KR102270242B1 - 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자 및 그 제조 방법 - Google Patents

생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자 및 그 제조 방법 Download PDF

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Abstract

분석 정확도나 감도가 높고, 또한 안정적으로 제조할 수 있는 분석용 시약을 제공할 수 있는, 간편하면서도 정밀하게 생리 활성 물질을 담지시키는 관능기 양을 조절 가능하며, 또한, 비특이적 반응을 억제하는 친수성 화합물을 라텍스 입자 표면에 도입할 수 있으며, 또한, 입경 분포를 좁게 균일하게 제조할 수 있는 새로운 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자 및 그 제조 방법을 제공한다. 상기 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자는 모노머, 라디칼 중합 개시제, 유화제를 중합하여 얻어지는 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자로서, 상기 유화제는 하기 일반식 (1)로 표시 하는 양친매성 블록 폴리머이다.

Description

생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자 및 그 제조 방법{Polymer microparticle for carrying physiologically active substance and method for preparing same}
본 발명은 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 명세서에서 「분석」에는, 분석 대상 물질의 양을 정량적 또는 반정량적으로 결정하는 「측정」과, 분석 대상 물질의 존재의 유무를 판정하는 「검색」을 모두 포함하는 것이다.
현재 임상 진단 검사 현장에서는 다수의 검체에 대해 질병 진단의 지표가 되는 다방면에 걸친 물질을 단시간이며 또한 정밀하게 측정하고, 그 결과를 신속·정확하게 치료 현장에 피드백하는 것이 요구되고 있다. 예를 들어, 입자 표면에 생리 활성 물질 (항체, 효소, 수용체 등의 단백질, 항원, DNA나 RNA 등의 핵산 물질 혹은 당쇄(糖鎖)등)을 결합시킨 분석계, 예를 들면, 항원 항체 반응을 이용한 면역학적 측정에 의해, 미량 분석 대상물의 정확한 정량(定量)이 많이 실시되고 있다. 특히 검출 감도나 정확성을 향상시키기 위한 방법으로서, 분석 대상 물질에 대한 항원 또는 항체를, 폴리스티렌 등의 합성 고분자 (이른바 라텍스) 입자의 표면에 담지시킨 입자를 이용한 라텍스 응집법이 공지이다. 라텍스 응집법은 분석 대상 물질과 라텍스 입자에 결합된 항원 또는 항체와의 반응에 의해 생기는 라텍스 입자의 응집의 정도를 육안 또는 광학적으로 검출함으로써 단시간에 분석 대상 물질을 측정하는 방법이다.
또한, 라텍스 입자를 자성 입자로 함으로써, 자성 입자에 결합된 제 1항체에 의해 분석 대상물을 트랩하고, 자석에 집적시켜 미반응물 등을 세정한 후 (이른바 B/F 분리), 효소나 형광제 등 시그날을 발생하는 물질을 표지한 제 2항체를 첨가하여 분석하는 샌드위치법도 많이 사용되고 있다.
항원 항체 반응에 의해 정량하는 분석 대상 물질의 대부분은, 일반적으로 생체 시료 중에 포함된 미량 성분이며, 저농도 영역의 정량성을 중시하고 있다. 그러나 질병의 진행 정도에 따라서는 측정 대상 물질 농도가 비정상적으로 높은 값을 나타내는 경우가 있기 때문에, 임상 검사 현장에서는 저가부터 고가까지를 정확하게 측정할 수 있는 성능을 가진 시약이 요구되고 있다.
라텍스 응집법에서도 샌드위치법에서도, 라텍스 입자를 이용하는 경우에는 라텍스 입자의 표면에 항원 또는 항체를 고정하는 것이 필요하다. 그 방법으로는 물리적 또는 화학적으로 담지시키는 방법이 이용되고 있다. 예를 들어, 물리적 흡착에 의해 라텍스 입자에 항원 또는 항체를 직접 고정화하거나, 또는 라텍스 입자의 표면의 관능기 예를 들어, 카르복실기, 말레이미드기, 아미노기, 메르캅토기, 히드록실기, 알데히드기 또는 에폭시기 등을 통한 공유 결합으로, 라텍스 입자에 항원 또는 항체를 결합시키는 방법이 사용되고 있다.
물리적 결합 방법에 비해, 화학적 결합 방법의 유리한 점은 항체가 공유 결합을 통해 라텍스 입자 표면에 결합되므로, 항체를 안정적으로 표면에 담지시킬 수 있다는 것이다. 라텍스 입자 표면으로의 관능기의 결합 방법은 여럿 보고되고 있지만, 제조 로트(ロット) 차이, 결합된 관능기 양의 제어가 곤란하여, 안정적으로 정밀하게 생리 활성 물질을 담지한 입자를 제작할 수 없는 것이 문제가 되고 있다 (특허 문헌 1, 특허 문헌 2).
또한, 라텍스 입자 표면의 관능기 양의 정량 방법은 여럿 보고되고 있지만, 예를 들면 카르복실기의 정량에 사용되는 산염기 적정을 실시하여, 전기 전도도의 변화로부터 정량하는 방법으로는, 관능기 양이 매우 미량인 경우, 정확한 정량은 곤란하다. 임상 진단에 사용되는 라텍스 입자는 미세하기 때문에 관능기의 양은 미량이 되므로, 정확한 정량이 어렵다는 것을 임상 진단약의 제조에 안정적인 공급을 할 수 없는 것이 되어, 문제가 되고 있다.
