JP3292721B2 - Ｓｇ粒子を用いたスクリーニング方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、表面がグリシジル
メタクリレートで覆われたスチレン−グリシジルメタク
リレート重合体にスペーサーを介して生理活性を有する
化合物を結合させて、当該生理活性を有する化合物に付
着する物質をスクリーニングする方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体を構成している細胞は、常に外界か
らの多種多様な刺激にさらされている。細胞は、こうし
た刺激に応答すべく一群の遺伝子発現を引き起こす。そ
の結果、細胞増殖・分化が誘導されたり、生体の恒常性
が保たれるなどの種々の生命現象が起こる。細胞外の刺
激は細胞内でシグナルに変換され、そのシグナルは特定
のタンパク性転写因子を活性化する。機能的に活性化さ
れた転写因子は、染色体上の特異塩基配列に結合し、そ
の支配下にある一群の遺伝子発現を誘導する。それら誘
導発現された遺伝子産物が刺激に応答すべく一次的に機
能を発揮する場合があるが、さらに、その遺伝子産物が
異なる転写因子を活性化して、その支配下にある別の遺
伝子群の発現を誘導し、刺激に対して二次的に応答する
場合もある。いずれにせよ、外界の刺激への細胞応答は
転写因子の機能変換ということになる。

【０００３】近年、極めて興味深いことが明らかにされ
た。免疫抑制剤であるシクロスポリンＡ（ＣｙｓＡ）や
ＦＫ５０６の作用機構が明らかにされたのである。その
きっかけになったのは、それら薬剤の細胞内受容体が同
定されたことである。それにより、免疫担当Ｔ細胞にお
いて、抗原刺激からの一連のシグナル伝達経路が明らか
にされた。 従って、薬剤の細胞内にある受容体を探索
・同定することは、シグナル伝達経路の解明と共に、シ
グナル伝達経路を標的とした新薬の開発や新規薬剤の設
計（ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ）へと発展することが大い
に期待される。

【０００４】従来、細胞内にある受容体を分離精製する
には、細胞粗抽出液を多種多様のカラムを用いて分画
し、各々の画分中に標識した薬剤と結合する因子が存在
するか否かを検討していた。従って、カラムによる分離
・精製するステップと薬剤との結合活性を評価する二つ
のステップを行わなければならなかった。そこで、特定
の薬剤に対する細胞内および細胞膜にある受容体の精製
・同定およびその機能解析などを行うために、特定の薬
剤を固定化したミクロスフィアを設計・構築した。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従来の精製法は、細胞
粗抽出液から薬剤結合因子を精製するのに非常に時間が
かかるし、多くのカラムを用いるので回収効率も低く、
アミノ酸配列を決定できるような量を得るには非常に多
量の出発材料が必要であった。結合活性の検討に関して
は、薬剤レセプターが未知な物質であるので、薬剤との
結合活性を検討する方法を確立するのも容易ではない。
従来、薬剤とそのレセプターとの結合を検討する方法と
して、薬剤レセプター（タンパク質）がフィルターに結
合することや、薬剤がその受容体と結合することにより
サイズが大きくなることなどを利用したフィルターバイ
ンディング法やゲル濾過法などが用いられてきた。しか
し、レセプターによってはフィルターに結合しなかった
り、フィルターに結合すると構造変換し薬剤が解離する
場合などがあり、薬剤レセプターの性質を前もって検討
することが必要となる。本発明者は、従来法の有する上
記課題を解決すべく鋭意検討した結果、以下の手段によ
り課題を解決できることを見いだし本発明を完成したも
のである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、表面がグリシ
ジルメタクリレートで覆われたスチレン−グリシジルメ
タクリレート重合体にスペーサーを介して生理活性を有
する化合物を結合させて、当該生理活性を有する化合物
に付着する物質をスクリーニングする方法に関する。よ
り詳細には、本発明は、表面がグリシジルメタクリレー
トで覆われたスチレン−グリシジルメタクリレート重合
体にスペーサーを介して生理活性を有する化合物を結合
させて、当該生理活性を有する化合物に付着する物質を
スクリーニングする方法において、当該生理活性を有す
る化合物、又は当該生理活性を有する化合物に付着する
物質が、受容体であるスクリーニング方法に関するもの
であり、本発明の方法により当該生理活性を有する化合
物が生理活性を発現させるために結合する細胞の受容体
をスクリーニングすることや、特定の受容体を用いて当
該受容体に結合する薬物の候補化合物をスクリーニング
することができる。さらに、本発明は、前記した方法に
おいて、受容体が、受容体の全長のアミノ酸配列のうち
の一部のアミノ酸配列からなるものであるスクリーニン
グ方法に関するものであり、本発明の方法により。受容
体が生理活性物質と結合し得る部位を決定することがで
きる。

【０００７】本発明におけるミクロスフィアの粒子を形
成する物質としては、表面がグリシジルメタクリレート
で覆われたスチレン−グリシジルメタクリレート重合体
が使用され、その重合状態や形態は液層から分離可能な
ものであれば特に制限はないが、ソープフリー乳化重合
による猪股らの方法に従って製造されるものが好まし
い。本発明におけるスペーサーとは、上記した粒子と後
述の生理活性を有する化合物の間に存在する化学物質で
ある。スペーサーは、粒子及び生理活性物質と結合する
前は、その両端に例えば、アミノ基、カルボキシル基、
エポキシ基等の官能基を有していることが好ましい。本
発明におけるスペーサーとしては、前記した表面がグリ
シジルメタクリレートで覆われたスチレン−グリシジル
メタクリレート重合体と生理活性を有する物質とを適当
な距離を置いて結合し得るものであれば特に制限はない
が、具体的にはエチレングリコールジグリシジルエーテ
ル誘導体を使用するのが好ましい。本発明における、生
理活性を有する物質（以下「生理活性物質」ということ
もある。）とは、生体内において活性を示し、生体内又
は生体外の他の物質との間に相互作用、親和性を有する
物質であれば特に制限はないが、細胞内又は細胞膜にあ
る受容体と特異的に結合する化合物が好ましい。これら
の生理活性を有する物質がその分子内に前記スペーサー
に結合し得る官能基、例えば、アミノ基、水酸基などの
官能基を有する場合には、その官能基をスペーサーに結
合する基として使用することができる。また、これらの
生理活性を有する物質がその分子内に前記スペーサーに
結合し得る官能基を有していない場合には、当該生理活
性物質中に新たにスペーサーに結合し得る官能基を導入
することにより、スペーサーと結合させることができ
る。いずれの場合においてもスペーサーに結合させるこ
とにより、当該生理活性物質の生理活性が失活しないよ
うに留意しなけばならない。即ち、当該生理活性物質を
スペーサーに結合させることにより、対象となる生理活
性が失活しないことを確認することは重要である。本発
明における生理活性を有する物質としては、例えば、３
−［（５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル−１，４
−ベンゾキノニル）］−２−ノニル−２−プロペン酸
（以下「Ｅ３３３０」と略称することもある。）誘導体
などを使用することができる。

【０００８】本発明の、表面がグリシジルメタクリレー
トで覆われたスチレン−グリシジルメタクリレート重合
体にスペーサーを介して生理活性を有する化合物が結合
したミクロスフィアの製造方法としては、通常の方法に
より、スチレン−グリシジルメタクリレート重合体から
なる粒子（以下、 「ＳＧ粒子」ともいう。）、好まし
くは特にスペーサーとの結合を良くするために粒子の表
面に官能性のグリシジル基が突出したものを製造し、Ｓ
Ｇ粒子のグリシジル基を必要に応じて水酸化アンモニウ
ムなどの試薬により開環させて、スペーサーとの結合に
好ましい官能基を導入することもできる。次いで、ＳＧ
粒子にスペーサーを結合させて、さらに生理活性を有す
る物質又はその誘導体を反応させることにより、本発明
のミクロスフィアを製造することができる。これらの反
応には必要に応じてジオキサン、ＤＭＳＯ、水などの溶
媒を使用することもできる。

【０００９】本発明のミクロスフィアの製造法の例を図
１に示す。まず、スチレンとグリシジルメタクリレート
などを重合、例えば乳化重合させて表面にグリシジル基
が突出したＳＧ粒子を製造する。粒子の大きさは適宜選
択することができるが、通常は約０．０５〜０．５μ
ｍ、好ましくは約０．１〜０．３μｍ程度である。得ら
れたＳＧ粒子にスペーサーとなる化合物、例えばエチレ
ングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）などを
反応させてＳＧ粒子にスペーサーを結合させてスペーサ
ーが結合したＳＧ粒子（ＳＧ−ＥＧＤＥ粒子）を得る。
これと、好ましくはジオキサンなどの有機溶媒の存在下
に、アミノ基などの反応性の官能基を有する生理活性物
質とを反応させることにより、生理活性物質が固定化さ
れたラテックス粒子である本発明のミクロスフィアを製
造することができる。

【００１０】本発明における分離される物質を含有する
混合物としては、ミクロスフィアに使用した生理活性物
質と親和性を有し選択的に付着し得る物質を含有する混
合物であれば特に制限はないが、通常は細胞抽出液、特
に当該生理活性物質が作用する部位の細胞の抽出液が好
ましい。本発明の分離方法は、生理活性物質が結合した
ミクロスフィアを細胞抽出液などのタンパク質を含有す
る混合物に加えて、数分〜数時間、必要により撹拌した
後、タンパク質が付着したミクロスフィアを分離し、必
要によりこれを緩衝液などで洗浄し、次いでＫＣｌ溶液
などで付着したタンパク質を溶出して解離させることに
より行うことができる。ミクロスフィアに使用した生理
活性物質と分離される物質との付着は、化学結合（水素
結合など）であってもよいし、化学的又は物理的な吸着
であってもよく、その形態は特に制限されものではな
い。図２に本発明のタンパク質の分離方法の例を示す。
この例は生理活性物質としてＥ３３３０を使用したもの
である。

