PT1132739E - Sistema de ligacao para activar superficies de bioconjugacao e seus processos de utilizacao - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "SISTEMA DE LIGAÇÃO PARA ACTIVAR SUPERFÍCIES DE B10C0NJUGA ÇÃO E SEUS PROCESSOS DE UTILIZAÇÃO ” A presente invenção refere-se a um sistema de ligação para activar superfícies de bioconjugação, e particularmente a um sistema de ligação que possui um novel grupo separador hidrófilo.

Devido à crescente importância das microtécnicas numa vasta variedade de aplicações científicas, o desenvolvimento de sistemas que permitem a interacção das moléculas com superfícies mantém-se um aspecto crítico. Tais interacções incluem a possibilidade de se removerem moléculas específicas de uma amostra, por exemplo para facilitar a sua análise/detecção, mas também a apresentação das moléculas numa superfície, permitindo assim que tenham lugar subsequentes reacções. Estes princípios para a imobilização de moléculas podem ser aplicados em sistemas de sensores ou cromatográficos ou para o fornecimento genérico de superfícies modificadas.

Em anos recentes tem havido numerosas abordagens ao fabrico de circuitos integrados (chips) sensores ou circuitos integrados biológicos (biochips) que são baseados em monocamadas auto reunidas de moléculas bifuncionais (SAMs), que directa ou indirectamente unem as moléculas da amostra à superfície do sensor. Tipicamente, estas moléculas bifuncionais são portadoras de, por exemplo, uma porção molecular silano ou tiol/dissulfeto a fim de conseguirem um encadeamento com a superfície inorgânica, e um grupo funcional adicional (por exemplo, grupos amino ou grupos epóxido) que interage com as moléculas da amostra, frequentemente contidas em amostras biológicas sob a forma de um oligonucleótido, uma proteína ou um polissacárido etc.

Embora a formação de um vínculo directo entre o composto bifuncional e a molécula da amostra seja possível, as moléculas da amostra não têm necessariamente de interagir directamente com os aglutinantes ou agentes de acoplamento, que formam, respectivamente, a monocamada. Altemativamente, as próprias moléculas biológicas imobilizadas adequadas podem actuar como sondas para a detecção das moléculas da amostra. Tais moléculas sonda podem igualmente ser imobilizadas através de uma reacção com os grupos funcionais livres da monocamada. Particularmente se forem usadas moléculas biológicas como moléculas sonda, a sua presença pode melhorar significativamente a especificidade da interaeção das moléculas da amostra com a superfície modificada.

Embora estas técnicas estejam bem estabelecidas para esta finalidade, a aplicação de métodos de detecção padronizados é problemática, especialmente nos casos em que a área de superfície disponível para detecção de um tipo específico de moléculas da amostra seja restrita, por exemplo se uma variedade de moléculas tiver de ser analisada num processo paralelo, uma vez que as monocamadas são limitadas na sua densidade de enxertia. Portanto, detectores adequados têm de preencher exigências muito elevadas no que se refere à sua sensibilidade c a área de superfície mínima necessária num sensor para a detecção de um tipo de molécula da amostra não pode ser facilmente reduzida.

Além disso, a densidade máxima, isto é uma molécula de amostra ou de sonda por grupo funciona], respectivamente dos aglutinantes ou agentes de acoplamento, dificilmente pode ser atingida, uma vez que devido ao obstáculo estérico exercido sobre a monocamada bidimensionalmente estendida, apenas uma fraeção dos grupos funcionais poderá reagir com as moléculas da amostra ou da sonda. Por isso a densidade geral de enxertia é baixa c normalmente mal definida.

Para a preparação dos circuitos integrados sensores ou circuitos integrados biológicos acima referidos, que são normalmente empregues em ambientes aquosos, são ffequentemente usadas camadas adequadamente hidrófilas funcionalizadas/activadas para conjugação com moléculas da amostra ou da sonda. Essas camadas hidrófilas são, em contraste com as camadas hidrófobas, passíveis de ser humedecidas e assim possuem uma melhor capacidade de ser impressas para aplicação sobre uma respectiva superfície, por exemplo sob a forma de uma distribuição com um desenho.