또한, 라텍스 입자 표면과 생체 시료를 결합시키기 위한 생리 활성 물질 담지용의 관능기 사이의 거리를 제어하는 것은, 임상 진단약 등의 생체 재료에의 응용을 생각한 경우에 중요하다. 지금까지 이중 결합을 가지고 또한 폴리에틸레글리콜 등의 친수성 고분자를 통해 관능기를 갖는 화합물을 매크로 모노머로서, 스티렌 등의 모노머와 공중합하여 라텍스 표면에 결합시키는 기술이 있지만, 결합한 관능기 양을 조절하거나, 제조 로트 차이가 작은 라텍스 입자를 얻는 것은 곤란하여, 문제가 되고 있다.
또한, 라텍스 응집법의 문제점으로서, 측정 대상 물질 이외의 협잡물이 라텍스 입자 표면에 흡착하는 것(비특이적 흡착)에 의해, 비특이적 응집을 일으키며, 이 비특이적 응집을 측정 대상 물질로서 정량해 버리는 비특이적 반응을 들 수 있다.
일반적으로 비특이적 반응을 억제하는 방법으로서, 미리 라텍스 입자에 소혈청 알부민 (BSA)과 당분을 흡착시켜 두는 방법이 있지만, BSA나 당의 흡착량이나, 생물 유래의 단백질인 BSA의 로트 차이 등을 일정하게 하는 것은 어렵고, 안정적이며, 라텍스 응집법에 의한 분석 시약을 제공하는 것은 곤란하다 (특허 문헌 3).
또한 고분자 입자의 합성시에 분석 대상 물질에 대한 항원·항체를 존재시켜 둠으로써 고분자 미립자에 항원 항체를 수식하여, 기존 발생했던 비특이적 흡착을 억제하는 방법이 보고되어 있지만 충분하지 않다 (특허 문헌 4).
또한, 비특이적 흡착을 억제하는 방법으로 비특이적 반응의 억제에 효과적인 것으로 알려진 폴리에틸렌 글리콜의 말단에 중합 가능한 이중 결합을 가지는 화합물을 모노머로 사용하여, 고분자 미립자를 합성하는 방법이 알려졌으나(특허 문헌 5) 충분하지 않다.
또한 비특이적 흡착 억제에 효과가 있는 모노머를 중합시에 존재시켜 둠으로써 비특이적 흡착을 억제하는 기술이 개발되고 있지만 충분하지 않다 (특허 문헌 6).
최근에는 폴리에틸렌 글리콜에 소수성 유니트를 도입한 블록 마스터 (JSR 사)를 라텍스 입자 표면에 흡착시켜 비특이적 반응을 억제하는 방법이 개발되고 있다. 그러나 면역학적 분석 시약의 조제 공정의 복잡성에 의한 로트 차이의 증가나 블록 마스터의 수식(修飾)양을 정량하는 것이 어렵다는 문제가 있다.
따라서, 임상 진단 의약품에 사용되는 라텍스 입자는 임상 진단 시약의 제조의 안정성이나 임상 진단 시약의 정확도를 향상시키는 것이 요구되고 있지만 아직 달성되고 있지 않다.
특허 문헌 1: 특개 2004-59696호 공보 특허 문헌 2: 특개 2004-61301호 공보 특허 문헌 3: 특개 2007-145985호 공보 특허 문헌 4: W02008/047799호 공보 특허 문헌 5: 일본 특허 공개 2003-231648호 공보 특허 문헌 6: 일본 특허 공개 2007-100035호 공보
본 발명자들은, 라텍스 입자의 합성에 관한 상기의 문제를 극복하기 위해, 예의 연구를 거듭한 결과, 간편하면서도 정밀하게, 생리 활성 물질을 담지시키는 관능기의 양을 제어할 수 있으며, 또한, 비특이적 반응을 억제하는 친수성 화합물을 라텍스 입자 표면에 도입할 수 있으며, 또한, 입경 분포를 좁게 균일하게 제조할 수 있는 새로운 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자 및 그 제조 방법을 발견했다.
발명의 과제는, 분석 정확도나 감도가 높고, 또한 안정적으로 제조할 수 있는 분석 시약을 제공할 수 있으며, 간편하면서도 정밀하게 생리 활성 물질을 담지시키는 관능기 양을 조절 가능하며, 또한, 비특이 반응을 억제하는 친수성 화합물을 라텍스 입자 표면에 도입 가능하며, 또한, 입경 분포를 좁게 균일하게 제조할 수 있는 새로운 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자 및 그 제조 방법을 제공하는 것이다.
종래에는, 하나의 문제점 밖에 해결할 수 없으며, 게다가 충분히 해결할 수 없고, 또한, 매우 복잡하고 어려운 방법 밖에 알려져있지 않았지만, 놀랍게도, 상기 과제는 모노머, 라디칼 중합 개시제, 유화제를 사용하여 미니 에멀젼 중합을 할 때, 유화제로서 하기 일반식 (1)로 표시되는, 일 분자 내에 생리 활성 물질 담지용 관능기를 가지며, 또한 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트로 이루어진 양친매성(兩親媒性) 블록 폴리머이며, 상기 친수성 세그먼트가 비특이적 반응을 억제하는, 고분자 유화제를 사용함으로써, 특히 세 가지 문제를 동시에 보다 간편한 방법으로 해결할 수 있다.
