JP2004000282A - 酵母におけるｇタンパク質結合受容体の発現 - Google Patents

酵母におけるｇタンパク質結合受容体の発現 Download PDF

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Abstract

【課題】哺乳類Ｇタンパク質結合受容体の遺伝暗号を指定する第１の異種ＤＮＡ配列および哺乳類Ｇタンパク質αサブユニット（哺乳類Ｇα）の遺伝暗号を指定する第２の異種ＤＮＡ配列を含む形質転換した酵母細胞を作るのに有用な新規なＤＮＡ発現ベクターを得る。
【解決手段】本発明で開示する新規なＤＮＡ発現ベクターは、少なくとも酵母Ｇタンパク質結合受容体の一番端のアミノ末端暗号配列のフラグメントから成る第１セグメントを含む。第２セグメントは第１セグメントの下流（さらに正確な読み取り枠内）に配置し、異種Ｇタンパク質結合受容体を暗号化するＤＮＡ配列から成る。得られる酵母細胞では、第１および第２の異種ＤＮＡ配列は発現されるが、内因性Ｇタンパク質αサブユニット（酵母Ｇα）を発現しないようにすることができる。これらの細胞は細胞内でＧαがＧβγから解離する速度に影響を与える化合物をスクリーニングするのに有用である。
【選択図】図１

Description

　本発明はＮＩＨ助成HL16037 の下に米国政府の支援により行われた。本発明の所定の権利は米国政府が所有する。
発明の分野
　本発明は異種Ｇタンパク質結合受容体を発現する酵母細胞、かかる細胞を作るのに有用なベクター、およびこれらのものを用いる方法に関する。
発明の背景
　種々の細胞外シグナル (例えば、神経伝達物質、ホルモン、臭気物質、光) の作用は７種のトランスメンブラン領域を有する受容体（Ｇタンパク質結合受容体）およびヘテロ三量体(heterotrimeric)グアニンヌクレオチド結合性調節タンパク質（Ｇタンパク質） により媒介される（例えば、非特許文献１及び２参照）。かかるＧタンパク質媒介シグナル系は酵母およびヒトのような異なる生物体で確認されている（例えば、非特許文献１、２及び３参照）。β2 アドレナリン受容体（βＡＲ）は哺乳類細胞内のリガンド結合性受容体の７種のトランスメンブランセグメントの原型である。エピネフリンまたはノルエピネフリンに対する応答で、βＡＲは細胞内でアデニル酸シクラーゼおよびサイクリックアデノシン一リン酸産生を交互に刺激するＧタンパク質、Ｇs を活性化する（例えば、非特許文献１及び２参照）。酵母内でＧタンパク質結合フェロモン受容体はａおよびα半数体細胞型が接合 (融合) してａ／α二倍体を形成するようになる発生プログラムを制御する（例えば、非特許文献３及び４参照）。
エイチ．ドールマン(H.Dohlman) 、エム．キャロン(M.Caron) 、およびアール．レフコウィッツ(R.Lefkowittz)の「Biochemistry」26、2657ページ(1987) エル．ストライヤー(L.Stryer)およびエイチ．ボーン(H.Bourne)の「Ann.Rev.Cell Biol.」 2、 391ページ(1986) ケー．ブルマー(K.Blumer)およびジェイ．トーナー(J.Thorner) の「Annu.Rev.Physiol. 」 (出版中) アイ．ヘルスコウィッツ(I.Herskowitz)の「Microbiol.Rev.」52、 536ページ(1988)
　本発明は酵母における異種Ｇタンパク質結合受容体の発現について本発明者らが行った長年の研究に基づいている。
発明の開示
　本発明の第１の観点は哺乳類Ｇタンパク質結合受容体の遺伝暗号を指定する第１の異種ＤＮＡ配列および哺乳類Ｇタンパク質αサブユニット（哺乳類Ｇα）の遺伝暗号を指定する第２の異種ＤＮＡ配列を含む形質転換した酵母細胞である。第１および第２の異種ＤＮＡ配列はこの細胞内で発現させることができるが、この細胞は内因性Ｇタンパク質αサブユニット（酵母Ｇα）を発現することができない。この細胞はフェロモン応答プロモータおよびフェロモン応答プロモータから下流に配置しさらに効果的に結合させた指示遺伝子から成る第３の異種ＤＮＡ配列を含む。
　本発明の第２の観点は細胞においてＧαがＧβγから解離する速度に影響を与える化合物の能力を試験する方法である。この方法は：上述のように形質転換した酵母細胞を供給し；化合物を細胞に接触させ；さらに次いで細胞においてＧαがＧβγから解離する速度を検出することから成る。細胞は水溶液中に供給される場合があり、水溶液に化合物を添加することにより接触工程を実施した。
　本発明の第３の観点は酵母細胞の細胞膜中にトランスメンブランタンパク質を発現させることができるＤＮＡ発現ベクターである。ベクターは少なくとも酵母Ｇタンパク質結合受容体の一番端のアミノ末端暗号配列のフラグメントから成る第１セグメントを含む。第２セグメントは第１セグメントの下流（さらに正確な読み取り枠内）に配置し、異種Ｇタンパク質結合受容体を暗号化するＤＮＡ配列から成る。
　本発明の第４の観点は上述のようなベクターにより形質転換した酵母細胞である。
発明の詳細な記載
　ここでヌクレオチド塩基は次のように略記する：
　　Ａ＝アデニン　　　　　　　　Ｇ＝グアニン
