである、
b)-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly-(SEQ ID NO:2)、
c)-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(SEQ ID NO:3)、
d)少なくとも2つのストレプトアビジン結合ペプチドの連続的構成、ここで、各ペプチドはストレプトアビジンに結合し、2つのペプチド間の距離は少なくとも0であり、かつ50アミノ酸を上回らず、前記少なくとも2つのペプチドのそれぞれはアミノ酸配列-His-Pro-Baa-を含み、配列中のBaaはグルタミン、アスパラギンおよびメチオニンからなる群より選択される、
e)前記少なくとも2つのペプチドの1つが配列-His-Pro-Gln-を含む、d)で述べた連続的構成、
f)前記ペプチドの1つがアミノ酸配列-His-Pro-Gln-Phe-(SEQ ID NO:4)を含む、d)で述べた連続的構成、
g)少なくとも1つのペプチドが少なくともアミノ配列-Oaa-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa-(SEQ ID NO:5)を含み、配列中、OaaはTrp、LysまたはArgであり、Xaaは任意のアミノ酸であり、かつYaaおよびZaaはどちらもGlyであるか、または、YaaがGluであり、かつZaaがLysもしくはArgである、d)で述べた連続的構成、
h)少なくとも1つのペプチドが少なくともアミノ酸配列-Trp-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa-(SEQ ID NO:6)を含み、配列中、Xaaは任意のアミノ酸であり、YaaおよびZaaはどちらもGlyであるか、YaaがGluであり、かつZaaがLysまたはArgである、d)で述べた連続的構成、
i)少なくとも1つのペプチドが少なくともアミノ酸配列-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(SEQ ID NO:7)を含む、d)で述べた連続的構成、
j)アミノ酸配列-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Xaa)n-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(SEQ ID NO:8)、配列中、Xaaは任意のアミノ酸であり、nは0〜12の整数である、
k)
からなる群より選択されるアミノ酸配列。これらの場合、多量体化試薬は、ストレプトアビジンムテイン(類似体)Val44-Thr45-Ala46-Arg47またはストレプトアビジンムテイン(類似体)Ile44-Gly45-Ala46-Arg47を含みうる。これらはどちらも例えば米国特許第6,103,493号に記載されており、Strep-Tactin(登録商標)という商標で市販されている。このような多量体型ストレプトアビジンムテインは多量体化したStrep-Tactinと呼ばれる場合もある。
- リガンド結合パートナーLBとしてのストレプトアビジンまたはストレプトアビジン類似体、およびストレプトアビジンに結合するリガンドL(分子)、
- 二価カチオンの存在下で結合する結合ペア、
- リガンドLとしてのオリゴヒスチジンペプチド、およびリガンド結合パートナーLBとしての少なくとも2つのキレート基Kを含む結合部分A、ここで、各キレート基は遷移金属イオンに結合する能力を有し、それによってオリゴヒスチジンペプチドに結合する能力を部分Aに与える、
- 抗原、および該抗原に対する抗体、ここで、リガンドLは前記抗原を含み、かつリガンド結合パートナーLBは該抗原に対する前記抗体を含む、
- リガンド結合パートナーLBとしてのグルタチオン-S-トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質(MBP)、キチン結合ドメイン、およびセルロース結合ドメインの群から選択されるタンパク質、ならびにリガンドLとしての、それぞれグルタチオン、マルトース、キチン、またはセルロース、
- リガンド結合パートナーLBとしての抗体Fcドメイン、およびリガンドLとしての免疫グロブリン結合タンパク質、例えばプロテインA、プロテインGまたはプロテインL。
- リガンドLを含む固相であって、リガンドLは、標的細胞を単離するために使用される受容体分子結合試薬または多量体化試薬中に存在するリガンド結合パートナーLBに特異的に結合する能力を有し、リガンドLはそれによって、固相上での標的細胞の可逆的固定化を可能にする、固相、
- a)細胞分離に適した第1固定相であって、ゲル濾過マトリックスおよび/またはアフィニティークロマトグラフィーマトリックスであり、前記マトリックスが、受容体分子結合試薬に含まれる結合パートナーCに特異的に結合する結合部位Zを有するアフィニティー試薬を含み、それによって、第1固定相上での受容体分子結合試薬の固定化と、標的細胞を含む溶出液からの受容体分子結合試薬の除去とを可能にする、第1固定相、
または
b)リガンドLを含む第2固定相であって、リガンドLは、標的細胞を単離するために使用される受容体分子結合試薬または多量体化試薬中に存在するリガンド結合パートナーLBに特異的に結合する能力を有し、リガンドLはそれによって、第2固定相上での受容体分子結合試薬または多量体化試薬の固定化と、標的細胞を含む溶出液からの受容体分子結合試薬または多量体化試薬の除去とを可能にする、第2固定相
のうちの少なくとも1つ
を含む。
実施例1:「細胞精製カラム」の構築