【００１１】得られたタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥな
どにより検出することができ、さらに必要であればクロ
マトグラフィなどの通常の方法により精製することがで
きる。本発明の方法により分離されるタンパク質は、ミ
クロスフィアの生理活性物質の受容体になるものと考え
られるが、本発明の方法で分離できるタンパク質は使用
する生理活性物質の受容体に制限されるものではなく、
使用する生理活性物質と化学的、物理的又は生物学的な
親和性を有するものであればこの方法で分離することも
できる。得られたタンパク質は必要に応じて精製した
後、バイオテクノジーの通常の手法により当該タンパク
質をコードする遺伝子をクローニングし、そのアミノ酸
配列及び遺伝子の塩基配列を決定することができる。さ
らに、通常の遺伝子操作により当該タンパク質の部分配
列を有するタンパク質又はペプチドを発現させることに
より、受容体タンパク質の活性部位を決定することもで
きる。これらの方法も本明細書において生理活性物質と
してＥ３３３０を使用した場合の例を挙げて具体的に開
示する。

【００１２】また、得られた受容体又はその中の活性部
位となるドメインの構造をＮＭＲ、Ｘ線結晶解析あるい
はアミノ酸配列を基にしたコンピューターによるシュミ
レーション解析により明らかにすることも可能である。
例えば、ミクロスフィアに使用する生理活性物質として
Ｅ３３３０を用いて本発明の方法により得られたタンパ
ク質Ｒｅｆ−１の８２ａ．ａ．から１０６ａ．ａ．の領
域は、このような構造解析によりβ−シート／α−ヘリ
ックス／β−シート構造を持つことが示唆されている。
このような立体構造解析や遺伝学的解析から、本発明の
方法により分離されたタンパク質又はその活性ドメイン
の中のどのアミノ酸残基が、ミクロスフィアに使用され
た生理活性物質と結合するのかを決定することも可能と
なるし、当該生理活性物質と分離されたタンパク質のア
ミノ酸との相互作用を分子・原子レベルで解明すること
や結合の反応速度論的解析も可能となる。それらの研究
結果を基にすれば、ミクロスフィアに使用した生理活性
物質の受容体となるタンパク質が判明するのみでなく、
当該生理活性物質の生体内での作用メカニズムを明らか
にすることも可能となる。さらには、受容体となるタン
パク質との相互作用に関してミクロスフィアに使用した
生理活性物質とは結合様式を異にする新規な薬剤を原子
レベルで的確にコントロールしてドラッグデザインする
ことも可能である。このようにして設計された各種薬剤
は、当然元のミクロスフィアに使用した生理活性物質と
は機能を異にしており、それら薬剤を用途により使い分
けることも可能であり、ドラッグデザインの新たな手法
として極めて重要なものである。

【００１３】さらに、本発明はミクロスフィアに結合さ
せる生理活性を有する物質として受容体活性を有するタ
ンパク質を使用することにより、当該受容体に親和性を
有する物質を分離、検出する方法を提供するものであ
る。受容体活性を有する物質としては、受容体の全長を
使用することも可能ではあるが、当該受容体の活性部分
として数十アミノ酸残基程度のドメインにまでトリミン
グし、このドメインを使用するのが好ましい。これによ
り、当該受容体又はドメインに特異的に結合する薬剤を
スクリーニングすることができる。このスクリーニング
により、薬剤としての有用性が期待される化学合成物質
をドラッグライブラリーの中から容易に分離、検出する
ことができる。このようにして分離、検出された物質は
ミクロスフィアに結合させた受容体活性を有するタンパ
ク質と親和性を有し、当該受容体の活性を促進又は阻害
するための医薬の有効成分となることができる。

【００１４】本発明によると、表面がグリシジルメタク
リレートで覆われたスチレン−グリシジルメタクリレー
ト重合体によるミクロスフィアを提供することができ、
また、生理活性を有する特定の化合物に対する細胞内及
び細胞膜にある受容体の精製、同定などを容易に行うこ
とができる。本発明にかかる生理活性を有する物質を結
合した粒子は、薬剤レセプターの分離・精製と結合活性
の評価が同時にできることが画期的な効果であり、薬剤
の分離・精製時間を大幅に短縮でき、回収効率も非常に
すぐれており、結合活性方法を検討することも必要ない
というきわめて顕著な効果を有する。さらに、本発明
は、薬剤および化合物を固定化した粒子を用いて、細胞
内に存在する薬剤や化合物の受容体を分離・精製し、か
つその受容体の構造・機能を解明することが可能である
ことを示すもので、さらに、本発明が薬剤受容体の構造
・機能の解明を基盤にして、より機能の優れた新規薬剤
の開発に極めて有用であることを示すものである。

【００１５】

【実施例】以下に本発明を実施例に基づいて具体的に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。

【００１６】実施例１ （表面がグリシジルメタクリレ
ートで覆われたスチレン−グリシジルメタクリレート重
合体の製造） スチレン（Ｓｔ；和光純薬工業、２１．５ｍｍＨｇ、４
６℃で減圧蒸留後使用）、グリシジルメタクリレート
（ＧＭＡ；和光純薬工業、２ｍｍＨｇ、３３℃で減圧蒸
留後使用）、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ；東京化成工
業）、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパンジハ
イドロクロライド）（Ｖ−５０；和光純薬工業）、及び
水を以下の処方で、 Ｓｔ／ＧＭＡ／ＤＶＢ／Ｖ−５０／Ｈ２０＝１．２／
１．８＋０．３／０．０４／０．０６／１１０（ｇ） 窒素置換後に７０℃、２４時間重合反応を行った。重合
は猪股らの方法によりソープフリー乳化重合を行った。
重合開始２時間後にＧＭＡ ０．３ｇを添加し、得られ
た重合体の表面を完全にＧＭＡにより覆った。得られた
重合体（ＳＧ粒子）を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、
１５ｍｉｎ、４℃）により沈澱し、上清をデカンテーシ
ョン後、水２００ｍｌに再分散した。上記操作を３回繰
り返しＳＧ粒子を洗浄し、最後に水で分散した。

【００１７】この洗浄したＳＧ粒子（０．２５ｇ）にア
ミノ基を導入するために、ＮＨ_４ＯＨ（５５．３ｍｍｏ
ｌ；ＧＭＡ ｕｎｉｔの５０倍量に相当）を加え、１Ｎ
のＨＣｌでｐＨ １１に調整した。スターラーで撹拌し
ながら７０℃、２４時間反応させ、ＧＭＡのエポキシ基
を開環した。

【００１８】実施例２ （スペーサーの結合） 次に、スペーサーとしてエチレングリコールジグリシジ
ルエーテル（ＥＧＤＥ；和光純薬工業）を用いて、実施
例１で得られたＳＧ粒子に固定化した例を示す。約６
２．５ｍｇのＳＧ粒子表面のアミノ基の１００倍量
（ｍｏｌ）となるように過剰のＥＧＤＥを仕込み、３０
℃、２４時間、ｐＨ １１（１ＮのＮａＯＨで調整）で
撹拌することにより、ＥＧＤＥのエポキシ基とＳＧ粒子
上のアミノ基との間で共有結合させた。ＥＧＤＥ１分子
の両末端にあるエポキシ基が同時にＳＧ粒子に固定化さ
れることを防ぐために過剰量のＥＧＤＥを加えた。この
条件下で、粒子１ｇ当たり、約１ｍｍｏｌのＥＧＤＥが
固定化された。反応後、ＳＧ粒子を遠心操作により水で
３回洗浄した。こうして得られたスペーサー固定化ＳＧ
−ＥＧＤＥ粒子を生理活性化合物を固定化するための粒
子として使用した。

【００１９】実施例３ （スペーサーとＥ３３３０アミ
ノ誘導体との結合） （ａ） （Ｅ３３３０へのアミノ基の導入） Ｅ３３３０は適当な反応基を有していないので、Ｅ３３
３０をＳＧ−ＥＧＤＥ粒子に固定化することは困難であ
る。そこで、Ｅ３３３０にアミノ基を導入したＮＨ_２−
Ｅ３３３０を合成した。

【００２０】（ｂ） （ＮＨ_２−Ｅ３３３０の機能の確
認） ＮＨ_２−Ｅ３３３０の機能を、Ｅ３３３０の機能と、Ｎ
Ｆ−κＢの転写活性化能に関して比較検討した。方法と
して、ＮＦ−κＢの制御下にあるルシフェラーゼ遺伝子
を持った組換えプラスミドDNAをJurkat細胞に導入する
トランスフェクション実験を行った。その結果、ＮＨ_２
−Ｅ３３３０は、Ｅ３３３０ほど強くはないが確かにＮ
Ｆ−κＢの転写活性化能を抑制することを確かめ、導入
したアミノ基がＥ３３３０と細胞内レセプターとの結合
を阻害するものではないことを確認した。

