JP2002253282A - 酵母におけるｇタンパク質結合受容体の発現 - Google Patents
酵母におけるｇタンパク質結合受容体の発現Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 哺乳類Ｇタンパク質結合受容体の遺伝暗号
を指定する第１の異種ＤＮＡ配列および哺乳類Ｇタンパ
ク質αサブユニット（哺乳類Ｇα）の遺伝暗号を指定す
る第２の異種ＤＮＡ配列を含む形質転換した酵母細胞を
作るのに有用な新規なＤＮＡ発現ベクターを得る。 【解決手段】 本発明で開示する新規なＤＮＡ発現ベク
ターは、少なくとも酵母Ｇタンパク質結合受容体の一番
端のアミノ末端暗号配列のフラグメントから成る第１セ
グメントを含む。第２セグメントは第１セグメントの下
流（さらに正確な読み取り枠内）に配置し、異種Ｇタン
パク質結合受容体を暗号化するＤＮＡ配列から成る。得
られる酵母細胞では、第１および第２の異種ＤＮＡ配列
は発現されるが、内因性Ｇタンパク質αサブユニット
（酵母Ｇα）を発現しないようにすることができる。こ
れらの細胞は細胞内でＧαがＧβγから解離する速度に
影響を与える化合物をスクリーニングするのに有用であ
る。
を指定する第１の異種ＤＮＡ配列および哺乳類Ｇタンパ
ク質αサブユニット（哺乳類Ｇα）の遺伝暗号を指定す
る第２の異種ＤＮＡ配列を含む形質転換した酵母細胞を
作るのに有用な新規なＤＮＡ発現ベクターを得る。 【解決手段】 本発明で開示する新規なＤＮＡ発現ベク
ターは、少なくとも酵母Ｇタンパク質結合受容体の一番
端のアミノ末端暗号配列のフラグメントから成る第１セ
グメントを含む。第２セグメントは第１セグメントの下
流（さらに正確な読み取り枠内）に配置し、異種Ｇタン
パク質結合受容体を暗号化するＤＮＡ配列から成る。得
られる酵母細胞では、第１および第２の異種ＤＮＡ配列
は発現されるが、内因性Ｇタンパク質αサブユニット
（酵母Ｇα）を発現しないようにすることができる。こ
れらの細胞は細胞内でＧαがＧβγから解離する速度に
影響を与える化合物をスクリーニングするのに有用であ
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はＮＩＨ助成HL16037
の下に米国政府の支援により行われた。本発明の所定の
権利は米国政府が所有する。発明の分野 本発明は異種Ｇタンパク質結合受容体を発現する酵母細
胞、かかる細胞を作るのに有用なベクター、およびこれ
らのものを用いる方法に関する。
の下に米国政府の支援により行われた。本発明の所定の
権利は米国政府が所有する。発明の分野 本発明は異種Ｇタンパク質結合受容体を発現する酵母細
胞、かかる細胞を作るのに有用なベクター、およびこれ
らのものを用いる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】発明の背景 種々の細胞外シグナル (例えば、神経伝達物質、ホルモ
ン、臭気物質、光) の作用は７種のトランスメンブラン
領域を有する受容体（Ｇタンパク質結合受容体）および
ヘテロ三量体(heterotrimeric)グアニンヌクレオチド結
合性調節タンパク質（Ｇタンパク質) により媒介され
る。エイチ．ドールマン(H.Dohlman) 、エム．キャロン
(M.Caron) 、およびアール．レフコウィッツ(R.Lefkowi
ttz)の「Biochemistry」26、2657ページ(1987)；エル．
ストライヤー(L.Stryer)およびエイチ．ボーン(H.Bourn
e)の「Ann.Rev.Cell Biol.」 2、 391ページ(1986)を参
照。かかるＧタンパク質媒介シグナル系は酵母およびヒ
トのような異なる生物体で確認されている。H.Dohlman
らの「前記」； L.StryerおよびH.Bourneの「前記」；
ケー．ブルマー(K.Blumer)およびジェイ．トーナー(J.T
horner) の「Annu.Rev.Physiol. 」 (出版中) を参照。
β2 アドレナリン受容体（βＡＲ）は哺乳類細胞内のリ
ガンド結合性受容体の７種のトランスメンブランセグメ
ントの原型である。エピネフリンまたはノルエピネフリ
ンに対する応答で、βＡＲは細胞内でアデニル酸シクラ
ーゼおよびサイクリックアデノシン一リン酸産生を交互
に刺激するＧタンパク質、Ｇs を活性化する。H.Dohlma
n らの「前記」；L.StryerおよびH.Bourneの「前記」を
参照。酵母内でＧタンパク質結合フェロモン受容体はａ
およびα半数体細胞型が接合 (融合) してａ／α二倍体
を形成するようになる発生プログラムを制御する。K.Bl
umerおよびJ.Thorner の「前記」；アイ．ヘルスコウィ
ッツ(I.Herskowitz)の「Microbiol.Rev.」52、 536ペー
ジ(1988)を参照。
ン、臭気物質、光) の作用は７種のトランスメンブラン
領域を有する受容体（Ｇタンパク質結合受容体）および
ヘテロ三量体(heterotrimeric)グアニンヌクレオチド結
合性調節タンパク質（Ｇタンパク質) により媒介され
る。エイチ．ドールマン(H.Dohlman) 、エム．キャロン
(M.Caron) 、およびアール．レフコウィッツ(R.Lefkowi
ttz)の「Biochemistry」26、2657ページ(1987)；エル．
ストライヤー(L.Stryer)およびエイチ．ボーン(H.Bourn
e)の「Ann.Rev.Cell Biol.」 2、 391ページ(1986)を参
照。かかるＧタンパク質媒介シグナル系は酵母およびヒ
トのような異なる生物体で確認されている。H.Dohlman
らの「前記」； L.StryerおよびH.Bourneの「前記」；
ケー．ブルマー(K.Blumer)およびジェイ．トーナー(J.T
horner) の「Annu.Rev.Physiol. 」 (出版中) を参照。
β2 アドレナリン受容体（βＡＲ）は哺乳類細胞内のリ
ガンド結合性受容体の７種のトランスメンブランセグメ
ントの原型である。エピネフリンまたはノルエピネフリ
ンに対する応答で、βＡＲは細胞内でアデニル酸シクラ
ーゼおよびサイクリックアデノシン一リン酸産生を交互
に刺激するＧタンパク質、Ｇs を活性化する。H.Dohlma
n らの「前記」；L.StryerおよびH.Bourneの「前記」を
参照。酵母内でＧタンパク質結合フェロモン受容体はａ
およびα半数体細胞型が接合 (融合) してａ／α二倍体
を形成するようになる発生プログラムを制御する。K.Bl
umerおよびJ.Thorner の「前記」；アイ．ヘルスコウィ
ッツ(I.Herskowitz)の「Microbiol.Rev.」52、 536ペー
ジ(1988)を参照。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は酵母における
異種Ｇタンパク質結合受容体の発現について本発明者ら
が行った長年の研究に基づいている。
異種Ｇタンパク質結合受容体の発現について本発明者ら
が行った長年の研究に基づいている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】発明の開示 本発明の第１の観点は哺乳類Ｇタンパク質結合受容体の
遺伝暗号を指定する第１の異種ＤＮＡ配列および哺乳類
Ｇタンパク質αサブユニット（哺乳類Ｇα）の遺伝暗号
を指定する第２の異種ＤＮＡ配列を含む形質転換した酵
母細胞である。第１および第２の異種ＤＮＡ配列はこの
細胞内で発現させることができるが、この細胞は内因性
Ｇタンパク質αサブユニット（酵母Ｇα）を発現するこ
とができない。この細胞はフェロモン応答プロモータお
よびフェロモン応答プロモータから下流に配置しさらに
効果的に結合させた指示遺伝子から成る第３の異種ＤＮ
Ａ配列を含む。本発明の第２の観点は細胞においてＧα
がＧβγから解離する速度に影響を与える化合物の能力