Bio-Spin(登録商標)カラム(BioRad;カタログ番号732-6008)の下側の排出口をカラムの上端から約45mmの位置で切り取る(図8A)。残りの上側カラム体を「遠心試験管(Centrifuge and Test Tube)」(Becton-Dickinson;製品番号352235)の濾過管キャップに差し込む(図8B参照)。このキャップは、Superflow(商標)樹脂を保持する能力を有する35μmナイロンメッシュを備えている。このカラム付きキャップを12×75mmの5mlポリスチレン丸底試験管上に戻す(図8A)。このカラムはSuperflow樹脂を充填する準備ができている。
当技術分野において公知の標準的手順に従って、ビオシチン(Sigma-Aldrich、カタログ番号B4261)をSuperflow(登録商標)6(Sterogene、カタログ番号806)にカップリングした。簡単に述べると、Superflow樹脂を洗浄し、1M NaCO3に再懸濁した。アセトニトリル(10ml/ml);臭化シアン(0.2g/ml)を使って活性化を行った。樹脂を1M NaCO3、pH9.5および1M HClで洗浄した。ビオチン-Superflowを得るために、0.1Mホウ酸;0.5M NaSO4中で、ビオシチンをSuperflow樹脂にカップリングした(0.38mg/ml)。その結果得られたビオチン-Superflow樹脂を50mMトリス、pH8.0で洗浄した。
この実施例では、Amersham-Biosciences Ficoll-Paque(登録商標)Plusを、製造者のプロトコールに従って使用した(6×500ml #17-1440-03)。簡単に述べると、シリンジを使って、必要量のFicoll(希釈抗凝固処理血液試料4mlに対して3ml)を無菌的に取り出した。Ficoll-Paque Plus(3ml)を遠心管に加えた。Ficoll-Paque(登録商標)Plusの上に希釈血液試料(4ml)を注意深く重層した。遠心分離を室温(20℃)、400×gで、20分行った。界面のリンパ球層を乱さないようにして、きれいなパスツールピペットで上層を取り除いた。きれいなパスツールピペットを使って、リンパ球層をきれいな遠心管に撮した。3体積またはそれ以上の平衡塩類溶液を試験管中のリンパ球に加えた。パスツールピペットに静かに出し入れすることにより、リンパ球を懸濁した。18〜20℃、10〜100×gで、10分間、遠心分離を行い、次に上清を除去した。
当技術分野において使用されている標準的プロトコールに従ってヒトバフィーコートの細胞を調製した。100μlの多量体化した可溶性Strep-Tactin(濃度1.7mg/ml、「Strep-tactin(登録商標)PE for Fab streptamer」として入手可能、カタログ番号6-5001-010、IBA GmbH(ドイツ・ゲッチンゲン)-ここで、ストレプトアビジンムテインのフィコエリトリン(PE)蛍光ラベルは、本発明の方法に干渉しないので試薬中に残っているが、これらの実験では使用されないことに注意されたい)を900μlの緩衝液IS(リン酸緩衝食塩水(PBS)pH7.4中、0.5%BSA(w/v)、PBS=8.06mM Na2HPO4、1.47mM KH2PO4、137mM NaCl)と混合することで、170μg/mlの1:10希釈液を得た。6μgの希釈された多量体化したStrep-Tactin(35.3μl)を、ストレプトアビジン結合ペプチド(
Twin-Strep-tag(登録商標)としても知られている)をその重鎖に保持する4μgのCD4結合Fabフラグメント(250μg/mlを16μl、例えばCD4 Fab Streptamer単離キット、カタログ番号6-8000-206、IBA GmbH(ドイツ・ゲッチンゲン)の一部として入手可能)および74μlの緩衝液ISと混合して最終濃度を125μlとし、15ml管中、4℃で45分インキュベートした。このインキュベーション中に、Fabフラグメントは、それらのストレプトアビジン結合ペプチドを介して、(多量体化試薬として役立つ)多量体化したStrep-tactinに結合することになる。
「細胞精製カラム」を実施例1の説明に従って組み立てた。カラムにベッド体積1mlのビオチン-Superflow(0.38mg/mlビオシチン)(実施例2参照)を充填した。実施例3で述べたように末梢血単球(PBMC)をバフィーコートから単離した。
図7に結果の概要を示す。
・全細胞のFACS分析により、ゲーティングされたリンパ球の集団内に濃度39.56%のCD4+細胞が明らかになった。
・フロースルーおよび洗浄液フラクション中の細胞は、濃度4.01%まで、CD4+細胞が枯渇していた。
・ビオチンによる溶出により、純度95.04%のCD4+細胞が明らかになった。
・カラム樹脂のピペット処理後に、物理的に溶出させた細胞は、依然として、88.26%の純度を示した。
確立された手順に従ってヒトバフィーコートの細胞を調製する。Strep-Tactinとグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質を標準的手順に従って生成させる。GST Spin Trapカラム(GE Healthcare Biosciences、スウェーデン国ウプサラ)を使用し、製造者の説明書に従って、前記融合タンパク質をアフィニティー精製する。「Controlled Protein-Protein Crosslinking Kit」(Thermo Fisher Scientific Inc、米国マサチューセッツ州ウォルサム、製品番号23456)を使用し、製造者の説明書に従って、GSTタグ付きStrep-Tactinを多量体化する。125μlの多量体化したGSTタグ付きStrep-Tactin(2.0mg/ml)を875μlのリン酸緩衝食塩水pH7.3と混合することで、250μg/mlの1:8希釈液を得る。6μgの希釈された多量体化したGST-Strep-Tactin(35.3μl)を、ストレプトアビジン結合ペプチドを保持する4μgのFabフラグメントと共にインキュベートし、次に、細胞を再懸濁するためにリン酸緩衝食塩水pH7.3を使って、実施例4で述べたように細胞に加える。