【００２１】（ｃ） （ＮＨ_２−Ｅ３３３０のSG-EGDE
粒子への結合） 実施例２で得られた１０ｍｇのＳＧ−ＥＧＤＥ粒子を、
遠心操作により１ｍｌの１，４−ｄｉｏｘａｎｅで３回
洗浄した。洗浄後、沈澱したＳＧ−ＥＧＤＥに１０μｍ
ｏｌのＮＨ_２−Ｅ３３３０を含んだ５００μｌの１，４
−ｄｉｏｘａｎｅを加え、ＳＧ−ＥＧＤＥ粒子を分散さ
せて、３７℃、２４時間反応させて、ＮＨ_２−Ｅ３３３
０を粒子上のＥＧＤＥのエポキシ基に固定化した。反応
後、遠心操作により、２０μｌの１，４−ｄｉｏｘａｎ
ｅで３回洗浄した。その後、ＳＧ−ＥＧＤＥ粒子上の未
反応のエポキシ基を完全にマスクするため、１ｍｌの１
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．４）に分散させ、少
なくとも４℃、２４時間静置後、使用した。この薬剤固
定化粒子は、暗所、４℃で保存した。洗浄時の遠心操作
は１５，０００×ｇ、室温、５分間で行った。この操作
により固定化されたＮＨ_２−Ｅ３３３０は１ｇのＳＧ−
ＥＧＤＥ粒子に対して、０．１５ｍｍｏｌであった。Ｅ
３３３０固定化量は、仕込み量からＳＧ−ＥＧＤＥ粒子
に結合しなかったＮＨ_２−Ｅ３３３０量を差し引いた量
で求めた。ＮＨ_２−Ｅ３３３０は、２５４．５ｎｍに吸
収極大をもつため、仕込量や非結合画分や洗浄画分の２
５４．５ｎｍにおける吸光度を測定することによりＮＨ
_２−Ｅ３３３０の定量を行うことができる。吸光度は、
ＤＵ−６４ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂ
ＥＣＫＭＡＮ）で測定した。

【００２２】実施例４ （核抽出液及び細胞質画分の調
製） ８リットルのスケールで浮遊培養したＪｕｒｋａｔ細胞
（２×１０^１０ｃｅｌｌｓ)の培養液を５００ｍｌの遠
心チューブ（ＮＡＲＧＥＮ）を用いて、５００×ｇ、４
℃、１０分間の遠心により、細胞を集めた。細胞はＰＢ
Ｓ（−）で２回洗浄した。その時の洗浄は、５０ｍｌの
遠心チューブで行い、遠心の条件は、７００×ｇ、４
℃、５分間とした。最終時の細胞体積（ＰＣＶ）を測
り、そのＰＣＶの４倍のボリュームのＢｕｆｆｅｒ Ａ
（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ ７．９， １．５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ_２， １０ｍＭ ＫＣｌ， ０．５ｍＭ
ＤＴＴ）を加え、懸濁し、氷上に２０分静置することで
細胞を膨張させた。膨張した細胞を４０ｍｌのＢ ｔｙ
ｐｅ Ｄｏｕｎｃｅ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ （ＷＨ
ＥＡＴＯＮ）で２０ｓｔｒｏｋｅｓで細胞膜を破砕し
た。これを５０ｍｌの遠心チューブ（ＮＡＲＧＥＮ）に
移し、４，２００×ｇ、４℃、６分間で遠心することに
より細胞質画分（上清）と核画分（沈澱）とを分離し
た。分離した核を再びＰＣＶの５倍のボリュームのＢｕ
ｆｆｅｒ Ａに懸濁し、４，２００×ｇ、４℃、６分間
遠心することで、混入している細胞質画分を取り除く。
これをＰＣＶと同じボリュームのＢｕｆｆｅｒ Ｃ
（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ ７．９， ２５％（Ｖ
／Ｖ） ｇｌｙｃｅｒｏｌ， ０．４２Ｍ ＮａＣｌ，
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２， ０．２ｍＭ ＥＤＴＡ，
０．５ｍＭＰＭＳＦ， １ｍＭ ＤＴＴ）に懸濁し、
Ｂ ｔｙｐｅ Ｄｏｕｎｃｅ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ
で１０ ｓｔｒｏｋｅｓすることにより、塊となった核
をほぐした。この懸濁液を４℃で３０分間ゆっくり撹拌
することにより、核内成分を抽出した。これを５０ｍｌ
の遠心管に移した後、１６，０００×ｇ、４℃、３０分
間遠心し、得られた上清を１リットルのＢｕｆｆｅｒ
Ｄ （２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ ７．９， ２０％
（Ｖ／Ｖ） ｇｌｙｃｅｒｏｌ， ０．１Ｍ ＫＣｌ，
０．２ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．５ｍＭ ＰＭＳＦ，
１ｍＭ ＤＴＴ）に対して２回透析した（４℃、２．５
時間）。

【００２３】一方、細胞質画分は５０ｍｌの別の遠心管
に移した後、再度４，２００×ｇ、４℃、６分間遠心
し、その上清を超遠心管（ＢＥＣＫＭＡＮ：Ｎｏ． ３
５５６２０）に移した。これを３５Ｋｒｐｍ、４℃、１
時間で超遠心（ＢＥＣＫＭＡＮ：Ｒｏｔｏｒ Ｔｙｐｅ
３５）し、得られた上清を核抽出液と同様に透析を行
った。透析終了後、核抽出液及び細胞質画分を共に、１
４，０００×ｇ、４℃、３０分間遠心し、得られた上清
をそれぞれ核抽出液、細胞質画分として使用した。これ
ら画分は分注して、使用時まで−８０℃に保存した。通
常、このスケールでは核抽出液で５ｍｇ／ｍｌ、細胞質
画分で１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度のものが、２０
ｍｌ程度得られる。

【００２４】実施例５ （核及び細胞質画分のホスホセ
ルロースによる分画） 細胞抽出液の分画には、陽イオン交換性のホスホセルロ
ース（Ｐ１１：Ｗｈａｔｍａｎ）を用いた。分画時の操
作は、すべて４℃で行った。ホスホセルロースの乾燥重
量１０ｇに蒸留水を加え５００ｍｌとし、よく撹拌して
３０分静置した。粘度の小さいホスホセルロースを除く
ために、その上清を捨て再び等量の蒸留水を加える。こ
の操作を数回繰り返しホスホセルロースの粒度を均一に
した。次に、ホスホセルロースを活性化するために、粒
度を揃えたホスホセルロースを、乾燥重量１ｇ当たり５
０ｍｌの０．５Ｎ ＨＣｌに懸濁し、５分間放置後、こ
れを２枚の濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ：３ＭＭ Ｃｈｒ）を
敷いたブフュナーロート上に集め、ｐＨが中性付近に戻
るまで大過剰の蒸留水で洗浄した。この時濾液のｐＨを
ＢＴＢ ｐＨ試験紙を用いて測定することでｐＨを確認
した。濾紙上のホスホセルロースをビーカーに移し、今
度は、０．５ＮのＮａＯＨに懸濁し、５分間放置後、同
様にホスホセルロースを洗浄した。最後にもう１度０．
５Ｎ ＨＣｌに懸濁し、洗浄することで、活性化ホスホ
セルロースを得た。

【００２５】カラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ：７３１−１５５
０）に、カラム体積が１０ｍｌとなるように活性化した
ホスホセルロースを充填した。充填したカラムを１００
ｍｌの１Ｍ ＫＣｌを含んだＢｕｆｆｅｒ Ｄ（２０ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳ （ｐＨ ７．９）， ２０％（Ｖ／
Ｖ） ｇｌｙｃｅｒｏｌ， １Ｍ ＫＣｌ， １．２ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ， ０．５ｍＭ ＰＭＳＦ， １ｍＭ Ｄ
ＴＴ）で洗浄した後、１００ｍｌの０．１Ｍ ＫＣｌを
含んだＢｕｆｆｅｒ Ｄで平衡化した。Ｊｕｒｋａｔ細
胞の核抽出液及び細胞質画分をそれぞれ５ｍｌ、カラム
にチャージした。溶出は段階的に行い、Ｂｕｆｆｅｒ
Ｄの塩濃度をそれぞれ０．１Ｍ ＫＣｌ，０．３２Ｍ
ＫＣｌ， ０３５Ｍ ＫＣｌ， １Ｍ ＫＣｌとして段
階的に溶出した。それぞれの溶出画分は、Ｂｕｆｆｅｒ
Ｄに透析後、分注して使用時まで、−８０℃で保存し
た。なお、流速は８ｍｌ／ｍｉｎとなるように調節し、
各塩濃度でのタンパク質の溶出が終了したかを見るため
に２８０ｎｍの吸光度をＵＶ検出機（ＧＩＬＳＯＮ：Ｍ
ＯＤＥＬ １１１Ｂ）で測定しながら分画を行った。

【００２６】まず、細胞質画分（タンパク質濃度１２ｍ
ｇ／ｍｌ）を上記のカラムに５ｍｌチャージし、３０ｍ
ｌの０．１Ｍ画分（Ｐ．１；タンパク質濃度１．１２ｍ
ｇ／ｍｌ）、３９ｍｌの０．３Ｍ画分（Ｐ．３；タンパ
ク質濃度０．２３ｍｇ／ｍｌ）、３７ｍｌの０．５Ｍ画
分（Ｐ．５；タンパク質濃度０．０７ｍｇ／ｍｌ）、５
３ｍｌの１．０Ｍ画分（Ｐ１．０；タンパク質濃度０．
０２ｍｇ／ｍｌ）が得られた。同様に、核抽出画分をホ
スホセルロースカラムにより分画した。