No caso de acoplamento a óxido de silicone ou substrato derivado, por exemplo uma superfície dc vidro etc., são gcralmcntc usados aminossilanos, por exemplo trimetoxissililpropilamina (APTF), num primeiro passo de modificação (silanização) da superfície. Num segundo passo para activar a referida superfície, os grupos amino livres dos aminossilanos são funcionalizados com um agente de ligação hetero bifuncional, capaz dc ligar de forma covalente a desejada molécula da amostra ou de sonda, por exemplo de 4-[maleimidofenil]butirato de succinimidilo (SMPB) no caso de oligómeros de ADN modificados com tiol (cf. Chrisey, Lee e 0’Ferrell, Nucleic Acids Research, 1996, Vol. 24, N° 15, pp. 3031-3039). O método à base de aminossilosano acima referido tem, no entanto, as desvantagens de os passos de reacção seguintes à sinalização resultarem numa reduzida densidade máxima de enxertia e de o método em si ser laborioso e difícil de controlar. Além disso, as camadas hidrófilas resultantes são positivamente carregadas na gama de pH biologicamente adequada. Não é possível obterem-se camadas negativamente carregadas ou sem carga. Uma forte carga positiva causaria uma forte absorção de moléculas negativamente carregadas e uma forte repulsão de moléculas positivamente carregadas.

Muito embora tenham sido feitas diversas tentativas para ultrapassar os problemas do método baseado nos aminossilanos esboçado acima, ainda existe a necessidade de camadas hidrófilas positivas alternativas, e particularmente de camadas hidrófilas negativamente carregadas ou descarregadas. Com estes diferentes tipos de camadas a superfície pode ser facilmente adaptada a um problema analítico particular.

Consequentemente, constitui um objecto da presente invenção proporcionar tais camadas hidrófilas positivas alternativas e particularmente proporcionar camadas hidrófilas negativamente carregadas ou descarregadas.

Esses e outros objectos e características de acordo com a invenção tomar-se-ão aparentes a partir da descrição e reivindicações que se seguem. 4

Consequentemente a invenção proporciona, de acordo com a reivindicação 1, um sistema de ligação destinado a activar superfícies para bioconjugação, o qual possui a seguinte fórmula genérica (I): X"[(Yi)i'Q-(Y2)j]k-Z (I) em que X é um grupo rcactivo capaz de se ligar de forma covalente a uma superfície, Z é um grupo rcactivo capaz de se ligar de forma covalente a uma biomolécula, com o pressuposto de que X não seja Z, Yi e Y2 sejam, independentemente um do outro, CR1R2 com R| e Ri a serem, independentemente um do outro, H, C1-C4 alquilo, C1-C4 alcoxi ou C1-C4 aciloxi, i, j, k são, independentemente uns dos outros, um número inteiro da série de 1 a 10, com o pressuposto de que o número total de átomos de C em Yi e Y2, não incluídos os átomos C de Ri e R2, se situa dentro dos limites de 2 a 100, e Q é um átomo hidrófilo ou um grupo seleccionado de entre o grupo constituído por O, NH, C=0, 0-C=0 c CR3R4, em que R3 e R4 são, independentemente um do outro, escolhidos do grupo constituído por H, OH, C1-C4 alcoxi e C1-C4 aciloxi, com 0 pressuposto de que R3 e R4 não sejam ao mesmo tempo H e que para Q = NH, Z não seja NH2 e em que no caso de k > 1 os Q para cada [(Yi)i-Q-(Y2)j]k sejam escolhidos independentemente um do outro. O sistema de ligação de acordo com a invenção proporciona a preparação de camadas carregadas positiva ou negativamente ou sem carga sobre o substrato, as quais possuem uma boa capacidade de humedecimento. Além disso, depois do encadeamento com a superfície, por exemplo através de silanização, não são necessários mais nenhuns passos, para, por exemplo, encadeamento de um agente de ligação bifuncional, para construir 0 sistema de ligação final que resulta numa densidade de enxertia aperfeiçoada. Se, por exemplo, Z for um grupo epoxi, grupo reactivo esse que deva ser introduzido directamente, o sistema de ligação de acordo com a invenção pode ligar-se directamente a biomoléculas tais como o ADN. Além disso, o sistema de ligação de acordo com a invenção pode ser facilmente impresso numa superfície por meio da utilização de técnicas convencionais de impressão, como por exemplo é pormenorizado abaixo.

Outras formas de realização vantajosas ou preferidas constituem a matéria sujeito das reivindicações subordinadas.

No sistema de ligação acima o referido grupo reactivo X não é particularmente limitado e pode ser escolhido de acordo com a situação prática, isto é, a superfície à qual se pretende que se ligue. Por exemplo, os gnipos tíol e dissulfeto pnde.m ligar-se a superfícies de ouro, os alcoxissilanos ou os halogenossilanos podem ligar-se a superfícies de vidro ou de cerâmica e os grupos capazes de formar radicais livres, por exemplo ao serem expostos a luzes como seja a luz UV (ultravioleta), podem ligar-se a superfícies plásticas, isto é que compreendem polímeros orgânicos.

