JPWO2016035806A1

JPWO2016035806A1 - 生理活性物質担持用高分子微粒子及びその製造方法

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Publication number: JPWO2016035806A1
Application number: JP2016546666A
Authority: JP
Inventors: 淳門脇; 谷口　竜王; 竜王谷口; 祐亮佐々木; 菜穂小西
Original assignee: Chiba University NUC; LSI Medience Corp
Current assignee: Chiba University NUC; LSI Medience Corp
Priority date: 2014-09-02
Filing date: 2015-09-02
Publication date: 2017-07-06
Anticipated expiration: 2035-09-02
Also published as: KR102270242B1; JP6671688B2; CN107076741A; EP3190417A1; US20170299580A1; WO2016035806A1; CN107076741B; US10557848B2; EP3190417A4; KR20170047306A

Abstract

分析精度や感度が高く、且つ、安定して製造できる分析試薬を提供可能な、簡便且つ精密に、生理活性物質を担持させる官能基量をコントロール可能であり、且つ、非特異反応を抑制する親水性化合物をラテックス粒子表面に導入可能であり、且つ、粒径分布を狭く均一に製造することが可能な新規の生理活性物質担持用高分子微粒子及びその製造方法を提供する。前記生理活性物質担持用高分子微粒子は、モノマー、ラジカル重合開始剤、乳化剤を重合して得られる生理活性物質担持用高分子微粒子であって、該乳化剤は、下記一般式（１）で表される両親媒性ブロックポリマーである。

Description

本発明は、生理活性物質担持用高分子微粒子及びその製造方法に関する。
なお、本明細書における「分析」には、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」との両方が含まれる。

現在、臨床診断検査の現場では、多数の検体について疾病診断の指標となる多岐に渡る物質を短時間且つ高精度に測定し、その結果を迅速・正確に治療現場にフィードバックすることが求められている。例えば、粒子表面に生理活性物質（抗体、酵素、受容体等のタンパク質、抗原、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸物質、或いは糖鎖等）を結合させた分析系、例えば、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定によって、微量な分析対象物の正確な定量が多く実施されている。特に検出感度や正確性を向上させるための方法として、分析対象物質に対する抗原又は抗体を、ポリスチレン等の合成高分子（いわゆるラテックス）粒子の表面に担持させた粒子を利用したラテックス凝集法が公知である。ラテックス凝集法とは、分析対象物質と、ラテックス粒子に結合した抗原又は抗体との反応により生じるラテックス粒子の凝集の程度を目視あるいは光学的に検出することにより、短時間に分析対象物質を測定する方法である。

また、ラテックス粒子を磁性粒子にすることで、磁性粒子に結合した第一抗体により分析対象物をトラップし、磁石で集積させて未反応物等を洗浄後（いわゆるＢ／Ｆ分離）、酵素や蛍光剤等シグナルを発生する物質を標識した第二抗体を添加して分析するサンドイッチ法も多用されている。

抗原抗体反応によって定量する分析対象物質の多くは、一般的に生体試料中に含まれる微量成分であり、低濃度領域における定量性を重視している。しかし、疾病の進行度合いによっては測定対象物質濃度が異常に高値を示す場合があるため、臨床検査の現場においては、低値から高値までを正確に測定できる性能を有する試薬が求められている。

ラテックス凝集法でもサンドイッチ法でも、ラテックス粒子を用いる場合には、ラテックス粒子の表面に抗原又は抗体を固定することが必要である。その方法としては、物理的又は化学的に担持させる方法が用いられている。例えば、物理的吸着によりラテックス粒子に抗原又は抗体を直接固定化するか、あるいは、ラテックス粒子の表面の官能基、例えば、カルボキシル基、マレイミド基、アミノ基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、又はエポキシ基などを介した共有結合により、ラテックス粒子に抗原又は抗体を結合させる方法が使用されている。

物理的な結合方法に比べて、化学的結合方法の優位な点は、抗体が共有結合を介してラテックス粒子表面に結合されることから、抗体を安定に表面に担持できることである。ラテックス粒子表面への官能基の結合方法は、種々報告されているが、製造ロット差、結合された官能基量のコントロールが困難であり、安定して精度良く生理活性物質を担持した粒子を作製できないことが問題となっている（特許文献１、特許文献２）。

また、ラテックス粒子表面の官能基量の定量方法は種々報告されているが、例えばカルボキシル基の定量に使用される酸塩基滴定を行い、電気伝導度の変化から定量する手法では、官能基量が非常に微量な場合、正確な定量は困難である。臨床診断に使用されるラテックス粒子は微小なので官能基量は微量になるため、正確な定量が困難であることは、臨床診断薬の製造へ安定した供給が出来ないこととなり、問題となっている。