　　Ｃ＝シトシン　　　　　　　　Ｔ＝チミン
　ここでアミノ酸残基は次のように３文字または１文字で略記する：
　　Ａｌａ；Ａ＝アラニン　　　　Ｌｅｕ；Ｌ＝ロイシン
　　Ａｒｇ；Ｒ＝アルギニン　　　Ｌｙｓ；Ｋ＝リジン
　　Ａｓｐ；Ｎ＝アスパラギン　　Ｍｅｔ；Ｍ＝メチオニン
　　Ａｓｐ；Ｄ＝アスパラギン酸　Ｐｈｅ；Ｆ＝フェニルアラニン
　　Ｃｙｓ；Ｃ＝システイン　　　Ｐｒｏ；Ｐ＝プロリン
　　Ｇｌｎ；Ｑ＝グルタミン　　　Ｓｅｒ；Ｓ＝セリン
　　Ｇｌｕ；Ｅ＝グルタミン酸　　Ｔｈｒ；Ｔ＝スレオニン
　　Ｇｌｙ；Ｇ＝グリシン　　　　Ｔｒｐ；Ｗ＝トリプトファン
　　Ｈｉｓ；Ｈ＝ヒスチジン　　　Ｔｙｒ；Ｙ＝チロシン
　　Ｉｌｅ；Ｉ＝イソロイシン　　Ｖａｌ；Ｖ＝バリン
　ここで使用した「哺乳類」とは任意の哺乳類（例えば、ヒト、マウス、ラット、およびサル）を意味する。
　ここで「異種」とは酵母に対して用い、従って酵母以外（例えば、哺乳類、鳥類、両生類）に由来するＤＮＡ配列、タンパク質、および他の物質、または酵母中で本来見出せないこれらの組み合わせを意味する。
　ここで「上流」および「下流」とは転写および翻訳の方向を意味するものとし、他の配列の前に転写または翻訳される配列は他の配列の上流という。
　Ｇタンパク質は３種のサブユニット：グアニルヌクレオチド結合αサブユニット；βサブユニット；およびγサブユニットから成る。ＧＴＰかＧＤＰのどちらが結合するかに依存して、Ｇタンパク質は２種の形態のいずれかになる。ＧＤＰが結合する場合Ｇタンパク質は不活性なヘテロ三量体、Ｇαβγ複合体として存在する。ＧＴＰが結合する場合αサブユニットは解離し、Ｇβγ複合体を放つ。重要なことに、Ｇαβγ複合体が細胞膜中の活性化されたＧタンパク質結合受容体と効果的に結合する場合、ＧＴＰを結合したＧＤＰに交換する速度は上昇し、従って、結合したαサブユニットがＧβγ複合体から解離する速度は増加する。この事象の基本的な機構は非常に多くの異なる細胞シグナル現象の基礎を形成する。一般にはStryerおよびBourneの「前記」を参照。
　任意の哺乳類Ｇタンパク質結合受容体、およびこれら受容体を暗号化するＤＮＡ配列を本発明の実施に用いることができる。かかる受容体の例には、ドーパミン受容体、ムスカリン性コリン作動性受容体、αアドレナリン受容体、βアドレナリン受容体、オピエート受容体、カンナビノイド受容体、およびセロトニン受容体が含まれるが、これらに限定されるものではない。ここで使用する受容体とは上記の受容体のサブタイプ、ならびにこれらの変異体および異種相同物、またこれらのものを暗号化したＤＮＡ配列をも含むものである。
　ヒトＤ1 ドーパミン受容体ｃＤＮＡはエイ．デアリー(A.Dearry)らが、「Nature」 347、72〜76ページ(1990)に報告している。
　ラットＤ2 ドーパミン受容体ｃＤＮＡはジェイ．ブンゾウ(J. Bunzow) らの、「Nature」 336、 783〜 787ページ(1988)に報告されており；さらにオウ．シベリー(O.Civelli) らの国際出願　PCT WO 90/05780 号（ここで引用したすべての文献は参考のためここに記載する）を参照。
　ムスカリン性コリン作動性受容体（種々のサブタイプ）はイー．ペラルタ(E.Peralta) らの「Nature」 343、 434ページ　(1988)およびケイ．フクダ(K.Fukuda)らの「Nature」 327、　623 ページ(1987)に開示されている。
　α2 アドレナリン受容体の種々のサブタイプはジェイ．リーガン(J.Regan) らの「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」85、6301ページ(1988)およびR.Lefkowitz およびM.Caron の「J.Biol.Chem.」263 、4993ページ(1988)に開示されている。
　セロトニン受容体（種々のサブタイプ）はエス．ペロートカ(S.Peroutka)の「Ann.Rev.Neurosci. 」11、45ページ(1988)に開示されている。
　カンナビノイド受容体はエル．マツダ(L.Matsuda) らの「Nature」 346、 561ページ(1990)に開示されている。
　哺乳類Ｇαサブユニット（Ｇα）の遺伝暗号を指定する任意のＤＮＡ配列を用いて本発明を実施することができる。哺乳類Ｇαサブユニットの例にはＧs αサブユニット、Ｇi αサブユニット、Ｇo αサブユニット、Ｇz αサブユニット、およびトランスデューシン(transducine) αサブユニットが含まれる。一般的にはStryerおよびBourneの「前記」を参照。本発明を実施するのに有用なＧタンパク質およびサブユニットにはサブタイプ、ならびにこれらの変異体および異種相同物、またこれらのものを暗号化したＤＮＡ配列がともに含まれる。
　異種ＤＮＡ配列は宿主中で発現ベクターにより発現される。発現ベクターは異種ＤＮＡ配列を暗号化するＤＮＡ配列を意図する宿主中の異種ＤＮＡ配列により遺伝暗号を指定したタンパク質またはタンパク質サブユニットの発現に影響を与えることができる適当な制御配列に操作可能に結合される再製可能なＤＮＡ構成体である。一般に、制御配列には転写プロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位を暗号化する配列、ならびに（任意に）転写および翻訳の終結を制御する配列が含まれる。