Por exemplo, o referido grupo reactivo X é seleccionado do grupo constituído por um grupo dissulfeto (-SS-), um grupo tiol ou mercapto (-SH), um grupo silano S1W3 com W a ser um átomo ou um grupo hidrolisável e um grupo capaz de formar radicais livres, por exemplo por exposição à luz, como seja um grupo antrationa ou um seu derivado, um grupo antraquinona ou um seu derivado, um grupo benzofenona ou um seu derivado.

Preferivelmente 0 referido átomo ou grupo hidrolisável W é escolhido do grupo constituído por haletos tais como Cl, Br, I e F, grupos C1-C4 alcoxi como sejam os grupos metoxi, ctoxi, propoxi, iso-propoxi, n-butoxi, iso-butoxi ou terc.-butoxi, C1-C4 aciloxi tais como formilo, acetilo, propionilo, iso-propionilo, n-butirilo, iso-butirilo ou terc.-butirilo e grupos amino.

Outros grupos reactivos X adequados são, por exemplo, descritos no livro “Bioconjugate Techniques”, da autoria de G.T. Hermanson, Academic Press, 1996. Como exemplos de artigos originais a este respeito poderiam ser mencionados Chrisey, Lee e 0'Ferrell, NucleicAcids Research, 1996, Vol. 24, N° 15, pp. 3031-3039; ou Beier e Hoheisel, Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, N° 9, pp. 1970-1977, descrevendo particularmente ETA, PEDA conforme aqui definidos, os quais também são adequados para a invenção. 6

Conforme já definido acima Yj e Yj podem ser, independentemente um do outro, CR1R2 com Ri e Ra a serem, independentemente um do outro, H, Q-C4 alquilo, por exemplo metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, iso-butilo ou terc.-butilo; ou C1-C4 alcoxi, por exemplo metoxi, etoxi, propoxi, iso-propoxi, n-butoxi, iso-butoxi ou terc.-butoxi; ou C1-C4 aciloxi como seja formilo, acetilo, propionilo, iso-propionilo, n-butirilo, iso-butirilo ou terc.-butirilo.

Os índices i, j, k são, independentemente uns dos outros, um número inteiro da série de 1 a 10, com o pressuposto de que o número total de átomos de C em Yi e Y2, não incluídos os átomos C de Ri e R2, se situe dentro da gama de 2 a 100, por exemplo de 2 a 80, ou 2 a 60, ou 2 a 40, ou 2 a 20, particularmente 2 a 18, ou 2 a 16, ou 2 a 14, ou 2 a 12, ou 2 a 10, ou 2 a 8.

Neste contexto deverá notar-se que a única razão para o pressuposto acima é saber-se que uma distância ideal de um ADN para uma superfície hidrófoba é de cerca de 100 átomos de carbono. Assim não existe de facto nenhuma distância máxima de separação devida a quaisquer razões químicas, mas sim uma distância de separação máxima apropriada ou útil. Por outro lado, é conhecido também que quanto mais longo for 0 separador menor é a densidade de enxertia.

Exemplos específicos para Yi e Y2 que podem ser iguais ou diferentes um do outro, estão dependentes dos respectivos valores de i e j dos grupos metileno, etileno, tri-, tera-, penta-, hexa-, hepta-, octa-, nono- ou decametileno, os quais além disso podem ser ramificados ou substituídos conforme definido acima para Ri e R2. Deve entender-se que Yi e Y2 não têm uma tal extensão de cadeia que daí resulte a solidificação, ou são tão extensamente ramificados que a formação de monocamadas numa superfície seja inibida ou impedida. O mesmo é verdadeiro no caso de k > 1 para cada “bloco repetido” [(Y0i-Q-(Y2)j]k. Q é um átomo ou um grupo hidrófilo, o qual não é particularmente limitado desde que a sua função de proporcionar hidrofilicidade ao sistema de ligação de acordo com a invenção não seja afectada. De uma forma geral, a hidrofilicidade pode resultar da 7 polarização de uma molécula pela acção de atracção dos electrões de átomos que sejam mais electronegalivus do que os átomos de carbono. Os átomos ou grupos hidrófilos podem, por exemplo, formar vínculos ou pontes de hidrogénio num ambiente aquoso, o que resulta em hidratação, a qual leva a uma acessibilidade melhorada para as moléculas hidrófilas. Átomos ou grupos hidrófilos adequados para utilização no sistema de ligação de acordo com a invenção são seleccionados do grupo constituído por O, NH, C=0 (grupo ceto) 0-C=0 (grupo éster) e CR3R4, onde R3 e R4 são, independentemente um do outro, escolhidos do grupo constituído por H, OH, C1-C4 alcoxi e C1-C4 aciloxi, com o pressuposto de R3 e R4 não serem ao mesmo tempo H e que para Q = NH, Z (conforme definido acima) não seja NH2.