確立された手順に従ってヒトバフィーコートの細胞を調製する。6×Hisタグ付きCD4結合Fabフラグメントを標準的手順に従って生成させる。Ni-NTAスピンカラム(Qiagen、米国カリフォルニア州バレンシア)を使用し、製造者の説明書に従って、前記融合タンパク質をアフィニティー精製する。ビオチンと複数のニトリロ三酢酸(NTA)部分とのコンジュゲートをSchmidtら(前記, 2011)が記載したように合成する。そのビオチン/NTAコンジュゲートを1mg/ml NiCl2を含有するリン酸緩衝食塩水pH7.3に約0.1μg/mlの濃度で溶解し、ストレプトアビジンと接触させることで、リガンド結合パートナーLBとして作用することができるストレプトアビジンの遊離ビオチン部位を保った状態で、多量体型NTA部分を形成させる。88μlの多量体化したビオチン/Ni-NTAストレプトアビジンコンジュゲートを4μgの6×Hisタグ付きCD4-Fab(250μg/mlを16μl)および21μlの緩衝液ISと混合して最終体積を125μlとし、15ml管中、4℃で1時間インキュベートする。細胞を再懸濁するのにリン酸緩衝食塩水pH7.3を使用して、実施例4で述べたように、1×107細胞を100μlの体積で加え、多量体化したCD4-Fab/ビオチン/Ni-NTAと共に、氷上で20分インキュベートする。
確立された手順に従ってヒトバフィーコートの細胞を調製する。ストレプトアビジン結合ペプチドを保持するCD4結合Fabフラグメントを実施例4および実施例5の場合と同じように使用する。FLAGタグ(DYKDDDDK)を持つStrep-Tactinを標準的な手順に従って生成させる。抗FLAG(登録商標)M2磁気ビーズ(Sigma-Aldrich)を使用し、製造者の説明書に従って、前記融合タンパク質をアフィニティー精製する。「Controlled Protein-Protein Crosslinking Kit」(Thermo Fisher Scientific Inc、米国マサチューセッツ州ウォルサム、製品番号23456)を使用し、製造者の説明書に従って、FLAGタグ付きStrep-Tactinを多量体化する。多量体化したFLAGタグ付きStrep-Tactin、Fab-Strep、および細胞を実施例4および実施例6で述べたように混和する。
CD4結合Fabフラグメントとカルモジュリン結合ペプチド(CBP)との融合タンパク質を標準的な手順に従って生成させる。カルモジュリンアフィニティー樹脂(Agilent Technologies、米国カリフォルニア州サンタクララ)を使用し、製造者の説明書によるバッチ結合法を使って、このFabフラグメント-CBP融合タンパク質をアフィニティー精製する。多量体化試薬はオリゴマー型Strep-Tactinであり、これにビオチン化カルモジュリンを加えることで、リガンド結合パートナーLBとして作用することができる遊離ビオチン結合部位を残す化学量論で、多量体化したカルモジュリンが得られる。抗CD4 Fabフラグメント-CBP融合タンパク質を、ビオチン化カルモジュリンが固定化されているオリゴマー型Strep-Tactinと共に、緩衝液IS中、4℃で1時間インキュベートする。
この実験には、全血ユニットからのバフィーコートを使用し、室温での標準的Ficoll-Hypaque密度遠心分離を使って、末梢血単核球(PBMC)を調製した(実施例3参照)。
本質的に国際特許出願WO 2013/124474に記載されているように、ピペットチップをカラムとして使用するクロマトグラフィー精製によって、CD8+細胞をPBMC調製物から単離した。
((SEQ ID NO:13)、この配列は「Twin-Strep-tag(登録商標)」というその商標名でも知られている)を重鎖のC末端に保持する抗CD8 Fabフラグメント(以下、抗CD8 Fab-TSTと呼ぶ。これはカタログ番号:6-8003の市販品(IBA GmbH、ゲッチンゲン)に対応する)1.5μgを、ローディングした。この目的を達成するために、細胞単離に先だって、Strep-Tactin(登録商標)-アガロースを含有するピペットチップに、300μlの緩衝液IS中の1.5μgの抗CD8-Fab-TSTを、200μl/分の速度で適用した。標的細胞を単離するために、1mlの緩衝液ISに再懸濁した1×107個の新鮮調製PBMCを、300μl/分の速度を使った試料の2回の上下サイクルにより、ピペットチップ中に存在するStrep-Tactin(登録商標)-アガロースマトリックスに適用した。次に、1mlの緩衝液ISを使って2ml/分の速度で3回洗浄(緩衝液を上下にピペッティング)することにより、結合していない(CD8陰性)細胞をチップから除去した。最後に、1mlの100μM D-ビオチン溶液を使って600μl/分の流速ですすぐことによって、結合している細胞をアフィニティーマトリックスから脱離させ、次に、1mlの緩衝液ISを使って2ml/分の流速で2回フラッシングすることにより、CD8+標的細胞をチップから溶出させた。溶出したCD8陽性フラクションと、先に除去したCD8陰性フラクションとを個別に(別々の容器に)プールし、フローサイトメトリーで分析することで、収率および純度を決定した。この目的を達成するために、細胞を100μlの緩衝液ISに再懸濁し、抗ヒトCD8-PE(OKT8)抗体(BioLegend製、カタログ番号300908)および抗ヒトCD3-APC(OKT3)抗体(BioLegend製、カタログ番号317318)を使って、暗所、4℃で、20分染色した。その後、細胞を洗浄し、緩衝液ISに再懸濁した。死細胞と生細胞とを区別するためにヨウ化プロピジウム(PI)を加えた。データはフローサイトメーター(Accuri C6、BD)で取得し、C Flow Plus Analysisソフトウェア(BD)で分析した。