【００２７】実施例６ （ミクロスフィアを用いたタン
パク質の分離） Ｅ３３３０固定化粒子によるＥ３３３０結合性タンパク
質の分離・精製法を図２に示す。 （ａ） ホスホセルロースカラムにより分画した実施例
５で得た画分とミクロスフィアとを混合し、粒子に固定
化したＥ３３３０に結合したものを遠心操作により、分
離した。遠心条件は、１５，０００×ｇ、４℃、５分間
行い、実験の操作はすべて４℃で行った。

【００２８】（ｂ） まず、Ｅ３３３０を固定化してい
ないＳＧ−ＥＧＤＥ粒子およびＥ３３３０を固定化した
ＳＧ−ＥＧＤＥ粒子１ｍｇをＢｕｆｆｅｒ Ｄのグリセ
ロール濃度を１０％に落としたＢｕｆｆｅｒ Ｄ’
（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ （ｐＨ７．９）， １０％
（Ｖ／Ｖ） ｇｌｙｃｅｒｏｌ， ０．１Ｍ ＫＣｌ，
０．２ｍＭ ＥＤＴＡ， １ｍＭ ＤＴＴ） ４００μ
ｌで３回洗浄した。Ｅ３３３０を固定化していないＳＧ
−ＥＧＤＥ粒子は、ＥＧＤＥのエポキシ基をマスクする
ために１ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．
４）に分散させ、少なくとも４℃、２４時間静置し、こ
れをＥ３３３０固定化粒子の比較対象として使用した。
この洗浄後のＥ３３３０非固定化および固定化粒子に、
ホスホセルロースで分画した細胞質画分のＰ．１、Ｐ．
３、Ｐ．５、Ｐ１．０を２００μｌを加え混合した後、
１０分おきにサンプルを撹拌しながら３０分間静置し
た。この間にＥ３３３０結合性タンパク質を粒子表面の
Ｅ３３３０に結合させ、遠心操作により上澄みを取り除
いた後、非特異的吸着をなるべく除くために、５００μ
ｌのＢｕｆｆｅｒ Ｄ’で３回洗浄した。

【００２９】その後、５０μｌの１Ｍ ＫＣｌを含んだ
Ｂｕｆｆｅｒ Ｄ’で３回溶出することにより、Ｅ３３
３０結合性タンパク質をＥ３３３０から解離・溶出させ
た。洗浄液及び溶出液は、−８０℃で保存した。

【００３０】（ｃ） Ｅ３３３０結合性タンパク質の検
出は、Ｅ３３３０固定化粒子およびコントロールとして
用いた非固定化粒子から得られた１〜３回目の溶出液２
５μｌを、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）することによって行った。結
合性タンパク質は、１回目で７０％以上、２回目を併せ
ると９０％以上が回収できる。なお、高塩濃度のために
泳動が乱れるのを防ぐため本実験では、４×ＳＤＳ ｓ
ａｍｐｌｅ ｄｙｅの代わりに４×ＳＤＳ ｓｐｅｃｉ
ａｌ ｄｙｅ （２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐ
Ｈ ６．８），５００ｍＭ β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔ
ｈａｎｏｌ （β−ＭＥ）， ８％ ＳＤＳ， ０．４
％ ＢＰＢ）を用いた。泳動したゲルは銀染色し、対照
群のサンプルと比較することで、Ｅ３３３０に特異的に
結合したタンパク質を同定した。その結果、Ｐ．５画分
に、対照群には見られない分子量約３８ｋＤａのタンパ
ク質バンドが鮮明に見られ、このタンパク質がＥ３３３
０に特異的に結合していることが示唆された。他の画分
では、１Ｍ ＫＣｌで溶出してくるタンパク質の間に対
照群との顕著な差は見られなかった。上記方法を繰り返
すことにより、Ｅ３３３０結合タンパク質を５μｇ得る
ことができた。

【００３１】実施例７ （Ｅ３３３０に対する特異的結
合の評価） Ｊｕｒｋａｔ細胞の細胞質および核抽出液のＰ．５画分
に存在する約３９ｋＤａタンパク質がＥ３３３０に特異
的に結合していることを確認するために２種類の実験を
行った。まず、結合の競合阻害実験を行った。細胞質画
分でホスホセルロースＰ．５画分（２００μｌ）をＳＧ
−ＥＧＤＥ粒子に加える段階で、粒子に固定されている
ＮＨ_２−Ｅ３３３０のモル数と等モルのフリーのＥ３３
３０あるいは、、その１０倍量のフリーのＮＨ_２−Ｅ３
３３０を同時に加え、それにより粒子上に固定化された
Ｅ３３３０に特異的吸着するタンパク性因子はフリーの
Ｅ３３３０あるいはＮＨ_２−Ｅ３３３０に吸着し、粒子
による回収率が下がるはずである。ただし、Ｅ３３３０
は水に不溶のため一度ＥｔＯＨに溶解し、Ｂｕｆｆｅｒ
Ｄ’で希釈したものを加えた（ＥｔＯＨの最終濃度は
２％）。その結果、３８ｋＤａのタンパク質の回収率が
下がることが確認され、このタンパク質は確かにＥ３３
３０に特異的に結合していることが示された。

【００３２】実施例８ 次に、ＳＧ−ＥＧＤＥ粒子に固定化するＮＨ_２−Ｅ３３
３０の量を変えて実験を行った。固定化量は、ＳＧ−Ｅ
ＧＤＥ粒子１ｍｇ当たり、最大０．４μｍｏｌのＥ３３
３０誘導体が固定化される。この条件下では、粒子表面
１ｍｍ^２に約５〜６分子のＥ３３３０が固定化されてい
る。本実験においては、固定化量が１ｍｇの粒子当た
り、０．２又は０．４μｍｏｌの場合で検討を行った
が、本発明においては、化合物の固定化量は、化合物の
性質、固定化条件等によって異なり特に限定されず、一
般に２〜３分子から約１００分子である。その結果、固
定化量が増加するに従って、３８ｋＤａのタンパク質の
回収率が増加することが確かめられた。特異的タンパク
質の評価は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて行った。

【００３３】実施例９ （Ｅ３３３０結合タンパク質の
アミノ酸配列の決定） 得られたＥ３３３０結合性タンパク質は、高濃度１．０
Ｍ ＫＣｌで溶出したので、混在するＫＣｌを除くため
に１リットルのＢｕｆｆｅｒ Ｄに対して４℃、２．５
時間の条件下で２回透析を行った。それを濃縮するため
に、透析後、サンプルを超遠心管 （ＢＥＣＫＭＡＮ：
ＮＯ． ３３１３７２）に移し、Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａ
ｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ （ＴＣＡ：ＭＥＲＣＫ）とＤｅ
ｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ （ＤＯＣ：Ｓｉｇｍ
ａ）をそれぞれ最終濃度が１０％、０．８ｍｇ／ｍｌと
なるように加えてよく撹拌し、氷上で３０分静置した。
これを２８Ｋｒｐｍ．、４℃、１５分間で超遠心 （Ｂ
ＥＣＫＭＡＮ：ＲｏｔｅｒＳＷ４１ Ｔｉ）し、その沈
殿物を１０ｍｌのアセトンに溶解させた。室温で１０分
間静置後、再度超遠心し、得られた沈殿物を氷上に１０
分間静置することで乾燥させ、濃縮した。

【００３４】最終的に、これを５０μｌの１×ＳＤＳ
ｓａｍｐｌｅ ｄｙｅに溶解し、サンプルチューブ（ｅ
ｐｐｅｎｄｏｒｆ：Ｎｏ． ００３０ １０２．００
２）に移した。この時、超遠心管に残っているサンプル
を回収するために、更に１０μｌの１×ＳＤＳ ｓａｍ
ｐｌｅ ｄｙｅで洗浄し、プールした。ＴＣＡとＤＯＣ
がサンプルに残存しているため、中和する目的で１Ｍの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．９）を３μｌ加えた
後、−８０℃で保存した。

【００３５】Ｅ３３３０結合性タンパク質のアミノ酸配
列分析を行うにあたってタンパク質をペプチドフラグメ
ント化した。まず、サンプルをｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｓｔａｎｄａｒｄ （ＢＩＯ−ＲＡ
Ｄ）と共に１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで
電気泳動した後、Ｍｉｎｉ ｔｒａｎｓ ｂｌｏｔｔｍ
ｏｄｕｌｅ ｋｉｔ （ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて、タ
ンパク質をポリアクリルアミドゲルからＰＶＤＦ膜
（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ：ｉｍｍｏｂｉｌｏｎｔｒａｎｓ
ｆｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ）にブロッティングした。あ
らかじめＰＶＤＦ膜は、１５秒間メタノールに、続いて
５分間以上ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ （１０ｍ
Ｍ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ （ｐＨ １１）、１０％メタ
ノール）に浸しておいた。ブロッティング装置の陽極側
を下にして順に、ファイバーパット２枚、３ＭＭペーパ
ー２枚、ＰＶＤＦ膜、ゲル、３ＭＭペーパー２枚、ファ
イバーパット２枚を泡が入らないように重ねた後、ｂｌ
ｏｔｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを満たした泳動槽に入れ
た。これを氷で冷却しながら３０分間０．３Ａの電流を
流し、タンパク質をＰＶＤＦ膜にブロッティングした。