본 발명은,
[1] 모노머, 라디칼 중합 개시제, 유화제를 중합하여 얻어지는 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자이며, 상기 유화제는 하기 일반식 (1):
[화1]
Figure 112017028543060-pct00001
[식에서, n은 5 이상의 정수이며,
m은 5 이상의 정수이며,
R1 및 R4는 각각 독립적으로 적어도 어느 한쪽이 생리 활성 물질 담지용 관능기이며,
R2-1 및 R2-2는 각각 독립적으로 수소 원자, 메틸기, 에틸기 또는 프로필 기이고,
R3는 친수성 화합물에서 유래하는 관능기이며,
R5는 소수성을 부여하는 관능기이며,
R6는 할로겐 원자 또는 유화제 합성시의 개시제 유래의 관능기이다]
로 표시되는 양친매성(兩親媒性) 블록 폴리머인 상기 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자,
[2] 상기 R1 또는 R4가 카르복실기, 말레이미드기, 아미노기, 메르캅토기, 히드록실기, 알데히드기 및 에폭시기로 이루어진 군에서 선택되는 기인, [1]의 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자,
[3] 상기 R3에 있어서 상기 친수성 화합물이 올리고(폴리)에틸렌 글리콜, 2- 메타크릴로일 옥시에틸 포스포릴콜린 폴리머, 폴리 비닐 알코올, 폴리 비닐 피롤리돈, 폴리 아미노산, 폴리펩티드, 단당류 및 다당류로 이루어진 군에서 선택되는 화합물인, [1] 또는 [2]의 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자,
[4] 상기 R5는 수소 원자, 할로겐 원자, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 치환 또는 비치환의 방향족 화합물기, 카르보닐기, 아미드기, 아미노기, 알데히드기 및 케톤기, 및 아민, 알데히드, 케톤 및 에테르의 각 화합물에 유래하는 관능기로 이루어진 군에서 선택되는 1 또는 그 이상의 관능기인, [1] ~ [3] 중 하나의 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자,
[5] 상기 유화제의 분자량이, 1000 ~ 100만인, [1] ~ [4] 중 하나의 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자,
[6] 상기 친수성 세그먼트의 분자량이 500 ~ 50만, [1] ~ [5] 중 하나의 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자,
[7] 상기 소수성 세그먼트의 분자량이 500 ~ 50만인, [1] ~ [6] 중 하나의 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자,
[8] 모노머, 라디칼 중합 개시제, 유화제를 사용하여 미니 에멀젼 중합을 할 때, 상기 유화제가 하기 일반식 (1):
[화 2]
Figure 112017028543060-pct00002
[식에서 n은 5 이상의 정수이며,
m은 5 이상의 정수이며,
R1 및 R4는 각각 독립적으로 적어도 어느 한쪽이 생리 활성 물질 담지용 관능기이며,
R2-1 및 R2-2는 각각 독립적으로 수소 원자, 메틸기, 에틸기 또는 프로필기이고,
R3는 친수성 화합물에서 유래하는 관능기이며,
R5는 소수성을 부여하는 관능기이며,
R6는 할로겐 원자 또는 유화제 합성시의 개시제 유래의 관능기이다]로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자의 제조 방법,
[9] 상기 유화제의 합성이, 제어/리빙 라디칼(リビングラジカル) 중합 또는 이온 중합인, [8]의 제조 방법,
[10] 상기 미니 에멀젼 중합이, 전상유화법(轉相乳化法)인, [8] 또는 [9]의 제조 방법,
에 관한 것이다.
발명에 의하면, 간편하면서도 정밀하게 생리 활성 물질을 담지시키는 관능기 양을 조절 가능하며, 또한, 비특이적 반응을 억제하는 친수성 화합물을 라텍스 입자 표면에 도입 가능하며, 또한 입경 분포를 좁고 균일하게 제조할 수 있는 새로운 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자 및 그 제조 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 라텍스 입자의 입경 분포를 나타낸다. 가로축은 입경, 종축은 입자의 비율이다.
본 발명의 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자는, 모노머, 라디칼 중합 개시제, 유화제를 포함하고, 상기 유화제는 하기에 기술된 특징을 갖는 것이다.
본 발명에서 사용 가능한 유화제는 적어도 다음과 같은 특징:
[1] 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트로 구성된 양친매성(兩親媒性) 블록 폴리머이며,
[2] 상기 친수성 세그먼트 말단 (R1, R4 중 어느 것도 한 군데 이상)에 생리 활성 물질 담지용 관능기를 가진다.
상기 유화제와 상기 모노머는, 미니 에멀젼 중합 반응에 의해 공유 결합하여도 좋고, 공유 결합하지 않아도 좋다. 예를 들어, 상기 유화제가 소수성 세그먼트 내 또는 말단에 중합 가능한 이중 결합을 갖는 경우, 고분자 미립자와 공유 결합하는 것이 가능하다. 한편, 상기 유화제의 소수성 세그먼트는 고분자 미립자와 강하게 상호 작용하기 때문에, 중합 반응시 첨가된 유화제는 고분자 미립자에 강하게 결합되어 공유 결합하지 않아도 안정된 상태를 유지할 수 있으므로, 중합 반응이 용이하고 바람직하다.
즉, 본 발명에서 사용 가능한 유화제는 다음의 일반식 (1)로 표현된다.
[화 3]
Figure 112017028543060-pct00003
[식에서 n은 5 이상의 정수이며,
m은 5 이상의 정수이며,
R1 및 R4는 적어도 어느 한쪽이 생리 활성 물질 담지용 관능기이며,
R2-1 및 R2-2는 각각 독립적으로 수소 원자, 메틸기, 에틸기 또는 프로필기이고,
R3는 친수성 화합물에서 유래하는 관능기이며,
R5는 소수성 화합물을 부여하는 관능기이며,
R6는 할로겐 원자 또는 유화제 합성시의 개시제 유래의 관능기이다].
본 발명에서 사용 가능한 유화제의 주쇄(主鎖)는 알킬 사슬로 구성된다.
또한, 본 발명에서 사용 가능한 유화제의 분자량 (수평균 분자량)은 1000 이상 100만 이하, 바람직하게는 1500 이상 50만 이하, 더욱 바람직하게는 2000 이상 25만 이하, 특히 바람직하게는 3000 이상 20만 이하이다.