また、ラテックス粒子表面と生体試料を結合させるための生理活性物質担持用の官能基の間の距離を制御することは、臨床診断薬などのバイオマテリアルへの応用を考えた場合に重要である。これまで、二重結合を有し更にポリエチレグリコールなどの親水性高分子を介して官能基を有する化合物をマクロモノマーとして、スチレンなどのモノマーと共重合しラテックス表面に結合させる技術があるが、結合した官能基量をコントロールすることや、製造ロット差の小さいラテックス粒子を得ることは困難であり、問題となっている。

さらに、ラテックス凝集法の問題点として、測定対象物質以外の夾雑物が、ラテックス粒子表面に吸着すること（非特異吸着）によって、非特異的な凝集を引きおこし、この非特異的な凝集を測定対象物質として定量してしまう非特異反応が挙げられる。

一般的に、非特異反応を抑制する方法として、予めラテックス粒子にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）や糖を吸着させておく手段があるが、ＢＳＡや糖の吸着量や、生物由来のタンパク質であるＢＳＡのロット差などを一定にすることは難しく、安定して、ラテックス凝集法による分析試薬の提供することは困難である（特許文献３）。

さらに高分子粒子の合成時に分析対象物質に対する抗原・抗体を存在しておくことによって、高分子微粒子に抗原抗体を修飾し、従来発生していた非特異吸着を抑制する方法が報告されているが、充分ではない（特許文献４）

また、非特異吸着の抑制方法として、非特異反応の抑制に有効であることが知られているポリエチレングリコールの末端に重合可能な二重結合を有する化合物をモノマーとして使用し、高分子微粒子を合成する方法が知られている（特許文献５）が、充分ではない。

さらに、非特異吸着の抑制に効果のあるモノマーを重合時に存在させておくことによって、非特異吸着を抑制する技術が開発されているが、充分ではない（特許文献６）。

最近では、ポリエチレングリコールに疎水性ユニットを導入したブロックマスター（ＪＳＲ社）をラテックス粒子表面に吸着させ、非特異反応を抑制する方法が開発されている。しかし、免疫学的分析試薬の調製工程の煩雑さによるロット間差の増大や、ブロックマスターの修飾量を定量することが難しいといった問題がある。

従って、臨床診断薬に用いられるラテックス粒子は、臨床診断薬の製造の安定性や臨床診断薬の精度を向上させることが求められているが、未だ達成されていない。

特開２００４−５９６９６号公報特開２００４−６１３０１号公報特開２００７−１４５９８５号公報Ｗ０２００８／０４７７９９号公報特開２００３−２３１６４８号公報特開２００７−１０００３５号公報

本発明者らは、ラテックス粒子の合成に関する前記の問題を克服するため、鋭意研究を重ねた結果、簡便且つ精密に、生理活性物質を担持させる官能基量を制御可能であり、且つ、非特異反応を抑制する親水性化合物をラテックス粒子表面に導入可能であり、且つ、粒径分布を狭く均一に製造することが可能な新規の生理活性物質担持用高分子微粒子及びその製造方法を見出した。

本発明の課題は、分析精度や感度が高く、且つ、安定して製造できる分析試薬を提供可能な、簡便且つ精密に、生理活性物質を担持させる官能基量をコントロール可能であり、且つ、非特異反応を抑制する親水性化合物をラテックス粒子表面に導入可能であり、且つ、粒径分布を狭く均一に製造することが可能な新規の生理活性物質担持用高分子微粒子及びその製造方法を提供することにある。

従来は、一つの問題点しか解決できない、しかも十分には解決できず、また、非常に煩雑で難しい方法しか知られていなかったが、驚くべきことに、前記課題は、モノマー、ラジカル重合開始剤、乳化剤を用いてミニエマルション重合を行う際に、乳化剤として下記一般式（１）で示されるような、一分子内に生理活性物質担持用官能基を有し、且つ、親水性セグメント及び疎水性セグメントからなる両親媒性ブロックポリマーであって、前記親水性セグメントが非特異反応を抑制する、高分子乳化剤を使用することによって、特に三つの問題点を同時に、より簡便な方法で解決することができる。

