ES2554766T3 - Resina cromatográfica mejorada y métodos y dispositivos relacionados con la misma - Google Patents

Resina cromatográfica mejorada y métodos y dispositivos relacionados con la misma Download PDF

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Abstract

Una resina cromatográfica adecuada para su uso en cromatografía de afinidad a alta presión, comprendiendo la resina un polímero orgánico rígido y teniendo la resina una superficie hidrófila, caracterizada por que la superficie hidrófila está formada por una multiplicidad de compuestos hidrófilos no polímeros pequeños unidos covalentemente que tienen un peso molecular menor de 1000 Dalton y en la que la resina no contiene un recubrimiento hidrófilo por una estructura polimérica.

Description

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DESCRIPCION
Resina cromatografica mejorada y metodos y dispositivos relacionados con la misma
La invencion se refiere al campo de la qmmica analftica y preparativa. Entre otros, se refiere a una resina cromatografica mejorada y a medios y metodos que implican el uso de la resina para la limpieza (en lmea) de muestras de ensayo complejas, tales como muestras biologicas.
Debido a su alta especificidad, alta sensibilidad y capacidad de proporcionar informacion estructural, se ha usado la espectrometffa de masas en diversos campos tecnicos, incluyendo aplicaciones farmaceuticas, clmicas y bioqmmicas. La combinacion de MS con una tecnica analftica cromatografica, tal como cromatograffa ftquida a alta presion (HPLC) puede proporcionar una gran cantidad de informacion en un tiempo relativamente corto. Sin embargo, actualmente, la preparacion de la muestra de ensayo antes de tal analisis cualitativo y cuantitativo aun es una tarea laboriosa. Normalmente comprende muchas etapas y es responsable de una parte significativa de las desviaciones en los datos analfticos. Una manera de esquivar (parcialmente) esto es el uso de extraccion en fase solida en lmea (SPE) para reducir el numero de etapas en la preparacion de una muestra. La SPE implica separacion cromatografica en una columna corta con una resolucion muy limitada. Sirve para aislar aproximadamente los analitos de los constituyentes principales de la matriz. En el modo en lmea, la columna SPE esta conectada directamente aguas arriba de la columna de HPLC, separada por una valvula conmutadora para permitir desviar los componentes de la matriz de los residuos, antes de transferir los analitos desde la columna de SPE a la columna de HPLC. Vease, por ejemplo el documento EP1159597 a nombre del solicitante. La SPE en lmea tambien se describe por Alex Berhitu y Emile Koster en "How to determine matrix effects and extraction recovery in online solid-phase extraction-liquid chromatography-mass spectrometry", ASMS 2007, XP002488408.
Sin embargo, para el analisis de muestras de ensayo biologicas con estas tecnicas, se ha descubierto que la senal de MS puede aun alterarse debido a la supresion de ionizacion de analito en el detector de MS provocada por los componentes de matriz no volatiles residuales, tal como protemas pequenas, peptidos y sales.
Para resolver este problema, se han investigado en la tecnica otros modos mas selectivos de SPE. La SPE de afinidad e inmunoafinidad son de lejos las tecnicas de separacion selectiva mas potentes para aislar, concentrar y purificar selectivamente compuestos diana de entre una muestra de ensayo compleja. Esto posibilita potencialmente la preparacion de una muestra en una unica etapa. Su selectividad se origina de un ligando que esta fijado a un soporte solido (medios, resina, parffculas, etc.), ligando que reconoce selectivamente el analito diana. Idealmente, una muestra de ensayo que comprende una mezcla de componentes, entre otros, el analito diana, se hace pasar a traves de una columna de (inmuno)afinidad y se separa en dos fracciones. La primera fraccion no se une al soporte solido y eluye a k' = 0, mientras que la segunda porcion, que idealmente contiene solo el analito de interes se reconoce y absorbe por el ligando. Cambiando las caracteffsticas de la fase movil, por ejemplo, cambiando el pH, el contenido de sal y/u otro parametro, la segunda porcion puede eluirse de la fase solida. Especialmente cuando se usa en combinacion con otros modos de cromatograffa, por ejemplo cromatograffa de alta presion, la SPE de (inmuno)afinidad posibilita por tanto una limpieza de la muestra muy selectiva y eficaz y, como resultado, un tiempo de analisis muy corto por cada muestra de ensayo.
Sin embargo, a pesar de su potencial y la disponibilidad de una gran diversidad de ligando para muchos analitos diana, se ha informado de que solo se usan unas pocas aplicaciones de SPE basada en (inmuno)afinidad en combinacion con otros modos de cromatograffa actualmente. Ademas, apenas se ha informado de la combinacion en teoffa muy potente y, por tanto, deseable de preparacion de muestra de (inmuno)afinidad con una separacion cromatografica seguido de deteccion MS, presumiblemente debido al hecho de que los tampones no volatiles convencionales usados durante este tipo de separaciones no son compatibles con MS. Cai et al. (Anal. Chem. Vol. 68, 1996, pag. 72-78) informaron de un metodo en tandem de extraccion de por inmunoafinidad en lmea-acoplado con cromatograffa ftquida en columna capilar/espectrometffa de masas, que implica una columna de inmunoafinidad de protema G con un anticuerpo inmovilizado de forma no covalente espedfico para los analitos de interes.
Adicionalmente, debe ponerse enfasis en que, en general, los soportes en fase solida mas ffgidos usados para la SPE de inmunoafinidad en lmea aun demuestran alguna adsorcion no selectiva de los constituyentes de la matriz que aun provoca supresion de iones en el detector de MS. Los presentes inventores se han dado cuenta de que, para la permitir la aplicacion combinada de SPE de (inmuno)afinidad con los detectores de MS altamente sensibles y selectivos con/sin la combinacion con otros modos de cromatograffa, la resina de SPE tiene que satisfacer criterios espedficos. Como ya se ha indicado, para las aplicaciones pretendidas en este documento, un criterio principal es la baja adsorcion no selectiva y/o interaccion hacia componentes de matriz no diana. Adicionalmente, la resina debeffa ser qmmica y ffsicamente estable, poseer buena resistencia mecanica para permitir altos caudales y soportar las altas presiones normalmente usadas durante la cromatograffa ftquida a alta presion. Ademas, la inmovilizacion del ligando de interes a la resina preferentemente debeffa ser tal que i) se consiga una alta accesibilidad al ligando y ii) las propiedades del ligando no se destruyan durante la inmovilizacion qmmica.
Esta disponible una gran variedad de soportes en fase solida, poffmeros organicos e inorganicos, que podffan usarse para el diseno de estos soportes en fase solida, cada uno con sus propias ventajas y desventajas. Entre los
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primeros materiales introducidos y ampliamente aceptados como soportes en fase solida estan los polisacaridos reticulados naturales, tales como agarosas, sacarosas, celulosas y dextranos. Estos materiales son estables sobre un amplio intervalo de pH, poseen abundantes grupos hidroxilo para activacion para permitir el acoplamiento del ligando en condiciones fisiologicas y tienen propiedades de adsorcion no selectiva bajas. Sin embargo, estos materiales se excluyen del uso en aplicaciones a alta presion debido a su pobre resistencia mecanica e hinchado dependiente de disolvente.
Los soportes basados en poftmeros organicos sinteticos, tales como poliacrilamida, poliacrilato, polimetacrilato, polivinilo y poftmeros de poliestireno y derivados de los mismos, dependiendo de su cantidad de reticulacion, demuestran resistencias mecanicas muchos mejores. Sin embargo, para el fin pretendido en este documento, se encontro que la adsorcion no selectiva aun era demasiado alta para, por ejemplo, para permitir un facil acoplamiento con la deteccion por MS y conseguir la sensibilidad requerida. Los poftmeros inorganicos tales como sflice, alumina y zirconia, que se conocen bien por su resistencia mecanica alta, demuestran propiedades de adsorcion altamente no selectiva. Se considera que esto se debe a sus enormes propiedades de adsorcion y/o en relacion con sus areas superficies generalmente altas.