【００３６】膜上のタンパク質を酵素消化するときは、
Ｌｙｓｉｌ Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（和光純薬工
業）を消化酵素として用いた。消化用緩衝液には２０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．８）、８％アセトニ
トリルを用い、酵素量は消化するタンパク質の１／１０
量（ｇ／ｇ）とした。まず１／２０量の酵素を加えて数
秒間撹拌振とうした後、さらに１／２０量の酵素を加え
て遮光して３７℃で一昼夜撹拌振とうした。反応終了
後、ＰＶＤＦ膜を吸い取らないように注意深く消化液を
採取し、残ったＰＶＤＦ膜を１００μｌの８％アセトニ
トリルで洗浄した。その洗浄液も同様に採取し、それら
をプールして、これを１５，０００×ｇ，室温、２分間
で遠心し、混在しているＰＶＤＦ膜を完全に沈澱させ取
り除いた。遠心上清をそのままＨｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒ
ｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐ
ｈｙ （ＨＰＬＣ）に投与すると親水性の高いペプチド
は、素通り画分に溶出してしまうため、遠心上清を減圧
下で濃縮しアセトニトリル濃度を下げた。これに０．１
％ Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＴＦ
Ａ）を加え、体積を２０５μｌとして逆相ＨＰＬＣ
（ＡＢＩ：ｍｏｄｅｌ １３０Ａ）にかけた。カラム
は、Ｃ８カラム （ＰＥＲＫＩＮ ＥＲＭＥＲ：０７１
１−００５６）を用い、流速５０μｌ／ｍｉｎ．、カラ
ム温度３５℃で展開した。溶出は、移動相０．１％ＴＦ
Ａ中でアセトニトリルの勾配を最初の５分間は０％、次
の３０分間は０〜３５％、最後の２０分間は３５〜７０
％にして行った。ペプチドのモニターは２１５ｎｍの紫
外吸収により行い、溶出されるペプチドはそのつど分取
し−８０℃で保存した。

【００３７】ペプチドのアミノ酸配列分析には、気相プ
ロテインシークエンサー（ＡＢＩ：ｍｏｄｅｌ ４７７
Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用いた。
Ｃａｒｒｉｅｒには、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ （ＡＢＩ）
を使用した。結果的に、３つのペプチド鎖のアミノ酸配
列が決定でき、それらは、ＧＬＤＷＶＫ／ＡＡＧＥＧＰ
ＡＬＹＥＤＰＰＤ／ＧＡＶＡＥＤＧＤＥＬという配列が
得られた。コンピューターによる解析により、それら配
列は、酸化還元に関与するレドックスタンパク質Ｒｅｆ
−１のＮ末端側にあるアミノ酸配列と全く一致した。ま
た、Ｒｅｆ−１は３１８個のアミノ残基を有し、分子量
が３８ｋＤａと報告されており、ここで分離・精製され
たタンパク質も同じ分子量を持っている。従って、Ｅ３
３３０結合性タンパク質はＲｅｆ−１である可能性が高
い。

【００３８】実施例１０ （Ｅ３３３０結合タンパク質
の遺伝子組換えによる製造） （ａ） Ｅ３３３０結合性タンパク質のｃＤＮＡクロー
ン化とその大腸菌組換えタンパク質のＥ３３３０への結
合能の解析は以下のように行った。決定したアミノ酸配
列から、Ｅ３３３０結合性因子がＲｅｆ−１である可能
性が極めて高いので、Ｒｅｆ−１のｃＤＮＡを作製し、
その組換えタンパク質を大腸菌で合成して、そのＥ３３
３０結合活性を検討した。

【００３９】（ｂ） まず、ＲＮＡの調製をした。調製
にあたり、予め前日に、超遠心管 （ＢＥＣＫＭＡＮ：
３３１３７２）、バケット （ＢＥＣＫＭＡＮ：ｆｏｒ
ＳＷ４１Ｔｉ）、バケットキャップ （ＢＥＣＫＭＡ
Ｎ：ｆｏｒ ＳＷ ４１Ｔｉ）を、２％ ａｂｓｏｌｖ
ｅ （ＤＵＰＯＮＴ；２０ｍｌを蒸留水で１リットルに
したもの）につけておき、混在するＲＮａｓｅ活性を出
来るだけ取り除く。これらは使用直前に蒸留水でよくす
すいでから使用した。４．２リットルまで培養したＪｕ
ｒｋａｔ細胞（７．６×１０^９ｃｅｌｌｓ）培養液を５
００ｍｌ遠心チューブに移し、５００×ｇ、４℃、５分
間遠心することによって、細胞を集めた。細胞は、ＰＢ
Ｓ（−）で２回洗浄した。洗浄時の遠心は５０ｍｌの遠
心チューブで行い、遠心の条件は、７００×ｇ、４℃、
５分間とした。この時、併せて細胞の体積（ＰＣＶ）を
計測した。

【００４０】この細胞をＰＣＶの１０倍量のグアニジウ
ム溶液（４Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｕｍｔｈｉｏｃｙａｎａ
ｔｅ， ０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５，
１％（Ｖ／Ｖ）β−ＭＥ）によく懸濁し、この懸濁液を
注射器（テルモ：ＳＳ−２０ＥＳ）を用いて１８Ｇ
（１．２ｍｍ）の注射針（テルモ：ＮＮ−１８３８Ｒ）
に２０回、２５Ｇ（０．５ｍｍ）の注射針（テルモ：Ｎ
Ｎ−２５２５Ｒ）に４０回通すことによりＤＮＡを切断
した。これに最終濃度０．５％となるように１０％ Ｎ
−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅを加えてよく撹拌
した後、あらかじめ９ｍｌのＣｓＣｌ／ＥＤＴＡ溶液
（５．７Ｍ ＣｓＣＬ， ０．０１Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ
７．５）を入れておいた超遠心管に３ｍｌずつ静かに
上層した。超遠心管をバケットに入れ、バケットキャッ
プを取り付けてからローター（ＳＷ４１Ｔｉ）に固定し
超遠心（３２Ｋｒｐｍ、２０℃、２４時間）を行った。

【００４１】上清を丁寧に取り除き、超遠心管の上部を
カッターで切断後、得られた沈殿物を７０％エタノール
で洗浄した。そして遠心管の底を１５０μｌのＴＥ／Ｓ
ＤＳ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．
６， １ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．１％ ＳＤＳ）で３回
洗浄することにより、沈殿物をＴＥ／ＳＤＳ溶液に溶解
した。これを２回、フェノール／クロロフォルム抽出し
てから、エタノール９００μｌ、３Ｍ ｓｏｄｉｕｍ
ａｃｅｔａｔｅ （ｐＨ ５．２） ３０μｌを加え使
用時まで−８０℃で保存した。濃度の測定時には、上記
の保存溶液の一部を分取して遠心（１５，０００×ｇ、
４℃、５分間）し、７０％エタノールで洗浄（１５，０
００×ｇ、４℃、５分間）後、ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒ
ｏｃａｒｂｏｎａｔｅ （ＤＥＰＣ）で処理した水（蒸
留水に最終濃度が０．１％になるようにＤＥＰＣを加え
撹拌後、一昼夜静置し、これを高圧滅菌し、室温保存し
た）に溶解したものをＤＵ−６４ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈ
ｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて２６０ｎｍの吸光度を測定
し、ＲＮＡ量を算出した。

【００４２】（ｃ） 次に、逆転写により鋳型１本鎖ｃ
DNAを調製した。上記の方法で得られたＲＮＡ（１０μ
ｇ）を分取して遠心（１５，０００×ｇ、４℃、５分
間）し、得られた沈澱を７０％エタノールで洗浄（１
５，０００×ｇ、４℃、５分間）した。これを９．８μ
ｌのＤＥＰＣ処理した水に溶解し、０．５μｇ／μｌの
Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）^１５ｐｒｉｍｅｒ （Ｐｒｏｍｅｇ
ａ：５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’）１
６０ｎｇを加えて７０℃で５分間加温する。５分後、す
ばやく氷上にサンプルを移し、それぞれ氷冷しておいた
Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ （Ｒｅｖｅｒｓｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ添付５×ＲＴ Ｂｕｆｆｅ
ｒを８μｌ、同じく添付の０．１Ｍ ＤＴＴを４μｌ、
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓを２μｌ、蒸留水１３μｌをそれ
ぞれ混合したもの）２８μｌ、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓ
ｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ （ＴａＫａＲａ：Ｒｉｂｏｎ
ｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）１μｌ、Ｒｅｖ
ｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ （ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬ：Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ ＲＮａｓｅ
Ｈ− Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｃｒｉｐｔａｓｅ）２
μｌをそれぞれこの順番で加えた。このサンプルをただ
ちに３７℃で１時間反応させて逆転写による鋳型１本鎖
ｃＤＮＡの伸長反応を行い、最後にｈｅａｔ ｂｌｏｃ
ｋにより９５℃で５分間加熱して反応を停止させた。な
お鋳型１本鎖ｃＤＮＡは使用時まで−３０℃で保存し
た。

【００４３】（ｄ） さらに、Ｒｅｆ−１翻訳領域をＬ
ｏｎｇ−ＰＣＲ法により増殖するためオリゴヌクレオチ
ドを合成した。合成したオリゴヌクレオチドの各塩基配
列は、以下の通りである。なお、各オリゴヌクレオチド
は名前に冠した制限酵素消化部位を持っている。 ５’Ｒｅｆ−１ ＸｈｏＩ ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＴ
ＣＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＣＣＧＡＡＧＣＧＴＧＧＧＡＡ
ＡＡＡＧ−３’ ３’Ｒｅｆ−１ ＢａｍＨＩ ｐｒｉｍｅｒ：５’−Ａ
ＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＧＴＧＣＴＡＧＧＴＡＴ
ＡＧＧＧＴ−３’