1μgの多量体化した可溶性Strep-Tactin(多量体化試薬として使用したカタログ番号:6-0911-000(IBA GmbH、ゲッチンゲン))を、1.5μgの抗CD8 Fab-TST(多量体化試薬に対する結合パートナーCを含有する受容体分子結合試薬になる)と共に、暗所、4℃で、45分インキュベートした。新鮮調製PBMC(30μlの緩衝液IS中に1×107細胞)をFabフラグメント/多量体化したStrep-Tactinの調製物に撮した。PMBCとFabフラグメントが負荷されている多量体化したStrep-Tactinとを含有する反応混合物を、暗所、4℃で20分インキュベートし、1mlの緩衝液ISで1回洗浄した。
国際特許出願WO 2013/124474に記載の方法(図9A)および本発明の方法(図9B)を使った代表的単離実験のAccuri C6プロットからわかるように、どちらの方法もCD8+標的細胞を単離することができる。図9Cに示す両方法の結果の比較(図9Cにおいて、0015という数字は国際特許出願WO 2013/124474の方法の結果を表し、一方、0016という数字は本発明の方法の結果を表す;%で示す数値は3回の独立した実験の平均値である)は、受容体分子結合試薬として等量の抗CD8 Fab-TSTを使用した場合に、本発明の方法を使用するとCD8+細胞が89%の収率および70%の純度で得られたが、国際特許出願WO 2013/124474の方法では、純度63%のCD8+細胞が72%の収率で得られたことを示している。これは、単離しようとする標的細胞の収率と純度がどちらも、本発明の方法によって改良されることを示している。
この実験でも、本発明の標的細胞単離方法の性能を、国際特許出願WO 2013/124474に記載のピペットチップを使用するクロマトグラフィー精製と比較した。
を、重鎖のC末端に保持していた。実施例10と比較して、Fabフラグメントの量は1.5μgから0.75μgに減らしたが、樹脂体積、多量体化した可溶性Strep-Tactinの量および細胞数は、それぞれ変化させなかった。得られたCD3陽性およびCD3陰性フラクションを、抗ヒトCD3-APC(OKT3)抗体(BioLegend製、カタログ番号317318)および抗ヒトCD4-PE(OKT4)抗体(BioLegend製、カタログ番号317410)を使って、フローサイトメトリーで分析した。
1μgの多量体化した可溶性Strep-Tactin(多量体化試薬として使用したカタログ番号:6-0911-000、IBA GmbH、ゲッチンゲン)を、1.5μgの抗CD19 Fabフラグメント(IBA GmbHからカタログ番号6-8013-100として入手することができる。このFabフラグメント(「抗CD 19 Fab-TST」)は、重鎖のC末端にTwin-Strep-tag(登録商標)を保持するので、多量体化試薬に対する結合パートナーCを含有する受容体分子結合試薬として役立つ)と共に、暗所、4℃で、45分インキュベートする。新鮮調製PBMC(30μlの緩衝液IS中に1×107細胞)をFabフラグメント/多量体化したStrep-Tactinの調製物に移す。PMBCとFabフラグメントが負荷されている多量体化したStrep-Tactinとを含有する反応混合物を、暗所、4℃で、20分インキュベートし、1mlの緩衝液ISで1回洗浄する。
Claims (70)
- 以下の工程を含む、標的細胞表面上に受容体分子を有する標的細胞を単離する方法:
- i)標的細胞表面上の受容体分子に特異的に結合する能力を有する結合部位Bと、多量体化試薬上の結合部位Zに可逆的に結合する能力を有する結合パートナーCとを含む、受容体分子結合試薬、
ii)受容体分子結合試薬に含まれる結合パートナーCに可逆的に結合する能力を有する2つ以上の結合部位Zを含み、リガンドLに特異的に結合する能力を有するリガンド結合パートナーLBをさらに含む、多量体化試薬、
および
iii)標的細胞を含む試料
を接触させ、
それによって、受容体分子結合試薬、多量体化試薬、および標的細胞が、多量体化試薬に結合した2つ以上の受容体分子結合試薬に結合している標的細胞を含む多価結合複合体を形成することを可能にする工程、および
- 標的細胞、受容体分子結合試薬、および多量体化試薬の多価結合複合体を、リガンドLを含む固相と接触させ、
それによって、リガンドLとリガンド結合パートナーLBとの間の結合による固相上での標的細胞の可逆的固定化を可能にする工程であって、固相上での標的細胞の固定化が、少なくとも受容体分子結合試薬に含まれる結合パートナーCと多量体化試薬の結合部位Zとの間の結合を破壊すると可逆的である、工程。 - 受容体分子結合試薬と多量体化試薬とを互いに接触させることで、多量体化試薬に結合した2つ以上の受容体分子結合試薬を含む複合体を形成させてから、この複合体を標的細胞と接触させる(インキュベートする)、請求項1記載の方法。
- 受容体分子結合試薬と受容体分子との間の結合に関する解離定数(Kd)が低アフィニティーである、請求項1または2記載の方法。
- 受容体分子結合試薬と受容体分子との間の結合に関する解離定数(Kd)が約10-2〜約10-10Mの範囲にある、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 受容体分子結合試薬と受容体分子との間の結合に関する解離定数(Kd)が約10-3M〜約10-10M、または約10-3M〜約10-9M、または約10-3M〜約10-8M、または約10-3M〜約10-7Mの範囲にある、請求項3記載の方法。
- 固相が、ビーズ、プラスチックプレート、またはクロマトグラフィーに適した固定相から選択される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 受容体分子結合試薬に含まれるパートナーCと多量体化試薬の結合部位Zとの間に形成される可逆的結合が、競合条件下で解離可能(破壊可能)である、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 固相を、結合パートナーCと結合部位Zとの間に形成される可逆的結合を破壊する能力を有する競合試薬と接触させ、それによって標的細胞/多価結合複合体を破壊し、固相から(溶出によって)標的細胞を放出させることを可能にする工程を含む、請求項7記載の方法。