本発明は、
［１］モノマー、ラジカル重合開始剤、乳化剤を重合して得られる生理活性物質担持用高分子微粒子であって、該乳化剤は、下記一般式（１）：
〔式中、ｎは、５以上の整数であり、
ｍは、５以上の整数であり、
Ｒ１及びＲ４は、それぞれ独立して、少なくともいずれか一方が生理活性物質担持用官能基であり、
Ｒ２_−１及びＲ２_−２は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基、エチル基、又はプロピル基であり、
Ｒ３は、親水性化合物に由来する官能基であり、
Ｒ５は、疎水性を付与する官能基であり、
Ｒ６は、ハロゲン原子、又は、乳化剤合成時の開始剤由来の官能基である〕
で表される両親媒性ブロックポリマーである、前記生理活性物質担持用高分子微粒子、
［２］前記Ｒ１又はＲ４が、カルボキシル基、マレイミド基、アミノ基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、及びエポキシ基からなる群から選択される基である、［１］の生理活性物質担持用高分子微粒子、
［３］前記Ｒ３における前記親水性化合物が、オリゴ（ポリ）エチレングリコール、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアミノ酸、ポリペプチド、単糖類、及び多糖類からなる群から選択される化合物である、［１］又は［２］の生理活性物質担持用高分子微粒子、
［４］前記Ｒ５が、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、エチル基、プロピル基、置換または非置換の芳香族化合物基、カルボニル基、アミド基、アミノ基、アルデヒド基、及びケト基、並びに、アミン、アルデヒド、ケトン、及びエーテルの各化合物に由来する官能基からなる群から選択される１又はそれ以上の官能基である、［１］〜［３］のいずれかの生理活性物質担持用高分子微粒子、
［５］前記乳化剤の分子量が、１０００〜１００万である、［１］〜［４］のいずれかの生理活性物質担持用高分子微粒子、
［６］前記親水性セグメントの分子量が、５００〜５０万である、［１］〜［５］のいずれかの生理活性物質担持用高分子微粒子、
［７］前記疎水性セグメントの分子量が、５００〜５０万である、［１］〜［６］のいずれかの生理活性物質担持用高分子微粒子、
［８］モノマー、ラジカル重合開始剤、乳化剤を用いてミニエマルション重合を行う際に、該乳化剤が下記一般式（１）：
〔式中、ｎは、５以上の整数であり、
ｍは、５以上の整数であり、
Ｒ１及びＲ４は、それぞれ独立して、少なくともいずれか一方が生理活性物質担持用官能基であり、
Ｒ２_−１及びＲ２_−２は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基、エチル基、又はプロピル基であり、
Ｒ３は、親水性化合物に由来する官能基であり、
Ｒ５は、疎水性を付与する官能基であり、
Ｒ６は、ハロゲン原子、又は、乳化剤合成時の開始剤由来の官能基である〕
で表される化合物であることを特徴とする、生理活性物質担持用高分子微粒子の製造方法、
［９］前記乳化剤の合成が、制御／リビングラジカル重合又はイオン重合である、［８］の製造方法、
［１０］前記ミニエマルション重合が、転相乳化法である、［８］又は［９］の製造方法
に関する。

本発明によれば、簡便且つ精密に、生理活性物質を担持させる官能基量をコントロール可能であり、且つ、非特異反応を抑制する親水性化合物をラテックス粒子表面に導入可能であり、且つ、粒径分布を狭く均一に製造することが可能な新規の生理活性物質担持用高分子微粒子及びその製造方法を提供することができる。

ラテックス粒子の粒径分布を示す。横軸は粒径、縦軸は粒子の割合である。

本発明の生理活性物質担持用高分子微粒子は、モノマー、ラジカル重合開始剤、乳化剤を含み、該乳化剤は、下記に記載する特徴を有するものである。

本発明で使用可能な乳化剤は、少なくとも以下の特徴：
[１]親水性セグメントと疎水性セグメントからなる両親媒性ブロックポリマーであって、
[２]前記親水性セグメント末端（Ｒ１、Ｒ４のいずれか一カ所以上）に生理活性物質担持用官能基を有する。
前記乳化剤と前記モノマーは、ミニエマルション重合反応によって、共有結合しても良いし、共有結合しなくても良い。例えば、前記乳化剤が、疎水性セグメント内もしくは末端に、重合可能な二重結合を有する場合、高分子微粒子と共有結合することが可能である。一方、前記乳化剤の疎水性セグメントは、高分子微粒子と強く相互作用するため、重合反応時に添加された乳化剤は高分子微粒子に強く結合され、共有結合しなくても安定な状態を保つことができるので、重合反応が容易であり好ましい。

すなわち、本発明で使用可能な乳化剤は、以下の一般式（１）で表される。
〔式中、ｎは、５以上の整数であり、
ｍは、５以上の整数であり、
Ｒ１及びＲ４は、少なくともいずれか一方が生理活性物質担持用官能基であり、
Ｒ２_−１及びＲ２_−２は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基、エチル基、又はプロピル基であり、
Ｒ３は、親水性化合物に由来する官能基であり、
Ｒ５は、疎水性化合物を付与する官能基であり、
Ｒ６は、ハロゲン原子、又は、乳化剤合成時の開始剤由来の官能基である〕

本発明で使用可能な乳化剤の主鎖はアルキル鎖からなる。
また、本発明で使用可能な乳化剤の分子量（数平均分子量）としては、１０００以上１００万以下、好ましくは１５００以上５０万以下、更に好ましくは２０００以上２５万以下、特に好ましくは３０００以上２０万以下である。
また、本発明で使用可能な乳化剤の分子量分布としては、多分散度であるＭｗ（重量平均分子量）／Ｍｎ（数平均分子量）が、１以上２以下、好ましくは１．８以下、更に好ましくは１．５以下であると良い。制御／リビングラジカル重合又はイオン重合によって、容易に合成することができる。