を試験する方法である。この方法は：上述のように形質
転換した酵母細胞を供給し；化合物を細胞に接触させ；
さらに次いで細胞においてＧαがＧβγから解離する速
度を検出することから成る。細胞は水溶液中に供給され
る場合があり、水溶液に化合物を添加することにより接
触工程を実施した。
遺伝暗号を指定する第１の異種ＤＮＡ配列および哺乳類
Ｇタンパク質αサブユニット（哺乳類Ｇα）の遺伝暗号
を指定する第２の異種ＤＮＡ配列を含む形質転換した酵
母細胞である。第１および第２の異種ＤＮＡ配列はこの
細胞内で発現させることができるが、この細胞は内因性
Ｇタンパク質αサブユニット（酵母Ｇα）を発現するこ
とができない。この細胞はフェロモン応答プロモータお
よびフェロモン応答プロモータから下流に配置しさらに
効果的に結合させた指示遺伝子から成る第３の異種ＤＮ
Ａ配列を含む。本発明の第２の観点は細胞においてＧα
がＧβγから解離する速度に影響を与える化合物の能力
を試験する方法である。この方法は：上述のように形質
転換した酵母細胞を供給し；化合物を細胞に接触させ；
さらに次いで細胞においてＧαがＧβγから解離する速
度を検出することから成る。細胞は水溶液中に供給され
る場合があり、水溶液に化合物を添加することにより接
触工程を実施した。
【０００５】本発明の第３の観点は酵母細胞の細胞膜中
にトランスメンブランタンパク質を発現させることがで
きるＤＮＡ発現ベクターである。ベクターは少なくとも
酵母Ｇタンパク質結合受容体の一番端のアミノ末端暗号
配列のフラグメントから成る第１セグメントを含む。第
２セグメントは第１セグメントの下流（さらに正確な読
み取り枠内）に配置し、異種Ｇタンパク質結合受容体を
暗号化するＤＮＡ配列から成る。本発明の第４の観点は
上述のようなベクターにより形質転換した酵母細胞であ
る。
にトランスメンブランタンパク質を発現させることがで
きるＤＮＡ発現ベクターである。ベクターは少なくとも
酵母Ｇタンパク質結合受容体の一番端のアミノ末端暗号
配列のフラグメントから成る第１セグメントを含む。第
２セグメントは第１セグメントの下流（さらに正確な読
み取り枠内）に配置し、異種Ｇタンパク質結合受容体を
暗号化するＤＮＡ配列から成る。本発明の第４の観点は
上述のようなベクターにより形質転換した酵母細胞であ
る。
【０００６】
【発明の実施の形態】発明の詳細な記載 ここでヌクレオチド塩基は次のように略記する： Ａ＝アデニン Ｇ＝グアニン Ｃ＝シトシン Ｔ＝チミン ここでアミノ酸残基は次のように３文字または１文字で
略記する： Ａｌａ；Ａ＝アラニン Ｌｅｕ；Ｌ＝ロイシン Ａｒｇ；Ｒ＝アルギニン Ｌｙｓ；Ｋ＝リジン Ａｓｐ；Ｎ＝アスパラギン Ｍｅｔ；Ｍ＝メチオニン Ａｓｐ；Ｄ＝アスパラギン酸 Ｐｈｅ；Ｆ＝フェニルアラニン Ｃｙｓ；Ｃ＝システイン Ｐｒｏ；Ｐ＝プロリン Ｇｌｎ；Ｑ＝グルタミン Ｓｅｒ；Ｓ＝セリン Ｇｌｕ；Ｅ＝グルタミン酸 Ｔｈｒ；Ｔ＝スレオニン Ｇｌｙ；Ｇ＝グリシン Ｔｒｐ；Ｗ＝トリプトファン Ｈｉｓ；Ｈ＝ヒスチジン Ｔｙｒ；Ｙ＝チロシン Ｉｌｅ；Ｉ＝イソロイシン Ｖａｌ；Ｖ＝バリン ここで使用した「哺乳類」とは任意の哺乳類（例えば、
ヒト、マウス、ラット、およびサル）を意味する。ここ
で「異種」とは酵母に対して用い、従って酵母以外（例
えば、哺乳類、鳥類、両生類）に由来するＤＮＡ配列、
タンパク質、および他の物質、または酵母中で本来見出
せないこれらの組み合わせを意味する。ここで「上流」
および「下流」とは転写および翻訳の方向を意味するも
のとし、他の配列の前に転写または翻訳される配列は他
の配列の上流という。
略記する： Ａｌａ；Ａ＝アラニン Ｌｅｕ；Ｌ＝ロイシン Ａｒｇ；Ｒ＝アルギニン Ｌｙｓ；Ｋ＝リジン Ａｓｐ；Ｎ＝アスパラギン Ｍｅｔ；Ｍ＝メチオニン Ａｓｐ；Ｄ＝アスパラギン酸 Ｐｈｅ；Ｆ＝フェニルアラニン Ｃｙｓ；Ｃ＝システイン Ｐｒｏ；Ｐ＝プロリン Ｇｌｎ；Ｑ＝グルタミン Ｓｅｒ；Ｓ＝セリン Ｇｌｕ；Ｅ＝グルタミン酸 Ｔｈｒ；Ｔ＝スレオニン Ｇｌｙ；Ｇ＝グリシン Ｔｒｐ；Ｗ＝トリプトファン Ｈｉｓ；Ｈ＝ヒスチジン Ｔｙｒ；Ｙ＝チロシン Ｉｌｅ；Ｉ＝イソロイシン Ｖａｌ；Ｖ＝バリン ここで使用した「哺乳類」とは任意の哺乳類（例えば、
ヒト、マウス、ラット、およびサル）を意味する。ここ
で「異種」とは酵母に対して用い、従って酵母以外（例
えば、哺乳類、鳥類、両生類）に由来するＤＮＡ配列、
タンパク質、および他の物質、または酵母中で本来見出
せないこれらの組み合わせを意味する。ここで「上流」
および「下流」とは転写および翻訳の方向を意味するも
のとし、他の配列の前に転写または翻訳される配列は他
の配列の上流という。
【０００７】Ｇタンパク質は３種のサブユニット：グア
ニルヌクレオチド結合αサブユニット；βサブユニッ
ト；およびγサブユニットから成る。ＧＴＰかＧＤＰの
どちらが結合するかに依存して、Ｇタンパク質は２種の
形態のいずれかになる。ＧＤＰが結合する場合Ｇタンパ
ク質は不活性なヘテロ三量体、Ｇαβγ複合体として存
在する。ＧＴＰが結合する場合αサブユニットは解離
し、Ｇβγ複合体を放つ。重要なことに、Ｇαβγ複合
体が細胞膜中の活性化されたＧタンパク質結合受容体と
効果的に結合する場合、ＧＴＰを結合したＧＤＰに交換
する速度は上昇し、従って、結合したαサブユニットが
Ｇβγ複合体から解離する速度は増加する。この事象の
基本的な機構は非常に多くの異なる細胞シグナル現象の
基礎を形成する。一般にはStryerおよびBourneの「前
記」を参照。
ニルヌクレオチド結合αサブユニット；βサブユニッ
ト；およびγサブユニットから成る。ＧＴＰかＧＤＰの
どちらが結合するかに依存して、Ｇタンパク質は２種の
形態のいずれかになる。ＧＤＰが結合する場合Ｇタンパ
ク質は不活性なヘテロ三量体、Ｇαβγ複合体として存
在する。ＧＴＰが結合する場合αサブユニットは解離
し、Ｇβγ複合体を放つ。重要なことに、Ｇαβγ複合
体が細胞膜中の活性化されたＧタンパク質結合受容体と
効果的に結合する場合、ＧＴＰを結合したＧＤＰに交換
する速度は上昇し、従って、結合したαサブユニットが
Ｇβγ複合体から解離する速度は増加する。この事象の
基本的な機構は非常に多くの異なる細胞シグナル現象の
基礎を形成する。一般にはStryerおよびBourneの「前
記」を参照。
【０００８】任意の哺乳類Ｇタンパク質結合受容体、お
よびこれら受容体を暗号化するＤＮＡ配列を本発明の実
施に用いることができる。かかる受容体の例には、ドー
パミン受容体、ムスカリン性コリン作動性受容体、αア
ドレナリン受容体、βアドレナリン受容体、オピエート
受容体、カンナビノイド受容体、およびセロトニン受容
体が含まれるが、これらに限定されるものではない。こ
こで使用する受容体とは上記の受容体のサブタイプ、な
らびにこれらの変異体および異種相同物、またこれらの
ものを暗号化したＤＮＡ配列をも含むものである。ヒト
Ｄ1 ドーパミン受容体ｃＤＮＡはエイ．デアリー(A.Dea
rry)らが、「Nature」 347、72〜76ページ(1990)に報告
している。ラットＤ2 ドーパミン受容体ｃＤＮＡはジェ
イ．ブンゾウ(J. Bunzow) らの、「Nature」 336、 783
〜 787ページ(1988)に報告されており；さらにオウ．シ
ベリー(O.Civelli) らの国際出願 PCT WO 90/05780 号
（ここで引用したすべての文献は参考のためここに記載
する）を参照。ムスカリン性コリン作動性受容体（種々
のサブタイプ）はイー．ペラルタ(E.Peralta) らの「Na
ture」 343、 434ページ (1988)およびケイ．フクダ
(K.Fukuda)らの「Nature」 327、 623 ページ(1987)に
開示されている。α2 アドレナリン受容体の種々のサブ
タイプはジェイ．リーガン(J.Regan) らの「Proc.Natl.