En vista de lo anterior, un objetivo de la presente invencion es proporcionar una resina cromatografica que tenga una buena estabilidad mecanica combinada con una absorcion no selectiva muy baja. Preferentemente, la resina permite un acoplamiento covalente de un ligando en condiciones fisiologicas (pH, potencia salina, etc.) y es compatible con los tampones volatiles adecuados para analisis de MS.
Sorprendentemente, se ha descubierto que los objetivos anteriores pueden satisfacerse mediante la provision de un soporte solido ngido especial (resina cromatografica) que se modifica qmmicamente con una molecula hidrofila no polimerica pequena para formar una superficie hidrofila, cuya superficie a) reduce la union no espedfica y b) permite un acoplamiento muy eficaz de un ligando al soporte solido.
Espedficamente, la presente invencion proporciona:
- una resina cromatografica adecuada para su uso en cromatograffa de afinidad a alta presion, comprendiendo la resina un poftmero organico ngido y teniendo la resina una superficie hidrofila, caracterizada por que la superficie hidrofila esta formada por una multiplicidad de compuestos hidrofilos no polimericos pequenos unidos covalentemente que tienen un peso molecular menor de 1000 Dalton y en las que la resina no contiene un recubrimiento hidrofilo formado por una estructura polimerica;
- un metodo para proporcionar una resina cromatografica de la presente invencion, comprendiendo el metodo la etapa de formar una superficie hidrofila no polimerica haciendo reaccionar un poftmero organico ngido con al menos un compuesto hidrofilo no polimerico que tiene un peso molecular menor de 1000 Dalton;
- una columna cromatografica que comprende una resina de la presente invencion;
- un aparato que comprende una columna cromatografica de la presente invencion en comunicacion fluida con un sistema analftico, preferentemente en el que dicho aparato comprende un sistema de extraccion en fase solida (SPE) integrado con un sistema de cromatograffa ffquida (LC), preferentemente un sistema de cromatograffa ffquida a alta presion (HPLC); y
- uso de una resina de la presente invencion en un metodo analftico para analizar una muestra de ensayo que comprende extraccion en fase solida, preferentemente en el que el metodo comprende deteccion mediante espectroscopfa de masas (MS) de al menos un analito en la muestra.
La resina puede estar en forma de parffculas.
Como se ejemplificara mas adelante en este documento, una resina de la invencion se caracteriza por una superficie hidrofila que se forma por una multiplicidad de pequenos compuestos hidrofilos unidos covalentemente. Los grupos hidrofilos de los compuestos contribuyen a una union no selectiva muy baja del material, y adicionalmente permiten un acoplamiento eficaz de ligando al material. Puesto que solo parte de los restos hidrofilos estan provistos de ligando, hacen a la superficie del poftmero hidrofila. Debido a su combinacion unica de alta resistencia mecanica y absorcion no selectiva muy baja, la resina como se proporciona en este documento se usa ventajosamente en cromatograffa de inmuno(afinidad) de alta capacidad de produccion, en particular para pretratamiento de muestras (en ftnea) por extraccion en fase solida.
Se sabe en la tecnica como proporcionar una material de soporte solido con una superficie hidrofila. Sin embargo, los agentes usados en la tecnica para obtener tal superficie hidrofila siempre son moleculas polimericas grandes. Por ejemplo, el documento WO 01/58561 y el documento US 2005/092196 desvelan el uso de poffmeros hidrofilos flexibles, solubles en agua, tal como polietilenimina, para modificar la superficie de un material de soporte de poftmero inorganico. El documento EP-0295073-A2 desvela un espaciador hidrofilo no ionico interpuesto entre un soporte solido y un ligando de afinidad para permitir un acceso esterico potenciado mediante ligandos de afinidad unidos a las macromoleculas. De acuerdo con el documento EP-0295073-A2, el espaciador es cualquier poftmero de subunidades que, cuando se polimeriza, produce un espaciador que contiene restos polares pero no ionizados que hacen al espaciador hidrofilo, tal como polietilenglicol (PEG), alcohol polivimlico (PVA), etc. Mas preferentemente, el espaciador tiene aproximadamente 90-100 atomos. El documento EP-0621074-A1 da a conocer un soporte de afinidad basado en un soporte de perfluorocarbono que esta recubierto con un poftmero hidrofilo reticulado,
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preferentemente PVA.
Antes de la presente invencion, en general se crefa en la tecnica que el area superficial hidrofila grande proporcionada por un recubrimiento de poKmeros hidrofilos era responsable de la union no espedfica reducida. De esta manera, por lo tanto, se ha dado preferencia siempre a estructuras hidrofilas reticuladas altamente complejas. Sin embargo, los presentes inventores observaron sorprendentemente que el uso de moleculas hidrofilas no polimericas pequenas tiene claras ventajas respecto al uso de estructuras hidrofilas polimericas grandes conocidas en la tecnica. Se ha encontrado que cuanto mayor es el peso molecular del compuesto hidrofilo, mayor es la absorcion no selectiva. La mayona de materiales de soporte cromatografico obtienen su gran area superficial (y por tanto su capacidad de union) de su estructura porosa. Normalmente estan disponibles en diferentes tamanos de poro, dependiendo de la aplicacion espedfica. Por ejemplo, el material de soporte con poros pequenos (por ejemplo 60 A) puede usarse para la separacion de moleculas pequenas que vanan de 100-1000 Dalton. Para la separacion de biomoleculas, la mayor parte de las cuales estan en el intervalo de 15 a 250 kDa y mayor, se requieren resinas con un tamano de poro mucho mas mayor, tal como de 300 a 2000 A. Las separaciones basadas en inmunoafinidad que implican el acoplamiento de un anticuerpo (aproximadamente 150 kD) a la resina, requieren estos grandes poros para permitir una capacidad de union suficiente. Puede observarse que no todos los poros tienen el gran tamano de poro prescrito, y se cree que los poros mas pequenos son al menos en parte responsables de la union no espedfica en el caso de que se empleen grandes moleculas polimericas para hacer a la superficie de la resina mas hidrofila. Aparte del hecho de que los pequenos analitos (tanto el analito de interes como aquellos que provocan una union no selectiva) generalmente demuestran mayores constantes de difusion en comparacion con estos materiales hidrofilos polimericos, estos pequenos analitos tambien pueden penetrar mas facilmente en estos poros mas pequenos, mientras que los materiales hidrofilos polimericos tendran solo un acceso limitado o ningun acceso en estos poros mas pequenos. Sin desear quedar ligado a teona alguna, se cree que la mayor velocidad de difusion del compuesto no polimerico de acuerdo con la invencion permite una modificacion mas eficaz de la superficie. Ademas, las cavidades de poro del soporte de polfmero son mucho mas accesibles para un compuesto hidrofilo pequeno empleado en la presente invencion en comparacion con una gran estructura polimerica usada en la tecnica, tal como dextranos, PEG o PVA. Esta diferente da como resultado un area superficial hidrofila eficaz mas grande y, por tanto, un caracter de union no selectiva mejorado del soporte.