本発明で使用可能な乳化剤の親水性セグメントは、全体として親水性であれば良い。また、親水性セグメントの主鎖及びグラフト鎖（Ｒ３−Ｒ４）の長さは、適宜、公知のものから選択したり、任意に合成したりすることができる。
親水性セグメントとしては、分子量５００以上５０万以下、好ましくは１０００以上４０万以下、更に好ましくは２０００以上３０万以下、特に好ましくは３０００以上２５万以下である。ｍは、５以上であり、５以上５００以下が好ましく、更に１０以上３００以下が好ましい。

前記親水性セグメントのグラフト鎖は、親水性化合物部分を含み、基Ｒ３として、該親水性化合物に由来する官能基を有する。
本発明に使用可能な前記親水性化合物としては、例えば、オリゴ（ポリ）エチレングリコール、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアミノ酸、ポリペプチド、単糖類、多糖類等が挙げられる。本発明で使用可能な乳化剤として合成可能な親水性化合物であれば、公知のものから適宜選択して使用することができる。
Ｒ３の分子量は、２０〜１万が好ましく、更に５０〜５０００が好ましい。

本発明で使用可能な乳化剤の疎水性セグメントは、全体として疎水性であれば良い。
疎水性セグメントとしては、分子量５００以上５０万以下、好ましくは１０００以上４０万以下、更に好ましくは２０００以上３０万以下、特に好ましくは３０００以上２５万以下である。ｎは、５以上であり、５以上５００以下が好ましく、更に１０以上３００以下が好ましい。
前記疎水性セグメントの分子量を選択することによって、本発明の生理活性物質担持用高分子微粒子の粒径を制御することができる。

一般式（１）における基Ｒ１又はＲ４、すなわち、本発明で使用可能な生理活性物質担持用官能基としては、公知の生理活性物質担持用官能基から適宜選択して使用することができるが、例えば、カルボキシル基、マレイミド基、アミノ基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、又はエポキシ基等が挙げられる。目的に合わせて、種類や数を適宜選択することができる。生理活性物質担持用官能基が導入された乳化剤を使用することによって、一微粒子に導入する生理活性物質担持用官能基量を容易に制御することができる。
該Ｒ１又は該Ｒ４が、生理活性物質担持用官能基でない場合は、公知の原子や官能基から適宜選択して使用することができるが、例えば、水素原子、ハロゲン、メチル基、エチル基、又はプロピル基が挙げられる。

基Ｒ２_−１及びＲ２_−２は、乳化剤の両親媒性や、生理活性物質担持用官能基の機能を妨げない限り、特に限定されるものではないが、例えば、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基等が好ましい。Ｒ２_−１及びＲ２_−２は、同じでも良いし、異なっても良い。それぞれの化合物や合成方法に合わせて、適宜選択して使用することができる。

更に、前記疎水性セグメントのグラフト鎖は、基Ｒ５として、疎水性を付与する官能基を有する。該疎水性を付与する官能基としては、例えば、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、エチル基、プロピル基、置換または非置換の芳香族化合物基、カルボニル基、アミド基、アミノ基、アルデヒド基、ケト基、あるいは、アミン、アルデヒド、ケトン、又はエーテルの各化合物に由来する官能基（例えば、前記各化合物から１又はそれ以上の原子が除かれた基）等が挙げられる。Ｒ５は、全て同じ基であることもできるし、２以上の異なる基であることもできる。
このような疎水性セグメントの主鎖及びＲ２_−１及びＲ５は、例えば、炭素二重結合を有するモノマーを重合して得ることができる。前記モノマーとしては、例えば、エチレン、プロピレン、スチレンスルホン酸、スチレン、メタクリレート、アクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド等を挙げることができ、これらの１つを単独で、あるいは、複数組合せて用いることができる。

本発明で使用可能な乳化剤の疎水性セグメントの末端Ｒ６は、乳化剤の重合法に従って、公知のものから適宜選択して使用することができる。例えば、乳化剤の重合に使用する開始基に由来する官能基やハロゲン原子が挙げられる。また、高分子微粒子を合成する際の重合法に従って、公知のものから適宜選択して使用することもできる。例えば、高分子微粒子を合成する際にモノマーと共有結合する場合には、二重結合を導入することもできる。

本発明で使用可能な乳化剤の合成は、例えば、制御／リビングラジカル重合、イオン重合を使用することができる。制御／リビングラジカル重合として例えば、ＲＡＦＴ（ＲｅｖｅｒｓｉｂｌｅＡｄｄｉｔｉｏｎＦｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｈａｉｎＴｒａｎｓｆｅｒＰｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、ＮＭＰ（ＮｉｔｒｏｘｉｄｅＭｅｄｉａｔｅｄＰｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、ＡＴＲＰ（ＡｔｏｍＴｒａｎｓｆｅｒＲａｄｉｃａｌＰｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）等が挙げられる。制御／リビングラジカル重合、イオン重合で合成された乳化剤を用いることで、本発明の生理活性物質担持用高分子微粒子の粒径分布を狭く均一に製造することができる。
これらの合成方法は、親水性セグメントに導入する生理活性物質担持用官能基等によって、好適な方法を選択することができる。