- 多量体化試薬に含まれるリガンド結合パートナーLBと固定相上に含まれるリガンドLとの間に形成される結合が解離可能(破壊可能)である、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- リガンド結合パートナーLBとリガンドLとの間に形成される結合が、競合条件下で解離可能(破壊可能)である、請求項9記載の方法。
- 固相を、リガンド結合パートナーLBとリガンドLとの間に形成される結合を解離させる(破壊する)能力を有する競合試薬と接触させ、それによって固相から標的細胞を放出させる工程を含む、請求項10記載の方法。
- 結合パートナーCと結合部位Zとの間に形成される可逆的結合を破壊するためと、リガンド結合パートナーLBとリガンドLとの間に形成される結合を破壊するためとに、同じ競合試薬が使用される、請求項7〜11のいずれか一項記載の方法。
- 固相から放出された標的細胞を収集する工程をさらに含む、請求項5〜11のいずれか一項記載の方法。
- 受容体分子結合試薬に含まれる結合パートナーCと多量体化試薬の結合部位Zとの間の可逆的結合が、約10-5〜約10-13MのKdを有する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 結合パートナーCと結合部位Zとが、
- ストレプトアビジンまたはストレプトアビジン類似体、および、ストレプトアビジンに結合するリガンド、
- 二価カチオンの存在下で結合する結合ペア、
- オリゴヒスチジンペプチド、および、各キレート基Kが遷移金属イオンに結合する能力を有し、それによって結合部分Aにオリゴヒスチジンペプチドに結合する能力を与える、少なくとも2つのキレート基Kを含む結合部分A、
- 抗原および該抗原に対する抗体であって、結合パートナーCが該抗原を含み、かつ多量体化試薬が該抗体を含む、抗原および該抗原に対する抗体、
の群から選択される結合ペアを形成する、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。 - (a)結合パートナーCが、ビオチンを含み、かつ、多量体化試薬が、ビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジン類似体またはアビジン類似体を含むか、または
(b)結合パートナーCが、ストレプトアビジンまたはアビジンに可逆的に結合するビオチン類似体を含み、かつ、多量体化試薬が、ストレプトアビジンもしくはアビジン、または該ビオチン類似体に可逆的に結合するストレプトアビジン類似体もしくはアビジン類似体を含むか、または
(c)結合パートナーCが、ストレプトアビジン結合ペプチドまたはアビジン結合ペプチドを含み、かつ、多量体化試薬が、ストレプトアビジンもしくはアビジン、または該ストレプトアビジン結合ペプチドもしくは該アビジン結合ペプチドに可逆的に結合するストレプトアビジン類似体もしくはアビジン類似体を含む、
請求項15記載の方法。 - 多量体化試薬が、野生型ストレプトアビジンの配列位置44〜47にアミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:19)を含むストレプトアビジンムテイン、または野生型ストレプトアビジンの配列位置44〜47にアミノ酸配列Ile44-Gly45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:20)を含むストレプトアビジンムテインを含み、かつ、結合パートナーCが、以下の配列の1つを含むか、または以下の配列の1つからなるストレプトアビジン結合ペプチドを含む、請求項16記載の方法:
a)-Trp-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa-(SEQ ID NO:1)、配列中、Xaaは任意のアミノ酸であり、YaaおよびZaaはどちらもGlyであるか、または、YaaがGluであり、かつZaaがLysもしくはArgである、
b)-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly-(SEQ ID NO:2)、
c)-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(SEQ ID NO:3)、
d)少なくとも2つのストレプトアビジン結合ペプチドの連続的構成、ここで、各ペプチドはストレプトアビジンに結合し、2つのペプチド間の距離は少なくとも0であり、かつ50アミノ酸を上回らず、前記少なくとも2つのペプチドのそれぞれはアミノ酸配列-His-Pro-Baa-を含み、配列中のBaaはグルタミン、アスパラギン、およびメチオニンからなる群より選択される、
e)前記少なくとも2つのペプチドの1つが配列-His-Pro-Gln-を含む、d)で述べた連続的構成、
f)前記ペプチドの1つがアミノ酸配列-His-Pro-Gln-Phe-(SEQ ID NO:4)を含む、d)で述べた連続的構成、
g)少なくとも1つのペプチドが少なくともアミノ配列-Oaa-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa-(SEQ ID NO:5)を含み、配列中、OaaはTrp、Lys、またはArgであり、Xaaは任意のアミノ酸であり、かつ、YaaおよびZaaはどちらもGlyであるか、または、YaaがGluであり、かつZaaがLysもしくはArgである、d)で述べた連続的構成、
h)少なくとも1つのペプチドが少なくともアミノ酸配列-Trp-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa-(SEQ ID NO:6)を含み、配列中、Xaaは任意のアミノ酸であり、YaaおよびZaaはどちらもGlyであるか、YaaがGluであり、かつZaaがLysまたはArgである、d)で述べた連続的構成、