　本発明の実施に有用なベクターにはプラスミド、ウイルス（ファージを含む）、および組み込み可能な(integratable)ＤＮＡフラグメント（すなわち、相同組み換えにより宿主ゲノムに組み込み可能なフラグメント）が含まれる。ベクターは、プラスミドの場合、宿主ゲノムとは無関係に再製し機能することができるが、組み込み可能なＤＮＡフラグメントの場合には、ゲノム自体に組み込むことができる。適当なベクターには意図する発現宿主に親和性のある種から誘導した制御配列およびレプリコンが含まれる場合がある。例えば、宿主細胞で操作可能なプロモーターはこの細胞のＲＮＡポリメラーゼに結合するものであり、宿主細胞で操作可能なリボソーム結合部位はこの細胞の内因性リボソームに結合するものである。
　ＤＮＡ領域はこれらが互いに機能的に関連する場合に操作可能に結合される。例えば：プロモーターはこれが配列の転写を制御する場合には暗号配列に操作可能に結合され；リボソーム結合部位はこれを翻訳が可能になるように配置する場合には暗号配列に操作可能に結合される。一般に、操作可能に結合させたとは、先導配列の場合において接触していること、読み取り相(reading phase) で接触していることを意味する。
　本発明の形質転換した宿主細胞は組み換えＤＮＡ技術を用いて構成したベクターでトランスフェクションしたかまたは形質転換した細胞であり、異種ＤＮＡ配列により遺伝暗号を指定したタンパク質またはタンパク質サブユニットを発現する。一般に、宿主細胞は内因性Ｇタンパク質αサブユニット（酵母Ｇα) を発現することができない。しかし、宿主細胞はＧタンパク質βサブユニットとＧタンパク質γサブユニットの複合体（Ｇβγ) を発現する。宿主細胞は内因性Ｇβγを発現する場合があり、あるいはこれらを操作して異種Ｇαを発現させるような同様の方法で操作して任意に異種（例えば、哺乳類）Ｇβγを発現させる場合がある。
　酵母細胞を形質転換するための種々の培養酵母、および適当な発現ベクターが知られている。例えば、米国特許第 4,745,057号; 米国特許第 4,797,359号; 米国特許第 4,615,974号; 米国特許第 4,880,734号; 米国特許第 4,711,844号; および米国特許第 4,865,989号を参照。サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)は酵母の中で最も普通に用いられるが、他の多数の株も普通に入手することができる。例えば、米国特許第 4,806,472号〔クルベロミセスラクチス(Kluveromyces lactis) およびこれらの発現ベクター〕；第 4,855,231号〔ピチアパストリス(Pichia pastoris) およびこれらの発現ベクター〕を参照。酵母ベクターは２ミクロン酵母プラスミドからの複製の開始点または自律複製配列[autonomously replicating sequence(ARS)]、プロモーター、異種ＤＮＡ配列を暗号化したＤＮＡ、ポリアデニル化および転写の終結のための配列、および選択遺伝子を含む場合がある。典型的なプラスミドはＹＲｐ７[ スティンコム(Stinchcomb)ら、「Nature」 282、39ページ　(1979); キングスマン(Kingsman)ら、「Gene」 7、 141ページ(1979); チェンパー(Tschemper) ら、「Gene」10、 157ページ(1980)] である。このプラスミドはトリプトファン中で増殖能力を欠く突然変異株の酵母の選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子を含む、例えばＡＴＣＣ No.44076 またはＰＥＡ４−１〔ジョーンズ(Jones) の「Genetics」85、12ページ(1977)〕。次いで酵母宿主細胞ゲノム中のＴＲＰ１の遺伝的変異の存在はトリプトファンを含まない状態で増殖させることによる形質転換の検出に有効な環境を提供する。
　酵母ベクター中の適当な促進配列(promoting sequence)にはメタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ〔ヒッツマン(Hitzeman)らの「J.Biol.Chem.」 255、2073ページ(1980)〕または他の解糖系酵素(glycolytic enzyme) 〔ヘス(Hess)らの「J.Adv.Enzyme Reg. 」 7、 149ページ(1968); およびホーランド(Holland) らの「Biochemistry」17、4900ページ(1978)〕、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ(phosphoglucose isomerase)およびグルコキナーゼのためのプロモーターが含まれる。また酵母の発現で用いる適当なベクターおよびプロモーターはアール．ヒッツマン(R.Hitzeman)らの欧州特許出願公開第73,657号明細書に開示されている。増殖条件により制御された転写の他の利点を有する、他のプロモーターはアルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解酵素(degradative enzyme)、ならびに上述のメタロチオネインおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、さらにマルトースおよびガラクトースの利用を担う酵素のためのプロモーター領域である。