Exemplos específicos para C1-C4 alcoxi são metoxi, etoxi, propoxi, iso-propoxi, n-butoxi, iso-butoxi ou t-butoxi. Exemplos específicos para C1-C4 aciloxi são formilo, acetilo, propionilo, iso-propionilo, n-butirilo, iso-butirilo ou terc.-butirilo. Além disso, deve entender-se que CR3R4 como Q não é tão extensivamente ramificado que a formação de monocamadas numa superfície seja inibida ou impedida.

Para Q também poderiam ser considerados S (enxofre) ou S-S (dissulfeto) mas, no entanto, não são preferidos, uma vez que os compostos resultantes são geralmente um odor desagradável. Além disso, as pontes de dissulfeto podem ser facilmente reduzidas, resultando numa quebra do sistema de ligação.

Ainda mais, no caso de k > 1 os Q para cada “bloco repetido” [(Yi)i-Q-(Y2)j]k podem ser seleccionados independentemente uns dos outros.

No sistema de ligação acima 0 referido grupo reactivo Z não é particularmente limitado e pode ser seleccionado de acordo com a situação prática, isto é, a molécula de amostra ou de sonda para a qual está prevista a ligação. Uma vez que a maioria das moléculas de amostra ou sonda, especialmente em aplicações biológicas ou médicas, compreende porções nucleófilas não perturbadas estericamente, as reacções preferidas com as referidas moléculas compreendem a substituição nucleófila ou as reacções de adição nucleófila ou reacções de Diels-Alder que levam a um vínculo covalcnte entre o grupo reactivo Z do sistema de ligação de acordo com a invenção e as moléculas da amostra ou de sonda. É também ainda possível a substituição de radical.

Poderá apreciar-se que o grupo ícaclivo Z acima, tanto representa o necessário para a interaeção com as moléculas da amostra ou de sonda, como pode ser transformado num tal grupo reactivo num passo posterior. Além disso, o grupo reactivo Z pode ser hidrófobo de per si, sujeito ao facto de o caracter do sistema de ligação no seu todo ainda ser hidrófilo. O referido grupo reactivo Z é seleccionado, por exemplo, do grupo constituído por um duplo encadeamento reactivo como seja uma porção acrílica, um grupo dieno tal como no butadieno, um grupo dienófilo como no anidrido maleíco ou na maleinimida, um grupo epóxido como nos derivados de glicidilo, um grupo aldeído, um grupo hidroxilo, um grupo de ácido carboxílico, um grupo de ésteres activos ou reactivos como nos ésteres de N-hidróxissuccinimidilo(NHS) ou imidoesteres ou azlactona, um grupo amino (-NH2), um grupo dissulfureto (-S-S-), um grupo tiol ou mercapto (-SH), um grupo aziridina, um grupo isocianato (-N=C=0), um grupo isotiocianato (-N=C=S), um grupo azida e um grupo reactivo residual como seja NHS.

Outros grupos reactivos Z adequados encontram-se descritos, por exemplo, no manual “Bioconjugate Techniques”, da autoria de G. T. Hermanson, Academic Press, 1996. Como exemplos de artigos originais a este respeito poderão ser mencionados Chrisey, Lee e 0’Ferrell, Nucleic Acids Research, 1996, Vol. 24, N° 15, pp. 3031-3039; ou Beier e Hoheisel, Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, N° 9, pp. 1970-1977, descrevendo em particular os PDITC, DSC, DSO, DMS, SMPB, MBS, SMCC, GMBS, MPS e SIAB conforme aqui definidos, os quais são também adequados para a invenção.

Um exemplo específico de um sistema de ligação de acordo com a invenção possui a fórmula seguinte:

Num outro aspecto a invenção proporciona uma superfície que suporta um sistema de ligação de acordo com a invenção. A forma, tamanho c composição química da superfície não são particularmente limitados e podem ser escolhidos de acordo com a situação prática. A superfície pode, por exemplo, fazer parte de um recipiente ou pode formar contas, grânulos, folhas ou películas, por exemplo sobre um substrato adequado. No que se refere à sua composição química a superfície pode, por exemplo, ser escolhida de um grupo constituído por uma superfície de Si02 (que inclua camadas de SiOx evaporadas ou ejectadas), por exemplo uma bolacha de silicones, de vidro, quartzo, sílica fundida, etc (superfícies de Si02 essas que podem também conter outros óxidos tais como B2O3, AI2O3 etc.), ouro e um polímero ou plástico, como sejam copolímeros de ciclo olefinas (COCs), poli(metacrilato de metilo) (PMMA, plexiglass), polistireno, polietileno e polipropileno. Um COC adequado é, por exemplo, comercializado pela Ticona sob a marca “Topaz”.