La expresion "no polimerico" como se usa en este documento se destina fundamentalmente a indicar que el compuesto hidrofilo no esta constituido por unidades estructurales de repeticion. De hecho, puede considerarse como una unidad estructural unica e individual. El peso molecular del compuesto hidrofilo no polimerico pequeno, es decir, cuando se considera como una molecula separada y no incluyendo el soporte en fase solida ni un ligando fijado al mismo, es menos de aproximadamente 1000 Dalton, preferentemente menos de 500 Dalton. De esta manera, la presente invencion se distingue claramente de la tecnica anterior, unicamente desvelando un soporte provisto de un recubrimiento hidrofilo formado por una estructura polimerica. En una realizacion, el compuesto hidrofilo no polimerico tiene 1-10 atomos de C. En particular, un metodo de la invencion comprende hacer reaccionar el polfmero con un compuesto hidrofilo de formula general CnHm(Y)k, en la que n es un numero entero de 1 a 10, preferentemente de 2 a 8; m < 2 n; k < 3 n y en el que Y es un resto hidrofilo, preferentemente en el que Y es -OH o -COOH.
La invencion puede realizarse de forma practica con cualquier tipo de polfmero organico que sea suficientemente ngido y estable para soportar una alta presion, preferentemente hasta aproximadamente 200, mas preferentemente aproximadamente 300 bar. En una realizacion, el polfmero organico es un polfmero seleccionado del grupo que consiste en poliacrilamidas, poliacrilatos, polimetacrilatos, polivinilo, poliestireno y derivados de los mismos. Estos incluyen polfmeros y copolfmeros de metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA), metacrilato de metilo (MMA) y metacrilato de etilenglicol (EDMa). Son particularmente adecuados los (co)polfmeros de HEMA. La resina puede tener una superficie porosa. El tamano de poro puede variar de aproximadamente 50 a 3000 A. Como se ha indicado anteriormente en este documento, el uso de pequenos compuestos hidrofilos es particularmente ventajoso para reducir las propiedades de union no selectiva de una resina que tiene poros relativamente grandes (por ejemplo de 300 a 1000 o de 300 a 2000 A) para su uso en separaciones de inmunoafinidad.
Para mejorar la reactividad entre el polfmero y dicho al menos un compuesto hidrofilo, un metodo puede comprender, antes de hacer reaccionar el polfmero con el al menos un compuesto hidrofilo, una etapa de activacion de dicho polfmero y/o dicho compuesto hidrofilo. Dependiendo del tipo de polfmero y compuesto hidrofilo usados, puede ser deseable activar uno cualquiera o ambos de los reactantes. Por supuesto, en los casos donde la reactividad entre el polfmero y el compuesto hidrofilo tal cual sea suficiente, no se requiere activacion. El experto sera capaz de decidir si la activacion es deseable y, si es asf, que compuesto qmmico de activacion aplicar. La activacion del polfmero y/o el compuesto hidrofilo se consigue facilmente proporcionando el polfmero y/o el compuesto hidrofilo con uno o mas grupos reactivos que se sabe que potencian la reactividad entre ambos reactantes. De esta manera, se pueden conseguir compuestos qmmicos complementarios (es decir, reactivos) conocidos en la tecnica introduciendo restos funcionales en el soporte en fase solida y/o el compuesto hidrofilo. Los grupos reactivos ejemplares incluyen -NH2-, -OH y CH=CH2. Estos pueden introducirse por metodos convencionales. Por ejemplo, los compuestos qmmicos reactivos de amina pueden introducirse usando NHS (N-hidroxisuccinimida esteres)-, CDI- (carbonil diimidazol)- y/o EDC- (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida), aminacion reductora introduciendo restos -CHO-, FMP- (tolueno-4-sulfonato de 2-fluoro-1 -metilpiridinio), activacion mediante cloruro de
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Tresilo y/o Tosilo. Los compuestos qmmicos reactivos con hidroxi pueden introducirse a traves de activacion epoxi. Los compuestos qmmicos reactivos por polimerizacion, tales como grupos vinilo, pueden introducirse mediante el uso de monomeros de derivados de acrilato y/o metacrilato.
Se entendera que el concepto de la presente invencion puede llevarse a la practica usando una amplia diversidad de moleculas hidrofilas pequenas (activadas). Los metodos ejemplares que implican hacer reaccionar un poffmero con al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en etanolamina, 3-amino-1,2-propanodiol, N- (hidroximetil)acrilamida, 3-aliloxi-1,2-propanodiol, N-[Tris(hidroximetil)metil]acrilamida y glicidol. Pueden usarse tambien combinaciones de dos o mas compuestos hidrofilos distintos.
La resina de la presente invencion puede comprender ademas uno o mas ligandos fijados al poffmero ngido descrito anteriormente mediante un compuesto hidrofilo fijado al poffmero. Para ello, la resina cromatografica que tiene una superficie hidrofila puede hacerse reaccionar con al menos un ligando para permitir la fijacion covalente de dicho al menos un ligando a la resina mediante dicho al menos un compuesto hidrofilo no polimerico.
El ligando puede ser cualquier molecula o fragmento de molecula capaz de unirse a otro analito basado en resto o molecula, por ejemplo, union a traves de interaccion hidrofoba, union covalente o interaccion columbica. Tales ligandos los conoce bien el experto en la materia de la cromatograffa de (bio)afinidad. Los ligandos ffpicamente usados en la industria de las bioseparaciones incluyen biotina, avidina, estreptavidina, protema natural o no natural, peptido, anffgeno y acido nucleico. En la presente invencion, el ligando preferentemente es una molecula biologica o sintetica, preferentemente una protema o peptido tal como un anticuerpo (monoclonal) o un receptor.
En una realizacion espedfica, el ligando es un anticuerpo capaz de unirse selectivamente a una o mas hormonas esteroideas desde una mezcla compleja. Las hormonas esteroideas incluyen, aunque sin limitacion, estradiol, estrona, etinilestradiol, testosterona y nortestosterona. En esta realizacion, las mezclas complejas pueden incluir, aunque sin limitacion, agua corriente, agua subterranea, aguas de proceso, muestras medioambientales tales como suelo, lodo, aguas superficiales en general y aguas superficies que contienen posible contaminacion farmaceutica en particular, formulaciones farmaceuticas, fluidos biologicos humanos y animales (tales como suero y orina) y otras muestras biologicas (por ejemplo, tejido animal, muestras biologicas, etc.). Otras aplicaciones ejemplares de la presente invencion pueden encontrarse en la industria de los alimentos y las bebidas. Por ejemplo, una resina como se proporciona en este documento puede usarse para deteccion de componentes indeseables en alimentos o fuentes alimentarias. En un aspecto espedfico, una resina hidrofila de acuerdo con la invencion se usa para detectar (mico)toxinas en cereales, por ejemplo, en una columna de SPE de inmunoafinidad en lmea.
Otra aplicacion espedfica de la presente invencion se refiere a la cuantificacion de compuestos terapeuticos en una muestra humana. Una resina de la invencion, funcionalizada con uno o mas ligandos capaces de reconocer espedficamente el farmaco o farmacos o metabolitos del mismo, se usa adecuadamente para la extraccion en fase solida en lmea (limpieza) de la muestra, seguido de un analisis del analito diana posterior, por ejemplo, usando espectrometna de masas en tandem con cromatograffa ffquida (por ejemplo SPE-LC-MS/MS). No es necesario realizar etapas adicionales tediosas y que consuman tiempo de preparacion de muestra, tal como precipitacion, centrifugacion y pipeteo de protemas para la limpieza de la muestra. Como un ejemplo, los farmacos retrovirales en plasma humano, tales como inhibidores (PI) e inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleosido (NNRTI), pueden cuantificarse de una manera rapida, sensible y totalmente automatizada. Por consiguiente, una resina de la invencion es perfectamente apropiada para monitorizacion de farmaco terapeutico rutinario, por ejemplo, de muestras de plasma de un paciente de VIH/SIDA o un paciente que recibe antidepresivos.
Como apreciara un experto en la materia, un metodo de la invencion puede implicar los poffmeros ejemplares y preferidos, compuestos hidrofilos y/o ligandos como se ha descrito anteriormente. Los Ejemplos a continuacion describen la preparacion de diversas resinas activadas de la invencion, que implican la activacion del poffmero y/o compuesto hidrofilo mediante diversos compuestos qmmicos de activacion.