　適当な発現プラスミドを構成する場合、さらにこれらの遺伝子と関連する終結配列が異種の遺伝暗号を指定する配列の発現ベクターの３′側につながれ、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終結を提供する場合がある。
　ここに記載した特に本発明の実施に有用な新規ＤＮＡ発現ベクターは少なくとも酵母Ｇタンパク質結合受容体の一番端のアミノ末端暗号配列のフラグメントから成る第１セグメントおよび前記第１セグメントの下流でさらに正確な読み取り枠内の第２セグメントを含み、第２セグメントは異種Ｇタンパク質結合受容体 (例えば、哺乳類Ｇタンパク質結合受容体) を暗号化するＤＮＡ配列から成る。好適例において、このベクターはプラスミドから成る。かかるベクターを構成する場合、異種Ｇタンパク質結合受容体の一番端のアミノ末端暗号配列のフラグメントを欠失させる場合がある。第１および第２セグメントは酵母細胞中で効果的なＧＡＬ１プロモーターのようなプロモーターと効果的に結合する。かかるベクターを構成するのに用いられる酵母Ｇタンパク質結合受容体の暗号配列は酵母フェロモン受容体を暗号化する遺伝子配列（例えば、α因子受容体を暗号化するＳＴＥ２遺伝子、およびａ因子受容体を暗号化するＳＴＥ３遺伝子）により例示される。少なくとも酵母Ｇタンパク質結合受容体遺伝子の５′非翻訳領域のフラグメント（例えば、酵母フェロモン受容体遺伝子；前記参照）を第１セグメントの上流に配置し効果的にこれに結合する場合これらの新規ベクターから得た発現のレベルが高められる。
　ＧβγからのＧαの解離を検出するための任意の種々の手段を本発明と関連して用いることができる。この細胞は粉砕されこれらのサブユニットと複合体の比は物理的に（例えば、クロマトグラフィーにより）測定される。細胞は粉砕されＧαの存在量は単離体のＧαが所有する酵素活性（すなわち、ＧＴＰをＧＤＰに加水分解する能力）をアッセイすることにより直接アッセイした。ＧＴＰまたはＧＤＰのどちらがＧタンパク質に結合するかはＧタンパク質がＧαまたはＧβγ複合体のどちらで存在するかに依存することから、解離は放射性標識したＧＴＰを用いて証明される場合がある。次に記載するように、細胞の形態上の変化が観察される場合がある。しかし、特に都合のよい方法は細胞に第３の異種ＤＮＡ配列を供給することであり、第３の異種ＤＮＡ配列はフェロモン応答プロモーターおよびフェロモン応答プロモーターの下流に配置し効果的にこれに結合させた指示遺伝子から成る。この配列はベクターとともに、ここに詳細に記載するように挿入することができる。かかる配列を適切に用いることで、細胞内の指示遺伝子の発現を監視することにより検出工程を実施することができる。任意の種々のフェロモン応答プロモーター、例えばＢＡＲ１遺伝子プロモーターおよびＦＵＳ１遺伝子プロモーターを用いることができる。同様に、任意の広範な指示遺伝子、例えばＨＩＳ３遺伝子およびＬａｃＺ遺伝子を用いることができる。
　上述のように、本発明の形質転換した宿主細胞は異種ＤＮＡ配列により遺伝暗号を指定されたタンパク質またはタンパク質サブユニットを発現する。発現した場合、Ｇタンパク質結合受容体は宿主細胞膜内に配置される（すなわち、細胞膜の外側でリガンドを立体特異的に結合させ細胞膜の細胞質側でＧタンパク質と機能的に相互作用させるために適当な配向でこれらに物理的に配置される）。
　異種アドレナリン受容体およびこの同種のＧタンパク質αサブユニットの発現により酵母フェロモン応答経路を制御する能力は哺乳類Ｇタンパク質結合受容体の構造上のおよび機能上の特徴づけを促進する可能性を有する。増殖の停止またはβガラクトシダーゼの誘導のような応答の記録により、次に変異受容体の機能的特性を迅速に試験することができる。同様に、推定されている他のＧタンパク質結合受容体の遺伝子を単離した際、多数のリガンドを予備選択して以前未確認であった受容体に対して活性を有するリガンドを確認することができる。エフ.リバート(F.Libert)らの「Science 」 244、 569ページ(1989)；エム．エス．チー(M.S.Chee)らの「Nature」 344、 774ページ(1990)を参照。さらに、推定されている他のＧタンパク質αサブユニットの遺伝暗号を指定している遺伝子を単離し、これらを本発明の細胞中で発現させて種々のＧタンパク質結合受容体およびリガンドで予備選抜してこれらのサブユニットを特徴づけることができる。またこれらの細胞を用いて受容体−Ｇタンパク質相互作用に影響を及ぼす化合物を予備選択することができる。