【００４４】合成したオリゴヌクレオチドを５５℃で８
時間加温し脱保護を行った。これを分注して真空乾燥
し、ＴＥ （１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．
９，１ｍＭ ＥＤＴＥ）を１０倍希釈したＢｕｆｆｅｒ
に溶解した。作製した１本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、上
記２種のオリゴヌクレオチドによりＰＣＲを行った。な
お、このＰＣＲにはキット（ＸＬ ＰＣＲ ｋｉｔ：Ｐ
ＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ）を用いた。反応溶液は２種
（Ｌｏｗｅｒ Ｌａｙｅｒ， Ｕｐｐｅｒ Ｌａｙｅ
ｒ）に分かれており、Ｌｏｗｅｒ Ｌａｙｅｒは５’末
端側および３’末端側プライマー各４０ｐｍｏｌずつ、
ｄＮＴＰｓを最終濃度０．８ｍＭ、Ｍｇ（ＯＡｃ）２を
最終濃度１．４ｍＭとして３．３×ＸＬ Ｂｕｆｆｅｒ
ＩＩ １２μｌを加えて全体積を４０μｌとした。一
方、Ｕｐｐｅｒ Ｌａｙｅｒは鋳型１本鎖ｃＤＮＡ １
μｌ、ｒＴｔｈ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ， Ｘ
Ｌ ４Ｕ、３．３×ＸＬ ＢｕｆｆｅｒＩＩ １８μｌ
を加えて、全体積を６０μｌとした。

【００４５】まず、サンプル管のＬｏｗｅｒ Ｌａｙｅ
ｒにＧＥＭ １００ ＷＡＸ（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥ
Ｒ）をのせ、遺伝子増幅装置で８０℃で５分間加熱後、
２５℃で１分間冷却してＷＡＸをＬｏｗｅｒ Ｌａｙｅ
ｒ上に固化させた。これにＵｐｐｅｒ Ｌａｙｅｒを加
え、遺伝子増幅装置を用いて９４℃で１分間、（９４℃
で１５秒間、６０℃で１０分間）を１６サイクル、（９
４℃で１５秒間、６０℃で１０分間（１サイクル毎に１
５秒間伸びる））を１２サイクル、７２℃で１０分とい
うスキームで反応を行った。反応終了後、上層で固化し
たＷＡＸに穴を開けて反応溶液を抽出し、クロロホルム
抽出、エタノール沈澱を行った。この増幅したＤＮＡ断
片をＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ（ＴＯＹＯＢＯ）で消化し
て、そのままアガロ−スゲル電気泳動した後、ゲルから
の切り出し、フェノール／クロロホルム抽出、エタノー
ル沈澱することによりＤＮＡ断片を純化した。

【００４６】（ｅ） 大腸菌発現ベクターには、ｐＥＴ
１４ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用し、上記のＤＮＡ断片
を、切り出して純化したｐＥＴ１４ｂ ＸｈｏＩ／Ｂａ
ｍＨＩ消化断片と連結することによって、Ｒｅｆ−１野
生型組換えタンパク質を発現する大腸菌発現プラスミド
（ｐＥＴ／Ｒｅｆ）を構築した。このｐＥＴ１４ｂ由来
の大腸菌発現プラスミドを保持する大腸菌は、６個のＨ
ｉｓｔｉｄｉｎｅからなるペプチドがそのＮ末端側に存
在するＨｉｓ−Ｔａｇ融合組換えタンパク質を発現す
る。

【００４７】実施例１１ （Ref-1とＥ３３３０との結
合能の確認） （ａ） この組換えタンパク質を用いて、Ｅ３３３０に
対する結合能をＥ３３３０固定化粒子を用いて検討する
と、確かにＲｅｆ−１組換えタンパク質はＥ３３３０と
特異的に結合することが確認された。また、^１４Ｃで標
識したＥ３３３０を用いたＦａｒ ｗｅｓｔｅｒｎ法で
も、Ｅ３３３０がRef-1に結合することが確認されたこ
とから、Ｒｅｆ−１はＥ３３３０の細胞内レセプターで
あると言えよう。 （ｂ） Ｒｅｆ−１は、そのＮ末端側にレドックス活性
を有するドメインを持ち、そのＣ末端側には脱プリン／
脱ピリミジン化（Ａｐｕｒｉｎｉｃ／Ａｐｙｒｉｍｉｄ
ｉｎｉｃ）したＤＮＡの１本鎖を切断して、ニックを入
れる活性（ＡＰｎｕｃｌｅａｓｅ活性）を有するドメイ
ンを持つ。そこで、Ｅ３３３０がそれらの活性を阻害す
るか否かを次に検討した。

【００４８】まず、ＡＰ ｎｕｃｌｅａｓｅ活性に関し
ては、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ^＋ＤＮ
Ａ（５０μｇ）を５０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ
３．５）で、６０℃で１５分間処理後に、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）にて透析（４℃、一
昼夜）を行った。このＡＰプラスミドＤＮＡは超ラセン
構造（ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ ｃｉｒｕｌａｒ ＤＮ
Ａ）を呈している。このＤＮＡをヌクレアーゼバッファ
ー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．０），
５ｍＭ ＭｇＣｌ_２， １ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．０
１％ ＮＰ−４０）に懸濁して、これに組換えＲｅｆ−
１を加えると、確かにニックが入り、弛緩した環状ＤＮ
Ａ（ｏｐｅｎ ｃｉｒｃｕｌａｒ ＤＮＡ）となる。し
かし、図３に示すように、このＲｅｆ−１のＡＰ ｎｕ
ｃｌｅａｓｅ活性は、Ｅ３３３０により阻害されない。

【００４９】（ｃ） 次に、Ｒｅｆ−１のレドックス活
性に及ぼす影響を検討した。その結果を図４に示す。こ
れを行うにあたって、転写因子ＮＦ−κＢはそのアミノ
酸配列の中で複数個のシステイン（Ｃｙｓ）残基を有し
ており、それらがＳ−Ｓ結合した酸化状態の場合とそれ
ぞれがＳＨ基になった還元状態の二つの場合がある。そ
こで、還元剤として知られているジチオスレイトール
（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ， ＤＴＴ）でＮＦ−
κＢを処理すると、ＮＦ−κＢは還元状態になりＤＮＡ
への結合能が増加することをゲルシフト法により示し
た。そこで、レドックス活性を有するＲｅｆ−１をＪｕ
ｒｋａｔ細胞から部分精製したＮＦ−ｋＢに加えるとゲ
ルシフト法で確かにＤＮＡに対する結合能が増加する。
さらに、このＲｅｆ−１によるＮＦ−κＢのＤＮＡ結合
活性の促進は、Ｅ３３３０を反応液に添加することによ
り抑制される。しかし、ＤＴＴによるＮＦ−κＢのＤＮ
Ａ結合活性の増加はＥ３３３０は阻害しない。従って、
Ｅ３３３０がＮＦ−κＢのＤＮＡへの結合能を特異的に
抑制することを示した。

【００５０】（ｄ） ＮＦ−κＢは、２つのサブユニッ
ト（ｐ６５とｐ５０）からなるへテロ２量体である。そ
れぞれの分子量は、６５ｋＤａおよび５０ｋＤａであ
る。バキュロウイルスの発現系を用いて、それらのＨｉ
ｓ−ｔａｇ組換えタンパク質を調製し、ｐ６５とｐ５０
のいずれにＥ３３３０が作用するかをゲルシフト法で検
討した。その結果を図５に示す。ｐ６５／ｐ６５ホモ２
量体は、ＤＴＴ添加による還元状態ではＤＮＡへの結合
能が著しく亢進するが、その効果はＲｅｆ−１添加では
見られない。しかし、ｐ５０／ｐ５０ホモ２量体および
ｐ６５／ｐ５０ヘテロ２量体のＤＮＡへの結合能は、Ｄ
ＴＴ添加でも組換えＲｅｆ−１でも亢進する。従って、
Ｒｅｆ−１はＮＦ−κＢサブユニットの中のｐ５０に作
用することがわかった。このｐ５０／ｐ５０あるいはｐ
６５／ｐ５０の２量体のＲｅｆ−１によるＤＮＡへの結
合能の亢進は、Ｅ３３３０により抑制される。ＮＦ−κ
Ｂは特異塩基配列を認識してそれに結合する転写因子
で、ＤＮＡへの結合は転写因子として機能するための必
要条件である。その段階がＲｅｆ−１により調節されて
いるので、Ｒｅｆ−１は少なくともＤＮＡ結合に関して
転写因子ＮＦ−κＢを活性化する細胞内因子であり、し
かも、Ｅ３３３０がその活性化を阻害することを明らか
にした。

【００５１】（ｅ） また、Ｒｅｆ−１がＮＦ−κＢの
ｐ５０に特異的に結合することを確証するために、ＧＳ
Ｔ ｐｕｌｌ ｄｏｗｎアッセイを行った。その結果か
ら、図６のようにＲｅｆ−１がＧＳＴ−ｔａｇのｐ５０
（ＧＳＴ−ｐ５０）に確かに結合することが示され
る。