Acad.Sci.USA」85、6301ページ(1988)およびR.Lefkowit
z およびM.Caron の「J.Biol.Chem.」263 、4993ページ
(1988)に開示されている。セロトニン受容体（種々のサ
ブタイプ）はエス．ペロートカ(S.Peroutka)の「Ann.Re
v.Neurosci. 」11、45ページ(1988)に開示されている。
カンナビノイド受容体はエル．マツダ(L.Matsuda) らの
「Nature」 346、 561ページ(1990)に開示されている。
よびこれら受容体を暗号化するＤＮＡ配列を本発明の実
施に用いることができる。かかる受容体の例には、ドー
パミン受容体、ムスカリン性コリン作動性受容体、αア
ドレナリン受容体、βアドレナリン受容体、オピエート
受容体、カンナビノイド受容体、およびセロトニン受容
体が含まれるが、これらに限定されるものではない。こ
こで使用する受容体とは上記の受容体のサブタイプ、な
らびにこれらの変異体および異種相同物、またこれらの
ものを暗号化したＤＮＡ配列をも含むものである。ヒト
Ｄ1 ドーパミン受容体ｃＤＮＡはエイ．デアリー(A.Dea
rry)らが、「Nature」 347、72〜76ページ(1990)に報告
している。ラットＤ2 ドーパミン受容体ｃＤＮＡはジェ
イ．ブンゾウ(J. Bunzow) らの、「Nature」 336、 783
〜 787ページ(1988)に報告されており；さらにオウ．シ
ベリー(O.Civelli) らの国際出願 PCT WO 90/05780 号
（ここで引用したすべての文献は参考のためここに記載
する）を参照。ムスカリン性コリン作動性受容体（種々
のサブタイプ）はイー．ペラルタ(E.Peralta) らの「Na
ture」 343、 434ページ (1988)およびケイ．フクダ
(K.Fukuda)らの「Nature」 327、 623 ページ(1987)に
開示されている。α2 アドレナリン受容体の種々のサブ
タイプはジェイ．リーガン(J.Regan) らの「Proc.Natl.
Acad.Sci.USA」85、6301ページ(1988)およびR.Lefkowit
z およびM.Caron の「J.Biol.Chem.」263 、4993ページ
(1988)に開示されている。セロトニン受容体（種々のサ
ブタイプ）はエス．ペロートカ(S.Peroutka)の「Ann.Re
v.Neurosci. 」11、45ページ(1988)に開示されている。
カンナビノイド受容体はエル．マツダ(L.Matsuda) らの
「Nature」 346、 561ページ(1990)に開示されている。
【０００９】哺乳類Ｇαサブユニット（Ｇα）の遺伝暗
号を指定する任意のＤＮＡ配列を用いて本発明を実施す
ることができる。哺乳類Ｇαサブユニットの例にはＧs
αサブユニット、Ｇi αサブユニット、Ｇo αサブユニ
ット、Ｇz αサブユニット、およびトランスデューシン
(transducine) αサブユニットが含まれる。一般的には
StryerおよびBourneの「前記」を参照。本発明を実施す
るのに有用なＧタンパク質およびサブユニットにはサブ
タイプ、ならびにこれらの変異体および異種相同物、ま
たこれらのものを暗号化したＤＮＡ配列がともに含まれ
る。
号を指定する任意のＤＮＡ配列を用いて本発明を実施す
ることができる。哺乳類Ｇαサブユニットの例にはＧs
αサブユニット、Ｇi αサブユニット、Ｇo αサブユニ
ット、Ｇz αサブユニット、およびトランスデューシン
(transducine) αサブユニットが含まれる。一般的には
StryerおよびBourneの「前記」を参照。本発明を実施す
るのに有用なＧタンパク質およびサブユニットにはサブ
タイプ、ならびにこれらの変異体および異種相同物、ま
たこれらのものを暗号化したＤＮＡ配列がともに含まれ
る。
【００１０】異種ＤＮＡ配列は宿主中で発現ベクターに
より発現される。発現ベクターは異種ＤＮＡ配列を暗号
化するＤＮＡ配列を意図する宿主中の異種ＤＮＡ配列に
より遺伝暗号を指定したタンパク質またはタンパク質サ
ブユニットの発現に影響を与えることができる適当な制
御配列に操作可能に結合される再製可能なＤＮＡ構成体
である。一般に、制御配列には転写プロモーター、転写
を制御するための任意のオペレーター配列、適当なｍＲ
ＮＡリボソーム結合部位を暗号化する配列、ならびに
（任意に）転写および翻訳の終結を制御する配列が含ま
れる。本発明の実施に有用なベクターにはプラスミド、
ウイルス（ファージを含む）、および組み込み可能な(i
ntegratable)ＤＮＡフラグメント（すなわち、相同組み
換えにより宿主ゲノムに組み込み可能なフラグメント）
が含まれる。ベクターは、プラスミドの場合、宿主ゲノ
ムとは無関係に再製し機能することができるが、組み込
み可能なＤＮＡフラグメントの場合には、ゲノム自体に
組み込むことができる。適当なベクターには意図する発
現宿主に親和性のある種から誘導した制御配列およびレ
プリコンが含まれる場合がある。例えば、宿主細胞で操
作可能なプロモーターはこの細胞のＲＮＡポリメラーゼ
に結合するものであり、宿主細胞で操作可能なリボソー
ム結合部位はこの細胞の内因性リボソームに結合するも
のである。ＤＮＡ領域はこれらが互いに機能的に関連す
る場合に操作可能に結合される。例えば：プロモーター
はこれが配列の転写を制御する場合には暗号配列に操作
可能に結合され；リボソーム結合部位はこれを翻訳が可
能になるように配置する場合には暗号配列に操作可能に
結合される。一般に、操作可能に結合させたとは、先導
配列の場合において接触していること、読み取り相(rea
ding phase) で接触していることを意味する。
より発現される。発現ベクターは異種ＤＮＡ配列を暗号
化するＤＮＡ配列を意図する宿主中の異種ＤＮＡ配列に
より遺伝暗号を指定したタンパク質またはタンパク質サ
ブユニットの発現に影響を与えることができる適当な制
御配列に操作可能に結合される再製可能なＤＮＡ構成体
である。一般に、制御配列には転写プロモーター、転写
を制御するための任意のオペレーター配列、適当なｍＲ
ＮＡリボソーム結合部位を暗号化する配列、ならびに
（任意に）転写および翻訳の終結を制御する配列が含ま
れる。本発明の実施に有用なベクターにはプラスミド、
ウイルス（ファージを含む）、および組み込み可能な(i
ntegratable)ＤＮＡフラグメント（すなわち、相同組み
換えにより宿主ゲノムに組み込み可能なフラグメント）
が含まれる。ベクターは、プラスミドの場合、宿主ゲノ
ムとは無関係に再製し機能することができるが、組み込
み可能なＤＮＡフラグメントの場合には、ゲノム自体に
組み込むことができる。適当なベクターには意図する発
現宿主に親和性のある種から誘導した制御配列およびレ
プリコンが含まれる場合がある。例えば、宿主細胞で操
作可能なプロモーターはこの細胞のＲＮＡポリメラーゼ
に結合するものであり、宿主細胞で操作可能なリボソー
ム結合部位はこの細胞の内因性リボソームに結合するも
のである。ＤＮＡ領域はこれらが互いに機能的に関連す
る場合に操作可能に結合される。例えば：プロモーター