Despues de la activacion de un poffmero ngido con compuestos hidrofilos, pueden usarse varios tipos de compuestos qmmicos para la fijacion covalente de ligandos (biologicos). De esta manera, en un metodo de la invencion, la preparacion de una resina hidrofila activada va seguida preferentemente de la etapa de reaccion de esta con al menos un ligando para permitir la fijacion covalente de dicho al menos un ligando a dicho soporte en fase solida a traves de dicho compuesto hidrofilo. De acuerdo con la invencion, el ligando no esta fijado directamente a la superficie del poffmero sino indirectamente mediante union covalente al compuesto hidrofilo. Los grupos hidrofilos, por ejemplo, -OH o -COOH, del compuesto hidrofilo pueden usarse o modificarse por metodos conocidos en la tecnica para crear sitios reactivos para la union del ligando. En general, habra un exceso de sitios reactivos en el compuesto hidrofilo que estan disponibles para la union del ligando. Por consiguiente, no todos los compuestos hidrofilos tienen que estar provistos de ligando. El ligando puede fijarse al compuesto hidrofilo de una manera directa o indirecta, por ejemplo, mediante una molecula espaciadora entre la resina activada y el ligando. El uso de espaciadores se conoce en la tecnica. Los espaciadores preferidos son espaciadores hidrofilos puesto que estos evitaran cualquier influencia negativa sobre la no selectividad de la resina.
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Las realizaciones ejemplares de metodos para funcionalizar una resina activada de acuerdo con la invencion se pueden describir esquematicamente de la siguiente manera en la que X-Z es la resina activada, siendo X un polfmero ngido provisto de Z, que representa el compuesto hidrofilo.
1. sin espaciador a. X-Z + A = X-Z-A (A permite el acoplamiento del ligando en condiciones fisiologicas)
b. X-Z-A + ligando = X-Z-ligando + A
2. con espaciador a. X-Z + A1 = X-Z-A1 (A1 permite el acoplamiento del espaciador)
b. X-Z-A1 + S = X-Z-S + A1 (S = espaciador)
c. X-Z-S + A2 = X-Z-S-A2 (A2 permite el acoplamiento del ligando en condiciones
fisiologicas; A2 puede ser igual o diferente de A1 por ejemplo amina, hidroxi, epoxi, acido
carbonico o carbonilo).
d. X-Z-S-A2 + ligando = X-Z-S-ligando + A2
La invencion proporciona tambien una resina cromatografica que puede obtenerse por un metodo de acuerdo con la invencion. La resina preferentemente es una resina funcionalizada que comprende al menos un ligando, por ejemplo, un anticuerpo, capaz de unirse espedficamente un analito de interes. Otro aspecto se refiere a una columna cromatografica que comprende una resina como se proporciona en este documento, por ejemplo una columna de afinidad que comprende una resina en forma de parffculas, en la que cada parffcula comprende un polfmero ngido cuya superficie esta activada con compuestos hidrofilos, y en la que al menos parte de los compuestos hidrofilos llevan uno o mas ligandos. En vista de la alta estabilidad mecanica de la resina, la columna puede ser una columna resistente a alta presion. En una realizacion preferida, la invencion proporciona un cartucho de extraccion en fase solida (SPE) que comprende una resina de la invencion. Debido a sus propiedades de union no selectiva bajas, un cartucho de SpE de la invencion es muy adecuado para SPE de afinidad. Preferentemente, el cartucho es un cartucho de SPE en lmea, por ejemplo adecuado para su uso en sistemas Symbiosis™/Prospekt-2 (Spark Holland BV, Emmen, Pafses Bajos).
El cartucho de SPE en lmea puede estar disenado especialmente para elucion en lmea a la columna de HPLC. Las dimensiones se optimizan para combinar una alta capacidad de extraccion con pequenos volumenes de elucion. Las dimensiones normales son de 10 mm de longitud y 2 mm de diametro interno, pero tambien se preve 10 x 1 mm. Preferentemente el cartucho resistira la presion ffpica del sistema de HPLC (max. 400 bar). Un cartucho puede marcarse con un codigo que representa la marca, el tipo y el lote de una resina de SPE. Adicionalmente, los cartuchos pueden suministrarse en placas multi-posicion (por ejemplo 96) que se colocan directamente en el sistema de HPLC (por ejemplo el Sistema Symbiosis™/Prospekt-2) para procesamiento, evitando de esta manera la necesidad de tocar un cartucho. Tfpicamente, cada bandeja contiene un sitio de referencia que transmite informacion sobre el tipo de cartucho, numero de lote, numero produccion (unico), y/o fecha de caducidad, etc. al sistema de HPLC. Esta informacion se muestra en la pantalla del PC y se adjunta al informe del analisis. Despues del uso, el sistema de HPLC transmite los datos al chip sobre las posiciones usadas/no usadas. Las bandejas parcialmente usadas pueden almacenarse entonces de forma segura sin marcar o retirar los cartuchos usados.
Se proporciona tambien un aparato que comprende una columna de cromatograffa de acuerdo con la invencion en comunicacion fluida con un sistema anafftico. El aparato por ejemplo comprende un sistema de extraccion en fase solida (SPE) integrado con un sistema de cromatograffa lfquida (LC). El aparato adicionalmente puede comprender un detector, tal como un espectrometro de masas (en tandem) o un detector de fluorescencia. Por consiguiente, se proporciona tambien un metodo analffico para analizar una muestra de ensayo, comprendiendo dicho metodo poner en contacto dicha muestra con una resina de acuerdo con la invencion. Un aspecto adicional se refiere al uso de una resina proporcionada en este documento en un metodo analftico para analizar una muestra de ensayo. El metodo implica extraccion en fase solida (SPE), preferentemente SPE en lmea, usando la resina. En vista de que la resina es compatible con tampones volatiles, el metodo puede incluir deteccion por espectroscopfa de masas (MS) de al menos un analito en la muestra.
Un aparato o metodo analftico de la invencion es atractivo para su uso en diversas areas, incluyendo farmacia y desarrollo de farmacos. Un desarrollo de farmacos eficaz rapidamente aumenta el numero de candidatos a farmaco y por lo tanto el numero de muestras. LC-MS se ha convertido en una herramienta predominante para bioanalisis debido a su aplicabilidad universal y gran ayuda en automatizacion de laboratorio. Las tecnicas de preparacion de muestras tradicionales no evolucionaron equitativamente, lo que ha dificultado la racionalizacion de la organizacion en laboratorio. El uso de una resina de la invencion en extraccion de (inmuno)afinidad en lmea totalmente integrada con LC (XLC) permite la inyeccion directa de muestras biologicas en bruto sin filtracion previa, precipitacion de protema y centrifugacion.
La invencion se ejemplifica en los Ejemplos a continuacion.
Los ejemplos describen la preparacion de un soporte en fase solida hidrofilo ngido (resina cromatografica) que despues puede activarse para permitir el acoplamiento covalente de ligandos de interes en condiciones fisiologicas y usarse para el fin de cromatograffa de (inmuno)afinidad en combinacion con otros modos de cromatograffa seguido de deteccion MS.