Numa forma de realização preferida 0 sistema de ligação de acordo com a invenção forma uma distribuição com um desenho sobre uma superfície, por exemplo uma superfície sólida. A criação sobre uma superfície de distribuições com desenho do sistema de ligação de acordo com a invenção, é possível por diversos meios, por exemplo por meio da 10

aplicação de processos fotolitográficos padrão, por meio da utilização de impressão por microcontacto ou métodos aparentados, técnicas de jacto de tinta ou outros métodos de micro traçado. Por meio da utilização de qualquer dessas técnicas, podem ser criadas estruturas de superfície com dimensões na casa dos micrómetros. Para circuitos integrados sensores ou circuitos integrados biológicos que usem marcadores adequados conforme descritos abaixo em pormenor, o elevado modo paralelo de geração de sinal e a melhoria significativa na integração dos dados analíticos, são as características mais promissoras de tais técnicas, as quais consequentemente permitem a optimização dos processos analíticos automáticos.

Numa outra forma de realização preferida, o sistema de ligação ligado à superfície de acordo com a invenção é covalentemente ligado com uma biomolécula, por exemplo para utilização como sonda para um circuito integrado sensor ou um circuito integrado biológico. A biomolécula acima referida não é particularmente limitada e pode ser seleccionada de acordo com a situação prática. Por exemplo, a biomolécula é um parceiro de um sistema interactivo específico dos parceiros complementares de ligação para melhorar a selectividade do encadeamento numa mistura complexa de componentes, como seja um líquido biológico. O termo “interactivos”, conforme usado nesta descrição, inclui a formação de vínculos covalentes, bem como de forças iónicas atractivas e de van-der-Waal e vínculos de hidrogénio.

Por exemplo, o referido sistema especificamente interactivo de parceiros complementares de ligação baseia-se na interacção ácido nucleíco/ácido nucleíco complementar, ácido nucleíco péptido (PNA)/ácido nucleíco, enzima/substrato, receptor/executor, lectina/açúcar, anticoipo/antigénio, avidina/biotina ou estreptavidina/biotina. 11

Os ácidos nucleícos acima podem ser ADN ou ARN, por exemplo um oligonucleótidõ ou um optomero. 0 anticorpo acima pode ser, mas sem a isso se restringir, um anticorpo policlonal, monoclonal, quimérico ou de cadeia simples ou um fragmento funcional ou um derivado de tais anticorpos.

Num outro aspecto a invenção refere-se a um processo para a detecção de uma biomolécula que é um parceiro de um sistema interactivo específico de parceiros complementares de ligação que compreende os passos de a) por em contacto uma superfície que compreende um sistema de ligação de acordo com a invenção, que tem covalentemente ligado a ele um parceiro de um sistema especificamente interactivo de parceiros complementares de ligação, por exemplo ácido nucleíco ou um anticorpo, com uma amostra suspeita de conter o parceiro de ligação complementar, por exemplo um ácido nucleíco ou um antigénio complementar, b) remoção de componentes da amostra não especificamente ligados num passo de lavagem, e c) detecção dos componentes da amostra especificamente ligados. O método de detecção não é particularmente limitado e pode ser escolhido de acordo com a situação prática. Por exemplo, podem ser usados um marcador colorido, fluorescente, bioluminescente, quimio-luminescente, fosforescente ou radioactivo, um enzima (por exemplo sob a forma de uma análise ELISA), um anticorpo ou um fragmento funcional ou derivado do mesmo, um sistema baseado em proteína A/ouro, um sistema baseado em biotina/avidina ou biotina/estreptavidina ou um sistema baseado num eléctrodo enzimático.

Os sistemas de detecção acima são bem conhecidos da técnica, ver por exemplo F. *

Lottspeich e H. Zorbas (Eds) em “BioanalytiP, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberga 1998. Assim pode ser dispensada uma descrição pormenorizada. Sistemas electroquimicamente adequados ou à base de eléctrodos enzimáticos são descritos em Angewandte Chemie, 2000, Vol. 112, N° 7, pp. 1230-1269. 12

Dependendo do método de marcação aplicado, a detecçâo pode ser efectuada por meio de métodos conhecidos da técnica, por exemplo através de rastreio com laser ou com utilização de câmaras CCD.

Podem ainda ser aplicados os chamados métodos dc dctccçâo indirccta. Um exemplo de uma tal detecçâo indirecta é a utilização de um anticorpo rotulado secundário (anti-anticorpo) dirigido a um primeiro anticorpo não rotulado que se vincula à biomolécula (molécula amostra) que interessa.

