JP4560406B2 - 固相担体上における分子間の非特異相互作用の抑制方法 - Google Patents

固相担体上における分子間の非特異相互作用の抑制方法 Download PDF

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Description

本発明は、固相担体を用いた分子間相互作用における基盤技術に関する。より詳しくは、解析を目的とする分子を固相担体に固定化し、当該固相上での分子間相互作用を活用し、当該相互作用を測定、解析することによって、解析を目的とする分子に特異的な相互作用を有する分子（以下、ターゲット分子ともいう）を選別、精製する、あるいは分子間の特異的な相互作用を解析する技術に関する。
近年、分子間相互作用を基盤とした手法を用い、ある特定の分子に特異的な相互作用を有する分子を探索する試み、あるいは分子間相互作用を詳細に検討する研究が盛んに行われている。これは具体的には、低分子−低分子、低分子−高分子、あるいは高分子−高分子の組み合わせのうちの片方の分子を固相担体に固定し、両分子間の相互作用を測定する研究、あるいはそれに基づいて目的とするターゲット（固相担体に固定化した分子に特異的な相互作用を有する分子）を精製する研究に代表される。分子間相互作用を基盤とした各種手法の例としては、後者の例としての１）アフィニティー樹脂を用いたターゲット研究、前者の例としての２）表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｓｅ：ＳＰＲ）を応用した方法が有名である。１）の例としては、１９８９年のシュライバー教授によるアフィニティー樹脂を用いた免疫抑制剤ＦＫ５０６の結合タンパク質ＦＫＢＰ（ＦＫ５０６ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の発見（ＦＫ５０６の細胞内結合タンパク質としてのＦＫＢＰ１２の発見、Ｎａｔｕｒｅ，３４１，７５８，１９８９）、および引き続き行われたＦＫ５０６−ＦＫＢＰ複合体によるＦＫ５０６薬効メカニズムにおけるカルシニューリン阻害作用の発見（Ｃｅｌｌ，６６，８０７−８１５，１９９１）や、抗癌剤Ｔｒａｐｏｘｉｎのターゲットタンパク質としてのＨＤＡＣ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２，４０８，１９９６）発見等が有名である。また２）の例としては、固相担体として金薄膜を利用し、化合物あるいはタンパク質等とそれと特異的に相互作用するタンパク質等との相互作用を詳細に検討できるＢＩＡＣＯＲＥ（商品名）が有名である。
しかし、これまでに上記手法において、１）アフィニティー樹脂を用いたターゲット探索においてはアフィニティー樹脂に結合したタンパク質をＳＤＳゲル等で解析する際に特異的タンパク質を覆い隠すような非特異的タンパク質が存在し、特異的タンパク質の検出が困難になる、あるいは２）ＢＩＡＣＯＲＥ等を用いた解析においては、大きな非特異的タンパク吸着に起因するピークの存在による特異的タンパク結合によるピーク判別が困難になる等、特異的な分子間相互作用に基づく選別、精製の障害となる非特異的な分子間相互作用の存在が問題となってきた。これらは、重要な基盤技術である固相担体、詳しくは固相担体の表面の性状が原因と経験上考えられてきたが、どのような性状が非特異的な相互作用の要因となっているのか、またこのような非特異的な分子間相互作用を効率的に抑制する方法は明確に知られていないのが現状である。例えばＴｅｎｔａＧｅｌ（Ｆｌｕｋａ社、Ｃａｔ．Ｎｏ＝８６３６４）等一部の樹脂はＰＥＧスペーサーを有する化学的・物理的に安定でかつアフィニティークロマト用樹脂としても使用されているが（例；Ｔｈｏｒｐｅ ＤＳ，Ｗａｌｌｅ Ｓ．，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｄｅｆｉｎｅｓ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｌｉｎｋｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｒｇｅｔｓ ｔｏ ＴｅｎｔａＧｅｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｂｅａｄｓ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２０００ Ｍａｒ １６；２６９（２）：５９１−５）、非特異的な相互作用の抑制にどのような構造がどのように寄与しているのか等の基礎的な技術は知られないできているし、その非特異的な相互作用がどの程度抑制されているかあるいはアフィニティー樹脂として十分機能しているのかについての情報も充分でないのが現状である。
そのようなＰＥＧスペーサーとしては上記したＴｅｎｔａＧｅｌやＡｒｇｏＧｅｌ（Ａｒｇｏｎａｕｔ社）が市販されている。これらの構造は下記の通りである。
Figure 0004560406
また、親水的な性質を有する糖誘導体から構成される樹脂（例えば、アフィゲル（ＡｆｆｉＧｅｌ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、Ｃａｔ．Ｎｏ＝１５３−２４０１）やセファロース誘導体（ファルマシア社、ＥＣＨ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、Ｃａｔ．Ｎｏ＝１７−０５７１−０１）等が知られている）は、非特異的な分子間相互作用は小さいものの、糖誘導体であるため物理的・化学的に不安定でその使用は制限されるものであった。
上記分子間相互作用を基盤とした手法において、非特異的な相互作用を人為的に抑制することが可能となれば、得られた結果が特異的タンパク結合によるものかあるいは非特異的タンパク吸着によるものかの検定をする必要がなくなり、両者の区別が現実的に不可能であるためによる研究の中断の機会が減少するばかりでなく、使用するタンパク等の必要量も大幅に削減でき時間的面、労力的面においても大幅なコスト削減が可能となる等、これらの手法の適応は一段と増すと考えられる。
本発明は、固相担体上での分子間相互作用の解析において障害となる非特異的な相互作用を排除、抑制する方法の提供を目的とし、さらに当該方法を利用して、固相担体上に固定化された分子と特異的な相互作用を有する分子を精製・解析する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく、リガンドとして特定の低分子化合物を固相担体における固相表面に固定し、固定化したリガンドと特異的に相互作用する分子（ターゲット分子）あるいは非特異的に相互作用する分子を定量的に観測する研究を行い、固定化する化合物（リガンド）の疎水性パラメーターと非特異的な相互作用に相関性があること、すなわち固相表面の疎水的な性質が分子間の非特異的な相互作用を引き起こす要因の一つとなり得ることを見出した。さらにかかる知見をもとに、固相表面と検討対象分子であるリガンドとの結合に親水性のスペーサーを導入することにより非特異的な相互作用を抑制することに成功して本発明を完成するに至った。
即ち本発明は下記の通りである。
（１）固相担体における固相表面の疎水的性質を調節することを特徴とする、分子の固相表面への非特異的な吸着を調節する方法。
（２）分子Ａを固相担体に固定化し、当該固相上での分子Ａと該分子Ａと特異的に相互作用する分子Ｂとの間での特異的な相互作用を解析する過程において、固相担体における固相表面の疎水的性質を低減させる処理を行うことを特徴とする、分子Ａおよび／または固相担体と分子Ｂ以外の分子との非特異的な相互作用を抑制する方法。
（３）分子Ａを固相担体に固定化し、当該固相上での分子Ａと該分子Ａと特異的に相互作用する分子Ｂとの間での特異的な相互作用を用いて分子Ｂを選別する過程において、固相担体における固相表面の疎水的性質を低減させる処理を行うことを特徴とする、分子Ａおよび／または固相担体と分子Ｂ以外の分子との非特異的な相互作用を抑制する方法。
（４）分子Ａおよび分子Ｂの組み合わせが、低分子化合物および低分子化合物、低分子化合物および高分子化合物、ならびに高分子化合物および高分子化合物のいずれかである上記（２）または（３）記載の方法。
（５）分子Ａおよび分子Ｂの組み合わせが、低分子化合物および高分子化合物、または高分子化合物および高分子化合物である上記（２）または（３）記載の方法。
（６）固相担体における固相表面の疎水的性質を低減させる処理が、分子Ａの固相担体への固定化の際にそれらの間に親水性スペーサーを導入することである、上記（２）または（３）記載の方法。
（７）親水性スペーサーが、固相担体および分子Ａと結合した状態で以下の特徴のいずれかを少なくとも有するものである、上記（６）記載の方法：
（ｉ）水素結合アクセプター数が６以上である、
（ｉｉ）水素結合ドナー数が５以上である、
（ｉｉｉ）水素結合アクセプター数および水素結合ドナー数の総計が９以上である。
（８）さらに、該親水性スペーサーがその分子中にカルボニル基を１以上有するものである、上記（７）記載の方法。
（９）さらに、該親水性スペーサーが水溶液中で電荷的に陽性あるいは陰性になる官能基を有さないことを特徴とする、上記（７）または（８）記載の方法。
（１０）分子Ａを固相担体に固定化し、当該固相上での分子Ａと該分子Ａと特異的に相互作用する分子Ｂとの間での特異的な相互作用を解析する方法であって、固相担体における固相表面の疎水的性質を低減させる処理を行うことにより分子Ａおよび／または固相担体と分子Ｂ以外の分子との非特異的な相互作用を抑制することを特徴とする方法。
（１１）分子Ａを固相担体に固定化し、当該固相上での分子Ａと該分子Ａと特異的に相互作用する分子Ｂとの間での特異的な相互作用を用いて、分子Ｂを選別する方法であって、固相担体における固相表面の疎水的性質を低減させる処理を行うことにより分子Ａおよび／または固相担体と分子Ｂ以外の分子との非特異的な相互作用を抑制することを特徴とする方法。
（１２）分子Ａおよび分子Ｂの組み合わせが、低分子化合物および低分子化合物、低分子化合物および高分子化合物、ならびに高分子化合物および高分子化合物のいずれかである上記（１０）または（１１）記載の方法。
（１３）分子Ａおよび分子Ｂの組み合わせが、低分子化合物および高分子化合物、または高分子化合物および高分子化合物である上記（１０）または（１１）記載の方法。
（１４）固相担体における固相表面の疎水的性質を低減させる処理が、分子Ａの固相担体への固定化の際にそれらの間に親水性スペーサーを導入することである、上記（１０）または（１１）記載の方法。
（１５）親水性スペーサーが、固相担体および分子Ａと結合した状態で以下の特徴のいずれかを少なくとも有するものである、上記（１４）記載の方法：
（ｉ）水素結合アクセプター数が６以上である、
（ｉｉ）水素結合ドナー数が５以上である、
（ｉｉｉ）水素結合アクセプター数および水素結合ドナー数の総計が９以上である。
（１６）さらに、該親水性スペーサーがその分子中にカルボニル基を１以上有するものである、上記（１５）記載の方法。
（１７）さらに、該親水性スペーサーが水溶液中で電荷的に陽性あるいは陰性になる官能基を有さないことを特徴とする、上記（１５）または（１６）記載の方法。
（１８）分子Ａに対して特異的な相互作用を有する分子Ｂのスクリーニング方法であって、少なくとも以下の工程を含む方法：
（ｉ）分子Ａを固相担体に親水性スペーサーを介して固定化する工程、
（ｉｉ）分子Ｂを含むかまたは含まない試料を上記（ｉ）で得られた分子Ａが固定化された固相担体に接触させる工程、
（ｉｉｉ）分子Ａに特異的な相互作用を示したか、または示さなかった分子を同定し、解析する工程、および
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）で得られた解析結果に基づいて分子Ａに対して特異的な相互作用を有する分子を分子Ｂと判断する工程。
（１９）分子Ａおよび分子Ｂの組み合わせが、低分子化合物および低分子化合物、低分子化合物および高分子化合物、ならびに高分子化合物および高分子化合物のいずれかである上記（１８）記載の方法。
（２０）分子Ａおよび分子Ｂの組み合わせが、低分子化合物および高分子化合物、または高分子化合物および高分子化合物である上記（１８）記載の方法。
（２１）親水性スペーサーが、固相担体および分子Ａと結合した状態で以下の特徴のいずれかを少なくとも有するものである、上記（１８）記載の方法：
（ｉ）水素結合アクセプター数が６以上である、
（ｉｉ）水素結合ドナー数が５以上である、
（ｉｉｉ）水素結合アクセプター数および水素結合ドナー数の総計が９以上である。
（２２）さらに、該親水性スペーサーがその分子中にカルボニル基を１以上有するものである、上記（２１）記載の方法。
（２３）さらに、該親水性スペーサーが水溶液中で電荷的に陽性あるいは陰性になる官能基を有さないことを特徴とする、上記（２１）または（２２）記載の方法。
（２４）固相担体における固相表面の疎水的性質を低減させる為の親水性スペーサーであって、固相担体および分子Ａと結合した状態で以下の特徴のいずれかを少なくとも有するものである親水性スペーサー：
（ｉ）水素結合アクセプター数が６以上である、
（ｉｉ）水素結合ドナー数が５以上である、
（ｉｉｉ）水素結合アクセプター数および水素結合ドナー数の総計が９以上である。
（２５）さらに、該親水性スペーサーがその分子中にカルボニル基を１以上有するものである、上記（２４）記載の親水性スペーサー。
（２６）さらに、該親水性スペーサーが水溶液中で電荷的に陽性あるいは陰性になる官能基を有さないことを特徴とする、上記（２４）または（２５）記載の親水性スペーサー。
（２７）固相担体および上記（２４）〜（２６）のいずれか１項に記載の親水性スペーサーを含む複合体。
（２８）上記（２４）〜（２６）のいずれか１項に記載の親水性スペーサーおよび分子Ａを含む複合体。
（２９）固相担体、上記（２４）〜（２６）のいずれか１項に記載の親水性スペーサーおよび分子Ａを含む複合体。
（３０）下記式（Ｉａ）〜（Ｉｅ）からなる群より選択されるいずれか１つの式で表される部分構造を少なくとも１つ有する、上記（２４）〜（２６）のいずれか１項に記載の親水性スペーサー：
Figure 0004560406
（式（Ｉａ）中、
Ａは適当な連結基であり、
Ｘ１〜Ｘ３はそれぞれ同一または異なって単結合あるいは炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基で置換されていてもよいメチレン基であり、
Ｒ１〜Ｒ７はそれぞれ同一または異なって水素原子、炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基、−ＣＨ２ＯＨあるいは水酸基であり、
ｍは０〜２の整数であり、ｍ’は０〜１０の整数であり、ｍ”は０〜２の整数であり、
Ｒ３〜Ｒ７が複数個存在する場合にはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｘ３が複数個存在する場合にはそれぞれ同一でも異なっていてもよい；
式（Ｉｂ）中、
ｎおよびｎ’はそれぞれ同一または異なって１〜１０００の整数であり；
式（Ｉｃ）中、
ｐ、ｐ’およびｐ”はそれぞれ同一または異なって１〜１０００の整数であり；
式（Ｉｄ）中、
Ｘ４は単結合あるいは炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基で置換されていてもよいメチレン基であり、
Ｒ８〜Ｒ１０はそれぞれ同一または異なって水素原子、炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基、−ＣＨ２ＯＨあるいは水酸基であり、
ｑは１〜７の整数であり、
Ｒ８が複数個存在する場合にはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｘ４が複数個存在する場合にはそれぞれ同一でも異なっていてもよい；
式（Ｉｅ）中、
Ｒ１１〜Ｒ１６はそれぞれ同一または異なって水素原子、炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基、−ＣＨ２ＯＨあるいは水酸基であり、
ｒは１〜１０の整数であり、ｒ’は１〜５０の整数であり、
Ｒ１１〜Ｒ１６がそれぞれ複数個存在する場合にはそれぞれ同一でも異なっていてもよい）。
（３１）式（Ｉａ）〜（Ｉｅ）からなる群より選択されるいずれか１つの式で表される部分構造を２つ以上有する上記（３０）記載の親水性スペーサー。
（３２）固相担体および上記（３０）または（３１）記載の親水性スペーサーを含む複合体。
（３３）上記（３０）または（３１）記載の親水性スペーサーおよび分子Ａを含む複合体。
（３４）固相担体、上記（３０）または（３１）記載の親水性スペーサーおよび分子Ａを含む複合体。
（３５）式（Ｉａ）〜（Ｉｅ）からなる群より選択されるいずれか１つの式で表される部分構造を少なくとも１つ有する化合物、
但し以下の化合物は除く。
Figure 0004560406
（３６）式（Ｉａ）〜（Ｉｅ）からなる群より選択されるいずれか１つの式で表される部分構造を２つ以上有する上記（３５）記載の化合物。
（３７）下記式（ＩＩａ）〜（ＩＩｅ）からなる群より選択されるいずれか少なくとも１つの式で表される化合物：
Figure 0004560406
（式（ＩＩａ）中、
Ｙａは水素原子またはアミノ基の保護基であり、
Ｚａは水素原子またはカルボキシル基の保護基であり、
Ｗａ、Ｗａ’およびＷａ”はそれぞれ同一または異なって水素原子または水酸基の保護基（これらの保護基は、隣り合う保護基同士で結合してジアルキルメチレン基を形成してもよい）であり、
Ｂは適当な連結基であり、
Ｘ１ａ〜Ｘ３ａはそれぞれ同一または異なって単結合あるいは炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基で置換されていてもよいメチレン基であり、
Ｒ１ａ〜Ｒ７ａはそれぞれ同一または異なって水素原子、炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基、−ＣＨ２ＯＨ（式中、水酸基は保護されていてもよい）あるいは保護されていてもよい水酸基であり、
ｍ１は０〜２の整数であり、ｍ１’は０〜１０の整数であり、ｍ１”は０〜２の整数であり、
Ｒ３ａ〜Ｒ７ａが複数個存在する場合にはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｘ３ａが複数個存在する場合にはそれぞれ同一でも異なっていてもよい；
式（ＩＩｂ）中、
Ｙｂは水素原子またはアミノ基の保護基であり、
Ｚｂは水素原子またはカルボキシル基の保護基であり、
ｎ１およびｎ１’はそれぞれ同一または異なって１〜１０００の整数であり；
式（ＩＩｃ）中、
ＹｃおよびＹｃ’はそれぞれ同一または異なって水素原子またはアミノ基の保護基であり、
Ｚｃは水素原子またはカルボキシル基の保護基であり、
ｐ１、ｐ１’およびｐ１”はそれぞれ同一または異なって１〜１０００の整数であり；
式（ＩＩｄ）中、
Ｙｄは水素原子またはアミノ基の保護基であり、
Ｚｄは水素原子またはカルボキシル基の保護基であり、
Ｗｄは水素原子または水酸基の保護基であり、
Ｘ４ａは単結合あるいは炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基で置換されていてもよいメチレン基であり、
Ｒ８ａ〜Ｒ１０ａはそれぞれ同一または異なって水素原子、炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基、−ＣＨ２ＯＨ（式中、水酸基は保護されていてもよい）あるいは保護されていてもよい水酸基であり、
ｑ１は１〜７の整数であり、
Ｒ８ａが複数個存在する場合にはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｘ４ａが複数個存在する場合にはそれぞれ同一でも異なっていてもよい；
式（ＩＩｅ）中、
Ｙｅは水素原子またはアミノ基の保護基であり、
Ｚｅは水素原子またはカルボキシル基の保護基であり、
Ｒ１１ａ〜Ｒ１６ａはそれぞれ同一または異なって水素原子、炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基、−ＣＨ２ＯＨ（式中、水酸基は保護されていてもよい）および保護されていてもよい水酸基であり、
ｒ１は１〜１０の整数であり、ｒ１’は１〜５０の整数であり、
Ｒ１１ａ〜Ｒ１６ａがそれぞれ複数個存在する場合にはそれぞれ同一でも異なっていてもよい）、
但し以下の化合物は除く。
Figure 0004560406
（３８）式（ＩＩａ）〜（ＩＩｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの式で表される化合物を重合してなるポリマー化合物。
（３９）固相担体および上記（３５）〜（３８）のいずれか１項に記載の化合物を含む複合体。
（４０）上記（３５）〜（３８）のいずれか１項に記載の化合物および分子Ａを含む複合体。
（４１）固相担体、上記（３５）〜（３８）のいずれか１項に記載の化合物および分子Ａを含む複合体。
図１は、親水性スペーサーを導入することによる、固相担体上での非特異的な分子間相互作用の抑制効果を示すグラフである。固相担体として樹脂を用いた。
固相担体および／または固相担体上のＦＫ５０６に吸着する分子のうち１０種を選択し、それぞれの吸着量に及ぼす親水性スペーサーの導入の影響を示す。ＦＫ５０６に特異的な相互作用を示すＦＫＢＰ１２の吸着量は、親水性スペーサーの導入およびヘキサエチレングリコールの繰り返し構造の数に関わらずほぼ一定であったが、特にバンド１や２の吸着量は顕著に減少し、これらのバンドが非特異的な相互作用によりＦＫ５０６結合アフィニティー樹脂に結合していたこと、および親水性スペーサーの導入によりこの非特異的な相互作用を抑制することができたことを示している。横軸はＳＤＳ−ＰＡＧＥのレーンの番号を、縦軸はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるバンドのピーク量を相対的に表したものである。
図２は、固相表面の疎水性と非特異的な相互作用との関係を示したグラフである。縦軸は非特異的な結合に基づくと思われる６種類のタンパク質の固相表面への結合量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるバンドのピーク量をもとに相対的に表したものである。横軸は疎水性パラメーターであるＣＬＯＧＰの値を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、特異的な分子間相互作用を解析し、それを利用する技術（上記）において問題視されてきた、非特異的な分子間相互作用（例えばタンパク質の固相担体への非特異的な吸着に代表される）が、固相担体における固相表面とタンパク質等の分子との疎水相互作用によるものであるという知見に基づく。従って、本発明は固相担体における固相表面の疎水的性質を調節することによって、当該固相への種々の分子の非特異的な吸着を調節する方法を提供する。
本明細書中、疎水的な性質は、一般的に疎水性パラメーターによって表すことができるが、例えば分配係数、具体的にはＬＯＧＰによって表すことができる。ＬＯＧＰの算出には、簡便には、ＣＬＯＧＰ（化合物の疎水性パラメーターを計算機によって見積もるソフトによって得られる予測値；例えばＣｏｒｗｉｎ／Ｌｅｏ’ｓ ｐｒｏｇｒａｍ（ＣＬＯＧＰ，Ｄａｙｌｉｇｈｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を使用して計算できる）等が利用されるが、疎水性のパラメーターはＣＬＯＧＰに限定されるものではない。定性的に疎水性傾向が強まるにつれて、非特異的な相互作用が増加する。例えばＣＬＯＧＰについて言えば、ＣＬＯＧＰが大きい程、疎水性が高いことを意味し、ＣＬＯＧＰの増加は非特異的な相互作用（例えば固相表面へのタンパク質の非特異的な吸着）の増加と相関関係にある。ここで疎水性パラメーターの変化は、例えば固相表面上に固定化する分子（分子Ａ）を様々な値（例えばＣＬＯＧＰ）の疎水性パラメーターを有するものに変更することによって実施され得るし、また、固相担体と分子Ａとの間に親水性のスペーサーを導入することによって、固相表面の疎水的な性質を緩和、低減化することもできる。一方、より疎水的な性質を有するスペーサーを導入すること等によって疎水性が増し、ひいては非特異的な相互作用が増加する。すなわち、本発明における疎水的性質の「調節」とはその増加ならびに低減化の両方を意図する。
当該スペーサーの導入は、ＣＬＯＧＰが大きいことが予測されるリガンドを固相に固定化する必要がある場合に好ましい態様であり、以下に非特異的な相互作用を抑制する手段として親水性スペーサーを用いた場合について詳述する。
本発明は、固相担体に固定化された分子（本明細書中、分子Ａとも定義し、便宜上リガンドとも称する）と当該分子に対して特異的な相互作用を有する分子（本明細書中、分子Ｂとも定義し、便宜上ターゲット分子とも称する）との相互作用を解析する技術、かかる解析をもとに分子Ｂを同定、選別するという技術を提供する。本明細書中、リガンドならびにターゲット分子という用語は、互いに特異的な分子間相互作用を有する組み合わせを意図するものであって、当該組み合わせのうち、片方をリガンドとして固相に固定化すれば他方がターゲット分子となり、すなわちどちらを固相に固定化するかによって、それらの呼称は変更され得る。分子Ａに特異的な相互作用を有する分子Ｂは１種類とは限らず、また同様に分子Ｂに特異的な相互作用を有する分子Ａも１種類とは限らない。本明細書では分子Ａならびに分子Ｂという用語は、互いに異なる物質であることを明確にすべく、便宜上、ＡあるいはＢとの符号を付したものである。ある特定の分子を指すものではなく特異的な相互作用を有する分子同士の各々を意図するものである。又、このような分子Ａと特異的な相互作用を有さない分子は「分子Ｂ以外の分子」と同義である。
「特異的な相互作用」とは、特定のリガンド（特定のターゲット分子）のみを特異的に認識して結合するような特性を発揮する作用であり、アゴニストあるいはアンタゴニストに対する特異的受容体、基質に対する酵素、そして例えばＦＫ５０６（リガンド）に対するＦＫ５０６結合タンパク質（ターゲット分子）や、ステロイドホルモンに対するステロイドホルモン受容体（例；ｄｅｘａｍａｔｈａｓｏｎとｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、抗がん剤ｔｒａｐｏｘｉｎに対するＨＤＡＣ等の関係が「特異的な相互作用」に該当する。一方、「非特異的な相互作用」とは、それによる結合の対象が広範にわたり且つ特定分子に限定されず、反応条件によって種々変化するような状況を生じる作用をいい、本発明においては、固相上の分子Ａや固相担体表面に、結合・吸着するような不特定の分子間の作用を意味する。「非特異的な相互作用」は、「特異的な相互作用」に基づくリガンドとターゲット分子の結合の障害となるか、あるいは混同されることにより「特異的な相互作用」による結合を見落としてしまう危険性がある。
本発明において「特異的な相互作用を解析する」とは、分子Ａと分子Ｂとの間の特異的な相互作用の程度を、相互作用情報として得ることであって、例えばＫｄ（解離速度定数）、Ｋａ（結合速度定数）等の数値として得ることができる。本発明において「選別」とは、上記相互作用情報に基づき、分子Ａと特異的な相互作用を有するか否かを判定し、分子Ｂを同定することを意図する。
本発明の非特異的な相互作用を抑制する方法、分子Ａと分子Ｂとの特異的な相互作用を解析する方法ならびに分子Ｂを選別する方法においては、固相担体における固相表面の疎水的性質を低減させる処理を必須とする。かかる処理としては、例えば、固相担体への分子Ａの固定化の際にそれらの間に親水性スペーサーを導入する方法が挙げられる。親水性スペーサーを導入することにより固相担体表面の疎水的な性質が変化し、非特異的な相互作用を抑制することができる。このような固相担体と分子Ａとの間に導入された親水性スペーサーという非特異的な相互作用を抑制する手段を用いることによって、分子Ａに特異的な相互作用を有する分子（ターゲット分子：分子Ｂ）を同定、選別すること、および両者の相互作用を正確に測定することが可能となる。
本発明において用いられる固相担体は、その上で分子Ａと分子Ｂの特異的な相互作用が生じるものであれば特に限定されず、当分野で通常使用されるものが利用でき、その後に実施する分子Ｂの同定、選別の工程の為に行われる方法に応じて適宜決定される。材質としては、例えば、樹脂（ポリスチレン、メタクリレート系樹脂、ポリアクリルアミド等）、ガラス、金属（金、銀、鉄、シリコン等）等が用いられる。これらの固相は、いかなる形状のものであってもよく、また上記した材質の種類や、その後に実施する分子Ｂとの相互作用の解析、分子Ｂの同定、選別の工程の為に行われる方法に応じて適宜決定される。例えば板状、ビーズ状、薄膜状、糸状、コイル状等が挙げられるが、樹脂からなるビーズであればカラムに充填することによりその後の操作を簡便にし、また金属の薄膜であれば表面プラズモン共鳴によるＢＩＡＣＯＲＥ等の担体として好適に使用できる。またガラスプレートを用いることも好適である。
本発明において使用する固相は、上述の如く、その材質や形状に特に制限はないが、当然のことながら、分子Ａが固定化されないような、あるいは分子Ａが固定化されるものの分子Ｂとの特異的な相互作用を発揮することができないような構造上の障害を有するものは、余分な工程を経る必要があって操作が煩雑になったり、あるいは使用に耐えなかったりする場合があるので、本発明を実施する上で好ましくない。
本発明において、「親水性スペーサー」とは、分子Ａの固相担体への固定化の際に導入されて固相担体と分子Ａとの間に介在する基となる物質であって、親水性である。親水性の程度については後述する。ここで「スペーサーが介在する」とは、該スペーサーが固相内の官能基からリガンド内の官能基までの間に存在することを意味する。該スペーサーは、その一端を固相内の官能基と結合し、他端をリガンド内の官能基と結合する。