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Este soporte en fase solida hidrofilo ngido comprende el soporte base del nucleo X (X = un soporte en fase solida ngido, basado en polfmeros organicos [de acuerdo con la presente invencion] e inorganicos [solo referencia], tales como poliacrilamida, poliacrilato, polimetacrilato, polivinilo y/o polfmeros de poliestireno y derivados de los mismos, sflice, alumina y/o zirconia y derivados de los mismos, que se hacen reaccionar con Z (Z es por ejemplo - NH2, -OH, -epoxi, -C(H)=O, -C(H)=C(H)2, mediante compuestos qmmicos de activacion correspondientes complementarias tales como compuestos qmmicos reactivos con amina tales como NHS (N-hidroxisuccinimida esteres)-, CDI-(carbonil diimidazol)- y/o EDC- (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida), aminacion reductora introduciendo restos -CHO-, FMP- (tolueno-4-sulfonato de 2-fluoro-1 -metilpiridinio), activacion con cloruro de Tresilo y/o Tosilo respectivamente compuestos qmmicos reactivos con hidroxi tal como activacion epoxi y compuesto qmmicos reactivos por polimerizacion, tales como grupos vinilo mediante el uso de monomeros de derivados de acrilato y/o metacrilato y permitiendo la funcionalizacion del soporte de base de nucleo ngido con un compuesto hidrofilo.
Mediante compuestos de acoplamiento con abundantes grupos hidrofilos, por ejemplo hidroxilo o carboxilo, sobre la superficie de los soportes, no solo se potencia significativamente la hidrofilia del soporte en fase solida (por ejemplo mejora del comportamiento no selectivo), sino que una gran diversidad de compuestos qmmicos estan disponibles entonces para permitir el acoplamiento de ligandos en condiciones fisiologicas. Por esta razon, una diversidad de recubrimientos qmmicos se ensayaron y examinaron respecto a su mejora de las caractensticas de adsorcion no selectiva. A continuacion, se ensayo una diversidad de compuestos qmmicos de activacion (con o sin la aplicacion de un espaciador) para permitir el acoplamiento qmmico de ligandos de interes en condiciones fisiologicas analizando la capacidad del soporte en fase solida funcionalizado para el analito diana. A continuacion, la compatibilidad MS se investigo usando soluciones tampon tanto convencionales como una diversidad de soluciones tampon volatiles durante el uso combinado de SPE de inmunoafinidad, cromatograffa lfquida a alta presion seguido de deteccion MS.
EJEMPLO 1: MEJORA DE LA NO SELECTIVIDAD
Par mejorar la no selectividad de un soporte en fase solida, una diversidad de compuestos hidrofilos se acoplaron qmmicamente sobre varios soportes, usando una diversidad de compuestos qmmicos de activacion:
A. Polimeros inorganicos (Solo referencia)
A.1. Silice mediante activacion con NH2:
A.1.1. Activacion del soporte en fase solida
Se lavo 1 gramo de sflice respectivamente con HCl 0,05 M, agua (3 veces) y tolueno con agitacion durante 1 hora a temperatura ambiente en un rotavapor al vacfo. La sflice se silanizo con 1 ml de 3-aminopropiltrimetoxisilano en 10 ml de tolueno por agitacion en un rotavapor durante 24 horas a temperatura ambiente. La sflice silaniza se lava con 3x20 ml de tolueno y eter y se seca durante 4 horas a 120 °C.
A.1.2. Acoplamiento de los compuestos hidrofilos
Los siguientes compuestos hidrofilos se usaron para acoplar:
a. Polietilenglicol 200 (PEG 200) (Ejemplo comparativo)
b. Maltosa (360 Dalton) (de acuerdo con la invencion)
c. Dextrano (10.000 Dalton) (Ejemplo comparativo)
Antes del acoplamiento, los compuestos hidrofilos se activaron mediante N,N'-carbonil diimizaol (CDI) (0,05 mM - compuesto hidrofilo 2,5 mM mas CDI 2,5 mM en 2,5 ml de acetona seca, se agito durante 1 hora a temperatura ambiente), tolueno-4-sulfonato de 2-fluoro-1-metilpiridinio (FMP) (compuestos hidrofilos 0,05 mM - 2,5 mM mas 5 ml de FMP 0,35 mM en DMSO, que contema trietilamina al 1%, se agito durante 15 minutos), N,N- disuccinimidilcarbonato (NHS) (compuestos hidrofilos 0,05 - 2,5 mM mas NHS 0,3 mM en 1 ml de DMSO y se anadio con agitacion vigorosa a 5 ml de trietilamina al 7,5% en piridina seca y se agito durante 1 hora mas a temperatura ambiente) o cloruro de Tresilo (compuesto hidrofilo 0,05 - 2,5 mM en 5 ml de DMSO y se anadio con agitacion vigorosa 1 ml de una mezcla de cloruro de tresilo / piridina / DMSO 1:10:89 y se agito 15 minutos a temperatura ambiente).
El acoplamiento de los compuestos hidrofilos activados individuales al soporte silanizado de aminopropilo se realizo de la siguiente manera:
a. compuestos activados con CDI: agitacion durante 16 horas a temperatura ambiente;
b. compuestos activados con FMP: agitacion durante 16 horas a temperatura ambiente en 10 ml de tampon fosfato 0,2 M a pH 7,0;
c. compuestos activados con NHS: agitacion durante 16 horas a temperatura ambiente en 3 ml de DMSO;
d. compuestos activados con cloruro de Tresilo: agitacion durante 16 horas a temperatura ambiente en 5 ml de
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tampon fosfato 0,2 M a pH 7,0.
A.2. Silice mediante activacion con epoxidos:
A.2.1. Activacion del soporte en fase solida
Se lavo 1 gramo de s^lice respectivamente con HCl 0,05 M, agua (3 veces) y tolueno por agitacion durante 1 hora a temperatura ambiente en un rotavapor a vacfo. La s^lice se silanizo con 3 ml de y-glicidoxipropiltrimetoxisilano en 10 ml de tolueno por agitacion en un rotavapor durante 24 horas a temperatura ambiente. La sflice silanizada se lavo con tolueno, eter y dioxano.
A.2.2. Acoplamiento de los compuestos hidrofilos
Se usaron los siguientes compuestos hidrofilos para acoplar:
a. Maltosa (360 Dalton) (de acuerdo con la invencion)
b. Dextrano (10.000 Dalton) (Ejemplo comparativo)
Debido al hecho de que los grupos epoxi reaccionan directamente con los grupos hidroxi, no fue necesaria activacion adicional. El acoplamiento de los compuestos hidrofilos individuales al soporte silanizado con glicidoxipropilo se produjo anadiendo 0,05-2,5 mM de compuesto hidrofilo a 1 gramo de soporte silanizado con glicidoxipropileno 5 ml de dioxano seco, que conterna 100 |il de eterato de BF3. La reaccion se dejo transcurrir durante 24 horas a temperatura ambiente en la oscuridad.
A.3. Silice mediante activacion con metacrilo:
A.3.1. Activacion del soporte en fase solida
Se lavo 1 gramo de sflice respectivamente con HCl 0,05, agua (3 veces) y tolueno por agitacion durante 1 hora a temperatura ambiente en un rotavapor a vacro. La sflice se silanizo con 9 ml de y-metacriloxipropiltrimetoxisilano en 10 ml de tolueno por agitacion en un rotavapor durante 24 horas a temperatura ambiente. La sflice silanizada se lavo con tolueno, eter y dimetilformamida.
A. 3.2. Acoplamiento de los compuestos hidrofilos
Los siguientes compuestos hidrofilos se usaron para acoplar:
a. Dextrano metacrilatado (Dextrano-MA) (16.000 Dalton, donde 13 de cada 100 moleculas de azucar contienen un grupo metacrilato) (Ejemplo comparativo)
a. N-(hidroximetil)acrilamida (HM-MA)
b. 3-aliloxi-1,2-propanodiol (Dp-MA)
c. N-[Tris(hidroximetil)metil]acrilamida (TRIS-MA)
d. Metilacrilato (MA)
El acoplamiento se realizo anadiendo respectivamente 0,6 gramos de HM-MA, DP-MA o Tris-MA en 5 ml de etanol respectivamente 12 ml de dextrano activado con metacrilato al 5% p/p en DMSO a 1 gramo de sflice silanizada con metacrilo. La reaccion se dejo transcurrir durante una noche a 75 °C en presencia de 15 mg de a,a'- azoisobutironitrilo. Despues del acoplamiento de MA, el ester se saponifico por agitacion en HCl 1 N en ebullicion en agua durante 4 horas.