【００５２】実施例１２ （Ｒｅｆ−１変異型組換えタ
ンパク質の作製） （ａ） Ｒｅｆ−１のＥ３３３０への結合を確証するた
めに、ｐＥＴ／Ｒｅｆを用いて、一連のＲｅｆ−１のＮ
末端およびＣ末端からの欠失変異株を下記のとおり作製
した。そして、それらの組換えタンパク質を大腸菌で発
現させ、ニッケルカラム及びグルタチオンカラムで精製
し、Ｅ３３３０固定化粒子に結合するか否かを検討し
た。野生型を含むＲｅｆ−１の変異型組換え体の模式図
を図７に示した。

【００５３】（ｂ）ｐＥＴ／ＲｅｆｄＣ７６、ｐＥＴ／
ＲｅｆｄＣ９１、ｐＥＴ／ＲｅｆｄＣ１６３、ｐＥＴ／
ＲｅｆｄＣ１８２の作製 作製したｐＥＴ／Ｒｅｆの１０μｇをＢａｍＨＩとＡａ
ｔＩＩ（ＴＯＹＯＢＯ）で消化し、フェノール／クロロ
ホルム抽出、エタノール沈殿を行った。このｐＥＴ／Ｒ
ｅｆ ＢａｍＨＩ／ＡａｔＩＩ消化断片をＥｘｏｎｕｃ
ｌｅａｓｅ ＩＩＩ（ＥｘｏＩＩＩ： ＴａＫａＲａ）
に添付の１０×ＥｘｏＩＩＩ Ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８）， ５０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ_２， １００ｍＭ β−ＭＥ）を１０倍希釈した
Ｂｕｆｆｅｒ １００μｌに溶解した。そしてＥｘｏＩ
ＩＩ １８０Ｕを加えて、２５℃でそれぞれ５分間、１
０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、４
０分間、５０分間、６０分間反応させ、ｐＥＴ／Ｒｅｆ
ＢａｍＨＩ／ＡａｔＩＩ消化断片を、３’→５’方向
に分解した。ＥｘｏＩＩＩはＺｎ＋により阻害されるこ
とから、反応の停止は、Ｍｕｎｇ Ｂｅｅｎ Ｎｕｃｌ
ｅａｓｅ （ＴａＫａＲａ）に添付の１０×Ｍｕｎｇ
ｂｅｅｎ Ｂｕｆｆｅｒ （３００ｍＭ ＣＨ_３ＣＯＯ
Ｎａ （ｐＨ４．６）， １Ｍ ＮａＣｌ， １０ｍＭ
（ＣＨ_３ＣＯＯ）_２Ｚｎ， ５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏ
ｌ）を１０倍希釈したＢｕｆｆｅｒを１００μｌずつサ
ンプリングすることで行った。サンプリングした反応液
は６５℃で５分加温して、完全に酵素を失活させた。次
にこの反応液にＭｕｎｇ Ｂｅｅｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ
５０Ｕを加え、３７℃で３０分間反応させることによ
り、ＥｘｏＩＩＩにより１本鎖化した部分のＤＮＡを分
解した。そしてフェノール／クロロホルム抽出、エタノ
ール沈殿を行い、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔによ
り末端を修復（ＤＮＡの平滑末端化）して完全な平滑末
端にした。これをフェノール／クロロホルム抽出、エタ
ノール沈殿後、ＸｈｏＩで消化を行った。この操作によ
り、Ｎ末端側はＸｈｏＩの消化末端、Ｃ末端側は平滑末
端であり、Ｃ末端側が様々の長さに削られたＲｅｆ−１
の翻訳領域を得た。この様々なＤＮＡ断片と、切り出し
て純化したｐＥＴ１４ｂ ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ消化断
片と、ＢａｍＨＩ Ｌｉｎｋｅｒの３断片を連結するこ
とによって、Ｒｅｆ−１変異型組換え体の大腸菌発現プ
ラスミドを構築した。ＢａｍＨＩＬｉｎｋｅｒの塩基配
列は以下の通りであり、このＬｉｎｋｅｒにはどのフレ
ームでも終止コドンがくるように設計した。また、作製
の方法は、上記で作製した各転写因子の結合配列をもつ
２本鎖ＤＮＡと同様である。 ＢａｍＨＩ Ｌｉｎｋｅｒ：５’−ＴＡＡＣＴＡＡＣＴＡＧ−３’ ：３’−ＡＴＴＧＡＴＴＧＡＴＣＣＴＡＧ−５’ Ｒｅｆ−１変異型組換え体大腸菌発現プラスミドの名前
は、翻訳後のＣ末端側からの欠失アミノ酸の長さが短い
ものから順にｐＥＴ／ＲｅｆｄＣ７６（Ｃ末端側から７
６アミノ酸を欠失）、ｐＥＴ／ＲｅｆｄＣ９１（Ｃ末端
側から９１アミノ酸を欠失）、ｐＥＴ／ＲｅｆｄＣ１６
３（Ｃ末端側から１６３アミノ酸を欠失）、ｐＥＴ／Ｒ
ｅｆｄＣ１８２（Ｃ末端側から１８２アミノ酸を欠失）
とした。

【００５４】（ｃ）ｐＥＴ／ＲｅｆｄＣ２３０、ｐＥＴ
／ＲｅｆｄＣ２４７、ｐＥＴ／ＲｅｆｄＣ２７８の作製 上記と同様の方法により、ｐＥＴ／ＲｅｆｄＣ２３０
（Ｃ末端側から２３０アミノ酸を欠失）、ｐＥＴ／Ｒｅ
ｆｄＣ２４７（Ｃ末端側から２４７アミノ酸を欠失）、
ｐＥＴ／ＲｅｆｄＣ２７８（Ｃ末端側から２７８アミノ
酸を欠失）を構築した。

【００５５】（ｄ）ｐＥＴ／ＲｅｆｄＮ４１、ｐＥＴ／
ＲｅｆｄＮ８１、ｐＥＴ／ＲｅｆｄＮ１２１、ｐＥＴ／
ＲｅｆｄＮ１６１の作製 Ｎ末端側が欠損しているこの一連のＲｅｆ−１変異型大
腸菌発現組換え体はオリゴヌクレオチドを合成しＬｏｎ
ｇ−ＰＣＲ法により増幅した。合成したオリゴヌクレオ
チドの各塩基配列は、以下の通りである。なお、各オリ
ゴヌクレオチドは名前に冠した制限酵素消化部位をもっ
ている。 ５’ＲｅｆｄＮ４１ ＸｈｏＩ ｐｒｉｍｅｒ：５’−
ＡＴＧＣＣＴＣＧＡＧＡＴＧＣＣＡＧＣＣＣＴＧＴＡＴ
ＧＡＧＧＡＣＣ−３’ ５’ＲｅｆｄＮ８１ ＸｈｏＩ ｐｒｉｍｅｒ：５’−
ＡＴＧＣＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＡＡＡＧ
ＧＡＡＧＡＡＧＣＣ−３’ ５’ＲｅｆｄＮ１２１ ＸｈｏＩ ｐｒｉｍｅｒ：５’
−ＡＴＧＣＣＴＣＧＡＧＡＴＧＣＣＴＴＣＧＧＡＣＡＡ
ＧＧＡＡＧＧＧＴ−３’ ５’ＲｅｆｄＮ１６１ ＸｈｏＩ ｐｒｉｍｅｒ：５’
−ＡＴＧＣＣＴＣＧＡＧＡＴＧＴＴＴＧＡＣＴＣＧＴＴ
ＴＧＴＧＣＴＧＧＴＡ−３’ 合成したオリゴヌクレオチドを５５℃で８時間加温し脱
保護を行った。これを分注して真空乾燥し、ＴＥ （１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．９）， １ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）を１０倍希釈したＢｕｆｆｅｒに溶解し
た。以下、上記の４種類のオリゴヌクレオチドと３’Ｒ
ｅｆ−１ ＢａｍＨＩ ｐｒｉｍｅｒの組合せにより先
に述べた方法と全く同様にしてＰＣＲを行った。増幅し
たＤＮＡ断片をそれぞれＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ （ＴＯ
ＹＯＢＯ）で消化して、そのままアガロースゲル電気泳
動した後、ゲルからの切り出し、フェノール／クロロホ
ルム抽出、エタノール沈殿することにより純化した。こ
れらのＤＮＡ断片を、切り出して純化したｐＥＴ１４ｂ
ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ消化断片及び、ＢａｍＨＩ Ｌ
ｉｎｋｅｒと連結することによって、それぞれｐＥＴ／
ＲｅｆｄＮ４１（Ｎ末端側から４１アミノ酸を欠失）、
ｐＥＴ／ＲｅｆｄＮ８１（Ｎ末端側から８１アミノ酸を
欠失）、ｐＥＴ／ＲｅｆｄＮ１２１（Ｎ末端側から１２
１アミノ酸を欠失）、ｐＥＴ／ＲｅｆｄＮ１６１（Ｎ末
端側から１６１アミノ酸を欠失）を構築した。