また当該親水性スペーサーは、結果的に固相担体と分子Ａとの間に介在する基として機能し得るものであれば２以上の化合物を順次、結合、重合させることによって得られるものであっても構わない。好ましくは単位化合物の重合反応によって得られる。２以上の化合物を結合あるいは重合させる過程は好ましくは固相上で行われる。固相担体と親水性スペーサーとの結合、親水性スペーサーと分子Ａとの結合、ならびに親水性スペーサーを構成する各成分の結合や重合はアミド結合や、シッフ塩基、Ｃ−Ｃ結合、エステル結合、水素結合、疎水相互作用等の共有結合あるいは非共有結合であり、いずれも当分野で公知の材料ならびに反応により形成される。
本発明において、非特異的な相互作用の抑制手段として固相担体と分子Ａとの間に導入させる親水性スペーサーとしては、固相担体における固相表面の疎水的な性質を変化させ、非特異的な相互作用を排除するかあるいは抑制するようなものであれば特に限定されないが、好ましくは固相担体および分子Ａと結合した状態（以下、この様な状態にある親水性スペーサーを便宜上「親水性スペーサー部分」と称する）で水素結合アクセプター（ＨＢＡ；ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄ ａｃｃｅｐｔｏｒ）数が６以上であるか、水素結合ドナー（ＨＢＤ；ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄ ｄｏｎｏｒ）数が５以上であるか、あるいは該スペーサー１分子あたりのＨＢＡ数およびＨＢＤ数の総計が９以上の化合物である。またこれらの条件を２つもしくは全て満たすような化合物であってもよい。特に好ましくはＨＢＡ数は９以上であり、ＨＢＤ数は６以上である。
ここで、水素結合アクセプター数（ＨＢＡ数）とは、含まれる窒素原子（Ｎ）と酸素原子（Ｏ）の総数であり、水素結合ドナー数（ＨＢＤ数）とは、含まれるＮＨとＯＨの総数である（Ｃ．Ａ．Ｌｉｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２３（１９９７）３−２５）。本発明においては、固相担体と分子Ａとの間に介在する基であっても、固相担体に由来する（すなわち固相合成時にあらかじめ導入されており固相担体の一部とみなされるもの）ＮＨやＯＨはそれぞれＨＢＡ数やＨＢＤ数に含めない。また、分子Ａと親水性スペーサーとの結合をより容易にする為に分子Ａと親水性スペーサーとの間に任意の基を親水性スペーサーとの結合の前にあらかじめ分子Ａに結合あるいは導入することができるが、これらは分子Ａに応じて適宜選択されるものであって、固相担体の疎水的な性質の緩和への寄与が少ないと考えられるので、当該基に含まれるＮやＯ、あるいはＮＨやＯＨも本発明におけるＨＢＤ数やＨＢＡ数には含めない。尚、分子Ａと親水性スペーサーの間への任意の基の導入も上述したような種々の共有結合あるいは非共有結合が利用され、いずれも当分野で公知の材料ならびに反応により実施される。
本願発明の状況下ではＨＢＡ数が６以上（好ましくは９以上）、ＨＢＤ数が５以上（好ましくは６以上）、ＨＢＡ数とＨＢＤ数の総計が９以上、というこれらの条件を少なくとも１つ、好ましくは２つ以上満たさなければ、非特異的な相互作用を十分に抑制することができず、固相担体への非特異的な吸着が生じる。従って、本願発明の親水性スペーサーにおいて「親水性」とは上記の性質を満たすことを意味する。本発明において親水性スペーサーのＨＢＤ数あるいはＨＢＡ数の上限としては、親水性であり且つ非特異的な相互作用を抑制することができるものであれば特に限定されるものではなく、適切に重合反応等を繰り返すことにより極めて高い親水性を有するスペーサーを得ることができる。また、該スペーサーはタンパク質等の高分子であってもよく、そういった観点から、いずれも５万程度の値を上限とする。
また、本発明においては、「親水性」の程度は上記定義を満たすものの物理的・化学的に不安定な化合物、例えば糖誘導体やセファロース誘導体をその基本骨格とする親水性スペーサーは、その不安定さ故にリガンドの固定化、続く種々の処理に耐えられない場合があり使用するのに好ましくない。
さらに本発明において使用する親水性スペーサーは、それ自体非特異的な相互作用（例えば該スペーサーへのタンパク質の吸着等）を生じるものでないことが好ましい。具体的には、該スペーサーが水溶液中で電荷的に陽性あるいは陰性になるような官能基を有さないことであり、当該官能基としてはアミノ基（ただし、該アミノ基に該アミノ基の塩基性を減弱させる官能基（例えばカルボニル基、スルホニル基）が結合している場合は除く）、カルボキシル基、硫酸基、硝酸基、ヒドロキサム酸基等が挙げられる。ここで水溶液中とは、具体的には、固相上での分子Ａと分子Ｂとの相互作用を解析する過程、分子Ｂを選別する過程、あるいは分子Ｂをスクリーニングする為に実施される分子Ａと分子Ｂとの結合反応（特異的な相互作用に基づいた反応）が行われる環境下であって、親水性スペーサーが電荷的に陽性あるいは陰性になるような官能基を有する場合にはイオン化するような条件下である。かかる条件は、例えば水溶液中、ｐＨ１〜１１、温度０℃〜１００℃であり、好ましくはｐＨ中性付近（ｐＨ６〜８）、約４℃〜約４０℃程度である。
さらに、本発明の親水性スペーサーは、後述する好適な親水性スペーサーとして例示される各種の構造ないしは化合物から理解されるように、その分子内に１以上のカルボニル基を有していることが好ましい。
例えば、本発明の親水性スペーサーは、下記式（Ｉａ）〜（Ｉｅ）からなる群より選択されるいずれか一つの式で表される部分構造を少なくとも１つ有する化合物である。
Figure 0004560406
（式（Ｉａ）中、
Ａは適当な連結基であり、
Ｘ１〜Ｘ３はそれぞれ同一または異なって単結合あるいは炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基で置換されていてもよいメチレン基であり、
Ｒ１〜Ｒ７はそれぞれ同一または異なって水素原子、炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基、−ＣＨ２ＯＨあるいは水酸基であり、
ｍは０〜２の整数であり、ｍ’は０〜１０の整数であり、ｍ”は０〜２の整数であり、
Ｒ３〜Ｒ７が複数個存在する場合にはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｘ３が複数個存在する場合にはそれぞれ同一でも異なっていてもよい；
式（Ｉｂ）中、
ｎおよびｎ’はそれぞれ同一または異なって１〜１０００の整数であり；
式（Ｉｃ）中、
ｐ、ｐ’およびｐ”はそれぞれ同一または異なって１〜１０００の整数であり；
式（Ｉｄ）中、
Ｘ４は単結合あるいは炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基で置換されていてもよいメチレン基であり、
Ｒ８〜Ｒ１０はそれぞれ同一または異なって水素原子、炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基、−ＣＨ２ＯＨあるいは水酸基であり、
ｑは１〜７の整数であり、
Ｒ８が複数個存在する場合にはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｘ４が複数個存在する場合にはそれぞれ同一でも異なっていてもよい；
式（Ｉｅ）中、
Ｒ１１〜Ｒ１６はそれぞれ同一または異なって水素原子、炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基、−ＣＨ２ＯＨあるいは水酸基であり、
ｒは１〜１０の整数であり、ｒ’は１〜５０の整数であり、
Ｒ１１〜Ｒ１６がそれぞれ複数個存在する場合にはそれぞれ同一でも異なっていてもよい）
本明細書において各基の定義中、「適当な連結基」とは隣接する各々の部位を連結することができる基であれば特に限定されないが、具体的には以下の基が用いられる。
Figure 0004560406
（式中、Ｒ１７は水素原子または炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基であり、Ｒ１８〜Ｒ２１はそれぞれ同一または異なって水素原子、炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基、−ＣＨ２ＯＨあるいは水酸基であり、Ｒ２２〜Ｒ２６はそれぞれ同一または異なって水素原子、炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基（該アルキル基は水酸基、カルボン酸基、アミノ基等の親水性置換基で置換されていてもよい）である）
本明細書において各基の定義中「炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基」としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基等が挙げられる。
本明細書において、「炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基で置換されていてもよいメチレン基」とは無置換のメチレン基ならびに上記した炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基で１または２置換されたメチレン基を意図する。
式（Ｉａ）中、好ましい連結基Ａとしては、
Figure 0004560406
（好ましくはＲ１７は水素原子）
であって、好ましいＸ１〜Ｘ３はそれぞれ単結合であって、好ましいＲ１〜Ｒ７はそれぞれ水素原子であって、好ましいｍは０〜２の整数であり、好ましいｍ’は０〜２の整数であり、好ましいｍ”は０〜２の整数である。
式（Ｉｂ）中、好ましいｎおよびｎ’はそれぞれ１〜５０の整数であり、より好ましくはそれぞれ１〜５の整数であり、特に好ましくは等しく１〜５の整数であり、いっそう好ましくは等しく５である。
式（Ｉｃ）中、好ましいｐ、ｐ’、ｐ”はそれぞれ１〜５０の整数であり、より好ましくはそれぞれ１〜５の整数であり、特に好ましくは等しく１〜５の整数であり、いっそう好ましくは等しく５である。
式（Ｉｄ）中、好ましいＸ４は単結合であり、好ましいＲ８〜Ｒ１０はそれぞれ水素原子であって、好ましいｑは１〜４の整数であって、特に好ましくは４である。
式（Ｉｅ）中、好ましいＲ１１〜Ｒ１６は水素原子であって、好ましいｒは１であって、好ましいｒ’は１〜５０の整数であり、より好ましくは１〜５の整数であって、特に好ましくは５である。
本発明の親水性スペーサーは、上記部分構造を２つ以上有していてもよく、その場合それらの部分構造は同一の式で表されるものであっても異なる式で表されるものであってもよい。
上記親水性スペーサーを少なくとも１種固相担体に固定化する。固相担体上のスペーサーの数は特に限定されず、分子Ａの種類や量および分子Ｂの種類や量、ならびに使用するスペーサーの種類や特性に応じて当業者は適宜設定することができるし、所望の分子間相互作用が検出できれば特に決める必要はない。通常、固相ならびに分子Ａに対して過剰量の親水性スペーサーを用いて固定化する。固相担体に結合しなかった親水性スペーサーは、固相担体の洗浄等の処理により反応系から容易に排除できる。
本発明において固相担体に固定化する分子Ａ（リガンド）は特に限定されず、公知の化合物であっても今後開発される新規な化合物であってもよい。また、低分子化合物であっても高分子化合物であってもかまわない。ここで低分子化合物とは分子量１０００未満程度の化合物であって、例えば医薬品として通常使用し得る有機化合物およびその誘導体や無機化合物が挙げられ、有機合成法等を駆使して製造される化合物やその誘導体、天然由来の化合物やその誘導体、プロモーター等の小さな核酸分子や各種の金属等であり、望ましくは医薬品として使用し得る有機化合物およびその誘導体、核酸分子をいう。また、高分子化合物としては分子量１０００以上程度の化合物であって、タンパク質、ポリ核酸類、多糖類、およびこれらを組み合わせたものなどが挙げられ、望ましくはタンパク質である。これらの低分子化合物あるいは高分子化合物は、公知のものであれば商業的に入手可能であるか、各報告文献に従って採取、製造、精製等の工程を経て得ることができる。これらは、天然由来であっても、また遺伝子工学的に調製されるものであってもよく、また半合成等によっても得ることができる。
本発明では、上記分子Ａを固定化した固相上で該分子Ａとの特異的な相互作用に基づいて分子Ｂを選別する過程を要する。従って分子Ｂは、分子Ａと特異的に相互作用するものであれば特に限定されるものではなく、公知化合物である場合もあれば新規物質である場合も予想される。分子Ｂとしては低分子化合物であっても高分子化合物であってもかまわない。分子Ｂが低分子化合物の場合には、低分子化合物である分子Ａとの低分子化合物と低分子化合物との特異的な相互作用に基づき、あるいは高分子化合物である分子Ａとの高分子化合物と低分子化合物との特異的な相互作用に基づき、分子Ｂが選別され得る。また分子Ｂが高分子化合物の場合には、低分子化合物である分子Ａとの低分子化合物と高分子化合物との特異的な相互作用に基づき、あるいは高分子化合物である分子Ａとの高分子化合物と高分子化合物との特異的な相互作用に基づき、分子Ｂが選別され得る。好ましい分子Ａと分子Ｂの組み合わせは低分子化合物と高分子化合物、あるいは高分子化合物と高分子化合物という組み合わせである。
分子Ａの分子Ｂとの相互作用の解析、ならびに分子Ｂの選別は簡便には固相上で行う。分子Ｂとして予め候補物質が予測される場合には、候補物質を単独で上記固相に固定化された分子Ａと接触させ両者の相互作用を測定し、候補物質が分子Ｂであるか否か、すなわち分子Ａのターゲット分子であるか否かを判断すればよいが、通常、複数の物質（高分子化合物および／または低分子化合物）を含む試料を分子Ａと接触させ、複数の物質（高分子化合物および／または低分子化合物）の各々と分子Ａとの相互作用の有無ならびにその相互作用の程度を測定することにより分子Ｂであるか否かを判断し、選別する。ここで複数の物質を含む試料としては、全て公知化合物から構成されるものであっても、一部新規な化合物を含むものであっても、さらには全て新規な化合物から構成されるものであってもよい。しかしながら、リガンドのターゲット分子の探索、あるいは昨今のプロテオーム解析の進歩によれば、全てその構造が公知な化合物の混合物であることが望ましい。全て公知な化合物から構成される試料としては、大腸菌等によって遺伝子工学的に調製されたタンパク質の混合物等であり、一部新規な化合物を含むものとしては、細胞や組織の抽出物（Ｌｙｓａｔｅ）であり、また全て新規な化合物から構成されるものとしては、まだその機能や構造が知られていない新規なタンパク質や新しく合成された化合物等の混合物が挙げられる。試料が混合物の場合、特に公知化合物を含む場合には、任意にこれらの化合物の試料中の含有量を所望の値に設定しておくこともできる。リガンドのターゲット分子の探索という見地にたてば、選別すべき分子Ｂは、低分子化合物ならびに高分子化合物であるのが好ましく、ヒト等の動物体内でのターゲット分子の探索についていえば高分子化合物であることが好ましい。
本発明は、上記固相に固定化された分子Ａを用いて、当該分子Ａに特異的な相互作用を有する分子Ｂをスクリーニングする方法を提供する。該スクリーニング方法は以下の工程を少なくとも含む。尚、本スクリーニング法における、分子Ａおよび分子Ｂや固相担体、ならびに親水性スペーサーの各々の定義は上記した通りである。
（１）分子Ａを固相担体に親水性スペーサーを介して固定化する工程。
当該工程は、分子Ａと親水性スペーサーとの結合、親水性スペーサーと固相担体との結合からなる。分子Ａに親水性スペーサーを結合させて、その後それらの複合体を固相担体に結合させてもよいし、固相担体に親水性スペーサーを結合させてから分子Ａを結合させてもよく、分子Ａが固相担体に固定化されたか否かは、分子Ａ、あるいは分子Ａに予め結合・導入された任意の基に含まれるある特定の構造乃至置換基等に基づく呈色反応等を利用して確認することができる。例えばアミノ基を認識するニンヒドリン反応等が利用できる。個々の結合は、通常当分野で実施される反応を利用して実施される。簡便且つ確実な手段としてアミド結合形成反応を利用する方法が挙げられる。本反応は、例えば「ペプチド合成の基礎と実験」（ＩＳＢＮ ４−６２１−０２９６２−２、丸善、昭和６０年初版）に従って実施できる。各反応に用いられる試薬や溶媒については当分野で通常用いられるものが利用でき、採用する結合反応によって適宜選択される。
（２）分子Ｂを含むかまたは含まない試料を上記（１）で得られた分子Ａが固定化された固相担体に接触させる工程。
本工程において用いる試料は、上記同様、複数の物質を含むものである。その態様は特に限定されず、使用する固相担体や後の工程（３）および（４）の同定方法あるいは解析方法にどのような原理や手段、方法を用いるかによって適宜変更し得る。例えば分子Ａが固定化されたビーズ樹脂を充填したカラムを用いる場合には液状とするのが好ましい。分子Ｂを含まない試料であれば、工程（３）で分子Ａに特異的な相互作用を示さなかった分子（複数種存在する場合あり）の同定ならびに解析を行う。分子Ｂを含む試料であれば、工程（３）で分子Ａに特異的な相互作用を示した分子Ｂ（複数種存在する場合あり）を同定、解析する。試料と固相担体とを接触させる方法は、試料内の分子Ｂが固相担体に固定化された分子Ａと結合することができれば特に限定されず、使用する固相担体や後の工程（３）および（４）の同定方法あるいは解析方法にどのような原理や手段、方法を用いるかによって適宜変更し得る。例えば分子Ａが固定化されたビーズ樹脂を充填したカラムを用いる場合には、液状にした試料をカラムに添加しカラム内を通すことにより簡便に実施される。
（３）分子Ａに特異的な相互作用を示したか、または示さなかった分子を同定し、解析する工程。
かかる工程は、使用する固相担体や固定化した分子Ａの種類等によって適宜変更し得るが、通常当分野で実施されている低分子化合物あるいは高分子化合物を同定する為の各種方法により行う。また、今後開発されるであろう方法によっても実施可能であろう。例えば分子Ａが固定化された固相担体として分子Ａが固定化されたビーズ樹脂を充填してなるカラムを用いた場合〔工程（１）〕、続く試料の添加により〔工程（２）〕、分子Ａに分子Ｂを結合させる。結合した分子Ｂを緩衝液の極性を変える、あるいは過剰の分子Ａをさらに加える等の処理によって分子Ａから解離させ、その後同定したり、あるいは固相上の分子Ａと結合した状態でそのまま界面活性剤等によって抽出して同定したりすることもできる。同定方法としては具体的には電気泳動法、免疫学的反応を用いたイムノブロッティングや免疫沈降法、クロマトグラフィー、マススペクトラム、アミノ酸シーケンス、ＮＭＲ（低分子のときに特に）等の公知の手法により、またこれらの方法を組み合わせて実施する。分子Ａに結合しない分子を同定する工程も上記分子Ａに結合する分子を同定する方法に準じて行うことができるが、カラムの素通り画分に含まれる分子を同定の対象とするので、同定工程に入る前に予め濃縮や粗精製等の処理を行うことが好ましい。得られたデータならびに既存の報告をもとに各分子を同定し、分子Ａのターゲット分子であるか否かを判断する。
また、本工程は自動化されていてもよい。例えば２次元電気泳動で得られた種々の分子のデータを直接読み取り、既存のデータベースに基づいて分子の同定を行うことも可能である。
本発明はさらに上記親水性スペーサーとして好適な化合物、当該化合物と固相担体との複合体、当該化合物と分子Ａとの複合体、ならびに当該化合物、固相担体および分子Ａとの複合体を提供する。当該化合物としては下記の一般式（ＩＩａ）〜（ＩＩｅ）で表される化合物（以下、本発明のモノマー成分とも称する）およびそれらの重合体（以下、本発明のポリマーあるいはポリマー化合物とも称する）が挙げられる。
Figure 0004560406
｛式（ＩＩａ）中、
Ｙａは水素原子またはアミノ基の保護基であり、
Ｚａは水素原子またはカルボキシル基の保護基であり、
Ｗａ、Ｗａ’およびＷａ”はそれぞれ同一または異なって水素原子または水酸基の保護基（これらの保護基は、隣り合う保護基同士で結合してジアルキルメチレン基を形成してもよい）であり、
Ｂは適当な連結基であり、
Ｘ１ａ〜Ｘ３ａはそれぞれ同一または異なって単結合あるいは炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基で置換されていてもよいメチレン基であり、
Ｒ１ａ〜Ｒ７ａはそれぞれ同一または異なって水素原子、炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基、−ＣＨ２ＯＨ（式中、水酸基は保護されていてもよい）あるいは保護されていてもよい水酸基であり、
ｍ１は０〜２の整数であり、ｍ１’は０〜１０の整数であり、ｍ１”は０〜２の整数であり、
Ｒ３ａ〜Ｒ７ａが複数個存在する場合にはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｘ３ａが複数個存在する場合にはそれぞれ同一でも異なっていてもよい；
式（ＩＩｂ）中、
Ｙｂは水素原子またはアミノ基の保護基であり、
Ｚｂは水素原子またはカルボキシル基の保護基であり、
ｎ１およびｎ１’はそれぞれ同一または異なって１〜１０００の整数であり；
式（ＩＩｃ）中、
ＹｃおよびＹｃ’はそれぞれ同一または異なって水素原子またはアミノ基の保護基であり、
Ｚｃは水素原子またはカルボキシル基の保護基であり、
ｐ１、ｐ１’およびｐ１”はそれぞれ同一または異なって１〜１０００の整数であり；
式（ＩＩｄ）中、
Ｙｄは水素原子またはアミノ基の保護基であり、
Ｚｄは水素原子またはカルボキシル基の保護基であり、
Ｗｄは水素原子または水酸基の保護基であり、
Ｘ４ａは単結合あるいは炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基で置換されていてもよいメチレン基であり、
Ｒ８ａ〜Ｒ１０ａはそれぞれ同一または異なって水素原子、炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基、−ＣＨ２ＯＨ（式中、水酸基は保護されていてもよい）あるいは保護されていてもよい水酸基であり、
ｑ１は１〜７の整数であり、
Ｒ８ａが複数個存在する場合にはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｘ４ａが複数個存在する場合にはそれぞれ同一でも異なっていてもよい；
式（ＩＩｅ）中、
Ｙｅは水素原子またはアミノ基の保護基であり、
Ｚｅは水素原子またはカルボキシル基の保護基であり、
Ｒ１１ａ〜Ｒ１６ａはそれぞれ同一または異なって水素原子、炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基、−ＣＨ２ＯＨ（式中、水酸基は保護されていてもよい）および保護されていてもよい水酸基であり、
ｒ１は１〜１０の整数であり、ｒ１’は１〜５０の整数であり
Ｒ１１ａ〜Ｒ１６ａがそれぞれ複数個存在する場合にはそれぞれ同一でも異なっていてもよい｝
各式の基の定義中「適当な連結基」、「炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基」および「炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基で置換されていてもよいメチレン基」の意味するところは上述の通りである。
式（ＩＩａ）中、好ましい連結基Ｂとしては、
Figure 0004560406
（好ましくはＲ１７は水素原子）
であって、好ましいＸ１ａ〜Ｘ３ａはそれぞれ単結合であって、好ましいＲ１ａ〜Ｒ７ａはそれぞれ水素原子であって、好ましいｍ１は０〜２の整数であり、好ましいｍ１’は０〜２の整数であり、好ましいｍ１”は０〜２の整数である。
式（ＩＩｂ）中、好ましいｎ１およびｎ１’はそれぞれ１〜５０の整数であり、より好ましくはそれぞれ１〜５の整数であり、特に好ましくは等しく１〜５の整数であり、いっそう好ましくは等しく５である。
式（ＩＩｃ）中、好ましいｐ１、ｐ１’、ｐ１”はそれぞれ１〜５０の整数であり、より好ましくは１〜５の整数であり、特に好ましくは等しく１〜５の整数であり、いっそう好ましくは等しく５である。
式（ＩＩｄ）中、好ましいＸ４ａは単結合であり、好ましいＲ８ａ〜Ｒ１０ａはそれぞれ水素原子であって、好ましいｑ１は１〜４の整数であって、特に好ましくは４である。
式（ＩＩｅ）中、好ましいＲ１１ａ〜Ｒ１６ａは水素原子であって、好ましいｒ１は１であって、好ましいｒ１’は１〜５０の整数であり、より好ましくは１〜５の整数であって、特に好ましくは５である。
各式の基の定義中の「アミノ基の保護基」、「カルボキシル基の保護基」あるいは「水酸基の保護基」は、種々の重合反応や、その後に続くリガンド等との結合を実施するのに好適なものが選択される。「アミノ基の保護基」としては、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、メトキシカルボニル基等の低級アルコキシカルボニル基；ベンジルオキシカルボニル基等のアラルキルオキシカルボニル基；ベンジル基等のアラルキル基；ベンゼンスルホニル基、ｐ−トルエンスルホニル基、メタンスルホニル基等の置換スルホニル基などが例示される。「カルボキシル基の保護基」としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソブチル基等の炭素数１〜６の直鎖状もしくは分枝状の低級アルキル基；ベンジル基等のアラルキル基などが例示される。「水酸基の保護基」としては、アセチル基、プロピオニル基、ピバロイル基、ベンゾイル基等のアシル基；メトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基等のアルコキシカルボニル基；ベンジルオキシカルボニル基等のアラルキルオキシカルボニル基；ベンジル基、ナフチルメチル基等のアリールメチル基；トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ベンジルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基等のシリル基；エトキシメチル基、メトキシメチル基等の低級アルコキシメチル基などを例示することができる。適当な保護基のリストとして、例えば公知文献「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ．（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）」が挙げられる。
化合物中に複数の「アミノ基の保護基」、「カルボキシル基の保護基」および／または「水酸基の保護基」が存在する場合には、それぞれ同一のものであってもよく、保護の必要な部位に応じて適宜選択される。それ以外の各記号の定義は上述の通りである。
尚、下記の化合物はＣＡＳ番号が付された化合物であるが、固相担体における固相表面の疎水性性質を低減させる為の親水性スペーサーとしての有用性については全く知られていない。
Figure 0004560406
以下に本発明のモノマー成分あるいはその誘導体の一般的製法について記載するが、記載される以外の通常当分野で実施される方法、あるいはそれらの方法を組み合わせた方法によっても又製造し得ることは当業者には明らかである。
尚、本明細書で使用する略語は下記の通りである。
略語 正式名称
Ａｃ アセチル基
ＡＥＴ アミノエチルタータリックジアミド
ＡＭＴ アミノメチルタータリックジアミド
Ｂｎ ベンジル基
Ｂｕ３Ｐ トリブチルフォスフィン
ＣＤＩ １，１’−カルボニルジイミダゾール
ＤＡＢＴ ジハイドロキシアミノブチルタータリックアシッド
ＤＢＵ １，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン
ＤＭＡＰ ジメチルアミノピリジン
ＤＭＥ １，２−ジメトキシエタン
ＤＭＦ ジメチルホルムアミド
ＥＤＣ １−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド
Ｅｔ エチル基
Ｆｍｏｃ ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基
Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ ９−フルオレニルメチルスクシンイミジルカルボネート
Ｇｏｌｄ
ｆｏｉｌ 金膜
ＨＯＢｔ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨｙＴ ヒドラジノタータリックアミド
Ｍｅ メチル基
ＮＭＰ Ｎ−メチル−２−ピロリドン
ＰＥＧ ポリエチレングリコール
Ｐｈ３Ｐ トリフェニルフォスフィン
ＰｙＢＯＰ ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート
ＴＢＡＦ フッ化テトラブチルアンモニウム
ＴＢＤＭＳ ｔ−ブチルジメチルシリル基
ＴＢＤＭＳＯＴｆ トリフルオロメタンスルホン酸 ｔ−ブチルジメチルシリル基
ＴＢＤＰＳ ｔ−ブチルジフェニルシリル基
ＴＢＳ ｔ−ブチルジメチルシリル基
ｔＢｕ ｔ−ブチル基
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＭＡＤ Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルアゾジカルボキサミド
ＴＯＹＯ−Ｐｅａｒｌ
ｒｅｓｉｎ ＴＯＹＯパール樹脂
Ｔｒ トリチル基
Ｔｓ トシル基（トルエンスルホニル基）
ＷＳＣ 水溶性カルボジイミド（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）
製法１：一般式（ＩＩａ）の製造方法（１）
Figure 0004560406
Figure 0004560406