本発明で使用可能な乳化剤の合成は、公知の方法から適宜選択して使用することができるが、例えば、疎水性セグメントから合成を開始し、その後、親水性セグメントを合成する場合や、親水セグメントから合成し、その後、疎水性セグメントを合成する方法等がある。目的に応じて好適な方法を選択することができる。

本発明で使用可能なラジカル重合開始剤としては、通常のミニエマルション重合で使用可能なラジカル重合開始剤を使用することができ、例えば、過酸化開始剤、過硫酸開始剤、アゾ系開始剤、アゾ系低温型開始剤、又はレドックス開始剤を挙げることができる。本発明においては、転相乳化温度よりも低温で重合を行うことができる点で、レドックス開始剤もしくは、アゾ系低温型開始剤を用いることが好ましいが、特に制約を設けるものではない。

前記過酸化開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）、ジ−ｔ−ブチルペルオキシド（ＤＢＰＯ）、過酸化アンモニウムを挙げることができる。前記過硫酸開始剤としては、例えば、過硫酸カリウム（ＫＰＳ）、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、過硫酸ナトリウム（ＮＰＳ）を挙げることができる。

前記アゾ系開始剤としては、例えば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、ジメチル２，２’−アゾビスイソブチレート（ＭＡＩＢ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）を挙げることができる。アゾ系開始剤の内、低温で実施できる前記アゾ系低温型開始剤としては、例えば、水溶性アゾ重合開始剤であるＶＡ−０４４（和光純薬工業）もしくは油溶性アゾ重合開始剤であるＶ−７０（和光純薬工業）等を挙げることができる。

前記レドックス開始剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン［N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine（ＴＭＥＤＡ）］／過硫酸カリウム［potassium persulfate（ＫＰＳ）］、ＦｅＳＯ_４／ＫＰＳ、ＦｅＳＯ_４／Ｈ_２Ｏ_２、アスコルビン酸（ビタミンＣ）／Ｈ_２Ｏ_２等を挙げることができる。

本発明で使用可能なモノマーは、通常のミニエマルション重合で使用可能なモノマーを使用することができる。例えば、スチレン、スチレン誘導体（例えば、クロロメチルスチレン、スチレンスルホン酸ナトリウム）、ジビニルベンゼン、アクリル酸若しくはメタクリル酸、イタコン酸、無水マレイン酸、マレイン酸、フタル酸、アクリル酸エステル若しくはメタクリル酸エステル［例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ヘキサデシル（メタ）アクリレート］、酢酸ビニルを挙げることができる。さらにこれらのモノマーは、２種類以上を混合して使用することもできる。

本発明の生理活性物質担持用高分子微粒子の製造方法は、上記の本発明の生理活性物質担持用高分子微粒子を製造することができれば特に制限することは無く、重合反応の際に上記の本発明で使用可能な乳化剤を使用すること以外は、従来公知のミニエマルション重合（例えば、M. Antonietti, K. Landfester, Prog. Polym. Sci.,2002, 27, 689-757、J.M. Asua, Prog. Polym. Sci., 2002, 27, 1283-1346）と同様にして実施することができる。特に、強力な乳化装置を使用した高いせん断力を必要とせず、低エネルギープロセスで微粒子を作製できるので、転相乳化法や転相温度乳化法が好ましく、特に転相温度乳化法（例えば、L. Spernath, S. Magdassi, Polym. Adv. Technol.,2007, 18, 705-711）を使用することが好ましい。

通常のミニエマルション重合は、これに限定されるものではないが、例えば、モノマー、ラジカル重合開始剤、乳化剤を混合する工程、前記混合物を剪断する工程、並びに前記混合物を重合開始温度まで加熱して重合させる工程を含むことができる。ミニエマルション重合では、重合用モノマーと乳化剤とを混合した後、例えば、超音波照射による剪断工程を実施することにより、前記剪断力によりモノマーが引きちぎられ、乳化剤に覆われたモノマー微小油滴が形成される。次いで、ラジカル重合開始剤の重合開始温度まで加熱することにより、モノマー微小油滴をそのまま重合し、高分子微粒子が得られる。

転相温度乳化法では、例えば、外部環境（水／油の組成、温度、圧力、電解質濃度、および化学反応）によって引き起こされる界面活性剤の曲率の変化を利用して、連続相を油相から水相へ変化させることでＯ／Ｗ型エマルションを作製し、開始剤を加えて重合を行い、高分子微粒子が得られる。