또한, 본 발명에서 사용 가능한 유화제의 분자량 분포로는 다분산도(多分散度)인 Mw(중량 평균 분자량)/Mn(수평균 분자량)가, 1 이상 2 이하, 바람직하게는 1.8 이하, 더욱 바람직하게는 1.5 이하인 것이 좋다. 제어/리빙 라디칼 중합 또는 이온 중합에 의해 쉽게 합성할 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 유화제의 친수성 세그먼트는 전체로서 친수성이면 좋다. 또한 친수성 세그먼트의 주쇄 및 이식 사슬(グラフト鎖) (R3-R4)의 길이는 적절히 공지의 것으로부터 선택하거나, 임의로 합성할 수 있다.
친수성 세그먼트로는 분자량 500 이상 50만 이하, 바람직하게는 1000 이상 40만 이하, 더욱 바람직하게는 2000 이상 30만 이하, 특히 바람직하게는 3000 이상 25만 이하이다. m은 5 이상이며, 5 이상 500 이하가 바람직하고, 더욱 10 이상 300 이하가 바람직하다.
상기 친수성 세그먼트의 이식 사슬은, 친수성 화합물 부분을 포함하며, 기(基) R3로서, 상기 친수성 화합물에서 유래하는 관능기를 가진다.
본 발명에 사용 가능한 상기 친수성 화합물로는, 예를 들어 올리고(폴리) 에틸렌 글리콜, 2-메타크릴로일 옥시에틸 포스포릴 콜린(MPC) 폴리머, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리 아미노산, 폴리펩티드, 단당류, 다당류 등을 들 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 유화제로서 합성 가능한 친수성 화합물이면 공지의 것으로부터 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
R3의 분자량은 20 ~ 1만이 바람직하고, 더욱 50 ~ 5000이 바람직하다.
본 발명에서 사용 가능한 유화제의 소수성 세그먼트는 전체로서 소수성이면 좋다.
소수성 세그먼트로는 분자량 500 이상 50만 이하, 바람직하게는 1000 이상 40만 이하, 더욱 바람직하게는 2000 이상 30만 이하, 특히 바람직하게는 3000 이상 25만 이하이다. n은 5 이상이며, 5 이상 500 이하가 바람직하고, 더욱 10 이상 300 이하가 바람직하다.
상기 소수성 세그먼트의 분자량을 선택함으로써 본 발명의 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자의 입경을 제어할 수 있다.
일반식 (1)의 기(基) R1 또는 R4, 즉 본 발명에서 사용할 수 있는 생리 활성 물질 담지용 관능기로는, 공지의 생리 활성 물질 담지용 관능기에서 적절히 선택하여 사용할 수 있지만, 예를 들어, 카르복실기, 말레이미드, 아미노기, 메르캅토기, 히드록실기, 알데히드기 또는 에폭시기 등을 들 수 있다. 목적에 맞게 종류나 수를 적절히 선택할 수 있다. 생리 활성 물질 담지용 관능기가 도입된 유화제를 사용함에 의해, 하나의 미립자에 도입하는 생리 활성 물질 담지용 관능기 양을 쉽게 제어 할 수 있다.
상기 R1 또는 상기 R4가 생리 활성 물질 담지용 관능기가 아닌 경우는, 공지의 원자나 관능기로부터 적절히 선택하여 사용할 수 있지만, 예를 들어 수소 원자, 할로겐, 메틸기, 에틸기 또는 프로필기를 들 수 있다.
기(基) R2-1 및 R2-2는 유화제의 양친매성이나 생리 활성 물질 담지용 관능기의 기능을 방해하지 않는 한, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 수소 원자, 메틸기, 에틸기, 프로필기 등이 바람직하다. R2-1 및 R2- 2은 같아도 좋고, 달라도 좋다. 각각의 화합물과 합성 방법에 따라 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 소수성 세그먼트의 이식 사슬은, 기(基) R5로서, 소수성을 부여하는 관능기를 가진다. 상기 소수성을 부여하는 관능기로는 예를 들면, 수소 원자, 할로겐 원자, 메틸기, 에틸기, 프로필 기, 치환 또는 비치환의 방향족 화합물기, 카르보닐기, 아미드기, 아미노기, 알데히드기, 케토기, 또는 아민, 알데히드, 케톤 또는 에테르의 각 화합물에서 유래하는 관능기 (예를 들어, 상기 각 화합물에서 1 또는 그 이상의 원자가 제외된 기)등을 들 수 있다. R5는 모두 동일한 기일 수도 있고, 2개 이상의 서로 다른 기일 수도 있다.
이러한 소수성 세그먼트의 주쇄 및 R2-1 및 R5는, 예를 들어 탄소 이중 결합을 갖는 모노머를 중합하여 얻을 수 있다. 상기 모노머로는 예를 들면, 에틸렌, 프로필렌, 스티렌술폰(スチレンスルホン)산, 스티렌, 메타크릴레이트, 아크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드 등을 들 수 있으며, 이들 중 하나를 단독으로 또는 여러 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 유화제의 소수성 세그먼트의 말단 R6는, 유화제의 중합법에 따라 공지의 것으로부터 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 유화제의 중합에 사용되는 개시기(開始基)에서 유래하는 관능기나 할로겐 원자를 들 수 있다. 또한, 고분자 미립자를 합성할 때의 중합법에 따라 공지의 것으로부터 적절히 선택하여 사용할 수도 있다. 예를 들면, 고분자 미립자를 합성할 때 모노머와 공유 결합하는 경우에는 이중 결합을 도입할 수도 있다.