式中、Ｗ１〜Ｗ４は水酸基の保護基であり、Ｚ１はカルボキシル基の保護基であり、Ｙ１はアミノ基の保護基である。Ｘ３ａ’はＸ３ａと同義であり、またＸ３ａ”もＸ３ａと同義である。Ｒ５ａ′はＲ５ａと同義であり、またＲ５ａ”もＲ５ａと同義である。またそれ以外の各記号の定義は上述の通りである。
水酸基の保護基としては、当分野で通常用いられている任意の各基が用いられるが、具体的には、ｔｅｒｔ−ブチル基等のアルキル基；アセチル基、プロピオニル基、ピバロイル基、ベンゾイル基等のアシル基；メトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基等のアルコキシカルボニル基；ベンジルオキシカルボニル基等のアラルキルオキシカルボニル基；ベンジル基、ナフチルメチル基等のアリールメチル基；トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基等のシリル基；エトキシメチル基、メトキシメチル基等の低級アルコキシメチル基などが例示され、好ましくは、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、メトキシメチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、当分野で通常用いられている任意の各基が用いられるが、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、ｔ−ブチル基、イソブチル基、アリル基等の炭素数１〜６の直鎖状もしくは分枝状の低級アルキル基；ベンジル基等のアラルキル基；ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基等のシリル基などが例示され、好ましくは、アリル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基が挙げられる。アミノ基の保護基としては、当分野で通常用いられている任意の各基が用いられるが、具体的には、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、メトキシカルボニル基等の低級アルコキシカルボニル基；ベンジルオキシカルボニル基等のアラルキルオキシカルボニル基；ベンジル基等のアラルキル基；ベンゼンスルホニル基ｐ−トルエンスルホニル基、メタンスルホニル基等の置換スルホニル基などが例示され、好ましくは、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基が挙げられる。
アミノ基の保護および脱保護、カルボキシル基の保護および脱保護、および水酸基の脱保護は使用する保護基に応じて適宜公知の方法および試薬によって実施される。
化合物（ａ−４）および化合物（ａ−２）をアミド化によって脱水縮合する反応は、通常、等量のアミノ体とカルボン酸の存在下、１．１当量程度のＮ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノカルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール等の縮合剤を用いて、ＤＭＦや塩化メチレン等の溶媒中で、室温下１時間から１０時間程度反応させることによって行なわれる。
製法２：一般式（ＩＩａ）の製造方法（２）
Figure 0004560406
式中、Ｙ２はアミノ基の保護基である。Ｒ３ａ’はＲ３ａと同義であり、またＲ３ａ”もＲ３ａと同義である。Ｒ４ａ’はＲ４ａと同義であり、またＲ４ａ”もＲ４ａと同義である。Ｒ６ａ’はＲ６ａと同義であり、またＲ６ａ”もＲ６ａと同義である。Ｒ７ａ’はＲ７ａと同義であり、またＲ７ａ”もＲ７ａと同義である。それ以外の各記号の定義は上述の通りである。アミノ基の保護基としては、上記したものと同様のものが例示される。
アミノ基の脱保護は使用する保護基によって適宜公知の方法および試薬によって実施される。
化合物（ａ−９）および化合物（ａ−１０）をアミド化によって脱水縮合する反応は、通常、等量のアミノ体とカルボン酸の存在下、１．１当量程度のＮ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノカルボジイミド、およびＮ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール等の縮合剤を用いて、ＤＭＦや塩化メチレン等の溶媒中で、室温下１時間から１０時間程度反応させることによって行なわれる。
製法３：一般式（ＩＩａ）の製造方法（３）
Figure 0004560406
式中、Ｙ３はアミノ基の保護基であり、それ以外の各記号の定義は上述の通りである。アミノ基の保護基としては、上記したものと同様のものが例示される。
化合物（ａ−１４）および化合物（ａ−１５）をアミド化によって脱水縮合する反応は、通常、等量のアミノ体とカルボン酸の存在下、１．１当量程度のＮ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノカルボジイミド、およびＮ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール等の縮合剤を用いて、ＤＭＦや塩化メチレン等の溶媒中で、室温下１時間から１０時間程度反応させることによって行なわれる。
製法４：一般式（ＩＩｂ）の製造方法
Figure 0004560406
式中、Ｗ５〜Ｗ７は水酸基の保護基であり、Ｈａｌはハロゲン原子（塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、フッ素原子）を表し、それ以外の各記号の定義は上述の通りである。水酸基の保護基としては、上記したものと同様のものが例示される。尚ｎ２は、ｎ１−１あるいはｎ１′−１である（ｎ１、ｎ１′は上述のとおり）。
水酸基の保護、脱保護は使用する保護基によって適宜公知の方法および試薬によって実施される。
化合物（ｂ−４）の化合物（ｂ−５）へのハロゲン置換反応は、通常、１当量のアルコール体に２〜３当量の四臭化炭素、および１〜２当量のトリフェニルフォスフィンを塩化メチレン等の溶媒中、０℃〜室温で、１時間から数時間反応させることによって行なわれる。
化合物（ｂ−６）と化合物（ｂ−２）との脱水縮合反応は、通常、１当量のアルコール体と１当量のトリブチルフォスフィンをトルエン溶媒中室温で１時間程度反応を行い、ここに１当量のフェノール体および１，１’−アゾビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）等の縮合剤を加え、０〜５０℃で数時間から終夜で反応させることによって行なわれる。
化合物（ｂ−８）と化合物（ｂ−５）との縮合反応は、通常、０〜１０℃において、１当量のフェノール体と約１０倍当量の過剰の水素化ナトリウムのような強塩基をＴＨＦ等の溶媒中、１０〜６０分程度反応させ、そこに２当量程度のハロゲン体を加え、室温下１〜１０時間程度反応させることによって行なわれる。
Figure 0004560406
式中、Ｗ６〜Ｗ７は水酸基の保護基であり、Ａｌｋは炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基（上述と同義）、Ｙ４はアミノ基の保護基であり、それ以外の各記号の定義は上述の通りである。水酸基の保護基およびアミノ基の保護基としては、上記したものと同様のものが例示される。
水酸基あるいはアミノ基の脱保護、もしくはカルボキシル基の脱保護は使用する保護基によって適宜公知の方法および試薬によって実施される。
化合物（ｂ−１０）の化合物（ｂ−１１）へのアルコキシカルボニル化は、通常、０〜１０℃において、１当量のアルコール体と３〜５倍当量程度の過剰の水素化ナトリウムのような強塩基をＴＨＦ等の溶媒中、１０〜６０分程度反応させ、そこに３〜５倍当量程度の過剰のハロゲン体（ブロモ酢酸−ｔｅｒｔ−ブチルエステル）を加え、室温下１〜１０時間程度反応させることによって行なわれる。
化合物（ｂ−１２）の化合物（ｂ−１３）へのアジド化は、通常、１当量のアルコール体と１．５当量程度のｐ−トルエンスルフォニルクロライドおよび０．２当量程度の４−ジメチルアミノピリジンのような塩基をピリジン等の溶媒中、３０〜５０℃で、数時間反応させることによって得られるＯ−トシル体を単離し、それに約１０倍当量程度の過剰のアジ化ナトリウムを加え、ＤＭＦ等の溶媒中、５０〜９０℃で数時間反応させることにより行なわれる。
化合物（ｂ−１３）の化合物（ｂ−１４）へのアミノ化は、通常、１当量のアジド体を、０．１当量程度の水酸化パラジウムのような触媒を用いてメタノール等の溶媒存在下、１〜数気圧の水素存在下、室温で数時間反応させることによって得られる。
製法５：一般式（ＩＩｃ）の製造方法
各構造式中、特定の基、特定の化合物を記載する場合があるが、それらは一例であって、特に限定されるものではない。同等の働きを有するものであれば適宜変更し得る。
Figure 0004560406
Figure 0004560406
式中、各記号の定義は上述の通りである。式中の水酸基の保護基、アミノ基の保護基、カルボキシル基の保護基はその一例を示したものであって、それ以外にも通常当分野で用いられる任意の各基が用いられる。具体的には上記したものと同様なものが例示される。アミノ基の保護、カルボキシル基の脱保護、および水酸基の保護ならびに脱保護の方法は、本明細書に記載する以外にも、使用する保護基に応じて適宜公知の方法および試薬によって実施され得ることは当業者には明らかであろう。
化合物（ｃ−１）の化合物（ｃ−２）への水酸基の保護は、例えば保護基としてＴＢＳを使用する場合には、通常、１当量のフェノール体、３当量程度の塩基（例えばイミダゾール）および２当量程度のシリルクロライドを、ＤＭＦ等の溶媒中で、室温で１０時間程度反応させることによって行なわれる。
化合物（ｃ−２）と化合物（ｃ−４）との脱水縮合反応は、通常、１当量のアルコール体と１当量のトリブチルフォスフィンとをトルエン溶媒中室温で１時間程度反応を行い、ここに１．３当量のフェノール体および１．３当最の１，１’−アゾビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）等の縮合剤を加え、室温で数時間から終夜反応させることによって行なわれる。
化合物（ｃ−７）の化合物（ｃ−８）への水酸基の脱保護は、通常、１当量のフェノールの保護体（例えばシリル保護体）、１．２当量程度のテトラブチルアンモニウムフルオライドをＴＨＦ等の溶媒中で、室温で１時間程度反応させることによって行う。
化合物（ｃ−８）と化合物（ｃ−６）との縮合反応は、通常、室温で１当量のフェノール体と約５．２当量の過剰の水素化ナトリウムのような強塩基をＴＨＦやＤＭＦ等の溶媒中で、１０〜６０分程度反応させ、そこに４当量程度のハロゲン化物（例えばアルキルブロマイド）を加え、室温で約４時間程度反応させることによって行われる。この縮合反応によって化合物（ｃ−９）が得られる。
化合物（ｃ−９）の化合物（ｃ−１０）への水酸基の脱保護は、通常、１当量のフェノール保護体（例えばトリチル保護体）を、ＴＦＡを含む塩化メチレン等の溶媒中で、室温で約１時間程度反応させることによって行なわれる。
化合物（ｃ−１０）の化合物（ｃ−１１）への水酸基の保護は、例えば保護基としてｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を使用する場合には、通常、１当量のアルコール体、約４当量の水素化ナトリウム等の強塩基、約４当量のブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを、ＴＨＦやＤＭＦ等の溶媒中で、室温で約４時間程度反応させることによって行われる。
化合物（ｃ−１１）の化合物（ｃ−１２）への水酸基の脱保護は、通常、１当量のフェノール保護体（例えばベンジル保護体）、触媒量の水酸化パラジウムを、水素ガス雰囲気下、メタノール等の溶媒中で、室温で約６時間程度反応させることによって行なわれる。
化合物（ｃ−１２）の化合物（ｃ−１３）への水酸基の保護は、例えば保護基としてＴｓを使用する場合には、通常、１当量のアルコール体、触媒量のＤＭＡＰ等の塩基、約６当量のトシルクロライドを、ピリジン等の溶媒中で、室温〜４０℃で約２時間程度反応させることによって行われる。
化合物（ｃ−１３）の化合物（ｃ−１４）へのアジド化は、１当量のトシル体、約１５当量のアジ化ナトリウムを、ＤＭＦ等の溶媒中で、約６０℃、約２時間程度反応させることによって行われる。
化合物（ｃ−１４）の化合物（ｃ−１５）へのアミノ化および、化合物（Ｃ−１６）へのアミノ基の保護基の導入は、通常、１当量のフェノール保護体（ベンジル保護体）、触媒量の水酸化パラジウムを水素ガス雰囲気下、メタノール等の溶媒中で、室温で約１時間程度反応させることによって得られるアミン体（ｃ−１５）に、約０．８４当量の炭酸９−フルオレニルメチルスクシンイミジル、約１．５当量のトリエチルアミンのような塩基を加え、ＴＨＦ等の溶媒中で、室温で約１時間程度反応させることによって行われる。
化合物（ｃ−１６）の化合物（ＩＩｃ）へのカルボキシル基の脱保護は、通常、１当量のフェノール保護体（例えばｔ−ブチル保護体）をＴＦＡを含む水溶液中で、室温、約１０時間程度反応させることによって行われる。
製法６：一般式（ＩＩｄ）の製造方法
（Ｒ１０ａ＝Ｒ９ａ＝水素原子，Ｒ８ａ＝水素原子，Ｘ４ａ＝単結合）
各構造式中、特定の基、特定の化合物を記載する場合があるが、それらは一例であって、特に限定されるものではない。同等の働きを有するものであれば適宜変更し得る。
Figure 0004560406
式中Ｗ８は水酸基の保護基であり、他の記号の定義は上述の通りである。水酸基の保護基としては上記したものと同様なものが例示される。水酸基の脱保護は使用する保護基に応じて適宜公知の方法および試薬によって実施される。
化合物（ｄ−４）から目的化合物（ＩＩｄ）へのカルボキシル化は、通常、１当量のアルコール体を、１０当量の過ヨウ素酸ナトリウム、０．４当量程度の塩化ルテニウム水和物（ＩＩＩ）のような酸化剤を水、アセトニトリル、ジクロロメタン等の溶媒存在下、室温で数時間反応させることによって得られる。
製法７：一般式（ＩＩｅ）の製造方法（１）
各構造式中、特定の基、特定の化合物を記載する場合があるが、それらは一例であって、特に限定されるものではない。同等の働きを有するものであれば適宜変更し得る。
Figure 0004560406
水酸基の保護基、アミノ基の保護基としては上記したものと同様なものが例示される。水酸基の脱保護は使用する保護基によって適宜公知の方法および試薬によって実施される。
化合物（ｅ−２）の化合物（ｅ−３）へのカルボニル基の還元反応は１．２当量程度のＮａＢＨ４のような還元剤をメタノール等の溶媒中で反応させ、引き続きアジド基の還元反応（アミノ化）は、通常、１当量のアジド体を、０．１当量程度の水酸化パラジウムのような触媒をメタノール等の溶媒存在下、１〜数気圧の水素存在下、室温で数時間反応させることによって行う。
化合物（ｅ−３）の化合物（ｅ−４）への水酸基の脱保護は１Ｎ水酸化ナトリウム等のアルカリをジオキサン、水等の混合溶媒中で反応させ、引き続きアミノ基の保護は（ｃ−１５）から（ｃ−１６）と同様な反応により行うことが出来る。
化合物（ｅ−４）の化合物（ｅ−５）への水酸基の保護は、例えば、２０当量程度のＴＢＤＭＳ−ＯＴｆを２，６−Ｌｕｔｉｄｉｎｅ等の存在下反応させることにより行うことが出来る。
化合物（ｅ−５）の化合物（ＩＩｅ）への水酸基の脱保護は１０％ギ酸／ジクロロメタンと反応させ、引き続きアルコールの酸化は化合物（ｄ−４）から化合物（ＩＩｄ）への反応と同様にして行うことが出来る。
製法８：一般式（ＩＩｅ）の製造方法（２）
Figure 0004560406
Figure 0004560406
式中、各記号の定義は上述の通りである。式中の水酸基の保護基、アミノ基の保護基、カルボキシル基の保護基はその一例を示したものであって、それ以外にも通常当分野で用いられる任意の各基が用いられる。具体的には上記したものと同様なものが例示される。アミノ基の保護、カルボキシル基の脱保護、および水酸基の保護の方法は、本明細書に記載する以外にも、使用する保護基に応じて適宜公知の方法および試薬によって実施され得ることは当業者には明らかであろう。
化合物（ｅ−７）から化合物（ｅ−８）へのアジド化は、１当量の化合物（ｅ−７）、触媒量のＤＭＡＰ等の塩基、約１０当量のトシルクロライドを、塩化メチレンなどの溶媒中で、室温〜４０℃で約２時間〜終夜反応させることによって化合物（ｅ−７）のトシル誘導体を得、得られたトシル誘導体１当量に対して約１５当量のアジ化ナトリウムを、ＤＭＳＯ等の溶媒中で、約６０〜７０℃で約５時間程度反応させることによって行われる。
化合物（ｅ−８）をアミノ化し、続いて当該アミノ基を保護することによって、化合物（ＩＩｅ）が得られる。
通常、１当量の化合物（ｅ−８）、触媒量の水酸化パラジウムを水素雰囲気下、メタノールやエタノールなどの溶媒中で、室温で約１〜２時間程度反応させることによってアミン体を得る。ついで、得られたアミン体に常法に従い、例えば炭酸９−フルオレニルメチルスクシンイミジル等を用いて、トリエチルアミンのような塩基の存在下、ＴＨＦ等の溶媒中で反応させることによってアミノ基の保護基を導入する。
本発明において、モノマー成分を重合してポリマーとするには、当分野で通常実施されている種々の方法を採用する。
具体的には上記一般式（ＩＩａ）〜（ＩＩｅ）で表される化合物を用いてアミド化、Ｎ−置換アミド化、シッフ塩基形成（シッフ塩基形成後、該当箇所を還元反応に付すこともできる）、エステル化、アミンあるいは水酸基によるエポキシ開裂反応等の化学反応に付すことによってモノマー成分を重合する。当該重合反応は、もとになるモノマー成分がフリーな状態でも行うことができるが、後の精製工程が容易になるという点から、好ましくはもとになるモノマー成分を固相担体上に固定化し、次いで固相担体上で重合反応を行う。これらの反応に使用する試薬や反応条件は通常当分野で実施されている方法に準じる。
以下、製造例ならびに実施例、実験例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によりなんら限定されるものではない。
製造例１：１７−アリル−１４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−１−ヒドロキシ−１２−｛２−［４−（７−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ−カルボニル）ヘプタノイル−オキシ）−３−メトキシ−シクロヘキシル］−１−メチル−ビニル｝−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ［２２．３．１．０４，９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオンの合成
Figure 0004560406
１７−アリル−１４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−１−ヒドロキシ−１２−［２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−シクロヘキシル）−１−メチル−ビニル］−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ［２２．３．１．０４．９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン（ＦＫ５０６；１３８ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）、Ｏ−モノ（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニル）オクタン二酸（８６．７ｍｇ，０．２１８ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ；１６．５ｍｇ，０．０９８ｍｍｏｌ）、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ／ＨＣｌ；６９．１ｍｇ，０．２６１ｍｍｏｌ）および塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２；１ｍｌ）の混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応物を酢酸エチル−水混合液に注ぎ、抽出した。得られた有機相を水、食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥した。ＭｇＳＯ４を濾別後、減圧下濃縮した。こうして得られた残渣をシリカゲルカラムで精製し（２０％ＡｃＯＥｔ（ｎ−ヘキサン中）で溶出）、目的とする１７−アリル−１４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−１−ヒドロキシ−１２−｛２−［４−（７−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ−カルボニル）ヘプタノイル−オキシ）−３−メトキシ−シクロヘキシル］−１−メチル−ビニル｝−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ［２２．３．１．０４，９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン（４４ｍｇ，２４．６％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：−０．１−０．１（１２Ｈ，ｍ），０．７−２．６（４７Ｈ，ｍ），０．８５ ａｎｄ ０．８６（１８Ｈ，ｓ），１．５０（３Ｈ，ｓ），１．６３（３Ｈ，ｓ），２．７５（１Ｈ，ｍ），３．３１（３Ｈ，ｓ），３．３５（３Ｈ，ｓ），３．３９（３Ｈ，ｓ），４．０５（１Ｈ，ｍ），３．０−４．４（６Ｈ），４．５−５．８（９Ｈ，ｍ）．
製造例２：１７−アリル−１，１４−ジ−ヒドロキシ−１２−｛２−［４−（７−カルボキシ−ヘプタノイル−オキシ）−３−メトキシ−シクロヘキシル］−１−メチル−ビニル｝−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ［２２．３．１．０４．９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオンの合成
Figure 0004560406
製造例１で調製した１７−アリル−１４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−１−ヒドロキシ−１２−｛２−［４−（７−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ−カルボニル）ヘプタノイル−オキシ）−３−メトキシ−シクロヘキシル］−１−メチル−ビニル｝−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ［２２．３．１．０４，９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン（４４ｍｇ，０．０３７ｍｍｏｌ）とアセトニトリル（０．８８ｍｌ）の混合物に４６−４８％のフッ化水素（ＨＦ）水（０．１２ｍｌ）を静かに加え室温にて終夜撹拌した。反応物を酢酸エチル−水混合液に注ぎ、抽出した。得られた有機相を水、食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥した。ＭｇＳＯ４を濾別後、減圧下濃縮した。こうして得られた残渣をシリカゲルカラムで精製し（５％メタノール（クロロホルム中））、目的とする１７−アリル−１，１４−ジ−ヒドロキシ−１２−｛２−［４−（７−カルボキシ−ヘプタノイル−オキシ）−３−メトキシ−シクロヘキシル］−１−メチル−ビニル｝−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ［２２．３．１．０４，９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン（１４．２ｍｇ，４０％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．７−２．６（４７Ｈ，ｍ），１．５０（３Ｈ，ｓ），１．６３（３Ｈ，ｓ），２．７５（１Ｈ，ｍ），３．３１（３Ｈ，ｓ），３．３５（３Ｈ，ｓ），３．３９（３Ｈ，ｓ），４．０５（１Ｈ，ｍ），３．０−４．４（６Ｈ），４．５−５．８（１１Ｈ，ｍ）．
ＭＳ（ｍ／ｚ）：９６０（Ｍ＋）
製造例３：ＦＫ５０６付ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ）の合成
Figure 0004560406
製造例２で調製した１７−アリル−１，１４−ジヒドロキシ−１２−｛２−［４−（７−カルボキシ−ヘプタノイル−オキシ）−３−メトキシ−シクロヘキシル］−１−メチル−ビニル｝−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ［２２．３．１．０４，９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン（３８．４ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）、ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ，１００μｌ，遊離アミノ基（ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐ）は０．０１ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ／ＨＣｌ（９．２ｍｇ，０．０４８ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ；６．５ｍｇ，０．０４８ｍｍｏｌ）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；１ｍｌ）の混合物を室温で６時間撹拌した。反応の終点はニンヒドリン反応で残存アミノ基が肉眼で観測できなくなることで確認した。この時の反応率を換算すると約８２％であった。反応終了確認後、ＤＭＦで樹脂を５回洗浄した。ここに無水酢酸（１００μｌ）およびＤＭＦ（４００μｌ）を加え１時間室温で撹拌した。その後ＤＭＦで十分洗浄し、得られたＦＫ５０６付ＴＯＹＯパール樹脂は後述する結合実験に用いた。ＴＯＹＯパール樹脂とＦＫ５０６の間に介在する基のＨＢＡ数は４、ＨＢＤ数は３である（但し、ＦＫ５０６にあらかじめ導入された基に由来する分は数に入れない）。当該ＨＢＡ数およびＨＢＤ数は市販のＴＯＹＯパール樹脂のリンカーに由来する。
製造例４：ＦＫ５０６付ＡｆｆｉＧｅｌ樹脂の合成
Figure 0004560406
ＴＯＹＯパール樹脂の代わりにＡｆｆｉＧｅｌ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いる以外は製造例３と同様な手法によりＦＫ５０６付ＡｆｆｉＧｅｌ樹脂を合成した。得られたＦＫ５０６付ＡｆｆｉＧｅｌ樹脂は後述する結合実験に用いた。ＡｆｆｉＧｅｌ樹脂とＦＫ５０６の間に介在する基のＨＢＡ数は３、ＨＢＤ数は２である（但し、ＦＫ５０６にあらかじめ導入された基に由来する分は数に入れない）。当該ＨＢＡ数およびＨＢＤ数は市販のＡｆｆｉｇｅｌ樹脂のリンカーに由来する。
製造例５：親水性スペーサー分子の合成（１−１）
２−（２−｛２−［２−（２−トリチルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）エタノールの合成
Figure 0004560406
ペンタエチレングリコール（化合物１；１０ｇ，４２．０ｍｍｏｌ）をピリジン（１００ｍｌ）に溶解し、トリフェニルメチルクロリド（１１．６ｇ，４１．６ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（０．９ｇ，７．４ｍｍｏｌ）を室温で加えた後、３５℃で終夜攪拌した。これを減圧濃縮して得られた残渣をクロロホルムに溶解し、有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水、及び飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。固形物を綿ろ過にて除去し、クロロホルムで洗浄し、ろ液と洗液を合わせて減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（関東化学 ６０Ｎ；６００ｍｌ）に供し、溶出液（６０：１ クロロホルム（ＣＨＣｌ３）−メタノール（ＭｅＯＨ）にて目的の２−（２−｛２−［２−（２−トリチルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）エタノール（化合物２；１０．４ｇ，５１．２％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：２．５３（１Ｈ，ｔ），３．１６（２Ｈ，ｔ），３．４９−３．６３（１８Ｈ，ｍ），７．１４−７．４１（１５Ｈ，ｍ）．
製造例６：親水性スペーサー分子の合成（１−２）
［２−（２−｛２−［２−（２−トリチルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］酢酸の合成
Figure 0004560406