B. Polimeros organicos
B.1. Polimero de clorometil estireno
Para estos experimentos se uso un polfmero de clorometilestireno, preparado por polimerizacion en dispersion de 4- clorometilestireno en etanol.
B.1.1. Acoplamiento de los compuestos hidrofilos
Debido al hecho de que el grupo clorometilo reacciona directamente con las aminas primarias, no fue necesaria activacion. El grupo clorometilo del soporte en fase solida se hizo reaccionar con etanolamina en agua durante la agitacion durante 24 horas a temperatura ambiente, seguido de 2 horas a 50 °C.
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B.2. Copolimero de hidroximetil estireno (Solo referenda)
El soporte en fase solida de copolfmero de un poKmero de hidroximetil estireno se preparo por polimerizacion en dispersion en etanol de los monomeros hidroximetil-metacrilamida y estireno. Este soporte en fase solida se ensayo directamente para su no selectividad.
B.3. Copolimero de glicidil estireno
El soporte en fase solida de copolimero de copolimero de glicidil estireno se preparo por polimerizacion en dispersion en etanol de los monomeros glicidilmetacrilato y estireno.
B.3.1. Acoplamiento de los compuestos hidrofilos
Se usaron los siguientes compuestos hidrofilos para el acoplamiento:
e. Agua
f. Dextrano (10.000 Dalton) (ejemplo comparativo)
Debido al hecho de que el grupo epoxi del monomero de glicidilo reacciona directamente con los grupos hidroxi, no fue necesaria activacion adicional. El acoplamiento de los compuestos hidrofilos individuales se produjo anadiendo 0,5 mM de compuesto hidrofilo a 1 gramo de soporte en fase solida en 10 ml de tampon borato 0,1 M a pH 13,0. La reaccion se dejo transcurrir durante 3 dfas horas a temperatura ambiente.
B.4. Copolimero de metacrilato de hidroxietilo
B.4.1. Copolimero de metacrilato de hidroxietilo simple
Este soporte en fase solida se ensayo directamente para su no selectividad sin modificaciones adicionales.
B.4.2. Modificacion con glicidol
El soporte en fase solida se hizo reaccionar con glicidol anadiendo 1 gramo de glicidol a 1 gramo de fase estacionaria, que se suspendio en 5 ml de hidroxido sodico 1 N, que contema 100 mg de NaBH4. La mezcla se dejo reaccionar durante una noche a temperatura ambiente. Este soporte en fase solida se ensayo directamente para su no selectividad sin modificaciones adicionales.
B.4.3. Activacion del soporte en fase solida con CDI
Se activo 1 gramo de soporte anadiendo 0,4 gramos de CDI, disuelto en 5 ml de acetona seca. La reaccion se dejo reaccionar durante 90 minutos a temperatura ambiente.
B.4.4. Acoplamiento del compuesto hidrofilo
El soporte activado obtenido en B.4.3 se hace reaccionar con 3-aminopropanodiol (Amino-DP) (compuesto hidrofilo) anadiendo 1 ml del compuesto hidrofilo en 5 ml de DMSO a 1 gramo de soporte activado. La reaccion se dejo reaccionar durante una noche a temperatura ambiente.
La no selectividad de los soportes obtenidos se ensayo mediante ensayos de adsorcion estaticos de soluciones que conteman cantidades pequenas de nortestosterona (NOR) (500 ng/ml en agua). El sobrenadante se analizo por HPLC respecto al contenido de nortestosterona. Los resultados se dan en la Tabla 1.
Los resultados del experimento A.1. muestran que, para mejorar la no selectividad del soporte en fase solida, una modificacion de la superficie con compuestos hidrofilos no polimericos pequenos que tienen abundantes grupos hidroxilo disminuye significativamente la no selectividad, mientras que la modificacion con polfmeros hidrofilos tales como PEG y dextrano, aun demuestra adsorcion no espedfica inaceptable de compuestos apolares pequenos, tales como nortestosterona. Adicionalmente, el acoplamiento de compuestos hidrofilos mediante carbonil diimidazol demostro los mejores de rendimientos de acoplamiento. Este compuesto qmmico de activacion generalmente da lugar a un acoplamiento estable sin anadir funcionalidades adicionales, que pueden influir en las propiedades (entre ellas la polaridad) del soporte.
A partir de los resultados del experimento A.2. y A.3. puede concluirse que la activacion del soporte en fase solida mediante grupos epoxi, respectivamente grupos metacrilo, en general mejora el rendimiento de acoplamiento de los compuestos hidrofilos que contienen (abundantes) grupos hidroxilo, respectivamente grupos metacrilato.
A partir de los resultados del experimento B1, B2 y B3 puede concluirse que, tambien para estos soportes en fase solida se obtienen buenos resultados cuando se acoplan compuestos pequenos con abundantes grupos hidroxilo. Lo
mismo es cierto cuando se usa metacrilato de hidroxietilo como soporte en fase solida. En este caso se obtienen buenos resultados cuando el soporte en fase solida se modifica directamente mediante un compuesto hidrofilo activado con epoxi y/o la activacion del soporte en fase solida mediante CDI y acoplamiento de compuestos hidrofilos pequenos.
5
En conclusion, el acoplamiento qmmico de componentes hidrofilos pequenos mejora significativamente la no selectividad de soportes en fase solida.
Tabla 1: No selectividad de diversos soportes preparados en el Ejemplo 1
Soporte
Soporte Activado Compuesto Hidrofilo Compuesto Hidrofilo Activado No selectividad (% de recuperacion)
Experimento A.1.
Sflice
- - - 31 *
Sflice
-NH2 Ninguno No 31 *
Sflice
-NH2 PEG200 CDI 55 *
Sflice
-NH2 PEG200 FMP 53 *
Sflice
-NH2 PEG200 NHS pegajoso *
Sflice
-NH2 PEG200 Cloruro de Tresilo 30 *
Sflice
-NH2 Maltosa CDI 65 *
Sflice
-NH2 Maltosa FMP 42 *
S^lice
-NH2 Maltosa NHS 37 *
S^lice
-NH2 Maltosa Cloruro de Tresilo 49 *
Sflice
-NH2 Dextrano CDI 56 *
S^lice
-NH2 Dextrano FMP 56 *
S^lice
-NH2 Dextrano NHS 42 *
S^lice
-NH2 Dextrano Cloruro de Tresilo 40 *
Experimento A.2.
Sflice
Epoxi Maltosa Hidroxi 91 *
S^lice
Epoxi Dextrano Hidroxi * LO 00
Experimento A.3.
Sflice
Metacrilo Dextrano Metacrilo 53 *
S^lice
Metacrilo HM-MA Metacrilo * CO 00
S^lice
Metacrilo DP-MA Metacrilo 94 *
S^lice
Metacrilo Tris-MA Metacrilo 90 *
S^lice
Metacrilo MA Metacrilo >99 *
Experimento B.1.
Estireno
- - - * o CM
Estireno
Clorometilo Etanolamina -NH2 91 *
Experimento B.2.
OHMe-Estireno
- - - 79 *
Experimento B.3.
Estireno
Epoxi Agua Hidroxi 100
Estireno
Epoxi Dextrano Hidroxi 90 *
Experimento B.4.