본 발명에서 사용 가능한 유화제의 합성은, 예를 들어, 제어/리빙 라디칼 중합, 이온 중합을 사용할 수 있다. 제어/리빙 라디칼 중합으로서, 예를 들어, RAFT (Reversible Addition Fragmentation chain Transfer Polymerization), NMP (Nitroxide Mediated Polymerization), ATRP (Atom Transfer Radical Polymerization) 등을 들 수 있다. 제어/리빙 라디칼 중합, 이온 중합으로 합성된 유화제를 사용함으로써, 본 발명의 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자의 입경 분포를 좁게 균일하게 제조할 수 있다.
이러한 합성 방법은, 친수성 세그먼트에 도입하는 생리 활성 물질 담지용 관능기 등에 따라 적합한 방법을 선택할 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 유화제의 합성은, 공지의 방법에서 적절히 선택하여 사용할 수 있지만 예를 들어, 소수성 세그먼트로부터 합성을 개시하고, 그 후 친수성 세그먼트를 합성하거나, 친수성 세그먼트로부터 합성한 후, 소수성 세그먼트를 합성하는 방법 등이 있다. 목적에 따라 적합한 방법을 선택할 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 라디칼 중합 개시제로서는 통상의 미니 에멀젼 중합에서 사용 가능한 라디칼 중합 개시제를 사용할 수 있으며, 예를 들면, 과산화 개시제, 과황산(過硫酸) 개시제, 아조계(アゾ系) 개시제, 아조계 저온형 개시제 또는 레독스(レドックス)개시제를 들 수 있다. 본 발명은 전상유화(轉相乳化) 온도보다 낮은 온도에서 중합을 할 수 있는 점에서, 레독스 개시제 혹은 아조계 저온형 개시제를 사용하는 것이 바람직하지만, 특히 제약을 마련하는 것은 아니다.
상기 과산화 개시제로서는, 예를 들면, 과산화벤조일(BPO), 디-t-부틸 퍼옥사이드(DBPO), 과산화 암모늄을 들 수 있다. 상기 과황산 개시제로서는, 예를 들면, 과황산 칼륨(KPS), 과황산 암모늄(APS), 과황산 나트륨(NPS)을 들 수 있다.
상기 아조계 개시제로서는, 예를 들면, 아조비스 이소부티로니트릴 (AIBN), 디메틸 2,2'-아조 비스 이소부틸레이트 (MAIB), 4,4'- 아조비스(4-시아노 발레르산), 2,2'-아조비스(2,4- 디메틸 발레로 니트릴)을 들 수 있다. 아조계 개시제 중, 저온에서 실시할 수 있는 상기 아조계 저온형 개시제로서는 예를 들면, 수용성 아조 중합 개시제인 VA-044 (和光純工業) 또는 지용성 아조 중합 개시제인 V-70 (和光純工業) 등을 들 수 있다.
상기 레독스 개시제로서는, 예를 들면, N, N, N ', N'- 테트라 메틸 에틸렌 디아민 [N, N, N', N'-tetramethylethylenediamine (TMEDA)]/과황산 칼륨 [potassium persulfate (KPS)], FeSO4/KPS, FeSO4/H2O2, 아스코르빈산 (비타민 C)/H2O2 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 모노머는, 통상의 미니 에멀젼 중합에서 사용 가능한 모노머를 사용할 수 있다. 예를 들어, 스티렌, 스티렌 유도체 (예를 들어, 클로로 메틸 스티렌, 스티렌 술폰산 나트륨), 디비닐벤젠, 아크릴산 또는 메타크릴산, 이타콘산, 무수말레산, 말레산, 프탈산, 아크릴산 에스테르 또는 메타크릴산 에스테르 [예를 들면, 메틸(메타)아크릴 레이트, 에틸(메타)아크릴 레이트, 부틸(메타)아크릴 레이트, 헥사 데실(메타) 아크릴 레이트, 비닐 아세테이트를 들 수 있다. 또한 이들 단량체는 2 종류 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자의 제조 방법은, 상기 본 발명의 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자를 제조할 수 있다면 특히 제한하는 것은 없고, 중합 반응시에 상기의 본 발명에서 사용 가능한 유화제를 사용하는 것을 제외하고는, 종래 공지의 미니 에멀젼 중합(예를 들어, M. Antonietti, K. Landfester, Prog. Polym. Sci., 2002, 27, 689-757, JM Asua, Prog. Polym. Sci., 2002, 27, 1283-1346)과 동일하게 하여 실시할 수 있다. 특히 강력한 유화 장치를 사용하여 높은 전단력을 필요로 하지 않고, 낮은 에너지 프로세스로 미립자를 제조할 수 있으므로, 전상유화법이나 전상온도유화법(轉相度乳化法)이 바람직하고, 특히 전상온도유화법(예를 들면, L. Spernath, S. Magdassi, Polym. Adv. Technol., 2007, 18, 705-711)을 사용하는 것이 바람직하다.
통상의 미니 에멀젼 중합은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 모노머, 라디칼 중합 개시제, 유화제를 혼합하는 공정, 상기 혼합물을 전단하는 공정, 및 상기 혼합물을 중합 개시 온도까지 가열하여 중합시키는 공정을 포함할 수 있다. 미니 에멀젼 중합에서는 중합용 단량체와 유화제를 혼합한 후, 예를 들면, 초음파 조사에 의한 전단 공정을 실시함으로써, 상기 전단력에 의해 모노머가 찢어지고, 유화제로 덮인 모노머 미소 유적(油滴)이 형성된다. 이어서, 라디칼 중합 개시제의 중합 개시 온도까지 가열하여 모노머 미소 유적을 그대로 중합하여 고분자 미립자가 얻어진다.
전상온도유화법에서는, 예를 들어, 외부 환경 (물/기름의 조성, 온도, 압력, 전해질 농도 및 화학 반응)에 의해 발생되는 계면 활성제의 곡률 변화를 이용하여, 연속상을 유상(油相)에서 수상(水相)으로 변화시킴으로써 O/W형 에멀젼을 제작하고, 개시제를 첨가하여 중합을 실시하여 고분자 미립자를 얻을 수 있다.