製造例５で得られた化合物２（１０．２ｇ，２１．２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ；２００ｍｌ）及びＤＭＦ（５０ｍｌ）の混合溶媒に溶解し、０℃にて水素化ナトリウム（３．１ｇ；油性，６０ｗｔ％）を少しずつ加えた後、室温で３０分間攪拌した。これを０℃に冷却した後、ブロモ酢酸（６．５ｇ，４６．８ｍｍｏｌ）を少しずつ加え、室温で３０分間攪拌した。その後更に水素化ナトリウム（１１．６ｇ；油性，６０ｗｔ％）を室温で少しずつ加えて室温で１時間攪拌した。反応液を０℃に冷却し、水（２５ｍｌ）を徐々に加えた後、反応液の量が約１００ｍｌになるまで減圧濃縮した。これに酢酸エチル（２００ｍｌ）及び、食塩水（１００ｍｌ）を加え、攪拌しながら２Ｍ硫酸水素カリウム水を加え、ｐＨを６に調製した。有機相を抽出し、３０℃にて減圧濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（関東化学 ６０Ｎ；４００ｍｌ）に供し、溶出液（８５：１５ ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ）にて目的の［２−（２−｛２−［２−（２−トリチルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］酢酸（化合物３）の粗精製物（１２．４ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．３４（２Ｈ，ｔ），３．７６−３．８４（２０Ｈ，ｍ），４．１３（２Ｈ，ｓ），７．３０−７．８３（１５Ｈ，ｍ）．
製造例７：親水性スペーサー分子の合成（１−３）
［２−（２−｛２−［２−（２−トリチルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］酢酸 ベンジルエステルの合成
Figure 0004560406
製造例６で得られた化合物３の粗精製物（１２．４ｇ）を塩化メチレン（１００ｍｌ）に溶解し、４−ジメチルアミノピリジン（０．２９ｇ，２．４ｍｍｏｌ）、ベンジルアルコール（３．１ｍｌ，３０．０ｍｍｏｌ）を加えた。これを０℃に冷却し、水溶性カルボジイミド（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド；ＷＳＣ；４．５ｇ，２３．５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて終夜攪拌した。反応液をクロロホルムで抽出し、有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水、及び飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。固形物を綿ろ過にて除去し、クロロホルムで洗浄し、ろ液と洗液を合わせて減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（関東化学 ６０Ｎ；６００ｍｌ）に供し、溶出液（１：１ 酢酸エチル−ヘキサン）にて目的の［２−（２−｛２−［２−（２−トリチルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］酢酸 ベンジルエステル（化合物４；１２．０ｇ，９０．１％，２ｓｔｅｐｓ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．１６（２Ｈ，ｔ），３．５５−３．６５（２０Ｈ，ｍ），４．１１（２Ｈ，ｓ），５．１１（２Ｈ，ｓ），７．１５−７．４０（２０Ｈ，ｍ）．
製造例８：親水性スペーサー分子の合成（１−４）
［２−（２−｛２−［２−（２−ヒドロキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］酢酸 ベンジルエステルの合成
Figure 0004560406
製造例７で得られた化合物４（１２．０ｇ）を５％トリフルオロ酢酸塩化メチレン溶液（１５０ｍｌ）に溶解し、０℃にて水（１０ｍｌ）を加えて、０℃にて２０分間攪拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水に注いで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。固形物を綿ろ過にて除去し、クロロホルムで洗浄し、ろ液と洗液を合わせて減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（関東化学 ６０Ｎ；４００ｍｌ）に供し、溶出液（１０００：１５ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ）にて目的の［２−（２−｛２−［２−（２−ヒドロキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］酢酸 ベンジルエステル（化合物５；７．０ｇ，９５％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：２．８０（１Ｈ，ｔ），３．６２−３．７６（２０Ｈ，ｍ），４．２２（２Ｈ，ｓ），５．２０（２Ｈ，ｓ），７．３６−７．４１（５Ｈ，ｍ）．
製造例９：親水性スペーサー分子の合成（１−５）
［２−（２−｛２−［２−（２−アジド−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］酢酸 ベンジルエステルの合成
Figure 0004560406
製造例８で得られた化合物５（７．０ｇ，１８．１ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（０．４ｇ，３．３ｍｍｏｌ）をピリジン（４５ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却した。これにｐ−トルエンスルホニルクロリド（５．２ｇ，２７．２ｍｍｏｌ）を加えて室温で終夜攪拌し、更にｐ−トルエンスルホニルクロリド（３．１ｇ，１６．２ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（１２０ｍｇ，０．９８ｍｍｏｌ）を加えて３０℃で２時間攪拌した。反応液を０℃に冷却し、水（３ｍｌ）を加えて減圧濃縮し、得られた残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水、及び飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。固形物を綿ろ過にて除去し、酢酸エチルで洗浄し、ろ液と洗液を合わせて減圧濃縮した。得られた残渣をＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解し、アジ化ナトリウム（１１．８ｇ，０．１８ｍｏｌ）を加えて６０℃で１時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで抽出し、有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水、及び飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。固形物を綿ろ過にて除去し、酢酸エチルで洗浄し、ろ液と洗液を合わせて減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（関東化学 ６０Ｎ；２５０ｍｌ）に供し、溶出液（３：１ 酢酸エチル−ヘキサン）にて目的の［２−（２−｛２−［２−（２−アジド−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］酢酸 ベンジルエステル（化合物６；３．３ｇ，４４．３％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．３１（２Ｈ，ｔ），３．５４−３．８７（２０Ｈ，ｍ），４．１３（２Ｈ，ｓ），５．１２（２Ｈ，ｓ），７．２０−７．３０（５Ｈ，ｍ）．
製造例１０：親水性スペーサー分子の合成（１−６）
［２−（２−｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］酢酸の合成
Figure 0004560406
製造例９で得られた化合物６（１．９４ｇ，４．７２ｍｍｏｌ）をメタノール（５０ｍｌ）に溶解し、１０％Ｐｄ−Ｃ（５００ｍｇ）を加えて、室温で２．５時間接触水素添加を行った。固形物をセライトろ過にて除去し、メタノールで洗浄し、ろ液と洗液を合わせて減圧濃縮して目的の［２−（２−｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］酢酸（化合物７；１．４ｇ，定量的）を得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：２９６（Ｍ＋）
製造例１１：親水性スペーサー分子の合成（１−７）
｛２−［２−（２−｛２−［２−（９Ｈ−フルオレン−９−イル−メトキシカルボニルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝酢酸の合成
Figure 0004560406
製造例１０で得られた化合物７（１．２５ｇ，４．２３ｍｍｏｌ）を１０％炭酸ナトリウム水（１４ｍｌ）に溶解し、ジメトキシエタン（１４ｍｌ）に懸濁した９−フルオレニルメチルスクシンイミジルカルボネート（２．１５ｇ，６．３７ｍｍｏｌ）を室温で滴下した後、室温で終夜攪拌した。固形物をセライトにてろ別後、クロロホルムで洗浄した。ろ液と洗液を合わせてクロロホルムで抽出し、有機相を２Ｍ硫酸水素ナトリウム水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。固形物を綿ろ過にて除去し、クロロホルムで洗浄し、ろ液と洗液を合わせて減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（関東化学 ６０Ｎ；１５０ｍｌ）に供し、溶出液（１０００：７ ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ）にて目的の｛２−［２−（２−｛２−［２−（９Ｈ−フルオレン−９−イル−メトキシカルボニルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝酢酸（化合物８；１．３８ｇ，６３．０％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．３４（２Ｈ，ｔ），３．５０−３．７１（１８Ｈ，ｍ），４．０５（２Ｈ，ｓ），４．１２（１Ｈ，ｔ），４．３３（２Ｈ，ｄ），５．５７（１Ｈ，ｓ），７．２２−７．９５（８Ｈ，ｍ）．
製造例１２：親水性スペーサー付樹脂の合成：ヘキサエチレングリコール誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ）の合成
Figure 0004560406
ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ；１００μｌ中に０．０１ｍｍｏｌのアミンが存在）に塩化メチレン（０．４ｍｌ）とＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ；０．１ｍｌ）の混合溶媒に溶解した｛２−［２−（２−｛２−［２−（９Ｈ−フルオレン−９−イル−メトキシカルボニルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝酢酸（製造例１１で得られた化合物８；２１ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）を加え、更にベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ；２６ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７μｌ，０．１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間振とうした。反応終了後、樹脂を塩化メチレン、及びＤＭＦで十分に洗浄した後、ニンヒドリンテストにより縮合収率を測定した（約８１％）。得られた樹脂に無水酢酸／塩化メチレン／ＮＭＰ（１／８／２）の混合溶液（０．５ｍｌ）を加えて室温で３時間振とうした。樹脂を塩化メチレン、及びＤＭＦで十分に洗浄した後、ピペリジン／ＤＭＦ／塩化メチレン（１／４／４）の混合溶液（０．５ｍｌ）を加えて室温で３時間振とうした。反応終了後、樹脂を塩化メチレン、及びＤＭＦで十分に洗浄した後、ニンヒドリンテストにより樹脂１００μｌ中に約７．９μｍｏｌのアミンが存在することを確認した。
製造例１３：ＦＫ５０６誘導体結合型親水性スペーサー付樹脂の合成
Figure 0004560406
製造例１２で得られたヘキサエチレングリコール誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂を用い、製造例３で述べた方法に準じて親水性スペーサーを有するＦＫ５０６結合型樹脂〔ＴＯＹＯ＋（ＰＥＧ）１−ＦＫ５０６〕を合成した。ＴＯＹＯパール樹脂とＦＫ５０６の間に介在する親水性スペーサー部分のＨＢＡ数は１１、ＨＢＤ数は４である。尚、ＴＯＹＯパール樹脂のリンカーに由来するＨＢＡ数およびＨＢＤ数を考慮しなければ、当該親水性スペーサーのＨＢＡ数は７、ＨＢＤ数は１である。
製造例１４：ＦＫ５０６誘導体結合型親水性スペーサー付樹脂の合成
Figure 0004560406
製造例１２で得られたヘキサエチレングリコール誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂を用い、製造例１２に従い親水性スペーサーの伸長反応を行った後、製造例３で述べた方法に準じて親水性スペーサーを有するＦＫ５０６結合型樹脂〔ＴＯＹＯ＋（ＰＥＧ）２−ＦＫ５０６〕を合成した。ＴＯＹＯパール樹脂とＦＫ５０６の間に介在する親水性スペーサー部分のＨＢＡ数は１８、ＨＢＤ数は５である。尚、ＴＯＹＯパール樹脂のリンカーに由来するＨＢＡ数およびＨＢＤ数を考慮しなければ、当該親水性スペーサーのＨＢＡ数は１４、ＨＢＤ数は２である。
製造例１５：ＦＫ５０６誘導体結合型親水性スペーサー付樹脂の合成
Figure 0004560406
製造例１２で得られたヘキサエチレングリコール誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂を用い、製造例１２に従い親水性スペーサーの伸長反応をくり返し行った後、製造例３で述べた方法に準じて親水性スペーサーを有するＦＫ５０６結合型樹脂〔ＴＯＹＯ＋（ＰＥＧ）３−ＦＫ５０６〕を合成した。ＴＯＹＯパール樹脂とＦＫ５０６の間に介在する親水性スペーサー部分のＨＢＡ数は２５、ＨＢＤ数は６である。尚、ＴＯＹＯパール樹脂のリンカーに由来するＨＢＡ数およびＨＢＤ数を考慮しなければ、当該親水性スペーサーのＨＢＡ数は２１、ＨＢＤ数は３である。
製造例１６：ＦＫ５０６誘導体結合型親水性スペーサー付樹脂の合成
Figure 0004560406
製造例１２で得られたヘキサエチレングリコール誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂を用い、製造例１２に従い親水性スペーサーの伸長反応をくり返し行った後、製造例３に述べた方法に準じ、親水性スペーサーを有するＦＫ５０６結合型樹脂〔ＴＯＹＯ＋（ＰＥＧ）４−ＦＫ５０６〕を合成した。ＴＯＹＯパール樹脂とＦＫ５０６の間に介在する親水性スペーサー部分のＨＢＡ数は３２、ＨＢＤ数は７である。尚、ＴＯＹＯパール樹脂のリンカーに由来するＨＢＡ数およびＨＢＤ数を考慮しなければ、当該親水性スペーサーのＨＢＡ数は２８、ＨＢＤ数は４である。
製造例１７：ＦＫ５０６誘導体結合型親水性スペーサー付樹脂の合成
Figure 0004560406
製造例１２で得られたヘキサエチレングリコール誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂を用い、製造例１２に従い親水性スペーサーの伸長反応をくり返し行った後、製造例３に述べた方法に準じ、親水性スペーサーを有するＦＫ５０６結合型樹脂〔ＴＯＹＯ＋（ＰＥＧ）５−ＦＫ５０６〕を合成した。ＴＯＹＯパール樹脂とＦＫ５０６の間に介在する親水性スペーサー部分のＨＢＡ数は３９、ＨＢＤ数は８である。尚、ＴＯＹＯパール樹脂のリンカーに由来するＨＢＡ数およびＨＢＤ数を考慮しなければ、当該親水性スペーサーのＨＢＡ数は３５、ＨＢＤ数は５である。
製造例１８：ＦＫ５０６誘導体結合型親水性スペーサー付樹脂の合成
Figure 0004560406
製造例１２で得られたヘキサエチレングリコール誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂を用い、製造例１２に従い親水性スペーサーの伸長反応をくり返し行った後、製造例３に述べた方法に準じ、親水性スペーサーを有するＦＫ５０６結合型樹脂〔ＴＯＹＯ＋（ＰＥＧ）６−ＦＫ５０６〕を合成した。ＴＯＹＯパール樹脂とＦＫ５０６の間に介在する親水性スペーサー部分のＨＢＡ数は４６、ＨＢＤ数は９である。尚、ＴＯＹＯパール樹脂のリンカーに由来するＨＢＡ数およびＨＢＤ数を考慮しなければ、当該親水性スペーサーのＨＢＡ数は４２、ＨＢＤ数は６である。
製造例１９：親水性スペーサー分子の合成（２−１）
（５Ｓ−アミノメチル−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラン−４Ｓ−イルメチル）カルバミン酸 ９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル エステル（化合物１０）の合成
Figure 0004560406
化合物９（１．０ｇ，６．２５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ２０ｍｌに溶解し、氷冷下攪拌した。その反応系中に９−フルオレニルメチルスクシンイミジルカルボネート（Ｆｍｏｃ−Ｏｓｕ；２．１ｇ，６．２５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ１０ｍｌにて溶解し、ゆっくりと滴下した。引き続きトリエチルアミンを滴下後、氷冷下３０分間攪拌した。反応終了後、水を加え、酢酸エチルにて水相を抽出し、有機相を飽和食塩水にて洗浄した後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥した。得られた有機相を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＢＷ−８２０ＭＨ；富シリシア化学、展開溶媒（１０：１＝酢酸エチル：エタノール））にて精製し目的の化合物１０（１．２２ｇ）を収率５２．８％にて得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：３８３（ＭＨ＋），１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ ｄ６）δ：１．３０（ｓ，６Ｈ），２．６８（ｄ，２Ｈ），３．０７（ｍ，２Ｈ），３．６３−３．６（ｍ，１Ｈ），３．６９−４．０２（ｍ，１Ｈ），４．０４−４．２１（ｍ，１Ｈ），４．２９（ｍ，２Ｈ），７．３３（ｍ，２Ｈ），７．４２（ｔ，２Ｈ），７．７０（ｄ，２Ｈ），７．８９（ｄ，２Ｈ）．
製造例２０：親水性スペーサー分子の合成（２−２）
５Ｒ−（｛５Ｓ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−メチル］−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラン−４Ｒ−イルメチル｝−カルバモイル）−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラン−４Ｓ−カルボン酸 ベンジルエステル（化合物１１）の合成
Figure 0004560406
２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラン−４Ｒ，５Ｒ−ジカルボン酸（７４０ｍｇ，３．８９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル５０ｍｌに溶かし、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ；１．２６ｇ，７．７８ｍｍｏｌ）を添加し室温にて３０分間攪拌した。その反応系中にベンジルアルコール（ＢｎＯＨ；４２０ｍｇ，３．８９ｍｍｏｌ），１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ；８８７ｍｇ，５．８４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１７時間攪拌した。反応終了後、反応溶液中に水を加え、さらに１Ｎ−塩酸にて弱酸性とした。反応液を酢酸エチルにて抽出し、抽出した有機相を飽和食塩水にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥した。得られた有機相を減圧濃縮後、目的のモノベンジルエステル体を得た。精製することなく得られたモノベンジルエステル体をＤＭＦ１００ｍｌに溶かし、製造例１９で得られた化合物１０（１．２ｇ，３．１４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１０ｍｌに溶かし反応系中に加えた。ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ；３．３７ｇ，６．４８ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ；１．２５ｇ，９．７４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１７時間攪拌した。反応液中に水１００ｍｌを加え、酢酸エチル１００ｍｌにて３回抽出した。抽出した有機相を飽和食塩水にて洗浄し、得られた有機相を無水硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的の化合物１１（０．４９ｇ）を収率２３．５％にて得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：６４５（ＭＨ＋），１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．３３−１．３９（ｍ，６Ｈ），１．４３（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｍ，３Ｈ），３．４２（ｂ，２Ｈ），３．５３（ｂ，２Ｈ），３．７５（ｍ，１Ｈ），４．２１（ｍ，１Ｈ），４．３７−４．４８（ｍ，２Ｈ），４．７６−４．８２（ｍ，２Ｈ），５．２５（ｓ，２Ｈ），５．２９（ｍ，１Ｈ），６．９３（ｍ，１Ｈ），７．２８−７．４１（ｍ，９Ｈ），７．５９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．７５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）．
製造例２１：親水性スペーサー分子の合成（２−３）
Ｎ−［４−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−２Ｓ，３Ｓ−ジヒドロキシ−ブチル］−２Ｒ，３Ｒ−ジヒドロキシ−スクシンアミド酸 ベンジルエステル（化合物１２）の合成
Figure 0004560406
化合物１１（０．４６ｇ，０．７１ｍｍｏｌ）を８０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水１０ｍｌに溶かし、室温にて５時間攪拌した。反応終了後、溶媒を留去し、ジクロロメタンにて３回共沸した。残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を飽和食塩水にて洗浄した。無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、減圧濃縮した。ｎ−ヘキサン−酢酸エチルにて再結晶し、目的の化合物１２（２２０ｍｇ）を収率５５％にて得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：５６５（ＭＨ＋），１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ ｄ６）δ：２．９９−３．０６（ｍ，２Ｈ），３．０９−３．１９（ｍ，２Ｈ），３．４４（ｍ，２Ｈ），４．１８−４．２３（ｍ，１Ｈ），４．２６−４．２７（ｍ，３Ｈ），４．４７（ｄ，１Ｈ），４．６３（ｄｄ，２Ｈ），５．１５（ｄｄ，２Ｈ），５．４０（ｄ，１Ｈ），５．８８（ｔ，１Ｈ），７．１４（ｍ，１Ｈ），７．２８−７．４２（ｍ，１０Ｈ），７．６４（ｍ，１Ｈ），７．７０（ｄ，２Ｈ），７．８８（ｄ，２Ｈ）．
製造例２２：親水性スペーサー分子の合成（２−４）
Ｎ−［４−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−２Ｓ，３Ｓ−ジヒドロキシ−ブチル］−２Ｒ，３Ｒ−ジヒドロキシ−スクシンアミド酸（化合物１３）の合成
Figure 0004560406
化合物１２（２００ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）をメタノール−酢酸エチル（１：１）の混合溶媒１００ｍｌに溶かし、１０％Ｐｄ／Ｃ（５０％含水）５０ｍｇを加え、水素気流下室温にて２時間攪拌した。反応終了後、Ｐｄ／Ｃを濾取し、メタノールにて３回洗いこみをした。得られた有機相を減圧濃縮し、目的の化合物１３（１６５ｍｇ）を定量的に得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：４７５（ＭＨ＋），１Ｈ−ＮＭＲ（ＡＣＥＴＯＮ ｄ６）δ：３．２−３．４（ｍ，３Ｈ），３．４９−３．７０（ｍ，３Ｈ），４．２３（ｍ，１Ｈ），４．３３−４．３５（ｍ，２Ｈ），４．４６（ｍ，１Ｈ），４．６０（ｍ，１Ｈ），６．５０（ｍ，１Ｈ），７．３３（ｔ，２Ｈ），７．４１（ｔ，２Ｈ），７．６８（ｍ，１Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．８６（ｄ，２Ｈ）．
製造例２３：親水性スペーサー付樹脂の合成：ジハイドロキシアミノブチルタータリックアシッド誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂の合成
Figure 0004560406
トヨパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ；１００μｌ中に０．０１ｍｍｏｌのアミンが存在）にジクロロメタン（０．４ｍｌ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ；０．１ｍｌ）を加え、さらに、Ｎ−［４−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−２Ｒ，３Ｒ−ジヒドロキシ−ブチル］−２Ｒ，３Ｒ−ジヒドロキシ−スクシンアミド酸（４０ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ；５０ｍｇ，０．０９６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２５ｍｇ，０．１９２ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間振とうした。反応終了後、樹脂を塩化メチレン、及びＤＭＦで十分に洗浄した後、ニンヒドリンテストにより縮合収率７３．４％を確認した。得られた樹脂に無水酢酸／メタノール／ジクロロメタン（１／１／１０）の混合溶液（１ｍｌ）を加えて室温で０．５時間振とうした。樹脂を塩化メチレン、及びＤＭＦで十分に洗浄した後、ピペリジン／ＤＭＦ／塩化メチレン（１／４／４）の混合溶液（０．５ｍｌ）を加えて室温で３時間振とうした。反応終了後、樹脂を塩化メチレン、及びＤＭＦで十分に洗浄し、目的のジハイドロキシアミノブチルタータリックアシッド誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂［ＴＯＹＯ＋（ＤＡＢＴ）１］を得た。
製造例２４：ＦＫ５０６誘導体結合型親水性スペーサー付樹脂の合成
Figure 0004560406
製造例２３で得られたジハイドロキシアミノブチルタータリックアシッド誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂［ＴＯＹＯ＋（ＤＡＢＴ）１］より、製造例３に述べた方法に準じ、親水性スペーサーを有するＦＫ５０６結合型樹脂〔ＴＯＹＯ＋（ＤＡＢＴ）１−ＦＫ５０６〕を合成した。ＴＯＹＯパール樹脂とＦＫ５０６の間に介在する親水性スペーサー部分のＨＢＡ数は１２、ＨＢＤ数は９である。尚、ＴＯＹＯパール樹脂のリンカーに由来するＨＢＡ数およびＨＢＤ数を考慮しなければ、当該親水性スペーサーのＨＢＡ数は８、ＨＢＤ数は６である。
製造例２５：ＦＫ５０６誘導体結合型親水性スペーサー付樹脂の合成
Figure 0004560406
製造例２３で得られたジハイドロキシアミノブチルタータリックアシッド誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂［ＴＯＹＯ＋（ＤＡＢＴ）１］より、製造例２３に従い親水性スペーサーの伸長反応を行った。ただし、反応溶媒には塩化メチレン（０．５ｍｌ）とＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ；０．０５ｍｌ）の混合溶媒を用いた。次いで、製造例３に述べた方法に準じ、親水性スペーサーを有するＦＫ５０６結合型樹脂〔ＴＯＹＯ＋（ＤＡＢＴ）２−ＦＫ５０６〕を合成した。ＴＯＹＯパール樹脂とＦＫ５０６の間に介在する親水性スペーサー部分のＨＢＡ数は２０、ＨＢＤ数は１５である。尚、ＴＯＹＯパール樹脂のリンカーに由来するＨＢＡ数およびＨＢＤ数を考慮しなければ、当該親水性スペーサーのＨＢＡ数は１６、ＨＢＤ数は１２である。
製造例２６：親水性スペーサー分子の合成（３−１）