はこれが配列の転写を制御する場合には暗号配列に操作
可能に結合され；リボソーム結合部位はこれを翻訳が可
能になるように配置する場合には暗号配列に操作可能に
結合される。一般に、操作可能に結合させたとは、先導
配列の場合において接触していること、読み取り相(rea
ding phase) で接触していることを意味する。
【００１１】本発明の形質転換した宿主細胞は組み換え
ＤＮＡ技術を用いて構成したベクターでトランスフェク
ションしたかまたは形質転換した細胞であり、異種ＤＮ
Ａ配列により遺伝暗号を指定したタンパク質またはタン
パク質サブユニットを発現する。一般に、宿主細胞は内
因性Ｇタンパク質αサブユニット（酵母Ｇα) を発現す
ることができない。しかし、宿主細胞はＧタンパク質β
サブユニットとＧタンパク質γサブユニットの複合体
（Ｇβγ) を発現する。宿主細胞は内因性Ｇβγを発現
する場合があり、あるいはこれらを操作して異種Ｇαを
発現させるような同様の方法で操作して任意に異種（例
えば、哺乳類）Ｇβγを発現させる場合がある。
ＤＮＡ技術を用いて構成したベクターでトランスフェク
ションしたかまたは形質転換した細胞であり、異種ＤＮ
Ａ配列により遺伝暗号を指定したタンパク質またはタン
パク質サブユニットを発現する。一般に、宿主細胞は内
因性Ｇタンパク質αサブユニット（酵母Ｇα) を発現す
ることができない。しかし、宿主細胞はＧタンパク質β
サブユニットとＧタンパク質γサブユニットの複合体
（Ｇβγ) を発現する。宿主細胞は内因性Ｇβγを発現
する場合があり、あるいはこれらを操作して異種Ｇαを
発現させるような同様の方法で操作して任意に異種（例
えば、哺乳類）Ｇβγを発現させる場合がある。
【００１２】酵母細胞を形質転換するための種々の培養
酵母、および適当な発現ベクターが知られている。例え
ば、米国特許第 4,745,057号; 米国特許第 4,797,359
号; 米国特許第 4,615,974号; 米国特許第 4,880,734
号; 米国特許第 4,711,844号; および米国特許第 4,86
5,989号を参照。サッカロミセスセレビシエ(Saccharomy
cescerevisiae)は酵母の中で最も普通に用いられるが、
他の多数の株も普通に入手することができる。例えば、
米国特許第 4,806,472号〔クルベロミセスラクチス(Klu
veromyces lactis) およびこれらの発現ベクター〕；第
4,855,231号〔ピチアパストリス(Pichia pastoris) お
よびこれらの発現ベクター〕を参照。酵母ベクターは２
ミクロン酵母プラスミドからの複製の開始点または自律
複製配列[autonomously replicating sequence(ARS)]、
プロモーター、異種ＤＮＡ配列を暗号化したＤＮＡ、ポ
リアデニル化および転写の終結のための配列、および選
択遺伝子を含む場合がある。典型的なプラスミドはＹＲ
ｐ７[ スティンコム(Stinchcomb)ら、「Nature」 282、
39ページ (1979); キングスマン(Kingsman)ら、「Gen
e」 7、 141ページ(1979); チェンパー(Tschemper)
ら、「Gene」10、 157ページ(1980)] である。このプラ
スミドはトリプトファン中で増殖能力を欠く突然変異株
の酵母の選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子を含
む、例えばＡＴＣＣ No.44076 またはＰＥＡ４−１〔ジ
ョーンズ(Jones) の「Genetics」85、12ページ(197
7)〕。次いで酵母宿主細胞ゲノム中のＴＲＰ１の遺伝的
変異の存在はトリプトファンを含まない状態で増殖させ
ることによる形質転換の検出に有効な環境を提供する。
酵母、および適当な発現ベクターが知られている。例え
ば、米国特許第 4,745,057号; 米国特許第 4,797,359
号; 米国特許第 4,615,974号; 米国特許第 4,880,734
号; 米国特許第 4,711,844号; および米国特許第 4,86
5,989号を参照。サッカロミセスセレビシエ(Saccharomy
cescerevisiae)は酵母の中で最も普通に用いられるが、
他の多数の株も普通に入手することができる。例えば、
米国特許第 4,806,472号〔クルベロミセスラクチス(Klu
veromyces lactis) およびこれらの発現ベクター〕；第
4,855,231号〔ピチアパストリス(Pichia pastoris) お
よびこれらの発現ベクター〕を参照。酵母ベクターは２
ミクロン酵母プラスミドからの複製の開始点または自律
複製配列[autonomously replicating sequence(ARS)]、
プロモーター、異種ＤＮＡ配列を暗号化したＤＮＡ、ポ
リアデニル化および転写の終結のための配列、および選
択遺伝子を含む場合がある。典型的なプラスミドはＹＲ
ｐ７[ スティンコム(Stinchcomb)ら、「Nature」 282、
39ページ (1979); キングスマン(Kingsman)ら、「Gen
e」 7、 141ページ(1979); チェンパー(Tschemper)
ら、「Gene」10、 157ページ(1980)] である。このプラ
スミドはトリプトファン中で増殖能力を欠く突然変異株
の酵母の選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子を含
む、例えばＡＴＣＣ No.44076 またはＰＥＡ４−１〔ジ
ョーンズ(Jones) の「Genetics」85、12ページ(197
7)〕。次いで酵母宿主細胞ゲノム中のＴＲＰ１の遺伝的
変異の存在はトリプトファンを含まない状態で増殖させ
ることによる形質転換の検出に有効な環境を提供する。
【００１３】酵母ベクター中の適当な促進配列(promoti
ng sequence)にはメタロチオネイン、３−ホスホグリセ
リン酸キナーゼ〔ヒッツマン(Hitzeman)らの「J.Biol.C
hem.」 255、2073ページ(1980)〕または他の解糖系酵素
(glycolytic enzyme) 〔ヘス(Hess)らの「J.Adv.Enzyme
Reg. 」 7、 149ページ(1968); およびホーランド(Hol
land) らの「Biochemistry」17、4900ページ(1978)〕、
例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボ
キシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６
−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムター
ゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラー
ゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ(phosphoglucose is
omerase)およびグルコキナーゼのためのプロモーターが
含まれる。また酵母の発現で用いる適当なベクターおよ