高分子微粒子の重合時の反応条件、例えば、溶媒、混合比、温度、反応時間などは、使用するモノマー、及び、生理活性物質担持用官能基の種類、開始剤、乳化剤、合成する高分子微粒子の平均粒径、微粒子表面に担持させる生理活性物質の量などに応じて、例えば、パイロット試験を実施することにより適宜決定することができる。

本発明の生理活性物質担持用高分子微粒子を使用すること以外は、公知の方法に従って、分析試薬を作製することができる。
本発明で示す分析試薬とは、生理活性物質担持用高分子微粒子に、生体試料中の分析対象物質と反応可能な生理活性物質を担持させた、該分析対象物質を分析するための試薬である。
また、生理活性物質と分析対象物質の組み合わせ、また、生理活性物質と生理活性物質担持用官能基との反応は、公知の方法から適宜選択して使用することができる。

本発明の実施形態で使用可能な生理活性物質としては、生体試料中の分析対象物質と反応可能な物質であって、例えば、抗原、抗体、酵素、受容体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖鎖等が挙げられる。

本発明の実施形態で使用可能な生体試料中の分析対象物質としては、ＩｇＧ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フェリチン、β−２マイクログロブリン、α−フェトプロティン（ＡＦＰ）、ＩｇＥ、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＳ抗体又はＨＢｃ抗体）、Ｄダイマー、フィブリン・フィブリノゲン分解産物（ＦＤＰ）、可溶性フィブリン（Ｓｏｌｕｂｌｅｆｉｂｒｉｎ：ＳＦ）、プラスミン・α２−プラスミンインヒビター複合体（ＰＰＩ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、エラスターゼ１、エラスターゼＸＤＰ、トロンボモジュリン、又はアルブミン（好ましくは血清アルブミン）等を挙げることができる。

例えば、前記生理活性物質として抗体を用いる場合には、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いることができる。また、抗体の種類としては、免疫グロブリン分子自体のほか、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２又はＦｖ等も使用可能である。
例えば、前記生理活性物質としてＤＮＡを用いる場合には、分析対象物質の相補的な約５〜１００塩基のＤＮＡプローブを用いることができる。

本発明の実施形態で使用可能な分析可能な被検試料は、前記分析対象物質を含む可能性のある試料であれば、特に限定されず、特には生体試料、例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、又は細胞若しくは組織破砕液などを挙げることができる。

本発明の実施形態で使用可能な分析試薬は、公知のラテックス法（例えば、ラテックス凝集法、ラテックスを用いたＢ／Ｆ分離）で用いることができる。
ラテックス凝集法では、前記分析試薬と被検試料とを液中で接触させた際に生じた凝集の度合い（凝集度）を光学的に分析（特には測定）することにより、被検試料中の分析対象物質の量を分析（特には測定）することができる。ラテックス粒子の凝集度を光学的に検出する具体的方法においては、例えば、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度を測定する光学機器を用いて測定を行うことができる。好ましい測定波長は３００〜８００ｎｍである。測定方法は、公知の方法に従い、用いるラテックス粒子の大きさ（平均粒径）若しくは濃度の選択、又は反応時間の設定により、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度の増加又は減少を測定することにより行うことができる。また、これらの方法を併用することも可能である。
ラテックスを用いたＢ／Ｆ分離では、前記分析試薬と被検試料とを液中で接触させた後、Ｂ／Ｆ分離を行うことにより、ラテックス粒子と液とを分離し、前記ラテックス粒子に結合した分析対象物質、あるいは、前記液中に残存する分析対象物質を分析（特に測定）することにより、被検試料中の分析対象物質の量を分析（特には測定）することができる。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは、本発明の範囲を限定するものではない。

≪実施例１：乳化剤（両親媒性ブロックポリマー）の合成≫
本実施例では、以下に示す反応工程式に従って、乳化剤（両親媒性プロックポリマー：ＰＳｔ_２１−ｂ−ＰＯＥＧＭＡ_４１−Ｃｌ）を合成した後、ガブリエル合成により、ω末端アミノ化両親媒性ブロックポリマーＰＳｔ_２１−ｂ−ＰＯＥＧＭＡ_４１−ＮＨ_２を合成した。

１０ｇのスチレン（関東化学）と、開始剤である１ｇのＨＥＢｉＢ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ−２−ｂｒｏｍｏｉｓｏｂｕｔｙｒａｔｅ）に、窒素雰囲気下で、２ｇの２，２’−ビピリジン（ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ；ｂｐｙ）と０．６ｇのＣｕＢｒを加えて、１１０℃で重合を行った。なお、ＨＥＢｉＢは、ＢｉＢ（２−ｂｒｏｍｏｉｓｏｂｕｔｙｒｙｌｂｒｏｍｉｄｅ）とエチレングリコールより合成したものを使用した。重合終了後、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）で希釈し、メタノール中で再沈することで、ＰＳｔ_２１−Ｂｒを得た。