Ｎ−［２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−エチル］−２，３−ジヒドロキシ−スクシンアミド酸（化合物１６）の合成
Figure 0004560406
９Ｈ−９−フルオレニルメチル Ｎ−（２−アミノエチル）カルバメート 塩酸塩（化合物１４；５．００ｇ，１５３．７ｍｍｏｌ）及びＬ−（＋）−酒石酸（化合物１５；５．８９ｇ，３９．２ｍｍｏｌ）に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３００ｍｌ）及びトリエチルアミン（５．４６ｍｌ，３９．２ｍｍｏｌ）を加え、溶解させた。次いで、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（２．５２ｇ，１６．５ｍｍｏｌ）を加え、１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド 塩酸塩（３．１６ｇ，１６．５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２００ｍｌ）溶液を滴下した後、室温で終夜攪拌した。これを減圧濃縮して得られた残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を２Ｎクエン酸水溶液で洗浄した。次いで、炭酸水素ナトリウム水を用いて逆抽出を行った後、得られた水相を酢酸エチルで洗浄した。氷冷下、２Ｎクエン酸水溶液にて水相を酸性とした後、酢酸エチルで抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。固形物をろ過、減圧濃縮した後、メタノール−ジエチルエーテルより結晶化を行い、目的とするＮ−［２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−エチル］−２，３−ジヒドロキシ−スクシンアミド酸（２．７２ｇ，４２％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ−ａｃｅｔｏｎｅ）δ：３．２９（２Ｈ，ｔ），３．３７（２Ｈ，ｔ），４．２４（１Ｈ，ｍ），４．３０（２Ｈ，ｍ），４．４１（１Ｈ，ｄ），４．５９（１Ｈ，ｄ），７．２９−７．４２（４Ｈ，ｍ），７．６８（２Ｈ，ｄ），７．８５（２Ｈ，ｄ）．ＭＳ（ｍ／ｚ）：４１５．２（Ｍ＋）．
製造例２７：親水性スペーサー付樹脂の合成：アミノエチルタータリックジアミド誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂の合成
Figure 0004560406
ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ；１００μｌ中に０．０１ｍｍｏｌのアミンが存在）に塩化メチレン（０．５ｍｌ）を加え、更に製造例２６で得られた化合物１６（１６．６ｍｇ，４０μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１６．７μｌ，９６μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（２５．０ｍｇ，４８μｍｏｌ）を加え、室温で終夜振とうした。反応終了後、樹脂を塩化メチレン、及びＤＭＦで十分に洗浄した後、得られた樹脂に無水酢酸／メタノール／塩化メチレン（１／１／１０）の混合溶液（１．５ｍｌ）を加えて室温で２５分振とうした。反応終了後、樹脂を塩化メチレン、及びＤＭＦで十分に洗浄した後、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（０．５ｍｌ）を加えて室温で１０分振とうした。次いで、樹脂をＤＭＦで洗浄した後、再度、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（０．５ｍｌ）を加えて室温で２０分振とうした。反応終了後、樹脂を塩化メチレン、及びＤＭＦで十分に洗浄し、アミノエチルタータリックジアミド誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂〔ＴＯＹＯ＋（ＡＥＴ）１〕を得た。
製造例２８：ＦＫ５０６誘導体結合型親水性スペーサー付樹脂の合成
Figure 0004560406
製造例２７で得られたアミノエチルタータリックジアミド誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂〔ＴＯＹＯ＋（ＡＥＴ）１〕より、製造例３に述べた方法に準じ、親水性スペーサーを有するＦＫ５０６結合型樹脂〔ＴＯＹＯ＋（ＡＥＴ）１−ＦＫ５０６〕を合成した。ＴＯＹＯパール樹脂とＦＫ５０６の間に介在する親水性スペーサー部分のＨＢＡ数は１０、ＨＢＤ数は７である。尚、ＴＯＹＯパール樹脂のリンカーに由来するＨＢＡ数およびＨＢＤ数を考慮しなければ、当該親水性スペーサーのＨＢＡ数は６、ＨＢＤ数は４である。
製造例２９：ＦＫ５０６誘導体結合型親水性スペーサー付樹脂の合成
Figure 0004560406
製造例２７で得られたアミノエチルタータリックジアミド誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂〔ＴＯＹＯ＋（ＡＥＴ）１〕より、製造例２７に従い親水性スペーサーの伸長反応を行った。ただし、反応溶媒には塩化メチレン（０．５ｍｌ）とＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ；０．０５ｍｌ）の混合溶媒を用いた。次いで、製造例３に述べた方法に準じ、親水性スペーサーを有するＦＫ５０６結合型樹脂〔ＴＯＹＯ＋（ＡＥＴ）２−ＦＫ５０６〕を合成した。ＴＯＹＯパール樹脂とＦＫ５０６の間に介在する親水性スペーサー部分のＨＢＡ数は１６、ＨＢＤ数は１１である。尚、ＴＯＹＯパール樹脂のリンカーに由来するＨＢＡ数およびＨＢＤ数を考慮しなければ、当該親水性スペーサーのＨＢＡ数は１２、ＨＢＤ数は８である。
製造例３０：親水性スペーサー分子の合成（４−１）
４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシフェノール（化合物１８）の合成
Figure 0004560406
氷冷したハイドロキノン（化合物１７；３．３ｇ，３０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（６０ｍｌ）溶液へ、イミダゾール（３．１ｇ，４５ｍｍｏｌ）及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロライド（４．５ｇ，３０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３０ｍｌ）溶液を加え、氷浴を取り除き室温にて終夜攪拌した。これを水へ注ぎ、反応を停止させた後、エーテルから抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧濃縮後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー〔Ｂｉｏｔａｇｅ、溶出液（９：１ ｎ−ヘキサン：酢酸エチル）〕にて精製し、化合物１８（白色固体３．６ｇ，５３％）を得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：２２５（ＭＨ＋），１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．１６（６Ｈ，ｓ），０．９７（９Ｈ，ｓ），４．４３（１Ｈ，ｓ），６．７０（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）．
製造例３１：親水性スペーサー分子の合成（４−２）
［２−（２−｛２−［２−（２−ベンジルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）］エタノール（化合物１９）の合成
Figure 0004560406
化合物１（５．２ｇ，２１．８ｍｍｏｌ）へ水酸化カリウム（１．２ｇ，２１．４ｍｍｏｌ）を加え、オイルバス上１３０℃で１５分攪拌した後、オイルバスから外し、ベンジルクロライド（２．７ｇ，２１．３ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。これを再び１３０℃に昇温し、２時間攪拌した。室温まで放冷した後、水を注ぎ、反応を停止させ、塩化メチレンから抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過、減圧濃縮後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（山善 ＹＦＬＣ Ｇｅｌ、溶出液（酢酸エチル〜５％メタノール−酢酸エチル溶液）にて精製し、化合物１９（淡黄色オイル ２．３ｇ，３２％）を得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：３２９（ＭＨ＋），１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．３４（２Ｈ，ｔ），３．７６−３．８４（２０Ｈ，ｍ），４．１３（２Ｈ，ｓ），７．２６−７．３５（５Ｈ，ｍ）．
製造例３２：親水性スペーサー分子の合成（４−３）
［２−（２−｛２−［２−（２−ブロモ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシメチル］ベンゼン（化合物２０）の合成
Figure 0004560406
化合物１９（２．０４ｇ，６．２１ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（２０ｍｌ）溶液へ、四臭化炭素（４．１２ｇ，１２．４ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（１０ｍｌ）溶液を室温にて加え、氷冷した後トリフェニルフォスフィン（２．５１ｇ，１２．４ｍｍｏｌ）を加えた。氷浴を外し、室温にて１時間攪拌した。減圧濃縮後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（山善 ＹＦＬＣ Ｇｅｌ、溶出液（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル ２：１〜１：１））にて精製し、化合物２０（淡黄色オイル ２．１４ｇ，８８％）を得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：３９１（ＭＨ＋），１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．４６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），３．６２−３．６９（ｍ，１６Ｈ），３．６２−３．７２（２０Ｈ，ｍ），３．８０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），４．５７（２Ｈ，ｓ），７．２６−７．３５（５Ｈ，ｍ）．
製造例３３：親水性スペーサー分子の合成（４−４）
ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−｛４−［２−（２−｛２−［２−（２−トリチルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−フェノキシ｝シラン（化合物２１）の合成
Figure 0004560406
化合物２（２．８ｇ，５．８ｍｍｏｌ）のトルエン（１０ｍｌ）溶液へ、トリブチルフォスフィン（１．１７ｇ，５．８ｍｍｏｌ）のトルエン（２ｍｌ）溶液を室温で加え、１時間攪拌した。これを化合物１８（１．１ｇ，４．９ｍｍｏｌ）と、１，１’−アゾビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）（１．０ｇ，５．８ｍｍｏｌ）のトルエン（１０ｍｌ）溶液へゆっくりと加え、室温にて終夜攪拌した。酢酸エチルを加え、生じた不溶物をセライトろ過によって取り除き、酢酸エチルにより洗浄を行った。合わせた有機相を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（山善 ＹＦＬＣ Ｇｅｌ、溶出液（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル ２：１））にて精製し、化合物２１（無色オイル ２．０３ｇ，６０％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．１６（６Ｈ，ｓ），０．９７（９Ｈ，ｓ），３．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ），３．６４−３．６９（１４Ｈ，ｍ），３．８０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ），４．０４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ），６．６９−６．７５（５Ｈ，ｍ），７．２３−７．３０（１３Ｈ，ｍ），７．４５−７．４７（６Ｈ，ｍ）．
製造例３４：親水性スペーサー分子の合成（４−５）
４−［２−（２−｛２−［２−（２−トリチルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］フェノール（化合物２２）の合成
Figure 0004560406
氷冷した化合物２１（１．８８ｇ，２．７４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍｌ）溶液へ１ＭテトラブチルアンモニウムフルオライドＴＨＦ溶液（４ｍｌ）を加えた。添加終了後、氷浴を外し室温にて１０分間攪拌した。これを水へ注ぎ、反応を停止させた後、酢酸エチルから抽出した。有機相を合わせて飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過減圧濃縮後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（山善 ＹＦＬＣ Ｇｅｌ、溶出液（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル ２：１〜１：１））にて精製し、化合物２２（淡黄色オイル １．４５ｇ，９２％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ），３．６４−３．６９（ｍ，１４Ｈ），３．７９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ），４．０４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ），４．６８（１Ｈ，ｓ），６．７１−６．７９（４Ｈ，ｍ），７．２０−７．３０（９Ｈ，ｍ），７．４５−７．４７（６Ｈ，ｍ）．
製造例３５：親水性スペーサー分子の合成（４−６）
１−［２−（２−｛２−［２−（２−ベンジルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−４−［２−（２−｛２−［２−（２−トリチルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］ベンゼン（化合物２３）の合成
Figure 0004560406
氷冷した水素化ナトリウム（８００ｍｇ，２０ｍｍｏｌ；６０％ ｉｎ ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ）のＴＨＦ（１５ｍｌ）懸濁溶液へ、化合物２２（１．２ｇ，２．１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍｌ）溶液をゆっくりと加え、２０分間攪拌した。ここへ化合物２０（１．７ｇ，４．３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１２ｍｌ）溶液を加え２０分間攪拌した。氷浴を外した後、更に２時間室温にて攪拌した。注意深く水を加えて反応を停止させた後、減圧下濃縮した。塩化メチレンから抽出し、合わせた有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過減圧濃縮後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（山善 ＹＦＬＣ Ｇｅｌ、溶出液（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル ２：１〜１：１））にて精製し、化合物２３（淡黄色オイル １．５６ｇ，８４％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ），３．６１−３．７２（３０Ｈ，ｍ），３．７８−３．８２（４Ｈ，ｍ），４．０３−４．０７（４Ｈ，ｍ），４．５６（２Ｈ，ｓ），６．８２（４Ｈ，ｓ），４．１２（１Ｈ，ｔ），７．０９−７．３４（１４Ｈ，ｍ），７．４４−７．４７（６Ｈ，ｍ）．
製造例３６：親水性スペーサー分子の合成（４−７）
２−（２−｛２−［２−（２−｛４−［２−（２−｛２−［２−（２−ベンジルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−フェノキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）エタノール（化合物２４）の合成、
Figure 0004560406
氷冷した化合物２３（１．４３ｇ，１．６２ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（２０ｍｌ）溶液へ、１０％トリフルオロ酢酸を含む塩化メチレン溶液（１０ｍｌ）を加え、さらにここへ水（１ｍｌ）を加えた後、氷浴を外し室温にて２時間３０分間攪拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液へ注ぎ反応を停止させた後、塩化メチレン、クロロホルムから抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過減圧濃縮後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（山善 ＹＦＬＣ Ｇｅｌ、溶出液（１０％メタノールを含む酢酸エチル））に供し、化合物２４（淡黄色オイル ８７５ｍｇ，８５％）を得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：６４１（ＭＨ＋），１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．５９−３．７４（３２Ｈ，ｍ），３．８０−３．８４（４Ｈ，ｍ），４．０５−４．０８（４Ｈ，ｍ），４．５６（２Ｈ，ｓ），６．８３（４Ｈ，ｓ），７．２６−７．３４（５Ｈ，ｍ）．
製造例３７：親水性スペーサー分子の合成（４−８）
［２−（２−｛２−［２−（２−｛４−［２−（２−｛２−［２−（２−ベンジルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−フェノキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］酢酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物２５）の合成
Figure 0004560406
氷冷した水素化ナトリウム（１８０ｍｇ，４．５ｍｍｏｌ；６０％ ｉｎ ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ）のＴＨＦ／ＤＭＦ（５／１混液７ｍｌ）懸濁溶液へ、化合物２４（８１７ｍｇ，１．２８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（６ｍｌ）溶液をゆっくりと加え、３０分間攪拌した。ここへブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１．０ｇ，５．１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（７ｍｌ）溶液を加えた。氷浴を外した後、更に２時間室温にて攪拌した。注意深く水を加えて反応を停止させた後、酢酸エチルから抽出し、合わせた有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過減圧濃縮後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（山善 ＹＦＬＣ Ｇｅｌ、溶出液（酢酸エチル〜５％メタノールを含む酢酸エチル溶液））にて精製し、化合物２５（淡黄色オイル ６５５ｍｇ，６８％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．４７（９Ｈ，ｓ），３．６１−３．７３（３０Ｈ，ｍ），３．８１−３．８４（４Ｈ，ｍ），４．０２（２Ｈ，ｓ），４．０５−４．０８（４Ｈ，ｍ），４．５６（２Ｈ，ｓ），６．８３（４Ｈ，ｓ），７．２６−７．２４（５Ｈ，ｍ）．
製造例３８：親水性スペーサー分子の合成（４−９）
［２−（２−｛２−［２−（２−｛４−［２−（２−｛２−［２−（２−ヒドロキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−フェノキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］酢酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物２６）の合成
Figure 0004560406
窒素雰囲気下、水酸化パラジウム（２０重量％；１４５ｍｇ）のメタノール（４ｍｌ）懸濁溶液へ化合物２５（６５５ｍｇ，０．８６８ｍｍｏｌ）のメタノール（６ｍｌ）溶液を加え、水素雰囲気に置換した後、室温で４時間攪拌した。再び窒素雰囲気とした後、酢酸エチル（約１０ｍｌ）を加え、シリカゲル上でろ過し、１０％メタノールを含む酢酸エチル溶液で洗浄した。減圧濃縮後、化合物２６の粗精製物を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．４７（９Ｈ，ｓ），３．５９−３．８４（３６Ｈ，ｍ），３．８１−３．８４（４Ｈ，ｍ），４．０２（２Ｈ，ｓ），４．０７−４．０９（４Ｈ，ｍ），６．８４（４Ｈ，ｓ）．
製造例３９：親水性スペーサー分子の合成（４−１０）
［２−（２−｛２−［２−（２−｛４−［２−（２−｛２−［２−（２−アジド−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−フェノキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］酢酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物２７）の合成
Figure 0004560406
化合物２６（２５４ｍｇ，０．４５１ｍｍｏｌ）のピリジン（１．５ｍｌ）溶液へ、４−ジメチルアミノピリジン（１１ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ）を加え氷冷した後、ｐ−トルエンスルホニルクロライド（１３０ｍｇ，０．６７７ｍｍｏｌ）を加え、３０℃〜４０℃に加温しつつ２時間攪拌した。ここへ氷を加えて反応を停止させた後、酢酸エチル、水を加えた。酢酸エチルから抽出し、合わせた有機相を飽和硫酸水素カリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過減圧下濃縮し、粗精製物を得た。得られた粗精製物をＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解し、ここへアジ化ナトリウム（２６４ｍｇ，４．１ｍｍｏｌ）を加えた。約６０℃に加温し、９０分間攪拌した。室温まで放冷した後、酢酸エチルで希釈した。更に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた後、酢酸エチルから抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過減圧下濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（山善 ＹＦＬＣ Ｇｅｌ、溶出液；１０％メタノールを含む酢酸エチル溶液）にて精製し、化合物２７（無色オイル １９６ｍｇ，７３％、２ｓｔｅｐｓ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．４７（９Ｈ，ｓ），３．３８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ），３．６６−３．７２（３０Ｈ，ｍ），３．８１−３．８４（４Ｈ，ｍ），４．０２（２Ｈ，ｓ），４．０６−４．０８（４Ｈ，ｍ），６．８４（４Ｈ，ｓ）．
製造例４０：親水性スペーサー分子の合成（４−１１）
［２−（２−｛２−［２−（２−｛４−［２−（２−｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−フェノキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］酢酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物２８）の合成
Figure 0004560406
窒素雰囲気下、水酸化パラジウム（２０重量％；１８ｍｇ）のメタノール（１ｍｌ）懸濁溶液へ化合物２７（１９０ｍｇ，０．３２３ｍｍｏｌ）のメタノール（１．５ｍｌ）溶液を加え、水素雰囲気に置換した後、室温で１時間攪拌した。再び窒素雰囲気とした後、セライト上で不溶物をろ別し、メタノールで洗浄した。減圧下濃縮し化合物２８の粗精製物を得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：６６４（ＭＨ＋）．
製造例４１：親水性スペーサー分子の合成（４−１２）
｛２−［２−（２−｛２−［２−（４−｛２−［２−（２−｛２−［２−（９Ｈ−フルオレン−９−イル−メトキシカルボニルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−フェノキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝酢酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物２９）の合成
Figure 0004560406
製造例４０で得られた化合物２８の粗精製物（１７５ｍｇ，０．３１１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１．２ｍｌ）溶液を氷冷し、ここへ炭酸９−フルオレニルメチルスクシンイミジル（１１５ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（０．５ｍｌ）溶液を加え、更にトリエチルアミン（６２ｍｇ，０．６２ｍｍｏｌ，８５μｌ）を加え４５分間攪拌した。ここへ水を加えて反応を停止させた後、酢酸エチルから抽出し、合わせた有機相を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過減圧下濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（山善 ＹＦＬＣ Ｇｅｌ、溶出液；酢酸エチル〜１０％メタノールを含む酢酸エチル溶液）にて精製し、化合物２９（無色オイル １９６ｍｇ，８４％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．４７（９Ｈ，ｓ），３．３７−３．４１（１Ｈ，ｍ），３．５５−３．８４（３６Ｈ，ｍ），３．６６−３．７２（３０Ｈ，ｍ），４．０１（２Ｈ，ｓ），４．０１−４．０７（４Ｈ，ｍ），４．２０−４．２３（１Ｈ，ｍ），４．４０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），６．８１（４Ｈ，ｓ），７．２９−７．３３（２Ｈ，ｍ），７．３９−７．４１（２Ｈ，ｍ），７．６０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），７．７６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）．
製造例４２：親水性スペーサー分子の合成（４−１３）
｛２−［２−（２−｛２−［２−（４−｛２−［２−（２−｛２−［２−（９Ｈ−フルオレン−９−イル−メトキシカルボニルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−フェノキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝酢酸（化合物３０）の合成
Figure 0004560406
化合物２９（１９６ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）へ５％含水トリフルオロ酢酸（１．５ｍｌ）を室温で加え、５分間攪拌した。トルエン（約１ｍｌ）を加え、減圧下濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（山善 ＹＦＬＣ Ｇｅｌ、溶出液；３％メタノールを含むクロロホルム〜１０％メタノールを含む酢酸エチル溶液）にて精製し、化合物３０（無色オイル １７５ｍｇ，９６％）を得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：８３０（ＭＨ＋），１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．４７（９Ｈ，ｓ），３．３７−３．３９（１Ｈ，ｍ），３．５６−３．８４（３６Ｈ，ｍ），４．０２−４．０７（４Ｈ，ｍ），４．１２（２Ｈ，ｓ），４．２２−４．２３（１Ｈ，ｍ），４．４０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），６．８１（４Ｈ，ｓ），７．２９−７．３３（２Ｈ，ｍ），７．３８−７．４１（２Ｈ，ｍ），７．６０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），７．７６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）．