　本発明の細胞はマイクロタイタープレートのウエルに既知の、所定量で配置して上述の種々のスクリーニング方法に従って化合物をスクリーニングするために有用な標準化したキットを提供することができる。
　次の実施例は本発明の種々の観点をさらに例示するために提供する。これらは本発明を限定するものとして解釈すべきではない。
実施例１
　ヒトβ 2 アドレナリン発現ベクターｐＹβＡＲ２の構成および酵母における発現
　酵母でヒトβ2 アドレナリン受容体（ｈβＡＲ）の高レベル発現を達成するため、修飾したｈβＡＲ遺伝子を多コピーベクター、ＹＥｐ２４（ｐＹβＡＲ２）のＧＡＬ１プロモーターの制御下に配置した。
　図１は酵母発現プラスミドｐＹβＡＲ２の構成を示す。ｐＹβＡＲ２では、ｈβＡＲ配列の発現はＧＡＬ１プロモーターの制御下にある。図１Ａは５′非翻訳領域およびｐＴＺＮＡＲのｈβＡＲ遺伝子の暗号配列の最初の63塩基対（ｂｐ）を示し、ビー．オー′ドード(B. O ′Dowd) ら、「J.Biol.Chem.」 263、 15985ページ(1988)、これをＡａｔ II 開裂により除去されＳＴＥ２遺伝子(SEQ ID NO:1;SEQ ID NO:2) からの11ｂｐの非暗号配列および42ｂｐの暗号配列に対応する合成オリゴヌクレオチドで置換した。エヌ．ナカヤマ(N.Nakayama)らの「EMBOJ.」 4、2643ページ(1985)；エイ．ブルクホルダー(A.Burkholder)およびエル．ハートウェル(L.Hartwell)の「Nucleic Acids Res.」13、8463ページ(1985)を参照。得られたプラスミド、　ｐＴＺＹＮＡＲはSEQ ID NO:3 としてここに記載した３′Ｈｉｎｄ III部位を有する非暗号配列においてＨｉｎｄ III部位により側面を接する修飾したｈβＡＲ遺伝子を含む。Ｈｉｎｄ　III −Ｈｉｎｄ IIIフラグメントをｐＴＺＹＮＡＲから単離し修飾したｈβＡＲ遺伝子の３′非翻訳配列に次いで酵母ＡＤＨ１遺伝子からの終結配列を含む 450ｂｐが続くようにｐＡＡＨ５に挿入した。ジー．アメラー(G.Ammerer) の「Methods.Enzymol.」 101、 192ページ(1983)を参照。
　図１Ｂに示すように、ｐｙβＡＲ２はＹＥｐＧ24中にｈβＡＲおよびＡＤＨ１配列を含むＢａｍ HI −Ｂａｍ HI フラグメントを挿入することにより構成した。イー．ウィコフ(E.Wyckoff) およびティー．ヒセー(T.Hsieh) の「Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.」85、6272ページ(1988)を参照。最大の発現が調査され、細胞をＬＡＣ９、ＧＡＬ１調節転写に必要なS.cerevisiae　ＧＡＬ４トランス作用転写活性タンパク質(transactivater protein)の異種相同物を含むプラスミドｐＭＴＬ９（Dr.S.Johnston から入手）で共形質転換した。ジェイ．サルメロン(J.Salmeron)らの「Mol.Cell.Biol.」 9、2950ページ(1989)を参照。後期指数期にまで増殖した細胞を３％のガラクトースを含み、約10μＭのアルプレノロールを追加した培地中で誘導し、さらに36時間増殖させた。細胞の維持のために標準法を使用した。エフ．シェルマン(F.Sherman) らの「Method in Yeast Genetics（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー所在のコールドスプリングハーバー研究所、1986年）」を参照。
　最大の発現は(i) トランス作用転写活性タンパク質（ＬＡＣ９）の発現、(ii)酵母ＳＴＥ２（α因子受容体）遺伝子の対応する領域を有するｈβＡＲ遺伝子の５′非翻訳領域および一番端のアミノ末端暗号配列の置換、(iii) 細胞増殖が後期指数期に達した際のガラクトースでの誘導、および(iv)誘導の間の増殖培地にアドレナリン性リガンドを包含することを必要とした。
　プラスミドｐＹβＡＲ２をブタペスト条約の規定に従って米国メリーランド州20852 、ロックビル、パークロウンドライブ12301 所在のアメリカンタイプカルチャーコレクションに１９９０年９月１１日に寄託し、ＡＴＣＣ受諾No.40891が割り当てられた。
実施例２
　ｐＹβＡＲ２で形質転換した酵母のｈβＡＲリガンドの結合親和力
　細胞表面受容体の本来の機能は他の細胞外刺激中から適当なリガンドだけを認識することである。従って、リガンド結合親和力を決定して酵母で発現されたｈβＡＲの機能的な完全性を確立した。詳細を次に記載するように、拮抗薬、125Ｉ標識シアノピンドロール(cyanopindolol)( 125Ｉ−ＣＹＰ）を飽和するように、ｐＹβＡＲ２で形質転換した酵母細胞から調製した膜に対して高い親和力で結合した。一連の作動薬で 125Ｉ−ＣＹＰを置換することによりｈβＡＲの期待される効力および立体特異性の程度を観察した。