HEMA
- - - * CM CO
HEMA
- Glicidol Epoxi 95 *
HEMA
CDI Amino-DP -NH2 94 *
*Solo referencia
10
EJEMPLO 2 (SOLO PARA REFERENCIA): EFECTO DEL RETICULANTE SOBRE LA NO SELECTIVIDAD
Para examinar el efecto del reticulante, durante la preparacion del soporte en fase solida de copolfmero de hidroximetil estireno (vease el Ejemplo 1, B.2.) mediante polimerizacion en dispersion, se uso el reticulante de
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dimetacrilato de etileno, respectivamente dimetacrilato de etilenglicol. Ambos soportes en fase solida se investigaron por su no selectividad como se ha descrito en el Ejemplo 1. Los resultados se presentan en la Tabla 2.
Tabla 2 (solo para referencia): Efecto del reticulante sobre la no selectividad
Reticulante
Adsorcion no selectiva (% de recuperacion)
dimetacrilato de etileno
30%
dimetacrilato de etilenglicol
95%
Como puede verse a partir de estos resultados, la aplicacion de reticulantes hidrofilos mejora significativamente las caractensticas de adsorcion no selectiva de los soportes en fase solida.
EJEMPLO 3 (SOLO PARA REFERENCIA): EFECTO DEL ESPACIADOR SOBRE CAPACIDAD DEL SOPORTE DE AFINIDAD
Aparte del compuesto qmmico de activacion, el uso de un espaciador puede ser crucial para la interaccion exitosa entre un ligando y el analito diana (en este caso un anticuerpo).
Espedficamente con soportes ngidos, una molecula espaciadora puede proporcionar mayor flexibilidad y permitir que el ligando inmovilizado se mueva a su posicion para establecer la orientacion de union correcta. Sin embargo, debe tenerse cuidado respecto a la introduccion de sitios apolares y, como resultado, un aumento en la adsorcion no selectiva. Se prefieren los espaciadores hidrofilos. Adicionalmente, debe tenerse cuidado con respecto a la proteccion terminal de las moleculas espaciadoras que no han reaccionado; si el ligando contiene las mismas funcionalidades, la selectividad y/o capacidad del soporte de (inmuno)afinidad podna verse alterada.
C.1. Copolimero de metacrilato de hidroxietilo
C.1.1. Activacion de CDI
Se activo 1 gramo de soporte anadiendo 0,4 gramos de CDI, disuelto en 5 ml de acetona seca. La mezcla se dejo reaccionar durante 90 minutos a temperatura ambiente.
C.1.2. Activacion por aminacion reductora
El soporte en fase solida se hizo reaccionar con glicidol anadiendo 1 gramo de glicidol a 1 gramo de fase estacionaria, que se suspendio en 5 ml de hidroxido sodico 1 N, que contema 100 mg de NaBH4. La mezcla se dejo reaccionar durante una noche a temperatura ambiente. Despues del acoplamiento el soporte se lavo con agua, NaCl 1 M y agua. Se forman grupos aldehfdo haciendo reaccionar el soporte obtenido de esta manera con 20 ml de NaIO4 0,2 M durante 90 minutos a temperatura ambiente. Despues de la reaccion, el polfmero activado se lava con un exceso de agua.
C.1.3. Acoplamiento del espaciador
Se introdujo un espaciador por acoplamiento de diaminodipropilamina (DADPA) haciendo reaccionar 2 gramos de DADPA, disueltos en 5 ml de acetona seca con 1 gramo de material activado obtenido en el apartado C.1.1. por la agitacion durante una noche a temperatura ambiente.
C.1.4. Acoplamiento de ligandos
a. Activacion con CDI - sin espaciador
Hacia el soporte activado obtenido en el apartado C.1.1. 20 mg de Protema A se disolvieron en 4 ml de tampon fosfato 0,1 M fno a pH 7, que contema 150 mM de NaCl. La reaccion se dejo transcurrir durante 4 horas a temperatura ambiente.
b. Activacion de CDI - espaciador
El soporte obtenido en C.1.3. se hizo reaccionar con 2 gramos de anhfdrido sucdnico en 20 ml de agua durante una noche a temperatura ambiente. Despues del lavado con, sucesivamente, un exceso de agua, NaCl 1 M, agua, acetona seca y dioxano seco, el soporte se suspendio en 5 ml de dioxano seco que contema 0,4 gramos de CDI y se agito durante 1 hora a temperatura ambiente. Despues del lavado con acetona seca, se anadieron 20 mg de Protema A, disuelta en 4 ml de tampon fosfato 0,1 M fno a pH 7, que contema 150 mM de NaCl al soporte activado. La reaccion se dejo transcurrir durante 4 horas a temperatura ambiente.
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c. Aminacion reductora - sin espaciador
Hacia el soporte obtenido en C.1.2., se disolvieron 20 mg de Protema A en 4 ml de tampon fosfato 0,1 M a pH 7, que contema 150 mM de NaCl y 320 mg de NaCNBH3. La reaccion se dejo transcurrir durante una noche a temperatura ambiente.
d. Aminacion reductora - espaciador
El soporte obtenido en C.1.3. se hizo reaccionar con glicidol anadiendo 1 gramo de glicidol a 1 gramo de fase estacionaria, que se suspendio en 5 ml de hidroxido sodico 1 N, que contema 100 mg de NaBH4. La reaccion se dejo transcurrir durante una noche a temperatura ambiente. Despues del acoplamiento, el soporte se lavo con agua, NaCl 1 M y agua. Los grupos aldehndo se forman haciendo reaccionar el soporte obtenido de esta manera con 20 ml de NaIO4 0,2 M durante 90 minutos a temperatura ambiente. Despues de la reaccion, el polfmero activado se lavo con un exceso de agua. Despues del lavado con tampon fosfato 0,1 M a pH 7, que contema 150 mM de NaCl, entonces se anadieron 20 mg de Protema A, disuelta en 4 ml de tampon fosfato 0,1 M a pH 7, que contema 150 mM de NaCl y 320 mg de NaCNBH3 al soporte activado. La reaccion se dejo transcurrir durante una noche a temperatura ambiente.
Los soportes de afinidad obtenidos de esta manera se ensayan para su capacidad de capturar IgG humana en condiciones fisiologicas. Para este fin, se realizaron ensayos de adsorcion estaticos con soluciones que conteman 1 mg/ml de IgG humana en tampon fosfato 10 mM, pH 7,4, que contema 150 mM de NaCI. El sobrenadante se analizo respecto al contenido de IgG humana a UV-VIS 280 nm despues de 4 horas de agitacion a temperatura ambiente. Los resultados de estos experimentos se presentan en la Tabla 3.
Tabla 3 (solo para referencia): Efecto del espaciador sobre la capacidad del soporte
Procedimiento de activacion
Espaciador Capacidad mg de hIgG por g de soporte
Carbonil Diimidazol
Sin espaciador 24
Con un espaciador de nueve atomos
47
Aminacion reductora
Sin espaciador 34
Con un espaciador de nueve atomos
34
Estos resultados muestran que el uso de un espaciador es particularmente ventajoso cuando se usa activacion por CDI.
EJEMPLO 4 (SOLO PARA REFERENCIA): CAPACIDAD DE LOS SOPORTES DE INMUNOAFINIDAD CON DIVERSOS LIGANDOS EN COMPARACION CON RESINAS DISPONIBLES EN EL MERCADO
Para examinar la aplicabilidad del soporte activado, una diversidad de ligandos se acoplaron covalentemente y se ensayaron para su capacidad. Los resultados se compararon con los obtenidos cuando los ligandos se acoplaron a una resina disponible en el mercado usando un compuesto qmmico de activacion similar.