製造例４３：親水性スペーサー付樹脂の合成：化合物３０誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ）の合成
ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ；１００μｌ中に０．０１ｍｍｏｌのアミンが存在）に塩化メチレン（０．４ｍｌ）と｛２−［２−（２−｛２−［２−（４−｛２−［２−（２−｛２−［２−（９Ｈ−フルオレン−９−イル−メトキシカルボニルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−フェノキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝酢酸（６６ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）を加え、更にベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ；５２ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３４μｌ，０．２０ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間振とうした。反応終了後、樹脂を塩化メチレン、及びＤＭＦで十分に洗浄した後、ニンヒドリンテストにより縮合を確認した。得られた樹脂に無水酢酸／塩化メチレン／ＮＭＰ（１／８／２）の混合溶液（１．０ｍｌ）を加えて室温で３時間振とうした。樹脂を塩化メチレン、及びＤＭＦで十分に洗浄した後、ピペリジン／ＤＭＦ／塩化メチレン（１／４／４）の混合溶液（０．５ｍｌ）を加えて室温で３時間振とうした。反応終了後、樹脂を塩化メチレン、及びＤＭＦで十分に洗浄した後、ニンヒドリンテストによりアミンの存在を確認し、親水性スペーサーが樹脂に付いたことが確認できた。
製造例４４：親水性スペーサー付樹脂の合成：化合物３０誘導体ダイマー付ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ）の合成
製造例４３で得られた樹脂（１００μｌ）を製造例４３の手法に従って反応し目的物を得た。これを製造例４３の手法に従ってアセチル化、脱Ｆｍｏｃ化して、化合物３０誘導体ダイマー付ＴＯＹＯパール樹脂を得た。ニンヒドリンテストよりアミンの存在を確認し、親水性スペーサーが樹脂に付いたことが確認できた。
製造例４５：親水性スペーサー分子の合成（５−１）
２−［［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ］−アセトアミド（化合物３２）の合成
Figure 0004560406
２−アミノ−アセトアミド 塩酸塩（化合物３１，１０．０ｇ，９０．５ｍｍｏｌ）に、１０％炭酸ナトリウム水溶液（６００ｍｌ）及びアセトン（２５０ｍｌ）を加え、次いで氷冷下、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（３０．５ｍｇ，９０．５ｍｍｏｌ）のアセトン溶液（２５０ｍｌ）を滴下した。室温で１時間攪拌後、減圧濃縮して得られた残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を２Ｎクエン酸水溶液、炭酸水素ナトリウム水、飽和食塩水で順次洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。固形物をろ過、減圧濃縮した後、メタノールより結晶化を行い、目的とする２−［［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ］−アセトアミド（化合物３２；２７．７ｇ，ｑｕａｎｔ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．８７（２Ｈ，ｂｄ），４．２３（１Ｈ，ｔ），４．４６（２Ｈ，ｄ），７．３０（２Ｈ，ｔ），７．３９（２Ｈ，ｔ），７．５７（２Ｈ，ｄ），７．７５（２Ｈ，ｄ）；ＭＳ（ｍ／ｚ）；２９７．２（Ｍ＋）．
製造例４６：親水性スペーサー分子の合成（５−２）
Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イル−メトキシカルボニルアミノ）−メチル］−２，３−ジヒドロキシ−スクシンアミド酸（化合物３３）の合成
Figure 0004560406
化合物３２（１．５０ｇ，５．０６ｍｍｏｌ）に、酢酸エチル（１５ｍｌ）、アセトニトリル（１５ｍｌ）、Ｈ２Ｏ（１５ｍｌ）及び［ビス（トリフルオロ−アセトキシ）ヨード］ベンゼン（２．８３ｇ，６．５８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１．５時間攪拌した。０．２Ｎ塩酸水溶液で逆抽出を行った後、得られた水相をジエチルエーテル：ヘキサン混合溶媒で洗浄した。氷冷下、飽和炭酸水素ナトリウム水にて水相をアルカリ性とした後、クロロホルムで抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、固形物をろ過、減圧濃縮した。得られた残渣に、Ｌ−（＋）−酒石酸（１．４２ｇ，９．４５ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１００ｍｌ）を加え溶解させた。次いで、１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）−カルボジイミド 塩酸塩（７９５ｍｇ，４．１５ｍｍｏｌ）を加えた後、室温で終夜攪拌した。これを減圧濃縮して得られた残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を２Ｎクエン酸水溶液で洗浄した。次いで、炭酸水素ナトリウム水を用いて逆抽出を行った後、得られた水相を酢酸エチルで洗浄した。氷冷下、２Ｎクエン酸水溶液にて水相を酸性とした後、酢酸エチルで抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。固形物をろ過、減圧濃縮した後、メタノールより結晶化を行い、目的とするＮ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イル−メトキシカルボニルアミノ）−メチル］−２，３−ジヒドロキシ−スクシンアミド酸（化合物３３；５８８ｍｇ，２９％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ−ａｃｅｔｏｎｅ）δ：４．２４（１Ｈ，ｔ），４．２３（２Ｈ，ｄ），４．４４（１Ｈ，ｄ），４．５８−４．７１（３Ｈ，ｍ），７．３３（２Ｈ，ｔ），７．４１（２Ｈ，ｔ），７．７１（２Ｈ，ｄ），７．８６（２Ｈ，ｄ）；ＭＳ（ｍ／ｚ）；４０１．２（Ｍ＋）．
製造例４７：親水性スペーサー付樹脂の合成：アミノメチルタータリックジアミド誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂の合成
Figure 0004560406
製造例２７の手法に従って、ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ；１００μｌ中に０．０１ｍｍｏｌのアミンが存在）に化合物３３を反応させ、アミノメチルタータリックジアミド誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂〔ＴＯＹＯ＋（ＡＭＴ）１〕を得た。
製造例４８：ＦＫ５０６誘導体結合型親水性スペーサー付樹脂の合成
Figure 0004560406
製造例４７で得られたアミノメチルタータリックジアミド誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂〔ＴＯＹＯ＋（ＡＭＴ）１〕より、製造例３に述べた方法に準じ、親水性スペーサーを有するＦＫ５０６結合型樹脂〔ＴＯＹＯ＋（ＡＭＴ）１−ＦＫ５０６〕を合成した。ＴＯＹＯパール樹脂とＦＫ５０６の間に介在する親水性スペーサー部分のＨＢＡ数は１０、ＨＢＤ数は７である。尚、ＴＯＹＯパール樹脂のリンカーに由来するＨＢＡ数およびＨＢＤ数を考慮しなければ、当該親水性スぺーサーのＨＢＡ数は６、ＨＢＤ数は４である。
製造例４９：ＦＫ５０６誘導体結合型親水性スペーサー付樹脂の合成
Figure 0004560406
製造例４７にて得られたアミノメチルタータリックジアミド誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂〔ＴＯＹＯ＋（ＡＭＴ）１〕より、製造例４７に従い親水性スペーサーの伸長反応を行った。次いで、製造例３に述べた方法に準じ、親水性スペーサーを有するＦＫ５０６結合型樹脂〔ＴＯＹＯ＋（ＡＭＴ）２−ＦＫ５０６〕を合成した。ＴＯＹＯパール樹脂とＦＫ５０６の間に介在する親水性スペーサー部分のＨＢＡ数は１６、ＨＢＤ数は１１である。尚、ＴＯＹＯパール樹脂のリンカーに由来するＨＢＡ数およびＨＢＤ数を考慮しなければ、当該親水性スペーサーのＨＢＡ数は１２、ＨＢＤ数は８である。
製造例５０：親水性スペーサー分子の合成（６−１）
（２，３，４，５，６−ペンタヒドロキシ−ヘキシル）−カルバミン酸 ９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（化合物３５）の合成
Figure 0004560406
Ｄ−グルカミン（化合物３４：９．０ｇ，４９．７ｍｍｏｌ）を１０％炭酸ナトリウム水溶液２００ｍｌと混ぜ、氷冷下攪拌した。９−フルオレニルメチルスクシンイミジルカルボナート（１６．７ｇ，４９．７ｍｍｏｌ）をＤＭＥ（１，２−ジメトキシエタン）２００ｍｌに溶かし、反応系中に加え、氷冷下３０分間攪拌した。析出した結晶をろ取し、結晶をＨ２Ｏ×３、ＭｅＯＨ×３にて洗浄した。減圧下乾燥し、目的の化合物（２，３，４，５，６−ペンタヒドロキシ−ヘキシル）−カルバミン酸 ９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（化合物３５：２０ｇ）を定量的に得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：２．９９−３．０５（ｍ，１Ｈ），３．１７−３．２０（ｍ，１Ｈ），３．３７−３．４８（ｍ，３Ｈ），３．５６−３．６３（ｍ，３Ｈ），４．１９−４．２７（ｍ，４Ｈ），４．３０−４．３３（ｍ，１Ｈ），４．３９−４．４０（ｍ，１Ｈ），４．４８−４．４９（ｍ，１Ｈ），４．７３（ｍ，１Ｈ），７．０９−７．１３（ｍ，１Ｈ），７．３５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．４１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．７１（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．８８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）；ＭＳ（ｍ／ｚ）４０４（ＭＨ＋）．
製造例５１：親水性スペーサー分子の合成（６−２）
｛６−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシ］−２，３，４，５−テトラヒドロキシ−ヘキシル｝−カルバミン酸 ９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（化合物３６）の合成
Figure 0004560406
化合物３５（５．０ｇ，１２．４ｍｍｏｌ）をピリジン１００ｍｌに溶かし共沸した。この操作を２回行った後、乾燥ピリジン１００ｍｌに溶かし、窒素気流下氷冷した。４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（５．０ｇ，１４．９ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（１．５ｇ，１２．４ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下から室温にゆっくりと昇温し、室温にて１７時間攪拌した。ピリジンを減圧留去した後、酢酸エチル５００ｍｌにて希釈した。水を加えた後、有機相を分離後、再び水相を酢酸エチルにて抽出した。酢酸エチル相は飽和食塩水にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥した。減圧濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１０：１）にて精製し、目的の化合物（化合物３６：５．０６ｇ）を収率５７．９％にて得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ−ａｃｅｔｏｎｅ）δ：３．２３−３．３８（ｍ，４Ｈ），３．６７−３．９５（ｍ，６Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ），４．０５（ｄ，１Ｈ），４．１８−４．２４（ｍ，２Ｈ），４．３１−４．３３（ｍ，２Ｈ），６．５１（ｍ，１Ｈ），６．８６（ｄ，４Ｈ），７．１７−７．４２（ｍ，１Ｈ），７．５１（ｄ，２Ｈ），７．７０（ｄ，２Ｈ），７．８６（ｄ，２Ｈ）．
製造例５２：親水性スペーサー分子の合成（６−３）
［６−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシ］−２，３，４，５−テトラキス−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチル−シラニルオキシ）−ヘキシル］−カルバミン酸 ９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（化合物３７）
Figure 0004560406
化合物３６（２．４６ｇ，３．４９ｍｍｏｌ）を２，６−ルチジン（１５ｇ，１４０ｍｍｏｌ）に溶かし、氷冷下攪拌した。トリフルオロメタンスルホン酸ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（１８．４ｇ，６９．８ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。氷冷下から室温へゆっくり戻し、一昼夜攪拌した。ジクロロメタン２００ｍｌ、水２００ｍｌを加え、室温にて２時間攪拌した。有機相を分離後、水相をさらにジクロロメタン２００ｍｌにて抽出した。ジクロロメタン相を無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝５：１）にて精製し、目的の化合物（化合物３７：３．５ｇ）を収率８６．４％にて得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：−０．１−０．２（ｍ，２４Ｈ），０．７２（ｓ，９Ｈ），０．７５（ｓ，９Ｈ），０．９１−０．９６（ｍ，１８Ｈ），３．２５（ｄ，１Ｈ），３．３５−３．５０（ｍ，３Ｈ），３．５９（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｓ，６Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），４．０３−４．１９（ｍ，３Ｈ），４．２９−４．４１（ｍ，２Ｈ），５．１８（ｍ，１Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，４Ｈ），７．１５−７．２１（ｍ，９Ｈ），７．２７−７．３４（ｍ，４Ｈ），７．４７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）．
製造例５３：親水性スペーサー分子の合成（６−４）
［２，３，４，５−テトラキス−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチル−シラニルオキシ）−６−ヒドロキシヘキシル］−カルバミン酸 ９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（化合物３８）の合成
Figure 0004560406
化合物３７（１．１６ｇ，１ｍｍｏｌ）を（ギ酸：ジクロロメタン＝１：１０）溶液１０ｍｌに溶かし、室温にて２時間攪拌した。飽和重曹水に反応液を注ぎ込み、ジクロロメタン１００ｍｌにて抽出した。ジクロロメタン相を無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝１０：１〜５：１）にて精製し、目的のアルコール体（化合物３８：６００ｍｇ）を収率６９．８％にて得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：−０．５０−０．１０（ｍ，２４Ｈ），０．７７−０．８７（ｍ，３６Ｈ），２．１０（ｍ，１Ｈ），３．２９−３．３６（ｍ，１Ｈ），３．４３−３．５６（ｍ，２Ｈ），３．５７−３．６１（ｍ，１Ｈ），３．６５−３．７１（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｍ，１Ｈ），４．０３（ｍ，１Ｈ），４．０９（ｍ，１Ｈ），４．２７−４．３２（ｍ，２Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ），７．１７−７．２１（ｍ，２Ｈ），７．２９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．４９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）；ＭＳ（ｍ／ｚ）８６０（ＭＨ＋）．
製造例５４：親水性スペーサー分子の合成（６−５）
２，３，４，５−テトラキス−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−ヘキサン酸（化合物３９）の合成
Figure 0004560406
化合物３８（５０ｍｇ，５８．１μｍｏｌ）に、水（１．５ｍｌ）、アセトニトリル（４．５ｍｌ）及びジクロロメタン（０．７５ｍｌ）を加え、溶解させた。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム（１２１ｍｇ，５８１μｍｏｌ）、次いで塩化ルテニウム（ＩＩＩ）水和物（５ｍｇ，２３μｍｏｌ）を加えた後、室温で３時間攪拌した。これに酢酸エチルを加え、得られた有機相を２Ｎ硫酸水素カリウム水溶液、次いで飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。固形物をろ過、減圧濃縮した後、分取ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）にて精製し、目的とする２，３，４，５−テトラキス−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−ヘキサン酸（化合物３９：９．１ｍｇ，１８％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．０７−０．２０（２４Ｈ，ｍ），０．９１（３６Ｈ，ｍ），３．４３（１Ｈ，ｍ），３．５２（１Ｈ，ｍ），４．００（１Ｈ，ｍ），４．０５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），４．２０（２Ｈ，ｍ），４．４１（２Ｈ，ｄ），４．５３（１Ｈ，ｓ），７．３０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．３９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．５９（２Ｈ，ｍ），７．７６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）；ＭＳ（ｍ／ｚ）；８７４．４（ＭＨ＋）．
製造例５５：親水性スペーサー分子の合成（７−１）
４−［Ｎ’−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−ヒドラジノ］−２，３−ジヒドロキシ−４−オキソ−ブタン酸（化合物４１）の合成
Figure 0004560406
Ｎ−（９Ｈ−９−フルオレニルメトキシカルボニル）ヒドラジン塩酸塩（化合物４０；５００ｍｇ，１．７２ｍｍｏｌ）及びＬ−（＋）−酒石酸（化合物１５；６３４ｍｇ，４．２２ｍｍｏｌ）に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（３００μｌ，１．７２ｍｍｏｌ）を加え、溶解させた。次いで、１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（４８５ｍｇ，２．５３ｍｍｏｌ）を加えた後、室温で終夜攪拌した。これを減圧濃縮して得られた残渣に、炭酸水素ナトリウム水、及びジエチルエーテルを加え、二相を分液した。得られた水相を、氷冷下、２Ｎ硫酸水素カリウム水溶液にて酸性とした後、酢酸エチルで抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。固形物をろ過、減圧濃縮した後、メタノール−ジエチルエーテルより結晶化を行い、目的とする４−［Ｎ’−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−ヒドラジノ］−２，３−ジヒドロキシ−４−オキソ−ブタン酸（化合物４１：４１３ｍｇ，６３％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ−ａｃｅｔｏｎｅ）δ：４．２９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．３５（１Ｈ，ｍ），４．６０（１Ｈ，ｓ），４．６３（１Ｈ，ｓ），７．３３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．４２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．７６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．８５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）；ＭＳ（ｍ／ｚ）；３８７．２（Ｍ＋）．
製造例５６：親水性スペーサー付樹脂の合成：ヒドラジノタータリックアミド誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂の合成
Figure 0004560406
ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ；１００μｌ中に０．０１ｍｍｏｌのアミンが存在）に塩化メチレン（０．５ｍｌ）を加え、更に製造例５５で得られた化合物４１（１５．５ｍｇ，４０μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１６．７μｌ，９６μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（２５．０ｍｇ，４８μｍｏｌ）を加え、室温で終夜振とうした。樹脂をＤＭＦ、及び塩化メチレンで十分に洗浄した後、塩化メチレン（０．５ｍｌ）を加え、再度、化合物４１（１５．５ｍｇ，４０μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１６．７μｌ，９６μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（２５．０ｍｇ，４８μｍｏｌ）を加え、室温で５時間振とうした。反応終了後、樹脂を塩化メチレン、及びＤＭＦで十分に洗浄した後、得られた樹脂に無水酢酸／メタノール／塩化メチレン（１／１／１０）の混合溶液（１．５ｍｌ）を加えて室温で２５分振とうした。反応終了後、樹脂を塩化メチレン、及びＤＭＦで十分に洗浄した後、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（０．５ｍｌ）を加えて室温で１０分振とうした。次いで、樹脂をＤＭＦで洗浄した後、再度、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（０．５ｍｌ）を加えて室温で２０分振とうした。反応終了後、樹脂を塩化メチレン、及びＤＭＦで十分に洗浄し、ヒドラジノタータリックアミド誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂〔ＴＯＹＯ＋（ＨｙＴ）１〕を得た。
製造例５７：ＦＫ５０６誘導体結合型親水性スペーサー付樹脂の合成
Figure 0004560406
製造例５６で得られたヒドラジノタータリックアミド誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂〔ＴＯＹＯ＋（ＨｙＴ）１］より、製造例３に述べた方法に準じ、親水性スペーサーを有するＦＫ５０６結合型樹脂〔ＴＯＹＯ＋（ＨｙＴ）１−ＦＫ５０６〕を合成した。ＴＯＹＯパール樹脂とＦＫ５０６の間に介在する親水性スペーサー部分のＨＢＡ数は１０、ＨＢＤ数は７である。尚、ＴＯＹＯパール樹脂のリンカーに由来するＨＢＡ数およびＨＢＤ数を考慮しなければ、当該親水性スペーサーのＨＢＡ数は６、ＨＢＤ数は４である。
製造例５８：ＦＫ５０６誘導体結合型親水性スペーサー付樹脂の合成：
Figure 0004560406
Figure 0004560406
製造例５６で得られたヒドラジノタータリックアミド誘導体付ＴＯＹＯパール樹脂〔ＴＯＹＯ＋（ＨｙＴ）１〕より、製造例２７に従い親水性スペーサーの伸張反応を行った。次いで、製造例３に述べた方法に準じ、親水性スペーサーを有するＦＫ５０６結合型樹脂〔ＴＯＹＯ＋（ＨｙＴ）２−ＦＫ５０６〕を合成した。ＴＯＹＯパール樹脂とＦＫ５０６の間に介在する親水性スペーサー部分のＨＢＡ数は１６、ＨＢＤ数は１１である。尚、ＴＯＹＯパール樹脂のリンカーに由来するＨＢＡ数およびＨＢＤ数を考慮しなければ、当該親水性スペーサーのＨＢＡ数は１２、ＨＢＤ数は８である。
製造例５９：親水性スペーサー分子の合成（８−１）
３，５−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−フェノール（化合物４３）の合成
Figure 0004560406
氷冷したベンゼン−１，３，５−トリオール（化合物４２；１０ｇ，７９．３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１５０ｍｌ）溶液へ、イミダゾール（１６．２ｇ，２３８ｍｍｏｌ）及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（２３．８ｇ，１５８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１５０ｍｌ）溶液を加え、氷浴を取り除き室温にて終夜攪拌した。これを水へ注ぎ、反応を停止させた後、エーテルから抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧濃縮後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ、溶出液（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル １９：１〜９：１））にて精製し、化合物４３（白色固体９．８ｇ，３５％）を得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：３５５．２ ＭＨ＋，１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．１８（１２Ｈ，ｓ），０．９６（１８Ｈ，ｓ），４．５８（１Ｈ，ｓ），５．９４−５．９７（１Ｈ，ｍ），５．９７−５．９８（２Ｈ，ｍ）．
製造例６０：親水性スペーサー分子の合成（８−２）
１，３−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−５−［２−（２−｛２−［２−（２−トリチルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−ベンゼン（化合物４４）の合成
Figure 0004560406
化合物２（４．３ｇ，８．９ｍｍｏｌ）のトルエン（２０ｍｌ）溶液へ、トリブチルフォスフィン（２．３５ｇ，８．９２ｍｍｏｌ）を室温で加え、１時間攪拌した。これを化合物４３（３．３ｇ，１１．６ｍｍｏｌ）と、１，１’−アゾビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）（２．０ｇ，１１．６ｍｍｏｌ）のトルエン（２０ｍｌ）溶液へゆっくりと加え、室温にて終夜攪拌した。酢酸エチル（１００ｍｌ）を加え、生じた不溶物をセライトろ過によって取り除き、酢酸エチルにより洗浄を行った。合わせた有機相を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（山善 ＹＦＬＣ Ｇｅｌ、溶出液（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル ３：１〜２：１））にて精製し、化合物４４（無色オイル２．８ｇ，３９％）を得た