고분자 미립자의 중합 반응 조건, 예를 들면, 용매, 혼합비, 온도, 반응 시간 등은 사용하는 모노머 및 생리 활성 물질 담지용 관능기의 종류, 개시제, 유화제, 합성하는 고분자 미립자의 평균 입경, 미립자 표면에 담지되는 생리 활성 물질의 양 등에 따르며, 예를 들어, 파일럿(パイロット) 시험을 실시하여 적절히 결정할 수 있다.
본 발명의 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자를 사용하는 것을 제외하고는 공지의 방법에 따라 분석 시약을 제조할 수 있다.
본 발명에서 나타내는 분석 시약으로는, 생리 활성 물질 담지용 고분자 미립자에, 생체 시료 중의 분석 대상 물질과 반응할 수 있는 생리 활성 물질을 담지시킨, 상기 분석 대상 물질을 분석하기 위한 시약이다.
또한, 생리 활성 물질과 분석 대상 물질의 조합 또한 생리 활성 물질과 생리 활성 물질 담지용 관능기의 반응은 공지의 방법에서 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 실시예에서 사용 가능한 생리 활성 물질로는 생체 시료 중의 분석 대상 물질과 반응할 수 있는 물질로서, 예를 들면, 항원, 항체, 효소, 수용체, DNA, RNA, 당쇄(糖鎖) 등을 들 수 있다.
본 발명의 실시예에서 사용 가능한 생체 시료 중의 분석 대상 물질로는 IgG, C반응성 단백질(CRP), 페리틴(フェリチン), β-2마이크로 글로불린(β－２マイクログロブリン), α-페토프로테인(フェトプロティン)(AFP), IgE, B형 간염 바이러스 (HBS 항체 또는 HBc 항체), D-dimer, 피브린·피브리노겐 분해산물(FDP), 가용성 피브린(Soluble fibrin : SF), 플라스민·α2-플라스민인히비타(プラスミンインヒビタ-)-복합체(PPI), 전립선 특이항원(PSA), 엘라스타제 1, 엘라스타제 XDP, 토론보모쥬린(トロンボモジュリン) 또는 알부민 (바람직하게는 혈청 알부민) 등을 들 수 있다.
예를 들어, 상기 생리 활성 물질로 항체를 이용하는 경우에는 모노클론 항체 또는 폴리클론 항체를 사용할 수 있다. 또한, 항체의 종류로는 면역 글로불린 분자 자체 외에도 항체 단편, 예를 들어, Fab, Fab ', F(ab')2 또는 Fv 등도 사용 가능하다.
예를 들어, 상기 생리 활성 물질로 DNA를 이용하는 경우에는 분석 대상 물질의 상호 보완적인 약 5 ~ 100 염기의 DNA 프로브를 사용할 수 있다.
본 발명의 실시예에서 사용 가능한 분석 가능한 피검 시료는, 상기 분석 대상 물질을 포함할 가능성이 있는 시료이면 특별히 한정되지 않으며, 특히 생체 시료, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 수액 또는 세포 또는 조직 파쇄액 등을 들 수 있다.
본 발명의 실시예에서 사용 가능한 분석 시약은, 공지의 라텍스법 (예를 들어, 라텍스 응집법, 라텍스를 이용한 B/F 분리)에서 사용할 수 있다.
라텍스 응집법은 상기 분석 시약과 피검 시료를 액체 중에서 접촉시킨 때에 생긴 응집의 정도(응집력)를 광학적으로 분석 (특히 측정)하여 피검 시료 중의 분석 대상 물질의 양을 분석 (특히 측정)할 수 있다. 라텍스 입자의 응집도를 광학적으로 검출하는 구체적인 방법에 있어서는, 예를 들면, 산란광 강도, 흡광도 또는 투과광 강도를 측정하는 광학 기기를 이용하여 측정할 수 있다. 바람직한 측정 파장은 300 ~ 800nm이다. 측정 방법은 공지의 방법에 따라 사용하는 라텍스 입자의 크기 (평균 입경) 또는 농도의 선택 또는 반응 시간의 설정에 의해, 산란광 강도, 흡광도 또는 투과광 강도의 증가 또는 감소를 측정함에 의해 실시할 수 있다. 또한 이러한 방법을 병용하는 것도 가능하다.
라텍스를 이용한 B/F 분리는, 상기 분석 시약 및 피검 시료를 액체 중에서 접촉시킨 후, B/F 분리함으로써 라텍스 입자와 액체를 분리하고, 상기 라텍스 입자에 결합한 분석 대상 물질, 또는 상기 용액 중에 잔존하는 분석 대상 물질을 분석(특히 측정)하여 피검 시료 중의 분석 대상 물질의 양을 분석(특히 측정)할 수 있다.
(실시예)
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
≪ 실시예 1: 유화제 (양친매성 블록 폴리머)의 합성 ≫
본 실시예에서는, 이하에 표시하는 반응 공정식에 따라, 유화제 (양친매성 블록 폴리머: PSt21-b-POEGMA41-Cl)를 합성한 후 가브리엘(ガブリエル)합성하여, ω 말단 아미노화 양친매성 블록 폴리머 PSt21-b -POEGMA41-NH2를 합성하였다.