　ｐＹβＡＲ２（ＵＲＡ３）およびｐＭＴＬ９（ＬＥＵ２）が含まれるＳＣ261細胞（ＭＡＴａ　ｕｒａ３−52　ｔｒｐｌ　ｌｅｕ２　ｐｒｂ１−1122　ｐｅｐ４−３　ｐｒｃｌ−40）　〔エス．ジョンストン(Dr.S.Johnston) から入手〕を最少グルコースフリー選択培地で後期対数期(OD600=5.0) まで増殖させ、次いで３％のガラクトースおよび40μＭのアルプレノロールを添加して誘導した。36時間後、細胞を収穫し記載したようにスフェロプラストを調製した。E.Wyckoff および T.Hsiehの「Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 」85、6272ページ(1988)を参照。簡単には、スフェロプラストを50mMのトリス−塩酸pH7.4 、5mＭのＥＤＴＡ中で再懸濁しガラスビーズを用いた渦流混合により４℃で３度１分間溶解した。粗膜を溶解液から調製し 125Ｉ−ＣＹＰとの結合を以前記載した方法によりアッセイした。H.Dohlman らの「Biochemistry」29、2335ページ(1990)を参照。
　図２はｐＹβＡＲ２で形質転換した酵母細胞由来の膜に対するｈβＡＲリガンドの結合を示す。(A)　125Ｉ−ＣＹＰ濃度を変化させること(5〜 400pM) によりＢmax （最大リガンド結合） およびＫd （リガンド解離定数）値を決定した。特異的結合は全結合（丸で示す）から10μＭの（−）アルプレノロールの存在下で測定した非特異的結合（四角で示す）を引いた量として定義する。 125Ｉ−ＣＹＰ結合のために93pMのＫd を得て作動薬親和力（次の）を計算するために用いた。(B) 種々の濃度の作動薬を使用した18pMの 125Ｉ−ＣＹＰの置換を用いて受容体結合のための明らかに低い親和力Ｋi 値（50μＭのＧＴＰの存在下に決定した非Ｇタンパク質結合） を決定した、四角；（−） イソプロテレノール、丸；（−）エピネフリン、下方に尖った三角；（＋）イソプロテレノール、上方に尖った三角；（−）ノルエピネフリン。
比較例Ａ
　酵母および哺乳類細胞で発現したｈβＡＲに対するリガンド結合親和力
　図２(A) および(B) の結合データは非線形最小自乗法回帰により分析し、エイ．デリーン(A.DeLean)らの「Mol.Pharmacol.」21、(1982)参照、さらに表Ｉに示す。記載した値は３回の測定値の平均であり、２〜３度の試験を代表する。酵母の結合親和力は以前哺乳類細胞で発現したｈβＡＲについて観察されたものとほとんど同一であった。
Figure 2004000282
実施例３
　酵母発現ｈβＡＲの接合シグナル伝達による作動薬依存活性化
　受容体の第２の主要な機能はシグナル伝達経路での下流成分の作動薬依存調節である。酵母のフェロモン応答エフェクターは知られていないので、間接的な生物学的アッセイが最も有効な受容体機能の指標である。K.BlumerおよびJ.Thorner の「Annu.Rev.Physiol. 」出版中；I.Herskowitzの「Microbiol.Rev.」52、 536ページ(1988)を参照。高濃度のｈβＡＲを発現する酵母で、接合シグナル伝達の作動薬依存活性化は任意の代表的なインビボアッセイ；例えば、Ｇ1 期停止の賦課物(impositoin)、遺伝子発現の誘導、形態の変化（いわゆる「シュモー」形成）または接合の刺激により検出することができない。応答の欠如に対する適当な解釈はｈβＡＲが内因性酵母Ｇタンパク質と結合することができないことである。
実施例４
　酵母におけるｈβＡＲおよび哺乳類Ｇ S αサブユニットの同時発現
　哺乳類ＧS αサブユニットの発現はＧＰＡ１遺伝子により暗号化された対応する内因性タンパク質を欠如する酵母細胞における増殖の欠陥を修正することができる。シー．ディーツェル(C.Dietzel) およびジェイ．クルジャン(J.Kurjan)の「Cell」50、1001ページ(1987)を参照。さらに、哺乳類細胞の受容体結合の特異性はＧタンパク質のαサブユニットにより与えられる。L.StryerおよびH.Bourneの「Ann.Rev.Cell Biol.」 2、 391ページ(1988)を参照。このように、酵母でのｈβＡＲおよび哺乳類ＧS αサブユニット（ＧS α）の同時発現は酵母をアドレナリン性リガンドに対し感受性にするめに試みられた。従って、銅誘導可能(copper-inducible)ＣＵＰ１プロモーターの制御下にラットＧS αを暗号化するｃＤＮＡを第２のプラスミド、ｐＹＳＫ 136Ｇαｓに導入した。C.Dietzel およびJ.Kurjanの　「Cell」50、1001ページ(1987)を参照。ｈβＡＲおよびラットＧS αを同時発現するが、野性型ＧＰＡ１を含む酵母（ＮＮＹ19）で、アドレナリン性作動薬誘導シュモー形成は観察されず、接合フェロモンに応じた酵母の特有な形態変化が観察された。
実施例５
　内因性Ｇタンパク質αサブユニットを欠如する酵母におけるｈβＡＲおよび哺乳類Ｇ S αサブユニットの同時発現
　内因性酵母Ｇタンパク質αサブユニットによる干渉を防止するため、ｇｐａ１突然変異細胞（８ｃ株）を用いた。