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．１８（１２Ｈ，Ｓ），０．９６（１８Ｈ，Ｓ），３．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ），３．６５−３．６９（ｍ，１４Ｈ），３．７９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ），４．０４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ），５．９５−５．９６５（１Ｈ，ｍ），６．０４−６．０５（２Ｈ，ｍ），７．２２−７．３１（９Ｈ，ｍ），７．４５−７．４７（６Ｈ，ｍ）．
製造例６１：親水性スペーサー分子の合成（８−３）
５−［２−（２−｛２−［２−（２−トリチルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−ベンゼン−１，３−ジオール（化合物４５）の合成
Figure 0004560406
氷冷した化合物４４（２．８１ｇ，３．４４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３０ｍｌ）溶液へ１ＭテトラブチルアンモニウムフルオライドＴＨＦ溶液（４ｍｌ）を加えた。添加終了後、氷浴を外し室温にて１時間攪拌した。これを水へ注ぎ、反応を停止させた後、酢酸エチルから抽出した。有機相を合わせて飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過減圧濃縮後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（山善 ＹＦＬＣ Ｇｅｌ、溶出液（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル １：１〜１：２〜１：３））にて精製し、化合物４５（淡黄色オイル １．９５ｇ，９６％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．２５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ），３．６２−３．７６（１６Ｈ，ｍ），４．０２−４．０４（２Ｈ，ｍ），５．８０（２Ｈ，ｓ），５．９５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２Ｈｚ），６．０３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ），７．１９−７．３０（９Ｈ，ｍ），７．４３−７．４６（６Ｈ，ｍ）．
製造例６２：親水性スペーサー分子の合成（８−４）
１，３−ビス−［２−（２−｛２−［２−（２−ベンジルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−５−［２−（２−｛２−［２−（２−トリチルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−ベンゼン（化合物４６）の合成
Figure 0004560406
氷冷した水素化ナトリウム（３５０ｍｇ，８．８ｍｍｏｌ；６０％ ｉｎ ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ）のＴＨＦ（４．５ｍｌ）、ＤＭＦ（１．５ｍｌ）懸濁混合溶液へ、化合物４５（１．０ｇ，１．７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４．５ｍｌ）、ＤＭＦ（１．５ｍｌ）混合溶液をゆっくりと加え、３０分間攪拌した。ここへ化合物２０（２．７ｇ，６．８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４ｍｌ）溶液を加え２０分間攪拌した。氷浴を外した後、更に４時間室温にて攪拌した。再び氷浴に浸した後、注意深く水を加えて反応を停止させ、減圧下濃縮した。酢酸エチルから抽出し、合わせた有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過減圧濃縮後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（山善 ＹＦＬＣ Ｇｅｌ、溶出液（酢酸エチル〜酢酸エチル：メタノール １９：１））にて精製し、化合物４６（淡黄色オイル １．２２ｇ，５９％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ），３．６１−３．７１（４６Ｈ，ｍ），３．７８−３．８２（６Ｈ，ｍ），４．０２−４．０５（６Ｈ，ｍ），４．５６（４Ｈ，ｓ），６．０９（３Ｈ，ｓ），７．２０−７．３４（ｍ，１９Ｈ），７．４４−７．４７（６Ｈ，ｍ）．
製造例６３：親水性スペーサー分子の合成（８−５）
２−（２−｛２−［２−（２−｛３，５−ビス−［２−（２−｛２−［２−（２−ベンジルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−フェノキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エタノール（化合物４７）の合成
Figure 0004560406
氷冷した化合物４６（１．２２ｇ，１．０１ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（１５ｍｌ）溶液へ、１０％トリフルオロ酢酸を含む塩化メチレン溶液（７ｍｌ）を加え、さらにここへ水（６５０μｌ）を加えた後、氷浴を外し室温にて３０分間攪拌した。反応液へトリエチルアミンを注ぎ、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（山善 ＹＦＬＣ Ｇｅｌ、溶出液（酢酸エチル〜酢酸エチル：メタノール ９：１））に供し、化合物４７（淡黄色オイル ９７７ｍｇ，Ｙ．ｑｕａｎｔ．）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．５６−３．７３（４８Ｈ，ｍ），３．８０−３．８４（６Ｈ，ｍ），４．０４−４．０９（６Ｈ，ｍ），４．５６（４Ｈ，ｓ），６．１０（３Ｈ，ｓ），７．２８−７．３２（１０Ｈ，ｍ）．
製造例６４：親水性スペーサー分子の合成（８−６）
［２−（２−｛２−［２−（２−｛３，５−ビス−［２−（２−｛２−［２−（２−ベンジルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−フェノキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−酢酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物４８）の合成
Figure 0004560406
氷冷した水素化ナトリウム（１７５ｍｇ，４．４ｍｍｏｌ；６０％ ｉｎ ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ）のＴＨＦ／ＤＭＦ（４／１混液５ｍｌ）懸濁溶液へ、化合物４７（１．０５ｇ，１．０９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍｌ）溶液をゆっくりと加え、３０分間攪拌した。ここへブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（８４７ｍｇ，４．３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（６ｍｌ）溶液を加えた。氷浴を外した後、更に２時間室温にて攪拌した。注意深く水を加えて反応を停止させて後、酢酸エチルから抽出し、合わせた有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過減圧濃縮後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（山善 ＹＦＬＣ Ｇｅｌ、溶出液（酢酸エチル〜５％メタノールを含む酢酸エチル溶液））にて精製し、化合物４８（淡黄色オイル ５３０ｍｇ，４５％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．４７（９Ｈ，ｓ），３．６３−３．７１（４８Ｈ，ｍ），３．８０−３．８３（６Ｈ，ｍ），４．０２（２Ｈ，ｓ），４．０４−４．０６（６Ｈ，ｍ），４．５６（２Ｈ，ｓ），６．０９（３Ｈ，ｓ），７．２７−７．３４（１０Ｈ，ｍ）．
製造例６５：親水性スペーサー分子の合成（８−７）
［２−（２−｛２−［２−（２−｛３，５−ビス−［２−（２−｛２−［２−（２−ヒドロキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−フェノキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−酢酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物４９）の合成
Figure 0004560406
窒素雰囲気下、水酸化パラジウム（２０重量％；９０ｍｇ）のメタノール（２．７ｍｌ）懸濁溶液へ化合物４８（５００ｍｇ，０．４６２ｍｍｏｌ）のメタノール（３．６ｍｌ）溶液を加え、水素雰囲気に置換した後、室温で約６時間攪拌した。再び窒素雰囲気とした後、酢酸エチル（約２０ｍｌ）を加え、シリカゲル上でろ過し、１０％メタノールを含む酢酸エチル溶液で洗浄した。減圧濃縮後、化合物４９の粗精製物を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．４７（９Ｈ，ｓ），３．５９−３．７３（４８Ｈ，ｍ），３．８１−３．８４（６Ｈ，ｍ），４．０２（２Ｈ，ｓ），４．０５−４．０８（６Ｈ，ｍ），６．１０（３Ｈ，ｓ）．
製造例６６：親水性スペーサー分子の合成（８−８）
（２−｛２−［２−（２−｛２−［３，５−ビス−（２−｛２−［２−（トルエン−４−スルホニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−フェノキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物５０）の合成
Figure 0004560406
化合物４９（１４６ｍｇ，０．１３８ｍｍｏｌ）のピリジン（０．８ｍｌ）溶液へ、４−ジメチルアミノピリジン（５．１ｍｇ，０．０４１ｍｍｏｌ）を加え氷冷した後、ｐ−トルエンスルホニルクロライド（１５８ｍｇ，０．８２８ｍｍｏｌ）を加え、３０℃〜４０℃に加温しつつ約２時間攪拌した。ここへ氷を加えて反応を停止させた後、酢酸エチル、水を加えた。酢酸エチルから抽出し、合わせた有機相を飽和硫酸水素カリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過減圧下濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（山善 ＹＦＬＣ Ｇｅｌ、溶出液；１０％メタノールを含む酢酸エチル溶液）にて精製し、化合物５０（無色オイル １３３ｍｇ，８０％、２ｓｔｅｐｓ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．４７（９Ｈ，ｓ），３．５８−３．８３（５４Ｈ，ｍ），４．０２（２Ｈ，ｓ），４．０４−４．０６（６Ｈ，ｍ），６．０９（３Ｈ，ｓ），７．３３（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．７９（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）．
製造例６７：親水性スペーサー分子の合成（８−９）
［２−（２−｛２−［２−（２−｛３，５−ビス−［２−（２−｛２−［２−（２−アジド−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−フェノキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−酢酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物５１）の合成
Figure 0004560406
化合物５０（１５５ｍｇ，０．１２８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶解し、ここへアジ化ナトリウム（１２５ｍｇ，１．９ｍｍｏｌ）を加えた。約６０℃に加温し、９０分間攪拌した。オイルバスを外し室温まで放冷した後、酢酸エチル（１０ｍｌ）で希釈した。更に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた後、酢酸エチルから抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過減圧下濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（山善 ＹＦＬＣ Ｇｅｌ、溶出液；５％メタノールを含む酢酸エチル溶液）にて精製し、化合物５１（無色オイル １２７ｍｇ，Ｙ．ｑｕａｎｔ）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．４７（９Ｈ，ｓ），３．３８（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ），３．６６−３．７３（４４Ｈ，ｍ），３．８２（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ），４．０２（２Ｈ，ｓ），４．０６（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ），６．１０（３Ｈ，ｓ）．
製造例６８：親水性スペーサー分子の合成（８−１０）
（２−｛２−［２−（２−｛２−［３，５−ビス−｛２−［２−（２−｛２−［２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−フェノキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−酢酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物５２）の合成
Figure 0004560406
窒素雰囲気下、水酸化パラジウム（２０重量％；１５ｍｇ）のメタノール（０．５ｍｌ）懸濁溶液へ化合物５１（１２２ｍｇ，０．３２３ｍｍｏｌ）のメタノール（０．７ｍｌ）溶液を加え、水素雰囲気に置換した後、室温で１時間攪拌した。再び窒素雰囲気とした後、セライト上で不溶物をろ別し、メタノールで洗浄した。減圧下濃縮し中間体の粗精製物を得た。
得られた中間体の粗精製物ＴＨＦ（０．７５ｍｌ）溶液を氷冷し、ここへ炭酸９−フルオレニルメチルスクシンイミジル（９１ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（０．５ｍｌ）溶液を加え、更にトリエチルアミン（４９ｍｇ，０．４９ｍｍｏｌ、６８μｌ）を加え５５分間攪拌した。ここへ水を加えて反応を停止させた後、酢酸エチルから抽出し、合わせた有機相を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過減圧下濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（山善 ＹＦＬＣ Ｇｅｌ、溶出液；酢酸エチル〜１０％メタノールを含む酢酸エチル溶液）にて精製し、化合物５２（無色オイル １１１ｍｇ，６７％、２ｓｔｅｐｓ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．４７（９Ｈ，ｓ），３．３８−３．３９（４Ｈ，ｍ），３．５５−３．８３（５０Ｈ，ｍ），４．０１（２Ｈ，ｓ），４．０１−４．０６（６Ｈ，ｍ），４．２１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ），４．４０（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），５．４３（２Ｈ，ｂｒｓ），６．０８−６．１０（３Ｈ，ｍ），７．２９−７．３３（４Ｈ，ｍ），７．３９（２Ｈ，ｍ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ），７．６０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），７．７５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）．
製造例６９：親水性スペーサー分子の合成（８−１１）
（２−｛２−［２−（２−｛２−［３，５−ビス−｛２−［２−（２−｛２−［２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−フェノキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−酢酸（化合物５３）の合成
Figure 0004560406
化合物５２（１０６ｍｇ，０．０７９ｍｍｏｌ）へ５％含水トリフルオロ酢酸（０．５４ｍｌ）を室温で加え、５分間攪拌した。トルエン（約１ｍｌ）を加え、減圧下濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（山善 ＹＦＬＣ Ｇｅｌ、溶出液；２％メタノールを含むクロロホルム溶液〜３％メタノールを含むクロロホルム溶液〜５％メタノールを含むクロロホルム溶液）にて精製し、化合物５３（淡黄色オイル ７９ｍｇ，７８％）を得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：１２８７．４ＭＨ＋，１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．３８−３．３９（４Ｈ，ｍ），３．５５−３．８３（５０Ｈ，ｍ），４．０１−４．０６（６Ｈ，ｍ），４．０２−４．０７（４Ｈ，ｍ），４．１２（２Ｈ，ｓ），４．２１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），４．４０（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），５．４６（２Ｈ，ｂｒｓ），６．０８（３Ｈ，ｍ），７．２９−７．３３（４Ｈ，ｍ），７．３９（４Ｈ，ｍ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ），７．６０（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），７．７５（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）．
製造例７０：親水性スペーサー分子の合成（９−１）
Figure 0004560406
ポリエチレングリコール（化合物５４：平均分子量２０００；１５ｇ、７．５ｍｍｏｌ）をピリジン（７５ｍｌ）に溶解し、トリフェニルメチルクロリド（２．１ｇ、７．５ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（０．２ｇ、１．６ｍｍｏｌ）を室温で加えた後、４０℃で終夜攪拌した。これを減圧濃縮して得られた残渣をベンゼン（６００ｍｌ）に溶解し、有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水、及び飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。固形物を綿ろ過にて除去し、ベンゼンで洗浄し、ろ液と洗液は合わせて減圧濃縮し、モノトリチル誘導体、及びジトリチル誘導体の混合物（７．６ｇ）を得た。このうち５．８ｇを採り、テトラヒドロフラン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド混合液（４／１；４０ｍｌ）に溶解し、水素化ナトリウム（６０％ ｏｉｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ；２１０ｍｇ）を室温で加えて３０分間攪拌した。これにブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（３．９ｍｌ、１５．１ｍｏｌ）を室温で加えて２時間攪拌した。これを０℃に冷却し、水（１−２ｍｌ）を少しずつ加えた後、反応液にベンゼン（３５０ｍｌ）を加えてから有機相を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。固形物を綿ろ過にて除去し、ベンゼンで洗浄し、ろ液と洗液は合わせて減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（関東化学 ６０Ｎ；２００ｍｌ）に供し、溶出液（１０：１ ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ）にてモノトリチル−モノ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル誘導体、及びジトリチル誘導体の混合物を５．２ｇ得た。これをエタノール（８０ｍｌ）に溶解し、１０％水酸化パラジウムを加えて接触水素添加（０．３ＭＰａ）を５時間行った。固形物をセライトろ過にて除去し、エタノールで洗浄し、ろ液と洗液は合わせて減圧濃縮した。得られた残渣をベンゼン（２５０ｍｌ）に溶解し、有機相を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。固形物を綿ろ過にて除去し、ベンゼンで洗浄し、ろ液と洗液は合わせて減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（関東化学 ６０Ｎ；２００ｍｌ）に供し、溶出液（１０：１ ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ）にて化合物５５（２．７ｇ、２４％、３ｓｔｅｐｓ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．４８（９Ｈ，ｓ），３．４６−３．８３（ｍ），４．０２（２Ｈ，ｓ）．
製造例７１：親水性スペーサー分子の合成（９−２）
Figure 0004560406
化合物５５（２．４ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（３０ｍｌ）に溶解し、モレキュラーシブス４Ａ（２ｇ）を加えて終夜攪拌し、これにｐ−トルエンスルホニルクロリド（２．１６ｇ、１１．３ｍｍｏｌ）及び、４−ジメチルアミノピリジン（０．７２ｇ、５．９ｍｍｏｌ）を室温で加えて終夜攪拌した。この反応液をそのままシリカゲルカラムクロマトグラフィー（関東化学 ６０Ｎ；２５０ｍｌ）に供し、溶出液（２０：１ ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ）にてトシル誘導体を得た。溶媒を留去後に得られた残渣をＤＭＳＯ（２４ｍｌ）に溶解し、アジ化ナトリウム（２．５ｇ、３８．５ｍｍｏｌ）、及びヨウ化ナトリウム（０．４ｇ、２．７ｍｍｏｌ）を加えて、７０℃で５時間攪拌した。反応液にベンゼン（３５０ｍｌ）を加え、有機相を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。固形物を綿ろ過にて除去し、ベンゼンで洗浄し、ろ液と洗液は合わせて減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（関東化学６０Ｎ；１５０ｍｌ）に供し、溶出液（１０：１ ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ）にて化合物５６（１．８５ｇ、７５％、２ｓｔｅｐｓ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．４７（９Ｈ，ｓ），３．３９（２Ｈ，ｔ），３．４５−３．８３（ｍ），４．０２（２Ｈ，ｓ）．
製造例７２：親水性スペーサー分子の合成（９−３）
Figure 0004560406
化合物５６（１．２３ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）をエタノール（４５ｍｌ）に溶解し、１０％水酸化パラジウム（２５０ｍｇ）を加えて、水浴中３５℃で２時間接触水素添加を行った。固形物をセライトろ過にて除去し、エタノールで洗浄し、ろ液と洗液は合わせて減圧濃縮してアミン体を得た。これを１０％炭酸ナトリウム水（１５ｍｌ）、及びアセトン（１５ｍｌ）の混合溶媒に溶解し、９−フルオレニルメチル スクシンイミジル カーボネート（２ｇ、５．９ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１時間攪拌した。反応液にベンゼン（１５０ｍｌ）を加え、有機相を飽和硫酸水素カリウム溶液、及び飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。固形物を綿ろ過にて除去し、ベンゼンで洗浄し、ろ液と洗液は合わせて減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（関東化学６０Ｎ；６０ｍｌ）に供し、溶出液（酢酸エチル→１０：１ ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ）にて化合物５７（８５２ｍｇ、６３％、２ｓｔｅｐｓ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．４７（９Ｈ，ｓ），３．３９（２Ｈ，ｔ），３．４５−３．８３（ｍ），４．０２（２Ｈ，ｓ），４．２３（１Ｈ，ｍ），４．３９（２Ｈ，ｄ），７．２８−７．７７（８Ｈ，ｍ）．
製造例７３：親水性スペーサー分子の合成（９−４）
Figure 0004560406
化合物５７（８４０ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を９５％トリフルオロ酢酸溶液（８ｍｌ）に溶解し、室温で１時間攪拌した。反応溶媒を減圧濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（関東化学６０Ｎ；６０ｍｌ）に供し、溶出液（酢酸エチル→４：１ ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ）にて化合物５８（６８９ｍｇ、８２％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．３９（２Ｈ，ｔ），３．４１−３．８３（ｍ），４．１６（２Ｈ，ｓ），４．２２（１Ｈ，ｍ），４．４０（２Ｈ，ｄ），７．２６−７．７７（８Ｈ，ｍ）．
製造例７４：親水性スペーサー付金膜の合成
ヘキサエチレングリコール誘導体付金膜（高純度化学研究所社；純金、純度９９．９％ｕｐ、形状１０ｍｍ×１０ｍｍ×０．０１ｍｍ（ｔ））の合成
Figure 0004560406
Ｐｉｒａｎｈａ溶液（３０％過酸化水素：濃硫酸＝１：４混合溶液）に数時間浸した金膜（約１ｃｍ２）をミリＱ水（ミリポアの純水製造装置で濾過した水）、エタノールで洗浄した。これを（６−メルカプト−ヘキシル）−カルバミックアシッド９Ｈ−フルオレン−９−イル−メチル エステルの１．５ｍＭエタノール溶液（０．５ｍｌ）に終夜浸した。反応終了後、金膜をエタノール、アセトニトリルで十分に洗浄した後、ピペリジン／アセトニトリル（１／４）の混合溶液（１ｍｌ）を加えて室温で３０分間振とうした。金膜をアセトニトリル（約１ｍｌ）で洗浄し、この洗浄液と回収した反応液を合わせ、この溶液中のフルオレン誘導体を定量することにより金膜上にアミンが約２５０ｐｍｏｌ存在することを確認した。
この金膜にアセトニトリル（０．２５ｍｌ）に溶解した｛２−［２−（２−｛２−［２−（９Ｈ−フルオレン−９−イル−メトキシカルボニルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝酢酸（製造例１１で得られた化合物８；１２．５ｍｇ，０．０２４ｍｍｏｌ）を加え、更にアセトニトリル（０．２５ｍｌ）に溶解したベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ；１３ｍｇ，０．０２５ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８．９μｌ，０．５０ｍｍｏｌ）を加え、室温で終夜振とうした。反応液を除き、金膜をアセトニトリルで洗浄後、同様の条件で終夜反応を行なった。反応終了後、金膜をアセトニトリルで十分に洗浄した後、アセトニトリル（０．２５ｍｌ）に溶解した酢酸（０．３μｌ，０．００５ｍｍｏｌ）を加え、更にアセトニトリル（０．２５ｍｌ）に溶解したベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ；２．６ｍｇ，０．００５ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．７μｌ，０．０１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間振とうした。金膜をアセトニトリルで十分に洗浄した後、上述のようにピペリジン／アセトニトリル（１／４）の混合溶液（１ｍｌ）で処理し、フルオレン誘導体を定量することにより縮合率を定量した（約９０％）。
製造例７５：ＦＫ５０６誘導体結合型親水性スペーサー付金膜の合成
Figure 0004560406