びプロモーターはアール．ヒッツマン(R.Hitzeman)らの
欧州特許出願公開第73,657号明細書に開示されている。
増殖条件により制御された転写の他の利点を有する、他
のプロモーターはアルコールデヒドロゲナーゼ２、イソ
シトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝と関連す
る分解酵素(degradative enzyme)、ならびに上述のメタ
ロチオネインおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ、さらにマルトースおよびガラクトース
の利用を担う酵素のためのプロモーター領域である。
ng sequence)にはメタロチオネイン、３−ホスホグリセ
リン酸キナーゼ〔ヒッツマン(Hitzeman)らの「J.Biol.C
hem.」 255、2073ページ(1980)〕または他の解糖系酵素
(glycolytic enzyme) 〔ヘス(Hess)らの「J.Adv.Enzyme
Reg. 」 7、 149ページ(1968); およびホーランド(Hol
land) らの「Biochemistry」17、4900ページ(1978)〕、
例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボ
キシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６
−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムター
ゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラー
ゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ(phosphoglucose is
omerase)およびグルコキナーゼのためのプロモーターが
含まれる。また酵母の発現で用いる適当なベクターおよ
びプロモーターはアール．ヒッツマン(R.Hitzeman)らの
欧州特許出願公開第73,657号明細書に開示されている。
増殖条件により制御された転写の他の利点を有する、他
のプロモーターはアルコールデヒドロゲナーゼ２、イソ
シトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝と関連す
る分解酵素(degradative enzyme)、ならびに上述のメタ
ロチオネインおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ、さらにマルトースおよびガラクトース
の利用を担う酵素のためのプロモーター領域である。
【００１４】適当な発現プラスミドを構成する場合、さ
らにこれらの遺伝子と関連する終結配列が異種の遺伝暗
号を指定する配列の発現ベクターの３′側につながれ、
ｍＲＮＡのポリアデニル化および終結を提供する場合が
ある。
らにこれらの遺伝子と関連する終結配列が異種の遺伝暗
号を指定する配列の発現ベクターの３′側につながれ、
ｍＲＮＡのポリアデニル化および終結を提供する場合が
ある。
【００１５】ここに記載した特に本発明の実施に有用な
新規ＤＮＡ発現ベクターは少なくとも酵母Ｇタンパク質
結合受容体の一番端のアミノ末端暗号配列のフラグメン
トから成る第１セグメントおよび前記第１セグメントの
下流でさらに正確な読み取り枠内の第２セグメントを含
み、第２セグメントは異種Ｇタンパク質結合受容体 (例
えば、哺乳類Ｇタンパク質結合受容体) を暗号化するＤ
ＮＡ配列から成る。好適例において、このベクターはプ
ラスミドから成る。かかるベクターを構成する場合、異
種Ｇタンパク質結合受容体の一番端のアミノ末端暗号配
列のフラグメントを欠失させる場合がある。第１および
第２セグメントは酵母細胞中で効果的なＧＡＬ１プロモ
ーターのようなプロモーターと効果的に結合する。かか
るベクターを構成するのに用いられる酵母Ｇタンパク質
結合受容体の暗号配列は酵母フェロモン受容体を暗号化
する遺伝子配列（例えば、α因子受容体を暗号化するＳ
ＴＥ２遺伝子、およびａ因子受容体を暗号化するＳＴＥ
３遺伝子）により例示される。少なくとも酵母Ｇタンパ
ク質結合受容体遺伝子の５′非翻訳領域のフラグメント
（例えば、酵母フェロモン受容体遺伝子；前記参照）を
第１セグメントの上流に配置し効果的にこれに結合する
場合これらの新規ベクターから得た発現のレベルが高め
られる。
新規ＤＮＡ発現ベクターは少なくとも酵母Ｇタンパク質
結合受容体の一番端のアミノ末端暗号配列のフラグメン
トから成る第１セグメントおよび前記第１セグメントの
下流でさらに正確な読み取り枠内の第２セグメントを含
み、第２セグメントは異種Ｇタンパク質結合受容体 (例
えば、哺乳類Ｇタンパク質結合受容体) を暗号化するＤ
ＮＡ配列から成る。好適例において、このベクターはプ
ラスミドから成る。かかるベクターを構成する場合、異
種Ｇタンパク質結合受容体の一番端のアミノ末端暗号配
列のフラグメントを欠失させる場合がある。第１および
第２セグメントは酵母細胞中で効果的なＧＡＬ１プロモ
ーターのようなプロモーターと効果的に結合する。かか
るベクターを構成するのに用いられる酵母Ｇタンパク質
結合受容体の暗号配列は酵母フェロモン受容体を暗号化
する遺伝子配列（例えば、α因子受容体を暗号化するＳ
ＴＥ２遺伝子、およびａ因子受容体を暗号化するＳＴＥ
３遺伝子）により例示される。少なくとも酵母Ｇタンパ
ク質結合受容体遺伝子の５′非翻訳領域のフラグメント
（例えば、酵母フェロモン受容体遺伝子；前記参照）を
第１セグメントの上流に配置し効果的にこれに結合する
場合これらの新規ベクターから得た発現のレベルが高め
られる。
【００１６】ＧβγからのＧαの解離を検出するための
任意の種々の手段を本発明と関連して用いることができ
る。この細胞は粉砕されこれらのサブユニットと複合体
の比は物理的に（例えば、クロマトグラフィーにより）
測定される。細胞は粉砕されＧαの存在量は単離体のＧ
αが所有する酵素活性（すなわち、ＧＴＰをＧＤＰに加
水分解する能力）をアッセイすることにより直接アッセ
イした。ＧＴＰまたはＧＤＰのどちらがＧタンパク質に
結合するかはＧタンパク質がＧαまたはＧβγ複合体の
どちらで存在するかに依存することから、解離は放射性
標識したＧＴＰを用いて証明される場合がある。次に記
載するように、細胞の形態上の変化が観察される場合が
ある。しかし、特に都合のよい方法は細胞に第３の異種
ＤＮＡ配列を供給することであり、第３の異種ＤＮＡ配
列はフェロモン応答プロモーターおよびフェロモン応答
プロモーターの下流に配置し効果的にこれに結合させた
指示遺伝子から成る。この配列はベクターとともに、こ
こに詳細に記載するように挿入することができる。かか
る配列を適切に用いることで、細胞内の指示遺伝子の発
現を監視することにより検出工程を実施することができ
る。任意の種々のフェロモン応答プロモーター、例えば
ＢＡＲ１遺伝子プロモーターおよびＦＵＳ１遺伝子プロ
モーターを用いることができる。同様に、任意の広範な