[화4]
Figure 112017028543060-pct00004
10g의 스티렌 (칸토화학(關東化學))와 개시제인 1g의 HEBiB(2-hydroxyethyl-2-bromoisobutyrate)에, 질소 분위기 하에서 2g의 2,2'-비피리딘(bipyridine; bpy)과 0.6g의 CuBr을 가하여, 110℃에서 중합을 실시했다. 또한 HEBiB는 BiB(2-bromoisobutyryl bromide)과 에틸렌글리콜로부터 합성한 것을 사용했다. 중합 종료 후, 테트라하이드로퓨란(THF)을 희석하고, 메탄올 중에서 재침전하여 PSt21-Br을 얻었다.
0.66g의 PSt21-Br에 7.0g의 OEGMA (oligo (ethylene glycol) methyl ether methacrylate (중합도: 9) : 신중부 화학공업(新中村化工業)과 0.14g의 Me6TREN (tris(2-N,N-dimethylamino)ethyl)amine: 치바 대학(千葉大)), 0.03g의 CuCl을 12mL의 톨루엔 (칸토화학(關東化學)) 중에서 혼합하고 80 ℃에서 24시간 중합했다.
중합 종료 후, THF에 용해시켜 알루미나 컬럼을 통해, 구리 착물을 제거했다. 다음 헥산 중에서 재침전하고, 이것을 톨루엔에 용해시키고, 톨루엔/메탄올의 1:1 용매 중에서 투석을 실시하여, 얻어진 용액을 증발기(エバポレ-タ)로 농축하여 양친매성 블록 폴리머-PSt21-b-POEGMA41-Cl을 얻었다.
0. 80g의 PSt21-b-POEGMA41-Cl에 0.07g의 KPHI(Potassium phthalimide)과 5mL의 N,N-디메틸 포름아미드(DMF)를 첨가하여 50℃에서 16 시간 동안 교반 하였다. 이어서, 15mL의 톨루엔을 가하여 미반응의 KPHI을 제거했다. 또한, 톨루엔/메탄올의 1:1 용매 중에서 투석을 실시했다. 얻어진 용액을 증발기(エバポレ-タ)로 농축하였다.
여기에 0.02g의 H2N-NH2·H2O 및 6mL의 DMF를 첨가하여 50℃에서 16 시간 동안 교반 하였다. 그 후, 톨루엔을 가하여 톨루엔/메탄올의 1:1 용매 중에서 투석을 실시했다. 얻어진 용액을 증발기로 농축하고 ω말단에 아미노기를 갖는 양친매성 블록 폴리머 PSt21-b-POEGMA41-NH2를 얻었다.
≪ 실시예 2: 유화제를 이용한 라텍스 입자의 합성 ≫
실시예 1에서 얻어진 0.05g의 PSt21-b-POEGMA41-NH2를 0.1g의 스티렌에 용해시키고, 또한 1.2g 초순수를 더했다. 이 혼합물을 90℃까지 승온하고, 10 분간 교반하여 W/O형 에멀젼을 얻었다.
그 후, 빙욕(氷浴)하면서 교반하여 전송유화(轉送乳化) 조작을 행하여, O/W형 에멀젼을 얻었다. 0.03g의 수용성 개시제(VA-044: 화광순약공업(和光純工業))을 넣고, 40℃에서 6 시간 중합했다.
얻어진 라텍스 입자의 입경을 동적 광산란 장치(DLS:ELSZ-1000ZSCK light scattering apparatus Otsuka)로 측정한 바, 52±20nm으로 되었다.
≪ 실시예 3: 유화제의 소수성 세그먼트 체인 길이가 입경에 미치는 영향 ≫
　실시예 1에 따라, 소수성 세그먼트에 폴리스티렌의 13, 21, 46, 95의 반복 단위 (일반식 (1)의 n에 해당) 및 친수성 세그먼트의 주쇄에 42, 41, 45, 36 반복 단위 (일반식 (1)에서 m에 상당)을 갖는, 표 1에 나타난 양친매성 블록 폴리머를 합성하였다. 또한 이식부(グラフト部)에는 OEGMA (중합도:9)을 사용하였다. 소수성 세그먼트의 반복 단위의 제어는 모노머(스티렌)/개시제(HEBiB)의 몰비(M/I 비)를, 표 1에 나타내는 값으로 하여 실시하였다. 친수성 세그먼트의 반복 단위의 제어는 모노머(OEGMA)/개시제(PSt-Br)의 몰비를 50으로 통일하여 실시했다.
다음, 실시예 2에 따라, 표1에 기재된 조합, 즉 PSt13과 OEGMA42의 조합, PSt21과 OEGMA41의 조합, PSt46과 OEGMA45의 조합, PSt95과 OEGMA36의 조합의 라텍스 입자를 합성하였다.
동적 광산란 장치(DLS)로 입경을 측정했다. 도 1에 라텍스 입자의 입경 분포를 나타내고, 표 1 입경을 나타낸다. 도 1에 나타난 4 개의 피크는, 왼쪽에서부터, PSt13-b-POEGMA42-Cl, PSt21-b-POEGMA41-Cl, PSt46-b-POEGMA45-Cl, PSt95-b-OEGMA36-Cl의 결과이다. 평균 입경 32nm ~ 120nm의 라텍스 입자를 합성할 수 있고, Mw/Mn은 약 1.4이며, 입경 분포가 좁게 합성할 수 있는 것으로 나타났다. 또한 라텍스 입자의 입경은 소수성 세그먼트 체인 길이에 따라 증가하는 것으로 나타났다. Mn은 수평균 분자량, Mw는 중량 평균 분자량, Mw/Mn은 분자량 분포를 나타낸다.
Figure 112017028543060-pct00005
≪ 실시예 4: 라텍스 입자에 HRP의 도입 ≫
　실시예 1에 따라, 모노머(OEGMA)를 개시제(PSt20-Br)에 대해, 24 등량(等量) 첨가하여 PSt20-b-POEGMA24-NH2를 제작하였다. 이어서 실시예 2와 동일한 방법으로 라텍스 입자를 합성하였다 (입경 = 22 ± 6nm). 이 라텍스 입자 0.5mg을 인산 나트륨 완충액(pH = 7.00)에 분산시켰다.