　酵母株８ｃ（ＭＡＴａ　ｕｒａ３　ｌｅｕ２　ｈｉｓ３　　ｔｒｐｌ　ｇｐａｌ：：Ｈ１Ｓ３）、アイ．ミヤジマ(I.Miyajima)らの「Cell」50、1011ページ(1987)、担体プラスミド(carrying plasmid)ｐＹＳＫ 136Ｇαｓ（ＴＲＰ１）、C.Dietzel およびJ.Kurjanの「Cell」50、1001ページ(1987)、ｐＭＴＬ９（ＬＥＵ２）、J.Salmeronらの「Mol.Cell.Biol.」 9、2950ページ(1989)、およびｐＹβＡＲ２（ＵＲＡ３）を３％のグリセロール、２％の乳酸、50μＭのCuSO4 および３％のガラクトースを含むグルコースフリーの最小選択プレートに維持した。コロニーを0.5mＭのアスコルビン酸および望ましいアドレナリン性リガンドを含む同様のプレートに移しかえた。30℃で16〜20時間の後、コロニーを106 〜107 細胞／mlの密度で同様の液体培地に移しかえ位相差顕微鏡により試験した。
　ｐＹβＡＲ２、ｐＭＴＬ９、およびｐＹＳＫ 136Ｇαｓで共形質転換した酵母細胞の形態は(A) アドレナリン性薬品を含まず；(B)100μＭの（−）イソプロテレノール；(C)100μＭの　（−）イソプロテレノールおよび50μＭの（−）アルプレノロール；および(D)100μＭの（＋）イソプロテレノールとともに温置した後試験した。結果はｈβＡＲおよびラットＧS αを同時発現する８ｃ細胞のβアドレナリン性作動薬イソプロテレノールを用いた処理が実際にシュモー形成を誘導し、この効果が特定の拮抗薬アルプレノロールにより阻害されることを示した。
実施例６
　βガラクトシダーゼのシグナル配列を含む酵母におけるｈβＡＲおよび哺乳類Ｇ S αサブユニットの同時発現
　ｈβＡＲおよびラットＧS αを同時発現する８ｃ細胞をイソプロテレノールで誘導した形態学的応答はこれらの成分が互いにおよび内因性Ｇαサブユニットを欠如する酵母でフェロモン応答経路の下流成分に結合することができることを示唆している。フェロモンシグナル経路がｈβＡＲおよびラットＧS αにより活性化されることを確認するため、フェロモン応答ＦＵＳ１遺伝子プロモーターの作動薬誘導をＦＵＳ１−ｌａｃＺ遺伝子融合がゲノムに確実に組み込まれた８ｃ細胞（８ｃ１）から誘導した酵母の系統で測定した。エス．ノモト(S.Nomoto)らの「EMBO J. 」 9、 691ページ(1990)を参照。
　系統８ｃ（図３、凡例）およびＮＮＹ19（ＭＡＴａ　ｕｒａ３　ｌｅｕ２　ｈｉｓ３　ｔｒｐ１　ｌｙｓ２　ＦＵＳ１−ＬａｃＺ：：ＬＥＵ２）をＹＩｐＦＵＳ 102（ＬＥＵ２）での組み込み形質転換により修飾し、S.Nomotoらの「前記」、それぞれ８ｃｌおよびＮＮＹ19と略記した。これらの系統をｐＹβＡＲ２、およびｐＹＳＫ 136Ｇαｓで形質転換しグルコースおよび50μＭのCuSO4 を含む最小選択プレートに維持した。コロニーを最小選択培地（３％のグリセロール、２％の乳酸、50μＭのCuSO4 ）に接種し、初期対数期(OD600=1.0) まで増殖させ、さらに３％のガラクトースの添加により12時間誘導した。細胞を洗浄し0.5mＭのアスコルビン酸および望ましいリガンドを含む誘導培地(OD600=5.0) に再び懸濁した。30℃で４時間温置した後、細胞を収穫し１mlのＺ緩衝液、ジェイ．ミラー(J.Miller)の「Experiments in Molecular Genetics 」（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー所在の、コールドスプリングハーバー研究所、1972）を参照、に0.0075％のSDS を追加して、再び懸濁し、さらにβガラクトシダーゼ活性を以前記載したように３〜４回の独立した試験で測定した。J.Millerの「前記」を参照。
　図３にはフェロモン誘導可能な遺伝子活性に及ぼすβアドレナリン性作動薬の影響を比較して示す。α−ＭＦ、10μＭα接合因子；（−）ＩＳＯ、50μＭ（−）イソプロテレノール；　（−）ＡＬＰ、50μＭ（−）アルプレノロール；（＋）ＩＳＯ、 100μＭ（＋）イソプロテレノールである。ｈβＡＲおよびラットＧS αを同時に発現する８ｃｌ（ｇｐａ１）細胞において、イソプロテレノールで刺激されたβガラクトシダーゼ活性の劇的な誘導を観察した。作動薬刺激は立体特異的であり特定の拮抗薬を添加することにより阻害された。作動薬応答はｈβＡＲおよびラットＧS αの発現に依存し、内因性Ｇタンパク質αサブユニットが分裂した系統を必要とした。形質転換した８ｃｌ細胞でイソプロテレノールに応じて達成した最終的βガラクトシダーゼ活性はＧＰＡ１（ＮＮＹ19）を発現する形質転換していない細胞でα因子により誘導したものに匹敵したが、ＮＮＹ19細胞の基底の(basal) βガラクトシダーゼ活性は８ｃｌ細胞よりかなり低かった。総合して、本発明者らの結果はｈβＡＲおよびラットＧS αの同時発現が酵母の接合シグナル伝達経路のカテコールアミン制御キー観点(control key aspect)の下に配置するのに十分であることを示した。しかし、アドレナリン性作動薬は酵母フェロモン受容体が、結合フェロモンに加え、接合に必要な他の認識事象に関連するという最近の観察結果と一致して、ｈβＡＲおよびラットＧS αを同時に発現する８ｃ細胞またはＮＮＹ19細胞のどちらの接合をも刺激しない。エイ・ベンダー(A.Bender)およびジー・スプラーグ(G.Sprague) の「Genetics」 121、 463ページ(1989)を参照。