指示遺伝子、例えばＨＩＳ３遺伝子およびＬａｃＺ遺伝
子を用いることができる。
任意の種々の手段を本発明と関連して用いることができ
る。この細胞は粉砕されこれらのサブユニットと複合体
の比は物理的に（例えば、クロマトグラフィーにより）
測定される。細胞は粉砕されＧαの存在量は単離体のＧ
αが所有する酵素活性（すなわち、ＧＴＰをＧＤＰに加
水分解する能力）をアッセイすることにより直接アッセ
イした。ＧＴＰまたはＧＤＰのどちらがＧタンパク質に
結合するかはＧタンパク質がＧαまたはＧβγ複合体の
どちらで存在するかに依存することから、解離は放射性
標識したＧＴＰを用いて証明される場合がある。次に記
載するように、細胞の形態上の変化が観察される場合が
ある。しかし、特に都合のよい方法は細胞に第３の異種
ＤＮＡ配列を供給することであり、第３の異種ＤＮＡ配
列はフェロモン応答プロモーターおよびフェロモン応答
プロモーターの下流に配置し効果的にこれに結合させた
指示遺伝子から成る。この配列はベクターとともに、こ
こに詳細に記載するように挿入することができる。かか
る配列を適切に用いることで、細胞内の指示遺伝子の発
現を監視することにより検出工程を実施することができ
る。任意の種々のフェロモン応答プロモーター、例えば
ＢＡＲ１遺伝子プロモーターおよびＦＵＳ１遺伝子プロ
モーターを用いることができる。同様に、任意の広範な
指示遺伝子、例えばＨＩＳ３遺伝子およびＬａｃＺ遺伝
子を用いることができる。
【００１７】
【発明の効果】上述のように、本発明の形質転換した宿
主細胞は異種ＤＮＡ配列により遺伝暗号を指定されたタ
ンパク質またはタンパク質サブユニットを発現する。発
現した場合、Ｇタンパク質結合受容体は宿主細胞膜内に
配置される（すなわち、細胞膜の外側でリガンドを立体
特異的に結合させ細胞膜の細胞質側でＧタンパク質と機
能的に相互作用させるために適当な配向でこれらに物理
的に配置される）。異種アドレナリン受容体およびこの
同種のＧタンパク質αサブユニットの発現により酵母フ
ェロモン応答経路を制御する能力は哺乳類Ｇタンパク質
結合受容体の構造上のおよび機能上の特徴づけを促進す
る可能性を有する。増殖の停止またはβガラクトシダー
ゼの誘導のような応答の記録により、次に変異受容体の
機能的特性を迅速に試験することができる。同様に、推
定されている他のＧタンパク質結合受容体の遺伝子を単
離した際、多数のリガンドを予備選択して以前未確認で
あった受容体に対して活性を有するリガンドを確認する
ことができる。エフ.リバート(F.Libert)らの「Science
」 244、 569ページ(1989)；エム．エス．チー(M.S.Ch
ee)らの「Nature」 344、 774ページ(1990)を参照。さ
らに、推定されている他のＧタンパク質αサブユニット
の遺伝暗号を指定している遺伝子を単離し、これらを本
発明の細胞中で発現させて種々のＧタンパク質結合受容
体およびリガンドで予備選抜してこれらのサブユニット
を特徴づけることができる。またこれらの細胞を用いて
受容体−Ｇタンパク質相互作用に影響を及ぼす化合物を
予備選択することができる。本発明の細胞はマイクロタ
イタープレートのウエルに既知の、所定量で配置して上
述の種々のスクリーニング方法に従って化合物をスクリ
ーニングするために有用な標準化したキットを提供する
ことができる。
主細胞は異種ＤＮＡ配列により遺伝暗号を指定されたタ
ンパク質またはタンパク質サブユニットを発現する。発
現した場合、Ｇタンパク質結合受容体は宿主細胞膜内に
配置される（すなわち、細胞膜の外側でリガンドを立体
特異的に結合させ細胞膜の細胞質側でＧタンパク質と機
能的に相互作用させるために適当な配向でこれらに物理
的に配置される）。異種アドレナリン受容体およびこの
同種のＧタンパク質αサブユニットの発現により酵母フ
ェロモン応答経路を制御する能力は哺乳類Ｇタンパク質
結合受容体の構造上のおよび機能上の特徴づけを促進す
る可能性を有する。増殖の停止またはβガラクトシダー
ゼの誘導のような応答の記録により、次に変異受容体の
機能的特性を迅速に試験することができる。同様に、推
定されている他のＧタンパク質結合受容体の遺伝子を単
離した際、多数のリガンドを予備選択して以前未確認で
あった受容体に対して活性を有するリガンドを確認する
ことができる。エフ.リバート(F.Libert)らの「Science
」 244、 569ページ(1989)；エム．エス．チー(M.S.Ch
ee)らの「Nature」 344、 774ページ(1990)を参照。さ
らに、推定されている他のＧタンパク質αサブユニット
の遺伝暗号を指定している遺伝子を単離し、これらを本
発明の細胞中で発現させて種々のＧタンパク質結合受容
体およびリガンドで予備選抜してこれらのサブユニット
を特徴づけることができる。またこれらの細胞を用いて
受容体−Ｇタンパク質相互作用に影響を及ぼす化合物を
予備選択することができる。本発明の細胞はマイクロタ
イタープレートのウエルに既知の、所定量で配置して上
述の種々のスクリーニング方法に従って化合物をスクリ
ーニングするために有用な標準化したキットを提供する
ことができる。
【００１８】
【実施例】次の実施例は本発明の種々の観点をさらに例
示するために提供する。これらは本発明を限定するもの
として解釈すべきではない。実施例１ ヒトβ 2 アドレナリン発現ベクターｐＹβＡＲ２の構成
および酵母における発現 酵母でヒトβ2 アドレナリン受容体（ｈβＡＲ）の高レ
ベル発現を達成するため、修飾したｈβＡＲ遺伝子を多
コピーベクター、ＹＥｐ２４（ｐＹβＡＲ２）のＧＡＬ
１プロモーターの制御下に配置した。図１は酵母発現プ
ラスミドｐＹβＡＲ２の構成を示す。ｐＹβＡＲ２で
は、ｈβＡＲ配列の発現はＧＡＬ１プロモーターの制御
下にある。図１Ａは５′非翻訳領域およびｐＴＺＮＡＲ
のｈβＡＲ遺伝子の暗号配列の最初の63塩基対（ｂｐ）
を示し、ビー．オー′ドード(B. O ′Dowd) ら、「J.Bi
ol.Chem.」 263、 15985ページ(1988)、これをＡａｔ I
I 開裂により除去されＳＴＥ２遺伝子(SEQ ID NO:1;SEQ
ID NO:2) からの11ｂｐの非暗号配列および42ｂｐの暗
号配列に対応する合成オリゴヌクレオチドで置換した。
エヌ．ナカヤマ(N.Nakayama)らの「EMBOJ.」 4、2643ペ
ージ(1985)；エイ．ブルクホルダー(A.Burkholder)およ
びエル．ハートウェル(L.Hartwell)の「Nucleic Acids
Res.」13、8463ページ(1985)を参照。得られたプラスミ
ド、 ｐＴＺＹＮＡＲはSEQ ID NO:3 としてここに記載
した３′Ｈｉｎｄ III部位を有する非暗号配列において
Ｈｉｎｄ III部位により側面を接する修飾したｈβＡＲ
遺伝子を含む。Ｈｉｎｄ III −Ｈｉｎｄ IIIフラグメ
ントをｐＴＺＹＮＡＲから単離し修飾したｈβＡＲ遺伝
子の３′非翻訳配列に次いで酵母ＡＤＨ１遺伝子からの
終結配列を含む 450ｂｐが続くようにｐＡＡＨ５に挿入
した。ジー．アメラー(G.Ammerer) の「Methods.Enzymo
l.」 101、 192ページ(1983)を参照。図１Ｂに示すよう