０．６６ｇのＰＳｔ_２１−Ｂｒに７．０ｇのＯＥＧＭＡ（ｏｌｉｇｏ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ（重合度：９）：新中村化学工業）と０．１４ｇのＭｅ_６ＴＲＥＮ（ｔｒｉｓ（２−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｅ：千葉大学）、０．０３ｇのＣｕＣｌを、１２ｍＬのトルエン（関東化学）中で混合し、８０℃で２４時間重合した。
重合終了後、ＴＨＦに溶解させアルミナカラムを通して、銅錯体を除去した。次に、ヘキサン中で再沈を行い、これをトルエンに溶解させ、トルエン／メタノールの１：１溶媒中で透析を実施し、得られた溶液をエバポレータで濃縮することで両親媒性プロックポリマーＰＳｔ_２１−ｂ−ＰＯＥＧＭＡ_４１−Ｃｌを得た。

０．８０ｇのＰＳｔ_２１−ｂ−ＰＯＥＧＭＡ_４１−Ｃｌに、０．０７ｇのＫＰＨＩ（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ）と５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を加えて、５０℃で１６時間攪拌した。次に、１５ｍＬのトルエンを加えて未反応のＫＰＨＩを除去した。さらにトルエン／メタノールの１：１溶媒中で透析を行った。得られた溶液をエバポレータで濃縮した。
これに、０．０２ｇのＨ_２Ｎ−ＮＨ_２・Ｈ_２Ｏ及び６ｍＬのＤＭＦを加えて５０℃で１６時間攪拌した。その後、トルエンを加えてトルエン／メタノールの１：１溶媒中で透析を行った。得られた溶液をエバポレータで濃縮し、ω末端にアミノ基を有する両親媒性ブロックポリマーＰＳｔ_２１−ｂ−ＰＯＥＧＭＡ_４１−ＮＨ_２を得た。

≪実施例２：乳化剤を用いたラテックス粒子の合成≫
実施例１で得られた０．０５ｇのＰＳｔ_２１−ｂ−ＰＯＥＧＭＡ_４１−ＮＨ_２を０．１ｇのスチレンに溶解させ、さらに、１．２ｇ超純水を加えた。この混合物を９０℃まで昇温し、１０分間攪拌してＷ／Ｏ型エマルションを得た。
その後、氷浴しながら攪拌することで転送乳化操作を行い、Ｏ／Ｗ型エマルションを得た。０．０３ｇの水溶性開始剤（ＶＡ−０４４：和光純薬工業）を加え、４０℃で６時間重合した。
得られたラテックス粒子の粒径を動的光散乱装置（ＤＬＳ：ＥＬＳＺ−１０００ＺＳＣＫｌｉｇｈｔｓｃａｔｔｅｒｉｎｇａｐｐａｒａｔｕｓＯｔｓｕｋａ）にて測定したところ、５２±２０ｎｍとなった。

≪実施例３：乳化剤の疎水性セグメントの鎖長が粒径に及ぼす影響≫
実施例１に従い、疎水性セグメントにポリスチレンの１３、２１、４６、９５の繰り返し単位（一般式（１）におけるｎに相当）、及び、親水性セグメントの主鎖に、４２、４１、４５、３６の繰り返し単位（一般式（１）におけるｍに相当）を有する、表１に示す両親媒性プロックポリマーを合成した。なお、グラフト部には、ＯＥＧＭＡ（重合度：９）を用いた。疎水性セグメントの繰り返し単位の制御は、モノマー（スチレン）／開始剤（ＨＥＢｉＢ）のモル比（Ｍ／Ｉ比）を、表１に示す値にすることにより実施した。親水性セグメントの繰り返し単位の制御は、モノマー（ＯＥＧＭＡ）／開始剤（ＰＳｔ−Ｂｒ）のモル比を５０に統一することにより実施した。

次に、実施例２に従い、表１に記載の組合せ、すなわち、ＰＳｔ１３とＯＥＧＭＡ４２の組み合わせ、ＰＳｔ２１とＯＥＧＭＡ４１の組み合わせ、ＰＳｔ４６とＯＥＧＭＡ４５の組み合わせ、ＰＳｔ９５とＯＥＧＭＡ３６の組み合わせのラテックス粒子を合成した。

動的光散乱装置（ＤＬＳ）で粒径を測定した。図１にラテックス粒子の粒径分布を示し、表１に粒径を示す。図１に示す４つのピークは、左から、ＰＳｔ_１３−ｂ−ＰＯＥＧＭＡ_４２−Ｃｌ、ＰＳｔ_２１−ｂ−ＰＯＥＧＭＡ_４１−Ｃｌ、ＰＳｔ_４６−ｂ−ＰＯＥＧＭＡ_４５−Ｃｌ、ＰＳｔ_９５−ｂ−ＰＯＥＧＭＡ_３６−Ｃｌの結果である。平均粒径３２ｎｍ〜１２０ｎｍのラテックス粒子が合成でき、Ｍｗ／Ｍｎは約１．４で、粒径の分布が狭く合成できることがわかった。また、ラテックス粒子の粒径は、疎水性セグメントの鎖長にしたがい増大することがわかった。Ｍｎは数平均分子量、Ｍｗは重量平均分子量、Ｍｗ／Ｍｎは多分散度を示す。