i)少なくとも1つのペプチドが少なくともアミノ酸配列-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(SEQ ID NO:7)を含む、d)で述べた連続的構成、
j)アミノ酸配列-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Xaa)n-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(SEQ ID NO:8)、配列中、Xaaは任意のアミノ酸であり、nは0〜12の整数である、
k)
からなる群より選択されるアミノ酸配列。 - 二価カチオンの存在下で結合する結合ペアに関して、
結合パートナーCがカルモジュリン結合ペプチドを含み、かつ多量体化試薬がカルモジュリンを含むか、または
結合パートナーCがFLAGペプチドを含み、かつ多量体化試薬がFLAGペプチドに結合する抗体を含むか、または
結合パートナーCがオリゴヒスチジンタグを含み、かつ多量体化試薬がキレートされた遷移金属を含む、
請求項15記載の方法。 - 二価カチオンがCa2+、Ni2+、またはCo2+からなる群より選択される、請求項18記載の方法。
- 結合パートナーCと多量体化試薬の結合部位Zとの間の結合が金属イオンキレーションによって破壊される、請求項18記載の方法。
- 金属キレーションがEDTAまたはEGTAの添加によって実行される、請求項20記載の方法。
- 結合パートナーCに含まれる抗原がエピトープタグである、請求項15記載の方法。
- 結合パートナーCに含まれる抗原がタンパク質である、請求項15記載の方法。
- タンパク質が、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質(MBP)、キチン結合タンパク質(CBP)、およびチオレドキシンの群から選択される、請求項23記載の方法。
- リガンド結合パートナーLBへのリガンドLの結合の解離定数Kdが、結合部位Zへの可逆的結合パートナーCの結合の解離定数Kdより小さい、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- リガンドLおよびリガンド結合パートナーLBが、
- リガンド結合パートナーLBとしてのストレプトアビジンまたはストレプトアビジン類似体、およびストレプトアビジンに結合するリガンドL(分子)、
- 二価カチオンの存在下で結合する結合ペア、
- リガンドLとしてのオリゴヒスチジンペプチド、および、各キレートK基が遷移金属イオンに結合する能力を有し、それによってオリゴヒスチジンペプチドに結合する能力を部分Aに与える、リガンド結合パートナーLBとしての少なくとも2つのキレート基Kを含む結合部分A、
- 抗原および該抗原に対する抗体であって、リガンドLが該抗原を含み、かつリガンド結合パートナーLBが該抗体を含む、抗原および該抗原に対する抗体、
- リガンド結合パートナーLBとしての、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質(MBP)、キチン結合ドメイン、およびセルロース結合ドメインの群から選択されるタンパク質、ならびにリガンドLとしての、それぞれグルタチオン、マルトース、キチン、またはセルロース、
- リガンド結合パートナーLBとしての抗体Fcドメイン、およびリガンドLとしての免疫グロブリン結合タンパク質、例えばプロテインA、プロテインG、またはプロテインL、
の群から選択される結合ペアを形成する、請求項9〜26のいずれか一項記載の方法。 - (a)リガンドLがビオチンを含み、かつリガンド結合パートナーLBが、ビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジン類似体またはアビジン類似体を含むか、または
(b)リガンドLが、ストレプトアビジンまたはアビジンに可逆的に結合するビオチン類似体を含み、かつリガンド結合パートナーLBが、ストレプトアビジンもしくはアビジン、または該ビオチン類似体に可逆的に結合するストレプトアビジン類似体もしくはアビジン類似体を含むか、または
(c)リガンドLがストレプトアビジン結合ペプチドまたはアビジン結合ペプチドを含み、かつリガンド結合パートナーLBが、ストレプトアビジンもしくはアビジン、または該ストレプトアビジン結合ペプチドもしくは該アビジン結合ペプチドに可逆的に結合するストレプトアビジン類似体もしくはアビジン類似体を含む、
請求項27記載の方法。 - リガンド結合パートナーLBが、野生型ストレプトアビジンの配列位置44〜47にアミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:19)を含むストレプトアビジン類似体、または野生型ストレプトアビジンの配列位置44〜47にアミノ酸配列Ile44-Gly45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:20)を含むストレプトアビジン類似体を含む、請求項28記載の方法。
- 二価カチオンの存在下で結合する結合ペアに関して、
リガンドLがカルモジュリン結合ペプチドを含み、かつリガンド結合パートナーLBがカルモジュリンを含むか、または
リガンドLがオリゴヒスチジンタグを含み、かつリガンド結合パートナーLBが、少なくとも2つのキレート基Kを含む結合部分Aを含み、各キレート基Kは遷移金属イオンに結合する能力を有し、それによって部分Aにオリゴヒスチジンペプチドに結合する能力を与える、
請求項27記載の方法。 - 結合パートナーCと多量体化試薬の結合部位Zとの間の結合が金属イオンキレーションによって解離される(破壊される)、請求項30記載の方法。