に、ｐｙβＡＲ２はＹＥｐＧ24中にｈβＡＲおよびＡＤ
Ｈ１配列を含むＢａｍ HI −Ｂａｍ HI フラグメントを
挿入することにより構成した。イー．ウィコフ(E.Wycko
ff) およびティー．ヒセー(T.Hsieh) の「Proc.Natl.Ac
ad.Sci. U.S.A.」85、6272ページ(1988)を参照。最大の
発現が調査され、細胞をＬＡＣ９、ＧＡＬ１調節転写に
必要なS.cerevisiae ＧＡＬ４トランス作用転写活性タ
ンパク質(transactivater protein)の異種相同物を含む
プラスミドｐＭＴＬ９（Dr.S.Johnston から入手）で共
形質転換した。ジェイ．サルメロン(J.Salmeron)らの
「Mol.Cell.Biol.」 9、2950ページ(1989)を参照。後期
指数期にまで増殖した細胞を３％のガラクトースを含
み、約10μＭのアルプレノロールを追加した培地中で誘
導し、さらに36時間増殖させた。細胞の維持のために標
準法を使用した。エフ．シェルマン(F.Sherman) らの
「Method in Yeast Genetics（ニューヨーク州コールド
スプリングハーバー所在のコールドスプリングハーバー
研究所、1986年）」を参照。最大の発現は(i) トランス
作用転写活性タンパク質（ＬＡＣ９）の発現、(ii)酵母
ＳＴＥ２（α因子受容体）遺伝子の対応する領域を有す
るｈβＡＲ遺伝子の５′非翻訳領域および一番端のアミ
ノ末端暗号配列の置換、(iii) 細胞増殖が後期指数期に
達した際のガラクトースでの誘導、および(iv)誘導の間
の増殖培地にアドレナリン性リガンドを包含することを
必要とした。プラスミドｐＹβＡＲ２をブタペスト条約
の規定に従って米国メリーランド州20852 、ロックビ
ル、パークロウンドライブ12301 所在のアメリカンタイ
プカルチャーコレクションに１９９０年９月１１日に寄
託し、ＡＴＣＣ受諾No.40891が割り当てられた。
示するために提供する。これらは本発明を限定するもの
として解釈すべきではない。実施例１ ヒトβ 2 アドレナリン発現ベクターｐＹβＡＲ２の構成
および酵母における発現 酵母でヒトβ2 アドレナリン受容体（ｈβＡＲ）の高レ
ベル発現を達成するため、修飾したｈβＡＲ遺伝子を多
コピーベクター、ＹＥｐ２４（ｐＹβＡＲ２）のＧＡＬ
１プロモーターの制御下に配置した。図１は酵母発現プ
ラスミドｐＹβＡＲ２の構成を示す。ｐＹβＡＲ２で
は、ｈβＡＲ配列の発現はＧＡＬ１プロモーターの制御
下にある。図１Ａは５′非翻訳領域およびｐＴＺＮＡＲ
のｈβＡＲ遺伝子の暗号配列の最初の63塩基対（ｂｐ）
を示し、ビー．オー′ドード(B. O ′Dowd) ら、「J.Bi
ol.Chem.」 263、 15985ページ(1988)、これをＡａｔ I
I 開裂により除去されＳＴＥ２遺伝子(SEQ ID NO:1;SEQ
ID NO:2) からの11ｂｐの非暗号配列および42ｂｐの暗
号配列に対応する合成オリゴヌクレオチドで置換した。
エヌ．ナカヤマ(N.Nakayama)らの「EMBOJ.」 4、2643ペ
ージ(1985)；エイ．ブルクホルダー(A.Burkholder)およ
びエル．ハートウェル(L.Hartwell)の「Nucleic Acids
Res.」13、8463ページ(1985)を参照。得られたプラスミ
ド、 ｐＴＺＹＮＡＲはSEQ ID NO:3 としてここに記載
した３′Ｈｉｎｄ III部位を有する非暗号配列において
Ｈｉｎｄ III部位により側面を接する修飾したｈβＡＲ
遺伝子を含む。Ｈｉｎｄ III −Ｈｉｎｄ IIIフラグメ
ントをｐＴＺＹＮＡＲから単離し修飾したｈβＡＲ遺伝
子の３′非翻訳配列に次いで酵母ＡＤＨ１遺伝子からの
終結配列を含む 450ｂｐが続くようにｐＡＡＨ５に挿入
した。ジー．アメラー(G.Ammerer) の「Methods.Enzymo
l.」 101、 192ページ(1983)を参照。図１Ｂに示すよう
に、ｐｙβＡＲ２はＹＥｐＧ24中にｈβＡＲおよびＡＤ
Ｈ１配列を含むＢａｍ HI −Ｂａｍ HI フラグメントを
挿入することにより構成した。イー．ウィコフ(E.Wycko
ff) およびティー．ヒセー(T.Hsieh) の「Proc.Natl.Ac
ad.Sci. U.S.A.」85、6272ページ(1988)を参照。最大の
発現が調査され、細胞をＬＡＣ９、ＧＡＬ１調節転写に
必要なS.cerevisiae ＧＡＬ４トランス作用転写活性タ
ンパク質(transactivater protein)の異種相同物を含む
プラスミドｐＭＴＬ９（Dr.S.Johnston から入手）で共
形質転換した。ジェイ．サルメロン(J.Salmeron)らの
「Mol.Cell.Biol.」 9、2950ページ(1989)を参照。後期
指数期にまで増殖した細胞を３％のガラクトースを含
み、約10μＭのアルプレノロールを追加した培地中で誘
導し、さらに36時間増殖させた。細胞の維持のために標
準法を使用した。エフ．シェルマン(F.Sherman) らの
「Method in Yeast Genetics（ニューヨーク州コールド
スプリングハーバー所在のコールドスプリングハーバー
研究所、1986年）」を参照。最大の発現は(i) トランス
作用転写活性タンパク質（ＬＡＣ９）の発現、(ii)酵母
ＳＴＥ２（α因子受容体）遺伝子の対応する領域を有す
るｈβＡＲ遺伝子の５′非翻訳領域および一番端のアミ
ノ末端暗号配列の置換、(iii) 細胞増殖が後期指数期に
達した際のガラクトースでの誘導、および(iv)誘導の間
の増殖培地にアドレナリン性リガンドを包含することを
必要とした。プラスミドｐＹβＡＲ２をブタペスト条約
の規定に従って米国メリーランド州20852 、ロックビ
ル、パークロウンドライブ12301 所在のアメリカンタイ
プカルチャーコレクションに１９９０年９月１１日に寄
託し、ＡＴＣＣ受諾No.40891が割り当てられた。
【００１９】実施例２ ｐＹβＡＲ２で形質転換した酵母のｈβＡＲリガンドの
結合親和力 細胞表面受容体の本来の機能は他の細胞外刺激中から適
当なリガンドだけを認識することである。従って、リガ
ンド結合親和力を決定して酵母で発現されたｈβＡＲの
機能的な完全性を確立した。詳細を次に記載するよう
に、拮抗薬、125Ｉ標識シアノピンドロール(cyanopindo
lol)( 125Ｉ−ＣＹＰ）を飽和するように、ｐＹβＡＲ
２で形質転換した酵母細胞から調製した膜に対して高い
親和力で結合した。一連の作動薬で 125Ｉ−ＣＹＰを置
換することによりｈβＡＲの期待される効力および立体
特異性の程度を観察した。ｐＹβＡＲ２（ＵＲＡ３）お
よびｐＭＴＬ９（ＬＥＵ２）が含まれるＳＣ261細胞
（ＭＡＴａ ｕｒａ３−52 ｔｒｐｌ ｌｅｕ２ ｐｒ
ｂ１−1122 ｐｅｐ４−３ ｐｒｃｌ−40） 〔エス．
ジョンストン(Dr.S.Johnston) から入手〕を最少グルコ
ースフリー選択培地で後期対数期(OD600=5.0) まで増殖
させ、次いで３％のガラクトースおよび40μＭのアルプ
レノロールを添加して誘導した。36時間後、細胞を収穫
し記載したようにスフェロプラストを調製した。E.Wyck