Ainda noutro aspecto, a invenção refere-se a um processo para o isolamento de uma biomolécula que é um parceiro de um sistema especificamente interactivo de parceiros complementares de ligação, que compreende os passos de a) por em contacto uma superfície que compreende um sistema de ligação de acordo com a invenção que possui covalentemente ligado a ele um parceiro de um sistema especificamente interactivo de parceiros complementares de ligação, por exemplo uma lectina ou um anticorpo, com uma amostra suspeita de conter o parceiro de ligação complementar, por exemplo um açúcar ou um antigénio, b) remover componentes da amostra não especificamente ligados num passo de lavagem e, facultativamente, c) eluir os componentes da amostra especificamente ligados, por exemplo através da utilização de um agente caotrópico. A invenção abrange ainda a utilização de uma superfície conforme definida acima como uma matriz de afinidade, por exemplo como uma fase estacionária para fins de cromatografia, ou para proporcionar um circuito integrado sensor ou um circuito integrado biológico. 0 circuito integrado sensor ou biológico pode fazer parte de um instrumento médico ou de diagnóstico o qual, por exemplo, pode ser usado para a detecçâo de componentes de e líquidos fisiológicos, como sejam o sangue, o soro, a saliva, etc.

I A regeneração das superfícies de acordo com a invenção após a vinculação da sonda ligada à respcctiva biomolccula dc amostra a scr dctcctada ou isolada ter tido lugar, é possível, mas são preferidas utilizações únicas a fim de se garantir a qualidade dos resultados, em particular no caso de utilizações em detecção (circuitos integrados sensores ou biológicos).

Com circuitos integrados sensores ou circuitos integrados biológicos que utilizem a superfície de acordo com a invenção conforme definida acima, podem ser analisados diferentes tipos de amostras, com uma precisão acrescida e/ou reduzida necessidade de espaço em métodos de detecção em série, bem como em paralelo.

Geralmente, a reacção de acoplamento entre o sistema de ligação de acordo com a invenção e as moléculas a ser detectadas ou isoladas, é executada sob condições que não são prejudiciais às moléculas da amostra ou de sonda.

Por exemplo, numa aplicação sensora de ácido nucleíco, a reacção deverá ser executada numa solução aquosa e a temperatura não deverá ser elevada acima de 95° C. Preferivelmente a temperatura situa-se na casa dos 40 - 60° C.

Também a reacção de acoplamento com a biomolécula de amostra ou de sonda deverá processar-se a um ritmo razoável, de modo que a detecção possa, de preferência, ser conseguida dentro de menos que 24 horas sem necessitar de valores extremos do pH na solução. Para a imobilização de cordões simples de oligonucleótidos sintéticos como sonda, o pH deverá variar entre 7 e 11, preferivelmente 7 a 10.

Durante a reacção de hibridação das moléculas do ácido nucleíco da amostra com as moléculas de sonda, os vínculos entre o grupo funcional e os cordões simples de oligonucleótidos sintéticos, bem como os vínculos do sistema de ligação ao substrato, têm de ser capazes de suportar temperaturas de mais que 65° C, e um pH de 6-9. Nos casos em que o ADN é usado como molécula de amostra, as temperaturas podem ter de ser elevadas até cerca de 95° C, a fim de se efectuar uma separação dos cordões de ADN, a qual é necessária para a hibridação. 14

Condições de hibridação adequadas podem ser estabelecidas de acordo com protocolos convencionais descritos, por exemplo, em Sambrook, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989): Ausubel, “Current Protocols in Molecular Biology,\ Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989); ou Higgins e Hames (Eds) “Nucleic acid hybridlzatlon, a practical approach”, IRL Press, Oxford, Washington DC, (1985). O estabelecimento de condições é bem conhecido do técnico treinado e deve ser determinado de acordo com os protocolos descritos na técnica. Assim, a detecção apenas de sequências especificamente hibridizantes exigirá geralmente uma hibridação rigorosa e condições de lavagem tais como, por exemplo, 0,lxSSC, 0,1% SDS a 65° C. Exemplos de condições de hibridação não rigorosas para a detecção de homólogos ou sequências não exactamente complementares podem ser estabelecidas a 6xSSC, 1% SDS a 65° C.

Como é bem conhecido, o comprimento da sonda e a composição do ácido nucleíco a ser determinada constituem outros parâmetros das condições de hibridação.

Os ácidos nucleícos a ser analisados podem ter origem numa livraria de ADN ou numa livraria genómica, incluindo livrarias de ácido nucleíco sintético ou semi-sintético.