다음으로, 알데히드기를 갖는 활성화 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (activated horseradish peroxidase (HRP: EZ-Link Plus Activated Peroxidase (Thermo scientific 사 제품)))를 입자수의 10 배량 더했다. 이것을 실온에서 1 시간 정치한 후 과량의 수소화 붕소 나트륨 수용액을 더했다. 5℃에서 1 시간 정치한 후, 중공사 필터(20mmol/L 인산 나트륨 완충액, 0.1 % Tween20)에 의해 정제하여, HRP 고정화 고분자 미립자를 얻었다.
얻어진 고분자 미립자 분산액 (8X108 Particles/mL) 100μL에 테트라 메틸벤지딘(TMB) 200μL를 첨가하였다. 30분 후 200mmol/L 황산 수용액 200μL를 추가하여 반응을 정지시켰다. 용액의 450nm에서의 흡광도가 상승했다 (OD = 0.8). 이 때문에 라텍스 입자 표면으로의 HRP가 화학적으로 도입된 것을 확인할 수 있었다.
이상, 본 발명을 특정 실시예에 따라 설명했지만, 당업자에게 자명한 변형이나 개량은 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims (10)

  1. 모노머, 라디칼 중합 개시제, 유화제를 중합하여 얻어지는 생리 활성 물질 담지용 고분자 라텍스 입자로서, 상기 유화제는 하기 일반식 (1):
    [화1]
    Figure 112021015776890-pct00009

    [식에서 n은 5 이상의 정수이며,
    m은 5 이상의 정수이며,
    R1 및 R4는 각각 독립적으로 적어도 어느 한쪽이 카르복실기, 말레이미드기, 아미노기, 메르캅토기, 히드록실기, 알데히드기 및 에폭시기로 이루어진 군에서 선택되는 생리 활성 물질 담지용 관능기이며,
    R1이 생리 활성 물질 담지용 관능기가 아닌 경우, R1은 수소 원자, 메틸기, 에틸기 및 프로필기로 이루어진 군에서 선택되고,
    R4가 생리 활성 물질 담지용 관능기가 아닌 경우, R4는 수소 원자, 할로겐 원자, 메틸기, 에틸기 및 프로필기로 이루어진 군에서 선택되고,
    R2-1 및 R2-2는 각각 독립적으로 수소 원자, 메틸기, 에틸기 또는 프로필기이고,
    R3는 친수성 화합물에서 유래하는 관능기이며,
    R5는 소수성을 부여하는 관능기이며,
    R6는 할로겐 원자 또는 유화제 합성시의 개시제 유래의 관능기이다]
    로 표시되는 양친매성 블록 폴리머인, 상기 생리 활성 물질 담지용 고분자 라텍스 입자.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 R3에 있어서 상기 친수성 화합물이, 올리고(폴리)에틸렌 글리콜, 2-메타크릴로일 옥시에틸 포스포릴콜린 폴리머, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아미노산, 폴리펩티드, 단당류 및 다당류로 이루어진 군에서 선택되는 화합물인, 생리 활성 물질 담지용 고분자 라텍스 입자.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 R5는 수소 원자, 할로겐 원자, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 치환 또는 비치환의 방향족 화합물기, 카르보닐기, 아미드기, 알데히드기 및 케톤기, 및 아민, 알데히드, 케톤 및 에테르의 각 화합물에서 유래하는 관능기로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 관능기인, 생리 활성 물질 담지용 고분자 라텍스 입자.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 유화제의 수평균 분자량이 1000 ~ 100만인, 생리 활성 물질 담지용 고분자 라텍스 입자.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 일반식 (1)에 표시된 친수성 세그먼트의 수평균 분자량이 500 ~ 50만인, 생리 활성 물질 담지용 고분자 라텍스 입자.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 일반식 (1)에 표시된 소수성 세그먼트의 수평균 분자량이 500 ~ 50만인, 생리 활성 물질 담지용 고분자 라텍스 입자.
  8. 모노머, 라디칼 중합 개시제, 유화제를 사용하여 미니 에멀젼 중합을 할 때, 상기 유화제가 하기 일반식 (1):
    [화 2]
    Figure 112021015776890-pct00007

    [식에서 n은 5 이상의 정수이며,
    m은 5 이상의 정수이며,
    R1 및 R4는 각각 독립적으로 적어도 어느 한쪽이 카르복실기, 말레이미드기, 아미노기, 메르캅토기, 히드록실기, 알데히드기 및 에폭시기로 이루어진 군에서 선택되는 생리 활성 물질 담지용 관능기이며,
    R1이 생리 활성 물질 담지용 관능기가 아닌 경우, R1은 수소 원자, 메틸기, 에틸기 및 프로필기로 이루어진 군에서 선택되고,
    R4가 생리 활성 물질 담지용 관능기가 아닌 경우, R4는 수소 원자, 할로겐 원자, 메틸기, 에틸기 및 프로필기로 이루어진 군에서 선택되고,
    R2-1 및 R2-2는 각각 독립적으로 수소 원자, 메틸기, 에틸기 또는 프로필기이고,
    R3는 친수성 화합물에서 유래하는 관능기이며,
    R5는 소수성을 부여하는 관능기이며,
    R6는 할로겐 원자 또는 유화제 합성시의 개시제 유래의 관능기이다]
    로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 생리 활성 물질 담지용 고분자 라텍스 입자의 제조 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 유화제의 합성이 제어/리빙 라디칼 중합 또는 이온 중합인, 제조 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 미니 에멀젼 중합이 전상유화법인, 제조 방법.
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