- 金属キレーションがEDTAまたはEGTAの添加によって実行される、請求項31記載の方法。
- 結合パートナーCに含まれる抗原がエピトープタグである、請求項27記載の方法。
- - 競合試薬がビオチンまたはビオチン誘導体であり、
- 結合パートナーCがストレプトアビジンに結合するリガンドであり、かつ多量体化試薬がストレプトアビジンまたはストレプトアビジンであり、かつ
- リガンドLがビオチンまたはビオチン類似体であり、かつリガンド結合パートナーLBがストレプトアビジンまたはストレプトアビジン類似体である、
請求項12〜34のいずれか一項記載の方法。 - 多量体化試薬の結合部位Zとリガンド結合パートナーLBとが同一である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 受容体分子に特異的に結合する受容体分子結合試薬が、抗体、二価抗体フラグメント、一価抗体フラグメント、抗体様の結合特性を有するタンパク質性結合分子、およびMHC分子からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 二価抗体フラグメントが(Fab)2'フラグメントまたは二価一本鎖Fvフラグメントである、請求項37記載の方法。
- 一価抗体フラグメントが、Fabフラグメント、Fvフラグメント、および一本鎖Fvフラグメント(scFv)からなる群より選択される、請求項38記載の方法。
- 抗体様の結合特性を有するタンパク質性結合分子が、アプタマー、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、グルボディ、アンキリンスキャフォールドに基づくタンパク質、結晶性スキャフォールドに基づくタンパク質、アドネクチン、およびアビマーの群より選択される、請求項37記載の方法。
- 試料が、標的細胞と、細胞表面上に前記受容体分子を欠くさらなる細胞との混合物を含み、かつ、方法が、該さらなる細胞から標的細胞を分離する工程を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 以下の工程を含む、標的細胞表面上に受容体分子を有する標的細胞を単離する方法:
- i)標的細胞表面上の受容体分子に特異的に結合する能力を有する結合部位Bと、多量体化試薬上の結合部位Zに可逆的に結合する能力を有する結合パートナーCとを含み、リガンドLに特異的に結合する能力を有するリガンド結合パートナーLBをさらに含む、受容体分子結合試薬、および
ii)受容体分子結合試薬に含まれる結合パートナーCに可逆的に結合する能力を有する2つ以上の結合部位Zを含む多量体化試薬、
iii)標的細胞を含む試料
を接触させ、
それによって、受容体分子結合試薬、多量体化試薬、および標的細胞が、多量体化試薬に結合した2つ以上の受容体分子結合試薬に結合している標的細胞を含む多価結合複合体を形成することを可能にする工程、
- 標的細胞、受容体分子結合試薬、および多量体化試薬の多価結合複合体を、リガンドLを含む固相と接触させ、
それによって、リガンドLとリガンド結合パートナーLBとの間の結合による固相上での標的細胞の可逆的固定化を可能にする工程であって、固相上での標的細胞の固定化が、
a)受容体分子結合試薬に含まれる結合パートナーCと多量体化試薬の結合部位Zとの間の結合、および/または
b)固相のリガンドLと受容体分子結合試薬に含まれるリガンド結合パートナーLBとの間の結合
を破壊すると可逆的である、工程。 - 受容体分子結合試薬と多量体化試薬とを互いに接触させることで、多量体化試薬に結合した2つ以上の受容体分子結合試薬を含む複合体を形成させてから、この複合体を標的細胞と接触させる(インキュベートする)、請求項42記載の方法。
- 受容体分子結合試薬と受容体分子との間の結合に関する解離定数(Kd)が低アフィニティーである、請求項42または43記載の方法。
- 受容体分子結合試薬と受容体分子との間の結合に関する解離定数(Kd)が約10-2〜約10-10Mの範囲にある、請求項42〜44のいずれか一項記載の方法。
- 以下の工程を含む、標的細胞表面上に受容体分子を有する標的細胞を固相上に固定化する方法:
- i)標的細胞表面上の受容体分子に特異的に結合する能力を有する結合部位Bと、多量体化試薬上の結合部位Zに可逆的に結合する能力を有する結合パートナーCとを含む、受容体分子結合試薬、
ii)受容体分子結合試薬に含まれる結合パートナーCに可逆的に結合する能力を有する2つ以上の結合部位Zを含み、リガンドLに特異的に結合する能力を有するリガンド結合パートナーLBをさらに含む、多量体化試薬、
および
ii)標的細胞を含む試料
を接触させ、
それによって、受容体分子結合試薬、多量体化試薬、および標的細胞が、多量体化試薬に結合した2つ以上の受容体分子結合試薬に結合している標的細胞を含む多価結合複合体を形成することを可能にする工程、
- 標的細胞、受容体分子結合試薬、および多量体化試薬の多価結合複合体を、リガンドLを含む固相と接触させ、
それによって、リガンドLとリガンド結合パートナーLBとの間の結合による固相上での標的細胞の可逆的固定化を可能にする工程であって、固相上での標的細胞の固定化が、少なくとも受容体分子結合試薬に含まれる結合パートナーCと多量体化試薬の結合部位Zとの間の結合を破壊すると可逆的である、工程。 - 受容体分子結合試薬と多量体化試薬とを互いに接触させることで、多量体化試薬に結合した2つ以上の受容体分子結合試薬を含む複合体を形成させてから、この複合体を標的細胞と接触させる(インキュベートする)、請求項46記載の方法。
- 受容体分子結合試薬と受容体分子との間の結合に関する解離定数(Kd)が低アフィニティーである、請求項46または47記載の方法。
- 受容体分子結合試薬と受容体分子との間の結合に関する解離定数(Kd)が約10-2〜約10-10Mの範囲にある、請求項46〜48のいずれか一項記載の方法。