Para um exemplo de aplicação num circuito integrado sensor proteico pode ligar-se um anticorpo, conforme definido acima, ao sistema de ligação de acordo com a invenção. A metodologia geral para produzir anticorpos é bem conhecida e foi descrita em, por exemplo, Kõhler e Milstein, Nature 256 (1975), 494, e revista em J.G.R. Hurrel, ed., LÍMonoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications,\ CRC Press Inc., Boco Raron, FL (1982). Uma outra metodologia é a ensinada por L. T. Mimms et. al., Virology 176 (1990), 604-619.

Conforme já foi dito acima o termo “anticorpo” refere-se a anticorpos monoclonais ou policlonais. Os fragmentos funcionais de anticorpo ou os seus derivados fornecem a mesma especificidade que o anticorpo original e compreendem fragmentos F(ab’)2i Fab, Fv ou scFv; ver, por exemplo, Harlow e Lane, “Antibodies, A Laboratory ManuaF, CSH Press 1988, Cold Spring Harbor, NY. Derivados de um anticorpo podem por exemplo ser produzidos por peptidomiméticos. Tais métodos de produção são hem conhecidos na técnica e podem ser aplicados pelo técnico treinado sem mais problemas. A seguir a invenção é descrita em mais pormenor com referência a exemplos. No entanto, as formas específicas descritas ou a formas de realização preferidas devem ser consideradas, sob todos os pontos de vista, como apenas ilustrativas e não restritivas, sendo o âmbito da invenção mais indicado pelas reivindicações anexas do que pela descrição que se segue e todas as modificações que se situem dentro do espirito e alcance de equivalência das reivindicações são por isso consideradas como sendo abrangidas por elas.

Exemplos Síntese de (1-12-íglicidilVetoxil-etoxil-trimetoxissilano fGEETSl A síntese dos silanos pertence ao estado da técnica. A amostra silano é sintetizada por meio da adição de 1,7-bromo-dietilenoglicol a glicidol, por exemplo através da adição de 1 mole de glicidol a uma solução 1,5 molar de 1,7-dietilenoglicol em tolueno. Após purificação do produto por meio de destilação no vácuo, o produto é dissolvido de novo em tolueno e é adicionado 1 mole de álcool alílico e agitado à temperatura ambiente durante 2 horas, O produto é de novo destilado e depois hidrosilado para o trimetoxissilano, conforme é conhecido dos técnicos do ramo.

Lamelas microscópicas com a superfície activada são silanisadas por meio de incubação durante 2 horas numa solução de lg/1 do silano em tolueno. Subsequentemente, as lamelas são levadas três vezes em tolueno e depois tratadas termicamente durante 2 horas a 130°C. Tais lamelas são impressas com oligonucleótidos amino-modificados e 16 fixadas numa câmara humedecida a 50° C durante 2 horas. As lamelas GEETS são comparadas a lamelas tratadas com epoxipropiltrimetoxissilano. A capacidade de humedecimento aumentada das lamelas tratadas com GEETS é significativamente mais elevada, levando a um encadeamento aumentado dos oligonucleótidos com a superfície e a um maior diâmetro de gota. A hibridação de tais gotas com oligonucleótidos complementares resulta num sinal de hibridação mais elevado nas lamelas tratadas com GEETS.

Lisboa,

Silvina Ferreira

ADVOGADA -<* C.íiclal cie Propriedade Industrial *; I c, bO - 5? - 1250 - 071 LISBOA . ) 1 381 50 50 - Fax. 21 383 11 50

Claims (20)

1 :·:Ό REIVINDICAÇÕES - / f . I 1. Sistema de ligação para activar superfícies para bioconjugação que possui a seguinte fórmula geral (I): x-[(Yi)i-Q-(Y2)j]k-Z (I) em que X é um grupo reactivo capaz de se vincular covalentemente com uma superfície, Z é um grupo reactivo capaz de se vincular covalentemente a um biomolécula, com o pressuposto de que X não seja Z, Yi e Y2 são independentemente um do outro CR1R2, com Rj e R2 a serem independentemente um do outro H, C1-C4 alquilo, C1-C4 alcoxi ou C1-C4 aciloxi, i, j, k são independentemente uns dos outros um número inteiro dentro da gama de 1 a 10, com o pressuposto de que o número total de átomos C em Yi e Y2, não incluídos os átomos de C de Rj e R2, se situe dentro dos limites de 2 a 100, e Q é um átomo ou grupo hidrófilo seleccionado do grupo constituído por O, NH, C=0, 0-C=0 e CR3R4 em que R3 e R4 são, independentemente um do outro, escolhidos do grupo constituído por H, OH, C1-C4 alcoxi e C1-C4 aciloxi, com 0 pressuposto de que R3 e R4 não sejam H ao mesmo tempo e que para Q = NH Z não seja NH2 e em que no caso de k > 1 os Q para cada [(Yi)i-Q-(Y2)j]k são seleccionados independentemente uns dos outros.