【００５６】（ｅ）ｐＥＴ／ＲｅｆｄＮ４１ｄＣ１６
３、ｐＥＴ／ＲｅｆｄＮ４１ｄＣ１８２、ｐＥＴ／Ｒｅ
ｆｄＮ４１ｄＣ２１３の作製 ｐＥＴ／ＲｅｆｄＮ４１をＰｖｕＩＩとＸｈｏＩで消化
した。これをアガロースゲル電気泳動して翻訳領域だけ
を含むものを切り出した。またｐＥＴ／ＲｅｆｄＣ１６
３、ｐＥＴ／ＲｅｆｄＣ１８２、ｐＥＴ／ＲｅｆｄＣ２
１３を、ＰｖｕＩＩとＢａｍＨＩで消化して翻訳領域だ
けを含むものをアガロースゲルから切り出し、それぞれ
調製した。さらに上記と同様の方法により、これらをそ
れぞれ、連結し、ｐＥＴ／ＲｅｆｄＮ４１ｄＣ１６３
（Ｎ末端側から４１アミノ酸を欠失、Ｃ末端側から１６
３アミノ酸を欠失）、ｐＥＴ／ＲｅｆｄＮ４１ｄＣ１８
２（Ｎ末端側から４１アミノ酸を欠失、Ｃ末端側から１
８２アミノ酸を欠失）、ｐＥＴ／ＲｅｆｄＮ４１ｄＣ２
１３（Ｎ末端側から４１アミノ酸を欠失、Ｃ末端側から
２１３アミノ酸を欠失）を構築した。

【００５７】（ｆ）ｐＥＴ／ＲｅｆｄＮ５１ｄＣ１８
２、ｐＥＴ／ＲｅｆｄＮ６１ｄＣ１８２、ｐＥＴ／Ｒｅ
ｆｄＮ７１ｄＣ１８２、ｐＥＴ／ＲｅｆｄＮ８１ｄＣ１
６３、ｐＥＴ／ＲｅｆｄＮ８１ｄＣ１８２の作製 上記と同様の方法により、それぞれの欠失変異株を構築
した。

【００５８】実施例１３ （Ｅ３３３０に対するＲｅｆ
−１変異型大腸菌組換え体の結合評価） まず、それぞれ大腸菌で発現させたＲｅｆ−１野生型組
換え体及び変異型組換え体をＨｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓ
ｉｎまたはＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ ４Ｂを用いて精製した。そして精製したそれぞれの
タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてラッピドステイ
ン ＣＢＢを用いてクマシー染色を行った。そのときの
結果を図８及び図９に示した。図８では一連のＣ末端か
らの欠失変異体を示し、図９では一連のＮ末端からの欠
失変異体と、Ｃ末端とＮ末端の両側から欠失させた変異
体を示す。図８ではレーン１から順番に野生型（Ｗ
Ｔ）、ｄｃ５０、ｄＣ７６、ｄＣ９１、ｄｃ１５７、ｄ
Ｃ１６３、ｄＣ１８２、ｄＣ２１３、ＧＳＴ−ｄＣ２１
３を泳動しており、それぞれのおおよその分子量は、４
０ＫＤａ、３７ＫＤａ、３６ＫＤａ、３５ＫＤａ、２８
ＫＤａ、２６ＫＤａ、２３ＫＤａ、１９ＫＤａ、４２Ｋ
Ｄａであった。また図９ではレーン１から順番に野生型
（ＷＴ）、ｄＮ４１、ｄＮ８１、ｄＮ１２１、ｄＮ１６
１、ＧＳＴ−ｄＮ８１ｄＣ１８２、ＧＳＴ−ｄＮ４１ｄ
Ｃ２１３、ＧＳＴ−ｄＮ８１ｄＣ２１３、ＧＳＴを泳動
しており、それぞれのおおよその分子量は、４０ＫＤ
ａ、３６ＫＤａ、３２ＫＤａ、２８ＫＤａ、２２ＫＤ
ａ、３６ＫＤａ（レーン７のすぐ左側のバンド）、３７
ＫＤａ、３３ＫＤａ、２８ＫＤａであった。

【００５９】実施例１４ （Ｒｅｆ−１変異型組換え体
を用いたＥ３３３０結合領域の同定） どのＲｅｆ−１変異型組換え体がＥ３３３０に結合する
かを検討し、その結果からＥ３３３０の結合領域を同定
するために、Ｅ３３３０固定化ＳＧ粒子を用いた結合実
験を行った。実験のスキームは図２で示したものと同様
に行った。なお、本実験では２通りの溶出を行った。１
つは、精製した各Ｒｅｆ−１欠失変異体の２μｇをＥ３
３３０固定化ＳＧ粒子と混合し、氷中で３０分間静置
し、粒子に結合してくるタンパク質を１Ｍ ＫＣｌを含
んだ溶出液で溶出した。最後に、それぞれの溶出液を１
２．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、銀染色により検
出を行った。もう１つは、精製した各Ｒｅｆ−１欠失変
異体の２μｇをＥ３３３０固定化ＳＧ粒子と混合し、氷
中で３０分間静置し、それぞれタンパク質を結合させた
粒子に１×ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｄｙｅを加え、その
まま直接煮沸することにより、粒子と結合するタンパク
質を溶出した。その後、１２．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ、クマシー染色を行った。その結果、以下に示す変異
型組換え体がＥ３３３０固定化ＳＧ粒子に結合している
ことが示唆された。まず、１Ｍ ＫＣｌ溶出液を用いた
方法では、野生型（約４０ＫＤａ）、ｄＣ７６（約３６
ＫＤａ）、ｄＣ９１（約３５ＫＤａ）、ｄＣ１６３（約
２６ＫＤａ）、ｄＣ１８２（約２３ＫＤａ）、ｄＣ２１
３（約１９ＫＤａ）、ＧＳＴ−ｄＣ２１３（約４２ＫＤ
ａ）であった。また、直接煮沸した方法では、野生型
（約４０ＫＤａ）、ｄＮ４１（約３６ＫＤａ）、ｄＮ８
１（約３２ＫＤａ）、ＧＳＴ−ｄＮ８１ｄＣ１８２（約
３６ＫＤａ）、ＧＳＴ−ｄＮ８１ｄＣ２１３（約３３Ｋ
Ｄａ）であった。これらの結果を図１０及び図１１に示
した。

【００６０】上記の結果から、Ｒｅｆ−１は全長３１８
個のアミノ酸残基からなるタンパク質であるが、Ｃ末端
から２３１個目（Ｎ末端から８８番目）以降のアミノ酸
残基を欠損するとＥ３３３０に結合しなくなり、Ｎ末端
から７２個目までのアミノ酸残基を欠損するとＥ３３３
０に結合しなくなることから、図１２に示すように少な
くとも７２〜８８番目のアミノ酸配列がＥ３３３０の結
合に関与していることが明らかになった。実際に、この
領域（７２ａ．ａ．−８８ａ．ａ．）のみを有する組換
えタンパク質を合成して、Ｅ３３３０固定化粒子を用い
て検討すると、Ｅ３３３０と結合することが確認でき
た。これらは、Ｅ３３３０固定化粒子を用いて細胞内に
存在するＥ３３３０レセプターを分離・精製できたこと
を示すものであり、本発明がタンパク質の分離精製にき
わめて有用であることが明らかである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、表面がグリシジルメタクリレートで覆
われた（表面にグリシジル基が突出した）スチレン−グ
リシジルメタクリレート重合体及びスペーサーが結合し
た、表面がグリシジルメタクリレートで覆われたスチレ
ン−グリシジルメタクリレート重合体の製造方法を示す
略図である。

【図２】図２は、本発明にかかるミクロスフィアによる
タンパク質の分離方法を示す略図である。

【図３】図３は、（ａ）がＥ３３３０によるＲｅｆ−１
のＡＰエンドヌクレアーゼ活性への影響を示すものであ
り、（ｂ）がＮＨ_２−Ｅ３３３０によるＲｅｆ−１のＡ
Ｐエンドヌクレアーゼ活性への影響を示すものである。

【図４】図４は、ｒＲｅｆ−１によるＮＦ−κＢのＤＮ
Ａ結合活性の促進及びＥ３３３０によるｒＲｅｆ−１活
性の抑制を示す。

【図５】図５は、ｒ−ｐ６５及び／又はｒ−ｐ５０のＤ
ＮＡへの結合能におけるｒＲｅｆ−１の影響を示す。

【図６】図６は、ＧＳＴ ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ アッセ
イの手順と結果を示す。

【図７】図７は、Ｒｅｆ−１の各欠失変異株の模式図で
ある。

【図８】図８は、Ｅ３３３０に対するＲｅｆ−１大腸菌
組換え体の結合評価の結果である。

【図９】図９は、Ｅ３３３０に対するＲｅｆ−１大腸菌
組換え体の結合評価の結果である。

【図１０】図１０は、各Ｒｅｆ−１変異型欠失株を用い
たＥ３３３０への結合領域の同定の結果を示す。

【図１１】図１１は、各Ｒｅｆ−１変異型欠失株を用い
たＥ３３３０への結合領域の同定の結果を示す。

【図１２】図１２は、各変異型欠失株により同定された
Ｒｅｆ−１のＥ３３３０への結合領域を示す模式図であ
る。

フロントページの続き (56)参考文献 特開 平４−218772（ＪＰ，Ａ) Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．, Ｖｏｌ．291，Ｎｏ．２，ｐｐ．121− 127（1995) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 1/14 C07K 14/00 C07K 14/705 C12N 11/08 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】表面がグリシジルメタクリレートで覆われ
   たスチレン−グリシジルメタクリレート重合体にスペー
   サーを介して生理活性を有する化合物を結合させて、当
   該生理活性を有する化合物に付着する物質をスクリーニ
   ングする方法。
2. 【請求項２】生理活性を有する化合物、又は生理活性を
   有する化合物に付着する物質が、受容体である請求項１
   に記載の方法。