Para estos experimentos, se acoplaron anticuerpos contra vitamina B 12, lactoferrina, aflatoxina B2 o aldosterona con resinas activadas por aminacion reductora. Por esta razon, se uso una resina activada por aminacion reductora disponible en el mercado y la resina producida en el apartado C.1.4.C. El acoplamiento de anticuerpos se realizo disolviendo 5-10 nmol de anticuerpo en 4 ml de tampon fosfato 0,1 M a pH 7, que contema 150 mM de NaCl y 320 mg de NaCNBH3. Esta solucion se dejo reaccionar con 1 gramo de soporte activado durante una noche a temperatura ambiente. Las resinas de inmunoafinidad funcionalizadas obtenidas de esta manera se ensayaron para su capacidad dinamica a 1 ml/min, aplicando de esta manera soluciones patron de los antfgenos correspondientes y midiendo la penetracion mediante HPLC. Los resultados de estos experimentos se demuestran en la Tabla 4.
Tabla 4 (Solo para referencia): Capacidades de absorcion de diversos soportes de inmunoafinidad en comparacion ________________ con los obtenidos con un soporte disponible en el mercado___________________
Ligando
Capacidad de analito diana por gramo de soporte C.1.4.c. (Ej. 3) Capacidad de analito diana por gramo de soporte comercial
Anti-vitamina B 12
800 ng 1000 ng
Anti-lactoferrina
60 |ig 70 |ig
Anti-afloxina B2
620 ng 520 ng
Anti-aldosterona
310 ng 200 ng
Como puede verse, la resina de afinidad de la invencion demuestra capacidades comparables para los diversos analitos ensayados.
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EJEMPLO 5 (SOLO PARA REFERENCIA): EFECTO DE LOS TAMPONES SOBRE LA COMPATIBILIDAD MS Y LA CAPACIDAD IAC
La carga de columnas de inmunoafinidad en general se realiza con una solucion salina tamponada con fosfato (PBS). Sin embargo, estos tampones no son compatibles con MS. Para investigar si los tampones compatibles o no con MS (tampones volatiles tales como tampones basados en formiato, acetato y carbonato) afectan al rendimiento de los soportes en fase solida de inmunoafinidad, se ensayaron varias resinas de inmunoafinidad respecto a su capacidad cuando se usa el tampon tradicional y tampones compatibles con MS. Para ello, se acoplaron anticuerpos contra aldosterona, respectivamente acrilamida, a una resina activada por aminacion reductora (C.I.4.C.). El acoplamiento de anticuerpos se realizo disolviendo 5-10 ml de anticuerpo en 5 ml de tampon fosfato 0,1 M a pH 7, que contema 150 mM de NaCl y 320 mg de NaCNBH3 y esta solucion a 1 gramo de soporte activado. La reaccion se dejo transcurrir durante una noche a temperatura ambiente.
Los soportes de inmunoafinidad obtenidos de esta manera se ensayaron para su capacidad dinamica a 1 ml/min, aplicando de esta manera soluciones patron de la absorcion del antfgeno correspondiente y midiendo la penetracion y elucion del analito capturado mediante HPLC, usando de esta manera las soluciones tampon mencionadas en la tabla 5. Adicionalmente, las mediciones de supresion de iones se realizaron para las diversas soluciones tampon investigadas reemplazando el detector de UV-VIS por un detector de MS.
Tabla 5. Efecto de la composicion de la solucion tampon sobre la capacidad del soporte de inmunoafinidad
Carga del tampon
Capacidad del analito diana por g de soporte Detector de MS de supresion de ion
Tampon fosfato sodico 10 mM pH 7,0 + NaCl 150 mM
440 ng de aldosterona respectivamente 500 ng de acrilamida No fue posible realizar mediciones debido a la supresion de ion
formiato de amonio 100 mM, pH 7,0
460 ng de aldosterona No hubo supresion de ion detectable
acetato de amonio 100 mM, pH 7,0
450 ng de aldosterona No hubo supresion de ion detectable
carbonato de amonio 10 mM, pH 7,0
560 ng de acrilamida No medido
A partir de estos resultados, puede concluirse que para estas resinas de inmunoafinidad no se observo efecto sobre la capacidad cuando se reemplazo la solucion tampon tradicional por una solucion tampon volatil. La aplicacion de las soluciones tampon volatiles claramente mejoro la supresion de ion del detector de MS.

Claims (15)

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    10
    15
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    REIVINDICACIONES
    1. Una resina cromatografica adecuada para su uso en cromatograffa de afinidad a alta presion, comprendiendo la resina un pokmero organico ngido y teniendo la resina una superficie hidrofila, caracterizada por que la superficie hidrofila esta formada por una multiplicidad de compuestos hidrofilos no pokmeros pequenos unidos covalentemente que tienen un peso molecular menor de 1000 Dalton y en la que la resina no contiene un recubrimiento hidrofilo por una estructura polimerica.
  2. 2. La resina de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el peso molecular de los compuestos hidrofilos no polimericos es menor de 500 Dalton.
  3. 3. La resina de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en la que el compuesto hidrofilo no polimerico tiene 1-10 atomos de C.
  4. 4. La resina de acuerdo con la reivindicacion 3, en la que el compuesto hidrofilo pequeno es de formula general CnHm(Y)k, en la que
    n es un numero entero de 1 a 10, preferentemente de 2 a 8, m < 2 n k < 3 n, e
    Y es un resto hidrofilo, preferentemente -OH o -COOH.
  5. 5. La resina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el compuesto hidrofilo no polimerico se selecciona del grupo que consiste etanolamina, 3-amino-1,2-propanodiol, N-(hidroximetil)acrilamida, 3- aliloxi-1,2-propanodiol, N-[Tris(hidroximetil)metil]acrilamida y glicidol.
  6. 6. La resina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho polimerico organico se selecciona del grupo que consiste en poliacrilamidas, poliacrilatos, polimetacrilatos, polivinilo y poliestireno.
  7. 7. La resina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas uno o mas ligandos fijados al poffmero organico ngido mediante dicho al menos un compuesto hidrofilo no polimerico, preferentemente en la que dicho ligando es una molecula biologica o sintetica, preferentemente una protema o peptido, tal como un anticuerpo.
  8. 8. Un metodo para proporcionar una resina cromatografica como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, comprendiendo el metodo la etapa de formar una superficie hidrofila no polimerica haciendo reaccionar un polfmero organico ngido con al menos un compuesto hidrofilo no polimerico que tiene un peso molecular menor de 1000 Dalton.
  9. 9. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 8 que comprende, antes de hacer reaccionar con el al menos un compuesto hidrofilo, una etapa de activar de dicho polfmero, dicho compuesto hidrofilo o tanto el polfmero como el compuesto hidrofilo, para mejorar la reactividad entre dicho polfmero y dicho al menos un compuesto hidrofilo.
  10. 10. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que dicha activacion comprende proporcionar el polfmero y/o el compuesto hidrofilo con uno o mas grupos reactivos, seleccionados preferentemente del grupo que consiste en -NH2, -OH y -CH=CH2.
  11. 11. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, que comprende ademas la etapa de hacer reaccionar dicha resina cromatografica que tiene una superficie hidrofila con al menos un ligando para permitir una fijacion covalente de dicho al menos un ligando a la resina mediante dicho al menos un compuesto hidrofilo no polimerico.
  12. 12. Una columna cromatografica que comprende una resina como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
  13. 13. Un aparato que comprende una columna cromatografica como se ha definido en la reivindicacion 12 en comunicacion fluida con un sistema analftico, preferentemente en el que dicho aparato comprende un sistema de extraccion en fase solida (SPE) integrado con un sistema de cromatograffa lfquida (LC), preferentemente un sistema de cromatograffa ffquida a alta presion (HPLC).
  14. 14. Aparato de acuerdo con la reivindicacion 13, en el que dicho sistema analftico comprende ademas un espectrometro de masas.
  15. 15. Uso de una resina como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en un metodo analftico para analizar una muestra de ensayo que comprende extraccion en fase solida, preferentemente en el que el metodo comprende deteccion por espectroscopia de masas (MS) de al menos un analito en la muestra.
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