2. Sistema de ligação de acordo com a reivindicação, caracterizado por o referido grupo reactivo X ser seleccionado do grupo constituído por um grupo dissulfeto, um grupo tiol, um grupo S1W3 com 0 W a ser um átomo ou um grupo hidrolisável e um grupo capaz de formar radicais livres, como seja um grupo antrationa ou um seu derivado, um grupo antraquinona ou um seu derivado, um grupo benzofenona ou um seu derivado.

3. Sistema de ligação de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o referido átomo ou grupo hidrolisável W ser seleccionado do grupo constituído por haletos, C1-C4 alcoxi, C1-C4 aciloxi e grupos amino.

4. Sistema de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por 0 referido grupo reactivo Z ser capaz de reacções de substituição 2 nucleófíla, reacções de adição nucleófila, reacções de Diels-Alder ou substituições de s radicais. |i

5. Sistema de ligação de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido grupo reactivo Z ser seleccionado do grupo constituído por um duplo vínculo reactivo, um grupo dieno, um grupo dienófilo, um grupo epoxi, um grupo aldeído, um grupo hidroxilo, um grupo ácido carboxílico, um grupo éster activo, um grupo amino, um grupo dissulfeto, um grupo tiol, um grupo aziridino, um grupo isocianato, um grupo isotiocianato um grupo azido e um grupo reactivo residual.

6. Superfície portadora de um sistema de ligação de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5.

7. Superfície de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o referido sistema de ligação formar uma distribuição com um desenho.

8. Superfície de acordo com as reivindicações 6 ou 7, caracterizada por a referida superfície ser seleccionada do grupo constituído por uma superfície de S1O2 de uma bolacha de silicone, vidro, quartzo, sílica fundida, ouro ou um polímero.

9. Superfície de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizada por 0 referido sistema de ligação ser covalentemente vinculado a uma biomolécula.

10. Superfície de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a referida biomolécula ser um parceiro de um sistema especificamente interactivo de parceiros complementares de ligação.

11. Superfície de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o referido sistema especificamente interactivo de parceiros complementares de ligação ser baseado na interacção ácido nucleíco/ácido nucleíco complementar, ácido nucleíco péptido/ácido nucleíco, enzima/substrato, receptor/executor, lectina/açúcar, anticorpo/antigénio, avidina/biotina ou estreptavidina/biotina.

12. Superfície de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por o referido ácido nucleíco ser um ADN ou ARN. | - ’v

13. Superfície de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o referido ADN ou ARN ser um oligonucleótido ou um optamero.

14. Superfície de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o referido anticorpo ser um anticorpo policlonal, monoclonal, quimérico ou de cadeia simples ou um fragmento funcional ou derivado de tais anticorpos.

15. Processo para a detecção de uma biomolécula que seja um parceiro de um sistema especificamente interactivo de parceiros complementares de ligação que compreende os passos de a) por em contacto uma superfície de acordo com as reivindicações 10 a 14 com uma amostra suspeita de conter o parceiro complementar de ligação, b) remover num passo de lavagem os componentes da amostra não especificamente ligados, e c) detectar os componentes da amostra especificamente ligados.

16. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por para a referida detecção ser usado um marcador colorido, fluorescente, bioluminescente, quimio-luminescente, fosforescente ou radioactivo, um enzima, um anticorpo ou um seu fragmento funcional ou derivado, um sistema baseado em proteína A/ouro, um sistema baseado em biotina/avidina/estreptavidina ou um sistema baseado em eléctrodo enzimático.

17. Processo para o isolamento de uma biomolécula que é um parceiro de um sistema especificamente interactivo de parceiros complementares de ligação, que compreende os passos de a) por em contacto uma superfície de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, com uma amostra suspeita de conter o parceiro complementar de ligação, b) remover num passo de lavagem componentes da amostra não especificamente ligados e, facultativamente, c) cluir os componentes não especificamente ligados.

18. Utilização de uma superfície de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14 como uma matriz de afinidade.

19. Utilização e uma superfície de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14 num circuito integrado sensor ou num circuito integrado biológico.

20. Instrumento médico ou de diagnóstico que compreende uma superfície de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14. Lisboa,

aria Silvina Ferreira ADVOGADA jente Oficial de Propriedade industriai . Castilho. 50 - 5? - 1250 - 071 LISBOA 'el. 2138150 50 - Fax. 21383 11 50