　ｈβＡＲは動物細胞のアデニル酸シクラーゼをＧタンパク質のαサブユニットの作用を介して刺激する。対照的に、酵母の接合因子受容体はこれらのエフェクターをβγサブユニットの作用を介して誘発する。エム．ホワイトウェイ(M.Whiteway)らの「Cell」56、 476ページ(1989)を参照。本発明者らの本結果は酵母のｈβＡＲの活性化が酵母のβγから哺乳類ＧS αを解離させること、およびこれがおそらく応答を誘い出すβγサブユニットであることを示している。
　上述の例は本発明の例示であり、制限と解釈すべきではない。本発明は、ここに含まれる請求の範囲と均等なものとともに、次の請求の範囲により明確となる。
図１には酵母ヒトβ2 アドレナリン受容体発現プラスミド、ｐＹβＡＲ２の構成を示す。 図２にはｐＹβＡＲ２で形質転換した酵母細胞由来の膜に対するｈβＡＲリガンド結合を示す。 図３にはフェロモン誘導遺伝子活性に与えるβアドレナリン性作動薬、α−ＭＦ、10μＭα交配因子；（−）ＩＳＯ、50μＭ（−）イソプロテレノール；（−）ＡＬＰ、50μＭ（−）アルプレノロール；（＋）ＩＳＯ、 100μＭ（＋）イソプロテレノールの効果を比較して示す。

Claims (13)

  1. 　酵母細胞の細胞膜中にトランスメンブランタンパク質を発現させることができるＤＮＡ発現ベクターであって：
    　酵母Ｇタンパク質結合受容体の少なくとも一番端のアミノ末端暗号配列のフラグメントから成る第１セグメント；および
    　前記第１セグメントから下流でさらに正確な読み取り枠内の第２セグメントであって、異種Ｇタンパク質結合受容体を暗号化するＤＮＡ配列から成る第２セグメントから成り、前記異種Ｇタンパク質結合受容体がＧタンパク質と機能的に相互作用し得ることを特徴とするＤＮＡ発現ベクター。
  2. 　前記異種Ｇタンパク質結合受容体の一番端のアミノ末端暗号配列のフラグメントが欠如していることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ発現ベクター。
  3. 　前記第１および第２セグメントが、酵母細胞において操作可能なプロモーターと動作可能に結合していることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ発現ベクター。
  4. 　前記プロモーターがＧＡＬ１プロモーターであることを特徴とする請求項３記載のＤＮＡ発現ベクター。
  5. 　前記第１セグメントが酵母フェロモン受容体の少なくとも一番端のアミノ末端暗号配列のフラグメントから成ることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ発現ベクター。
  6. 　前記第１セグメントがＳＴＥ２遺伝子およびＳＴＥ３遺伝子から成る群より選ばれる酵母フェロモン受容体の少なくとも一番端のアミノ末端暗号配列のフラグメントから成ることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ発現ベクター。
  7. 　さらに前記第１セグメントの上流に配置され動作可能に結合されている酵母Ｇタンパク質結合受容体遺伝子の少なくとも５′非翻訳領域のフラグメントを含んでいることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ発現ベクター。
  8. 　さらに前記第１セグメントの上流に配置され動作可能に結合されている酵母フェロモン受容体遺伝子の少なくとも５′非翻訳領域のフラグメントを含んでいることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ発現ベクター。
  9. 　酵母フェロモン受容体遺伝子がＳＴＥ２遺伝子およびＳＴＥ３遺伝子から成る群より選ばれていることを特徴とする請求項８記載のＤＮＡ発現ベクター。
  10. 　前記ベクターがプラスミドから成ることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ発現ベクター。
  11. 　前記第２セグメントが哺乳類Ｇタンパク質結合受容体を暗号化するＤＮＡ配列から成ることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ発現ベクター。
  12. 　前記第２セグメントが、ドーパミン受容体、ムスカリン性コリン作動性受容体、αアドレナリン受容体、βアドレナリン受容体、オピエート受容体、カンナビノイド受容体、およびセロトニン受容体から成る群より選ばれている哺乳類Ｇタンパク質結合受容体を暗号化するＤＮＡ配列から成ることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ発現ベクター。
  13. 　請求項１記載のＤＮＡ発現ベクターを有することを特徴とする酵母細胞。
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