- 以下の工程を含む、標的細胞表面上に受容体分子を有する標的細胞を固相上に固定化する方法:
- i)標的細胞表面上の受容体分子に特異的に結合する能力を有する結合部位Bと、多量体化試薬上の結合部位Zに可逆的に結合する能力を有する結合パートナーCとを含み、リガンドLに特異的に結合する能力を有するリガンド結合パートナーLBをさらに含む、受容体分子結合試薬、および
ii)受容体分子結合試薬に含まれる結合パートナーCに可逆的に結合する能力を有する2つ以上の結合部位Zを含む多量体化試薬、
iii)標的細胞を含む試料
を接触させ、
それによって、受容体分子結合試薬、多量体化試薬、および標的細胞が、多量体化試薬に結合した2つ以上の受容体分子結合試薬に結合している標的細胞を含む多価結合複合体を形成することを可能にする工程、
- 標的細胞、受容体分子結合試薬、および多量体化試薬の多価結合複合体を、リガンドLを含む固相と接触させ、
それによって、リガンドLとリガンド結合パートナーLBとの間の結合による固相上での標的細胞の可逆的固定化を可能にする工程であって、固相上での標的細胞の固定化が、
a)受容体分子結合試薬に含まれる結合パートナーCと多量体化試薬の結合部位Zとの間の結合、および/または
b)固相のリガンドLと受容体分子結合試薬に含まれるリガンド結合パートナーLBとの間の結合
を破壊すると可逆的である、工程。 - 受容体分子結合試薬と多量体化試薬とを互いに接触させることで、多量体化試薬に結合した2つ以上の受容体分子結合試薬を含む複合体を形成させてから、この複合体を標的細胞と接触させる(インキュベートする)、請求項50記載の方法。
- 受容体分子結合試薬と受容体分子との間の結合に関する解離定数(Kd)が低アフィニティーである、請求項50または51記載の方法。
- 受容体分子結合試薬と受容体分子との間の結合に関する解離定数(Kd)が約10-2〜約10-10Mの範囲にある、請求項50〜52のいずれか一項記載の方法。
- - リガンドLを含む固相であって、リガンドLは、標的細胞を単離するために使用される受容体分子結合試薬または多量体化試薬中に存在するリガンド結合パートナーLBに特異的に結合する能力を有し、リガンドLはそれによって、固相上での標的細胞の可逆的固定化を可能にする、固相、
- a)細胞分離に適し、ゲル濾過マトリックスおよび/またはアフィニティークロマトグラフィーマトリックスである第1固定相であって、該マトリックスが、受容体分子結合試薬に含まれる結合パートナーCに特異的に結合する結合部位Zを有するアフィニティー試薬を含み、それによって、第1固定相上での受容体分子結合試薬の固定化と、標的細胞を含む溶出液からの受容体分子結合試薬の除去とを可能にする、第1固定相、
または
b)リガンドLを含む第2固定相であって、リガンドLは、標的細胞を単離するために使用される受容体分子結合試薬または多量体化試薬中に存在するリガンド結合パートナーLBに特異的に結合する能力を有し、リガンドLはそれによって、第2固定相上での受容体分子結合試薬または多量体化試薬の固定化と、標的細胞を含む溶出液からの受容体分子結合試薬または多量体化試薬の除去とを可能にする、第2固定相
のうちの少なくとも1つ
を含む、試料から標的細胞を単離するための構成。 - 固相と第1固定相または第2固定相の少なくとも一方とが流体接続されている、請求項54記載の構成。
- 第1固定相および/または第2固定相がクロマトグラフィーカラムに含まれているか、または平面固定相である、請求項54または55記載の構成。
- 固相が標的細胞を単離するためのバッチ式リアクターに含まれているか、または固相が固定相である、請求項54〜56のいずれか一項記載の構成。
- バッチ式リアクターが、固相上にリガンドLが固定化されている固相を含む容器であるか、またはバッチ式リアクターが、ビーズ上に固定化されたリガンドLを有するビーズを含む、請求項57記載の構成。
- バッチ式リアクター中にビーズを保持するための保持手段をさらに含む、請求項58記載の構成。
- ビーズが磁気ビーズであり、かつ保持手段が磁石である、請求項59記載の構成。
- 固相が第1固定相に流体接続されており、かつ第1固定相が第2固定相に流体接続されている、請求項54〜60のいずれか一項記載の構成。
- 固相が第2固定相に流体接続されており、かつ第2固定相が第1固定相に流体接続されている、請求項54〜62のいずれか一項記載の構成。
- 固相および/または第2固定相に含まれるリガンドLがビオチンまたはビオチンの誘導体である、請求項54〜62のいずれか一項記載の構成。
- ビオチンの誘導体が、デスチオビオチン、イミノビオチン、2-(4'-ヒドロキシアゾベンゼン)安息香酸(HABA)、またはストレプトアビジン結合ペプチドである、請求項63記載の構成。
- 第1固定相に含まれるアフィニティー試薬が、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンのムテイン、アビジン、またはアビジンのムテインである、請求項54〜63のいずれか一項記載の構成。
- 請求項54〜65のいずれか一項記載の標的細胞を単離するための構成を含む、試料から標的細胞を単離するための機器。
- 標的細胞を可逆的に固定化または単離するための、リガンド結合パートナーLBに特異的に結合する能力を有するリガンドLを含む固相の使用。
- リガンドがビオチンまたはビオチンの誘導体である、請求項66記載の使用。
- ビオチンの誘導体が、デスチオビオチン、イミノビオチン、2-(4'-ヒドロキシアゾベンゼン)安息香酸(HABA)、またはストレプトアビジン結合ペプチドである、請求項68記載の使用。
- 請求項1〜54のいずれか一項記載の標的細胞を単離する方法または標的細胞を固定化するための方法における、リガンド結合パートナーLBに特異的に結合する能力を有するリガンドLを含む固相の使用。
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