製造例７４で得られたヘキサエチレングリコール誘導体付金膜を用い、製造例２で調整した１７−アリル−１４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−１−ヒドロキシ−１２−｛２−［４−（７−カルボキシ−ヘプタノイル−オキシ）−３−メトキシ−シクロヘキシル］−１−メチル−ビニル｝−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ［２２．３．１．０４，９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン（４．８ｍｇ，０．００５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ／ＨＣｌ（１．０ｍｇ，０．００５ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ；０．７ｍｇ，０．００５ｍｍｏｌ）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；０．５ｍｌ）の混合物を室温で終夜撹拌した。反応終了後、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリルで十分に洗浄し、親水性スペーサーを有するＦＫ５０６結合型金膜〔金膜＋（ＰＥＧ）１−ＦＫ５０６〕を合成した。金膜とＦＫ５０６の間に介在する親水性スペーサー部分のＨＢＡ数は７、ＨＢＤ数は１である。
実施例１：結合実験（樹脂）
（１）ｌｙｓａｔｅの調製
ラットの脳（２．２ｇ）を混合液Ａ（０．２５Ｍシュクロース，２５ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．４），２２ｍｌ）に混ぜ、ホモジネートを作成後、９５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。遠心分離上清を取り、５００００ｒｐｍでさらに３０分間遠心分離した。こうして得られた上清をｌｙｓａｔｅとして使用した。なお、実験はすべて４℃あるいは氷上で行った。
（２）結合実験
上記したＦＫ５０６を結合させた各種アフィニティー樹脂を用いて以下の手順でｌｙｓａｔｅとの結合実験を行った。なお、ｌｙｓａｔｅは混合液Ａで１／２に希釈して使用した。ＦＫ５０６を結合させた各種アフィニティー樹脂をそれぞれ１０μｌを使用した。
尚、ＦＫ５０６を結合させた各種アフィニティー樹脂としては、ヘキサエチレングリコール誘導体の繰り返し構造の数をそれぞれ変えて調製した製造例１３〜１８までのＦＫ５０６誘導体結合型親水性スペーサー付樹脂を用いた。また、比較例として製造例３のＦＫ５０６付ＴＯＹＯパール樹脂を用いた。
ＦＫ５０６結合アフィニティー樹脂とｌｙｓａｔｅ（１ｍｌ）を４℃で終夜、静かに振とうした。その後、上清を除き、残ったＦＫ５０６結合アフィニティー樹脂を混合液Ａで４回十分に洗浄してＦＫ５０６結合アフィニティー樹脂表面を十分に洗浄した。
こうして得られたＦＫ５０６結合アフィニティー樹脂に２０μｌのＳＤＳ用ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ｎａｋａｌａｉ ｃａｔ．ＮＯ＝３０５６６−２２、電気泳動用ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ２−ＭＥ（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）（２ｘ）ｆｏｒ ＳＤＳ ＰＡＧＥ）を加え、２５℃で１０分間加熱した。こうして得られたサンプル液を市販のＳＤＳゲル（ＢｉｏＲａｄ ｒｅａｄｙＧｅｌ Ｊ，１５％ＳＤＳ，ｃａｔ．ＮＯ＝１６１−Ｊ３４１）で分離し、そのＳＤＳゲルを解析した。比較例である製造例３のＦＫ５０６付ＴＯＹＯパール樹脂に結合（吸着）した分子の内、代表的な１０種類のバンドを選択し、そのピークの量を各製造例および比較例の樹脂について測定し、定量化した（図１）。別に行ったウエスタンブロットによりバンド１０がＦＫ５０６のターゲット分子、ＦＫＢＰ１２であることを確認した。
結果、親水性スペーサーを導入したものに非特異的な相互作用に基づくと思われるバンドの減少あるいは消失が認められた。これらの傾向は、ヘキサエチレングリコールの繰り返し構造の数が多くなるにつれて顕著であった。一方で、特異的な相互作用に基づいてＦＫ５０６結合アフィニティー樹脂に結合したＦＫＢＰ１２のバンド（バンド１０）については、親水性スペーサーの導入によるバンドの減少や消失は認められなかった。
同様な実験を他の親水性スペーサーについても行ったところ、バンドによって程度の違いはあったが非特異的な吸着を抑制することができた。
実験例１：固相表面の疎水的性質と非特異的な相互作用の相関性
ＣＬＯＧＰの異なる種々の化合物を固相表面に固定化することによって固相表面の疎水的性質を変え、非特異的な相互作用との関係を調べた。使用した化合物を以下に示す。
Figure 0004560406
括弧内の数字はＬＯＧＰ値（ＣＬＯＧＰ値）を示している。
また、種々の化合物のＴＯＹＯパール樹脂への固定化は以下のようにして行った。
（１）酢酸固定化樹脂〔ＴＯＹＯ＋酢酸〕の合成
Figure 0004560406
ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ）に酢酸を固定化した。
ＴＯＹＯパール樹脂１００μｌに２０％無水酢酸−ＤＭＦ溶液を０．５ｍｌ加え、室温で４時間撹拌した。反応終了後、樹脂をＤＭＦで十分に洗浄した。ニンヒドリンテストにより縮合収率を測定した（約１００％）。
（２）酪酸固定化樹脂〔ＴＯＹＯ＋酪酸〕の合成
Figure 0004560406
ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ）に酪酸を固定化した。
ＴＯＹＯパール樹脂１００μｌに、ＤＭＦ（０．２５ｍｌ）とジクロロメタン（０．２５ｍｌ）の混合溶媒に溶解した酪酸（３．４０μｌ，０．０４ｍｍｏｌ）を加え、更にベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ；２６ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７μｌ，０．１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間振とうした。反応終了後、樹脂をＤＭＦで十分に洗浄した後、ニンヒドリンテストにより縮合収率を測定した（約９８％）。
（３）オクタン酸固定化樹脂〔ＴＯＹＯ＋オクタン酸〕の合成
Figure 0004560406
ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ）にオクタン酸を固定化した。ＴＯＹＯパール樹脂１００μｌ相当に、ＤＭＦ（０．２５ｍｌ）とジクロロメタン（０．２５ｍｌ）の混合溶媒に溶解したオクタン酸（６．３４μｌ，０．０４ｍｍｏｌ）を加え、ＰｙＢＯＰ（２６ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７μｌ，０．１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間振とうした。反応終了後、樹脂をＤＭＦで十分に洗浄した後、ニンヒドリンテストにより縮合収率を測定した（約９７％）。
（４）ミリスチン酸固定化樹脂〔ＴＯＹＯ＋ミリスチン酸〕の合成
Figure 0004560406
ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ）にミリスチン酸を固定化した。ＴＯＹＯパール樹脂１００μｌに、ＤＭＦ（０．２５ｍｌ）とジクロロメタン（０．２５ｍｌ）の混合溶媒に溶解したミリスチン酸（９．１３ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）を加え、更にＰｙＢＯＰ（２６ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７μｌ，０．１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間振とうした。反応終了後、樹脂をＤＭＦで十分に洗浄した後、ニンヒドリンテストにより縮合収率を測定した（約９５％）。
（５）ステアリン酸固定化樹脂〔ＴＯＹＯ＋ステアリン酸〕の合成
Figure 0004560406
ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ）にステアリン酸を固定化した。ＴＯＹＯパール樹脂１００μｌに、ＤＭＦ（０．２５ｍｌ）とジクロロメタン（０．２５ｍｌ）の混合溶媒に溶解したステアリン酸（１１．３８ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）を加え、更にＰｙＢＯＰ（２６ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７μｌ，０．１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間振とうした。反応終了後、樹脂をＤＭＦで十分に洗浄した後、ニンヒドリンテストにより縮合収率を測定した（約９１％）。
（６）フェニルプロピオン酸固定化樹脂〔ＴＯＹＯ＋フェニルプロピオン酸〕の合成
Figure 0004560406
ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ）にフェニルプロピオン酸を固定化した。ＴＯＹＯパール樹脂１００μｌに、ＤＭＦ（０．２５ｍｌ）とジクロロメタン（０．２５ｍｌ）の混合溶媒に溶解したフェニルプロピオン酸（６．０ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）を加え、更にＰｙＢＯＰ（２６ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７μｌ，０．１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間振とうした。反応終了後、樹脂をＤＭＦで十分に洗浄した後、ニンヒドリンテストにより縮合収率を測定した（約９７％）。
（７）グルタラニリック酸固定化樹脂〔ＴＯＹＯ＋グルタラニリック酸〕の合成
Figure 0004560406
ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ）にグルタラニリック酸を固定化した。ＴＯＹＯパール樹脂１００μｌに、ＤＭＦ（０．２５ｍｌ）とジクロロメタン（０．２５ｍｌ）の混合溶媒に溶解したグルタラニリック酸（８．３ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）を加え、更にＰｙＢＯＰ（２６ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７μｌ，０．１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間振とうした。反応終了後、樹脂をＤＭＦで十分に洗浄した後、ニンヒドリンテストにより縮合収率を測定した（約９７％）。
（８）３−ピリジル酢酸固定化樹脂〔ＴＯＹＯ＋３−ピリジル酢酸〕の合成
Figure 0004560406
ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ）に３−ピリジル酢酸を固定化した。ＴＯＹＯパール樹脂１００μｌに、ＤＭＦ（０．２５ｍｌ）とジクロロメタン（０．２５ｍｌ）の混合溶媒に溶解した３−ピリジル酢酸（６．９ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）を加え、更にＰｙＢＯＰ（２６ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７μｌ，０．１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間振とうした。反応終了後、樹脂をＤＭＦで十分に洗浄した後、ニンヒドリンテストにより縮合収率を測定した（約９６％）。
（９）サクシニルサルファチアゾール固定化樹脂〔ＴＯＹＯ＋サクシニルサルファチアゾール〕の合成
Figure 0004560406
ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ）にサクシニルサルファチアゾールを固定化した。ＴＯＹＯパール樹脂１００μｌに、ＤＭＦ（０．２５ｍｌ）とジクロロメタン（０．２５ｍｌ）の混合溶媒に溶解したサクシニルサルファチアゾール（１４．２ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）を加え、更にＰｙＢＯＰ（２６ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７μｌ，０．１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間振とうした。反応終了後、樹脂をＤＭＦで十分に洗浄した後、ニンヒドリンテストにより縮合収率を測定した（約７５％）。
（１０）インドメタシン固定化樹脂〔ＴＯＹＯ＋インドメタシン〕の合成
Figure 0004560406
ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ）にインドメタシンを固定化した。ＴＯＹＯパール樹脂１００μｌに、ＤＭＦ（０．２５ｍｌ）とジクロロメタン（０．２５ｍｌ）の混合溶媒に溶解したインドメタシン（１４．３ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）を加え、更にＰｙＢＯＰ（２６ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７μｌ，０．１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間振とうした。反応終了後、樹脂をＤＭＦで十分に洗浄した後、ニンヒドリンテストにより縮合収率を測定した（約９３％）。
（１１）Ｎ−アセチルトリプトファン固定化樹脂〔ＴＯＹＯ＋Ｎ−アセチルトリプトファン〕の合成
Figure 0004560406
ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ）にＮ−アセチルトリプトファンを固定化した。ＴＯＹＯパール樹脂１００μｌに、ＤＭＦ（０．２５ｍｌ）とジクロロメタン（０．２５ｍｌ）の混合溶媒に溶解したＮ−アセチルトリプトファン（９．９ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）を加え、更にＰｙＢＯＰ（２６ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７μｌ，０．１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間振とうした。反応終了後、樹脂をＤＭＦで十分に洗浄した後、ニンヒドリンテストにより縮合収率を測定した（約９０％）。
尚、ＦＫ５０６固定化樹脂〔ＴＯＹＯ＋ＦＫ５０６〕は製造例３で調整したものを用いた。
それぞれの化合物付ＴＯＹＯパール樹脂を用いてｌｙｓａｔｅとの結合実験を行った。ｌｙｓａｔｅは実施例１（１）で調製したものを用いた。
結合実験についても、固相担体を、各種化合物が固定化されたＴＯＹＯパール樹脂を用いること以外は実施例１（２）に準じて行った。
非特異的な相互作用による非特異的な吸着に基づくと思われるバンドを６種類選択し、そのピークの量を各化合物付樹脂について測定し、定量化した。各化合物の疎水性パラメーターとしてＣＬＯＧＰを用い、非特異的な結合に基づくバンドのピーク量との関係を調べ、定量化した（図２）。ＣＬＯＧＰが大きくなるにつれ非特異的な結合が増した。この結果は固相表面の疎水的な性質が強まるにつれ、非特異的な相互作用による吸着が増加することを示している。
疎水的な性質を有する固相表面と検討対象のリガンドとの結合に親水性のスペーサーを導入することにより、非特異的な相互作用を抑制することが出来る。親水性スペーサーの導入は僅かな導入でも効果がある。また、この効果は親水性スペーサーの導入の量に比例して増大させることが出来る。
低分子−低分子、低分子−高分子、高分子−高分子の相互作用を、片方の分子を固相担体に固定し、相互作用を測定、あるいは相互作用をベースとして目的とするターゲットを精製する研究において、本願発明の技術により非特異的な相互作用を人為的に抑制することが可能である。すなわち、本技術は低分子−高分子、低分子−低分子、高分子−高分子相互作用を片方の分子を固相担体に固定し、相互作用を測定、あるいは相互作用をベースとして目的とするターゲットを精製する研究を容易にするものである。これらの成果は生命科学全般、特に創薬研究、ポストゲノム研究、プロテオミクス、ケミカルジェノミクス、ケミカルプロテオミクス等に広く応用できるものである。
本出願は、日本で出願された特願２００２−２２２２２６を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (29)

  1. 分子Ａを固相担体に固定化し、当該固相上での分子Ａと該分子Ａと特異的に相互作用する分子Ｂとの間での特異的な相互作用を解析する過程において、該固定化の際に、下記式（Ｉｂ）、（Ｉｃ）および（Ｉｅ）からなる群より選択されるいずれか１つの式で表される部分構造を少なくとも１つ有する親水性スペーサー（ただし、式（Ｉｅ）で表される部分構造の場合、当該部分構造を少なくとも２つ有する親水性スペーサー）を該分子Ａと該固相担体との間に導入し：
    Figure 0004560406
    （式（Ｉｂ）中、
    ｎおよびｎ’はそれぞれ同一または異なって１〜５０の整数であり；
    式（Ｉｃ）中、
    ｐ、ｐ’およびｐ”はそれぞれ同一または異なって１〜５０の整数であり；
    式（Ｉｅ）中、
    Ｒ１１〜Ｒ１６は水素原子であり、
    ｒは１であり、ｒ’は５である）、
    固相担体における固相表面の疎水的性質を低減させる処理を行うことを特徴とする、分子Ａおよび／または固相担体と分子Ｂ以外の分子との非特異的な相互作用を抑制する方法。
  2. 分子Ａを固相担体に固定化し、当該固相上での分子Ａと該分子Ａと特異的に相互作用する分子Ｂとの間での特異的な相互作用を用いて分子Ｂを選別する過程において、該固定化の際に、下記式（Ｉｂ）、（Ｉｃ）および（Ｉｅ）からなる群より選択されるいずれか１つの式で表される部分構造を少なくとも１つ有する親水性スペーサー（ただし、式（Ｉｅ）で表される部分構造の場合、当該部分構造を少なくとも２つ有する親水性スペーサー）を該分子Ａと該固相担体との間に導入し：
    Figure 0004560406
    （式（Ｉｂ）中、
    ｎおよびｎ’はそれぞれ同一または異なって１〜５０の整数であり；
    式（Ｉｃ）中、
    ｐ、ｐ’およびｐ”はそれぞれ同一または異なって１〜５０の整数であり；
    式（Ｉｅ）中、
    Ｒ１１〜Ｒ１６は水素原子であり、
    ｒは１であり、ｒ’は５である）、
    固相担体における固相表面の疎水的性質を低減させる処理を行うことを特徴とする、分子Ａおよび／または固相担体と分子Ｂ以外の分子との非特異的な相互作用を抑制する方法。
  3. 親水性スペーサーが、式（Ｉｅ）で表される部分構造を少なくとも２つ有する、請求項１または２記載の方法。
  4. 分子Ａおよび分子Ｂの組み合わせが、低分子化合物および低分子化合物、低分子化合物および高分子化合物、ならびに高分子化合物および高分子化合物のいずれかである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 分子Ａおよび分子Ｂの組み合わせが、低分子化合物および高分子化合物、または高分子化合物および高分子化合物である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  6. 分子Ａを固相担体に固定化し、当該固相上での分子Ａと該分子Ａと特異的に相互作用する分子Ｂとの間での特異的な相互作用を解析する方法であって、該固定化の際に、下記式（Ｉｂ）、（Ｉｃ）および（Ｉｅ）からなる群より選択されるいずれか１つの式で表される部分構造を少なくとも１つ有する親水性スペーサー（ただし、式（Ｉｅ）で表される部分構造の場合、当該部分構造を少なくとも２つ有する親水性スペーサー）を該分子Ａと該固相担体との間に導入し：
    Figure 0004560406
    （式（Ｉｂ）中、
    ｎおよびｎ’はそれぞれ同一または異なって１〜５０の整数であり；
    式（Ｉｃ）中、
    ｐ、ｐ’およびｐ”はそれぞれ同一または異なって１〜５０の整数であり；
    式（Ｉｅ）中、
    Ｒ１１〜Ｒ１６は水素原子であり、
    ｒは１であり、ｒ’は５である）、
    固相担体における固相表面の疎水的性質を低減させる処理を行うことにより分子Ａおよび／または固相担体と分子Ｂ以外の分子との非特異的な相互作用を抑制することを特徴とする方法。
  7. 分子Ａを固相担体に固定化し、当該固相上での分子Ａと該分子Ａと特異的に相互作用する分子Ｂとの間での特異的な相互作用を用いて、分子Ｂを選別する方法であって、該固定化の際に、下記式（Ｉｂ）、（Ｉｃ）および（Ｉｅ）からなる群より選択されるいずれか１つの式で表される部分構造を少なくとも１つ有する親水性スペーサー（ただし、式（Ｉｅ）で表される部分構造の場合、当該部分構造を少なくとも２つ有する親水性スペーサー）を該分子Ａと該固相担体との間に導入し：
    Figure 0004560406
    （式（Ｉｂ）中、
    ｎおよびｎ’はそれぞれ同一または異なって１〜５０の整数であり；
    式（Ｉｃ）中、
    ｐ、ｐ’およびｐ”はそれぞれ同一または異なって１〜５０の整数であり；
    式（Ｉｅ）中、
    Ｒ１１〜Ｒ１６は水素原子であり、
    ｒは１であり、ｒ’は５である）、
    固相担体における固相表面の疎水的性質を低減させる処理を行うことにより分子Ａおよび／または固相担体と分子Ｂ以外の分子との非特異的な相互作用を抑制することを特徴とする方法。
  8. 親水性スペーサーが、式（Ｉｅ）で表される部分構造を少なくとも２つ有する、請求項６または７記載の方法。
  9. 分子Ａおよび分子Ｂの組み合わせが、低分子化合物および低分子化合物、低分子化合物および高分子化合物、ならびに高分子化合物および高分子化合物のいずれかである請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 分子Ａおよび分子Ｂの組み合わせが、低分子化合物および高分子化合物、または高分子化合物および高分子化合物である請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
  11. 分子Ａに対して特異的な相互作用を有する分子Ｂのスクリーニング方法であって、少なくとも以下の工程を含む方法：
    （i）分子Ａを固相担体に、下記式（Ｉｂ）、（Ｉｃ）および（Ｉｅ）からなる群より選択されるいずれか１つの式で表される部分構造を少なくとも１つ有する親水性スペーサー（ただし、式（Ｉｅ）で表される部分構造の場合、当該部分構造を少なくとも２つ有する親水性スペーサー）を介して固定化する工程：
    Figure 0004560406
    （式（Ｉｂ）中、
    ｎおよびｎ’はそれぞれ同一または異なって１〜５０の整数であり；
    式（Ｉｃ）中、
    ｐ、ｐ’およびｐ”はそれぞれ同一または異なって１〜５０の整数であり；
    式（Ｉｅ）中、
    Ｒ１１〜Ｒ１６は水素原子であり、
    ｒは１であり、ｒ’は５である）、
    （ii）分子Ｂを含むかまたは含まない試料を上記（i）で得られた分子Ａが固定化された固相担体に接触させる工程、
    （iii）分子Ａに特異的な相互作用を示したか、または示さなかった分子を同定し、解析する工程、および
    （iv）上記（iii）で得られた解析結果に基づいて分子Ａに対して特異的な相互作用を有する分子を分子Ｂと判断する工程。
  12. 親水性スペーサーが、式（Ｉｅ）で表される部分構造を少なくとも２つ有する、請求項１１記載の方法。
  13. 分子Ａおよび分子Ｂの組み合わせが、低分子化合物および低分子化合物、低分子化合物および高分子化合物、ならびに高分子化合物および高分子化合物のいずれかである請求項１１または１２記載の方法。
  14. 分子Ａおよび分子Ｂの組み合わせが、低分子化合物および高分子化合物、または高分子化合物および高分子化合物である請求項１１または１２記載の方法。
  15. 固相担体における固相表面の疎水的性質を低減させる為の親水性スペーサーであって、固相担体および分子Ａと結合した状態で下記式（Ｉｂ）、（Ｉｃ）および（Ｉｅ）からなる群より選択されるいずれか１つの式で表される部分構造を少なくとも１つ有する親水性スペーサー（ただし、式（Ｉｅ）で表される部分構造の場合、当該部分構造を少なくとも２つ有する親水性スペーサー）：
    Figure 0004560406
    Figure 0004560406
    （式（Ｉｂ）中、
    ｎおよびｎ’はそれぞれ同一または異なって１〜５０の整数であり；
    式（Ｉｃ）中、
    ｐ、ｐ’およびｐ”はそれぞれ同一または異なって１〜５０の整数であり；
    式（Ｉｅ）中、
    Ｒ１１〜Ｒ１６は水素原子であり、
    ｒは１であり、ｒ’は５である）。
  16. 式（Ｉｂ）、（Ｉｃ）および（Ｉｅ）からなる群より選択されるいずれか１つの式で表される部分構造を２つ以上有する請求項１５記載の親水性スペーサー。
  17. 式（Ｉｅ）で表される部分構造を少なくとも２つ有する、請求項１５または１６記載の親水性スペーサー。
  18. 固相担体および請求項１５〜１７のいずれか1項に記載の親水性スペーサーを含む複合体。
  19. 請求項１５〜１７のいずれか1項に記載の親水性スペーサーおよび分子Ａを含む複合体。
  20. 固相担体、請求項１５〜１７のいずれか1項に記載の親水性スペーサーおよび分子Ａを含む複合体。
  21. 下記式（Ｉｂ）、（Ｉｃ）および（Ｉｅ）からなる群より選択されるいずれか１つの式で表される部分構造を少なくとも１つ有する化合物（ただし、式（Ｉｅ）で表される部分構造の場合、当該部分構造を少なくとも２つ有する化合物）：
    Figure 0004560406
    （式（Ｉｂ）中、
    ｎおよびｎ’はそれぞれ同一または異なって１〜５０の整数であり；
    式（Ｉｃ）中、
    ｐ、ｐ’およびｐ”はそれぞれ同一または異なって１〜５０の整数であり；
    式（Ｉｅ）中、
    Ｒ１１〜Ｒ１６は水素原子であり、
    ｒは１であり、ｒ’は５である）、
    但し以下の化合物は除く。
    Figure 0004560406
  22. 式（Ｉｂ）、（Ｉｃ）および（Ｉｅ）からなる群より選択されるいずれか１つの式で表される部分構造を２つ以上有する請求項２１記載の化合物。
  23. 式（Ｉｅ）で表される部分構造を少なくとも２つ有する、請求項２１または２２記載の化合物。
  24. 下記式（ＩＩｂ）および（ＩＩｃ）からなる群より選択されるいずれか少なくとも１つの式で表される化合物：
    Figure 0004560406
    （式（ＩＩｂ）中、
    Ｙｂは水素原子またはアミノ基の保護基であり、
    Ｚｂは水素原子またはカルボキシル基の保護基であり、
    ｎ１およびｎ１’はそれぞれ同一または異なって１〜５０の整数であり；
    式（ＩＩｃ）中、
    ＹｃおよびＹｃ’はそれぞれ同一または異なって水素原子またはアミノ基の保護基であり、
    Ｚｃは水素原子またはカルボキシル基の保護基であり、
    ｐ１、ｐ１’およびｐ１”はそれぞれ同一または異なって１〜５０の整数である）、
    但し以下の化合物は除く。
    Figure 0004560406
  25. 下記式（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）および（ＩＩｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの式で表される化合物を重合してなるポリマー化合物：
    Figure 0004560406
    （式（ＩＩｂ）中、
    Ｙｂは水素原子またはアミノ基の保護基であり、
    Ｚｂは水素原子またはカルボキシル基の保護基であり、
    ｎ１およびｎ１’はそれぞれ同一または異なって１〜５０の整数であり；
    式（ＩＩｃ）中、
    ＹｃおよびＹｃ’はそれぞれ同一または異なって水素原子またはアミノ基の保護基であり、
    Ｚｃは水素原子またはカルボキシル基の保護基であり、
    ｐ１、ｐ１’およびｐ１”はそれぞれ同一または異なって１〜５０の整数であり；
    式（ＩＩｅ）中、
    Ｙｅは水素原子またはアミノ基の保護基であり、
    Ｚｅは水素原子またはカルボキシル基の保護基であり、
    Ｒ１１ａ〜Ｒ１６ａは水素原子であり、
    ｒ１は１であり、ｒ１’は５である）、
    但し以下の化合物は除く。
    Figure 0004560406
  26. 式（ＩＩｅ）で表される化合物を重合してなる、請求項２５記載のポリマー化合物。
  27. 固相担体および請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の化合物を含む複合体。
  28. 請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の化合物および分子Ａを含む複合体。
  29. 固相担体、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の化合物および分子Ａを含む複合体。
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