≪実施例４：ラテックス粒子へのＨＲＰの導入≫
実施例１に従って、モノマー（ＯＥＧＭＡ）を開始剤（ＰＳｔ_２０−Ｂｒ）に対して、２４等量添加して、ＰＳｔ_２０−ｂ−ＰＯＥＧＭＡ_２４−ＮＨ_２を作製した。次いで実施例２と同様にしてラテックス粒子を合成した（粒径＝２２±６ｎｍ）。このラテックス粒子０．５ｍｇをリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．００）に分散させた。
次に、アルデヒド基を有する活性化ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ａｃｔｉｖａｔｅｄｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ：ＥＺ−ＬｉｎｋＰｌｕｓＡｃｔｉｖａｔｅｄＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）））を粒子数の１０倍量加えた。これを室温で１時間静置後、過剰量の水素化ホウ素ナトリウム水溶液を加えた。５℃で１時間静置後、中空糸フィルター(２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０)により精製し、ＨＲＰ固定化高分子微粒子を得た。
得られた高分子微粒子分散液（８Ｘ１０^８Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ）１００μＬにテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）２００μＬを加えた。３０分後、２００ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸水溶液２００μＬを加えることで反応を停止させた。溶液の４５０ｎｍにおける吸光度が上昇した（ＯＤ＝０．８）。このことから、ラテックス粒子表面へのＨＲＰが化学的に導入されたことが確認できた。

以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。

Claims

モノマー、ラジカル重合開始剤、乳化剤を重合して得られる生理活性物質担持用高分子微粒子であって、該乳化剤は、下記一般式（１）：
〔式中、ｎは、５以上の整数であり、
ｍは、５以上の整数であり、
Ｒ１及びＲ４は、それぞれ独立して、少なくともいずれか一方が生理活性物質担持用官能基であり、
Ｒ２_−１及びＲ２_−２は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基、エチル基、又はプロピル基であり、
Ｒ３は、親水性化合物に由来する官能基であり、
Ｒ５は、疎水性を付与する官能基であり、
Ｒ６は、ハロゲン原子、又は、乳化剤合成時の開始剤由来の官能基である〕
で表される両親媒性ブロックポリマーである、前記生理活性物質担持用高分子微粒子。
前記Ｒ１又はＲ４が、カルボキシル基、マレイミド基、アミノ基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、及びエポキシ基からなる群から選択される基である、請求項１に記載の生理活性物質担持用高分子微粒子。
前記Ｒ３における前記親水性化合物が、オリゴ（ポリ）エチレングリコール、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアミノ酸、ポリペプチド、単糖類、及び多糖類からなる群から選択される化合物である、請求項１又は２に記載の生理活性物質担持用高分子微粒子。
前記Ｒ５が、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、エチル基、プロピル基、置換または非置換の芳香族化合物基、カルボニル基、アミド基、アミノ基、アルデヒド基、及びケト基、並びに、アミン、アルデヒド、ケトン、及びエーテルの各化合物に由来する官能基からなる群から選択される１又はそれ以上の官能基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の生理活性物質担持用高分子微粒子。
前記乳化剤の分子量が、１０００〜１００万である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の生理活性物質担持用高分子微粒子。
前記親水性セグメントの分子量が、５００〜５０万である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の生理活性物質担持用高分子微粒子。
前記疎水性セグメントの分子量が、５００〜５０万である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の生理活性物質担持用高分子微粒子。
モノマー、ラジカル重合開始剤、乳化剤を用いてミニエマルション重合を行う際に、該乳化剤が下記一般式（１）：
〔式中、ｎは、５以上の整数であり、
ｍは、５以上の整数であり、
Ｒ１及びＲ４は、それぞれ独立して、少なくともいずれか一方が生理活性物質担持用官能基であり、
Ｒ２_−１及びＲ２_−２は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基、エチル基、又はプロピル基であり、
Ｒ３は、親水性化合物に由来する官能基であり、
Ｒ５は、疎水性を付与する官能基であり、
Ｒ６は、ハロゲン原子、又は、乳化剤合成時の開始剤由来の官能基である〕
で表される化合物であることを特徴とする、生理活性物質担持用高分子微粒子の製造方法。
前記乳化剤の合成が、制御／リビングラジカル重合又はイオン重合である、請求項８に記載の製造方法。
前記ミニエマルション重合が、転相乳化法である、請求項８又は９に記載の製造方法。