off および T.Hsiehの「Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 」
85、6272ページ(1988)を参照。簡単には、スフェロプラ
ストを50mMのトリス−塩酸pH7.4 、5mＭのＥＤＴＡ中で
再懸濁しガラスビーズを用いた渦流混合により４℃で３
度１分間溶解した。粗膜を溶解液から調製し 125Ｉ−Ｃ
ＹＰとの結合を以前記載した方法によりアッセイした。
H.Dohlman らの「Biochemistry」29、2335ページ(1990)
を参照。図２はｐＹβＡＲ２で形質転換した酵母細胞由
来の膜に対するｈβＡＲリガンドの結合を示す。(A)
125Ｉ−ＣＹＰ濃度を変化させること(5〜 400pM) によ
りＢmax （最大リガンド結合) およびＫd （リガンド解
離定数）値を決定した。特異的結合は全結合（丸で示
す）から10μＭの（−）アルプレノロールの存在下で測
定した非特異的結合（四角で示す）を引いた量として定
義する。 125Ｉ−ＣＹＰ結合のために93pMのＫd を得て
作動薬親和力（次の）を計算するために用いた。(B) 種
々の濃度の作動薬を使用した18pMの 125Ｉ−ＣＹＰの置
換を用いて受容体結合のための明らかに低い親和力Ｋi
値（50μＭのＧＴＰの存在下に決定した非Ｇタンパク質
結合) を決定した、四角；（−) イソプロテレノール、
丸；（−）エピネフリン、下方に尖った三角；（＋）イ
ソプロテレノール、上方に尖った三角；（−）ノルエピ
ネフリン。
結合親和力 細胞表面受容体の本来の機能は他の細胞外刺激中から適
当なリガンドだけを認識することである。従って、リガ
ンド結合親和力を決定して酵母で発現されたｈβＡＲの
機能的な完全性を確立した。詳細を次に記載するよう
に、拮抗薬、125Ｉ標識シアノピンドロール(cyanopindo
lol)( 125Ｉ−ＣＹＰ）を飽和するように、ｐＹβＡＲ
２で形質転換した酵母細胞から調製した膜に対して高い
親和力で結合した。一連の作動薬で 125Ｉ−ＣＹＰを置
換することによりｈβＡＲの期待される効力および立体
特異性の程度を観察した。ｐＹβＡＲ２（ＵＲＡ３）お
よびｐＭＴＬ９（ＬＥＵ２）が含まれるＳＣ261細胞
（ＭＡＴａ ｕｒａ３−52 ｔｒｐｌ ｌｅｕ２ ｐｒ
ｂ１−1122 ｐｅｐ４−３ ｐｒｃｌ−40） 〔エス．
ジョンストン(Dr.S.Johnston) から入手〕を最少グルコ
ースフリー選択培地で後期対数期(OD600=5.0) まで増殖
させ、次いで３％のガラクトースおよび40μＭのアルプ
レノロールを添加して誘導した。36時間後、細胞を収穫
し記載したようにスフェロプラストを調製した。E.Wyck
off および T.Hsiehの「Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 」
85、6272ページ(1988)を参照。簡単には、スフェロプラ
ストを50mMのトリス−塩酸pH7.4 、5mＭのＥＤＴＡ中で
再懸濁しガラスビーズを用いた渦流混合により４℃で３
度１分間溶解した。粗膜を溶解液から調製し 125Ｉ−Ｃ
ＹＰとの結合を以前記載した方法によりアッセイした。
H.Dohlman らの「Biochemistry」29、2335ページ(1990)
を参照。図２はｐＹβＡＲ２で形質転換した酵母細胞由
来の膜に対するｈβＡＲリガンドの結合を示す。(A)
125Ｉ−ＣＹＰ濃度を変化させること(5〜 400pM) によ
りＢmax （最大リガンド結合) およびＫd （リガンド解
離定数）値を決定した。特異的結合は全結合（丸で示
す）から10μＭの（−）アルプレノロールの存在下で測
定した非特異的結合（四角で示す）を引いた量として定
義する。 125Ｉ−ＣＹＰ結合のために93pMのＫd を得て
作動薬親和力（次の）を計算するために用いた。(B) 種
々の濃度の作動薬を使用した18pMの 125Ｉ−ＣＹＰの置
換を用いて受容体結合のための明らかに低い親和力Ｋi
値（50μＭのＧＴＰの存在下に決定した非Ｇタンパク質
結合) を決定した、四角；（−) イソプロテレノール、
丸；（−）エピネフリン、下方に尖った三角；（＋）イ
ソプロテレノール、上方に尖った三角；（−）ノルエピ
ネフリン。
【００２０】比較例Ａ 酵母および哺乳類細胞で発現したｈβＡＲに対するリガ
ンド結合親和力 図２(A) および(B) の結合データは非線形最小自乗法回
帰により分析し、エイ．デリーン(A.DeLean)らの「Mol.
Pharmacol.」21、(1982)参照、さらに表Ｉに示す。記載
した値は３回の測定値の平均であり、２〜３度の試験を
代表する。酵母の結合親和力は以前哺乳類細胞で発現し
たｈβＡＲについて観察されたものとほとんど同一であ
った。
ンド結合親和力 図２(A) および(B) の結合データは非線形最小自乗法回
帰により分析し、エイ．デリーン(A.DeLean)らの「Mol.
Pharmacol.」21、(1982)参照、さらに表Ｉに示す。記載
した値は３回の測定値の平均であり、２〜３度の試験を
代表する。酵母の結合親和力は以前哺乳類細胞で発現し
たｈβＡＲについて観察されたものとほとんど同一であ
った。
【００２１】
【表１】酵母およびＣＯＳ−７細胞でのヒトβアドレナ
リン受容体の高レベル発現のためのリガンド結合パラメ
ータの比較* * 値は図２およびH.Dohlman らの「Biochemistry」29,2
335 ページ(1990)から導いた；±S.E.。1 Kd 、リガンド解離定数2 Bmax 、最大リガンド結合3 Ki 、阻害定数
リン受容体の高レベル発現のためのリガンド結合パラメ
ータの比較* * 値は図２およびH.Dohlman らの「Biochemistry」29,2
335 ページ(1990)から導いた；±S.E.。1 Kd 、リガンド解離定数2 Bmax 、最大リガンド結合3 Ki 、阻害定数
【００２２】実施例３ 酵母発現ｈβＡＲの接合シグナル伝達による作動薬依存
活性化 受容体の第２の主要な機能はシグナル伝達経路での下流
成分の作動薬依存調節である。酵母のフェロモン応答エ
フェクターは知られていないので、間接的な生物学的ア
ッセイが最も有効な受容体機能の指標である。K.Blumer
およびJ.Thorner の「Annu.Rev.Physiol. 」出版中；I.
Herskowitzの「Microbiol.Rev.」52、 536ページ(1988)
を参照。高濃度のｈβＡＲを発現する酵母で、接合シグ
ナル伝達の作動薬依存活性化は任意の代表的なインビボ
アッセイ；例えば、Ｇ1 期停止の賦課物(impositoin)、
遺伝子発現の誘導、形態の変化（いわゆる「シュモー」
形成）または接合の刺激により検出することができな
い。応答の欠如に対する適当な解釈はｈβＡＲが内因性
酵母Ｇタンパク質と結合することができないことであ
る。
活性化 受容体の第２の主要な機能はシグナル伝達経路での下流
成分の作動薬依存調節である。酵母のフェロモン応答エ
フェクターは知られていないので、間接的な生物学的ア
ッセイが最も有効な受容体機能の指標である。K.Blumer
およびJ.Thorner の「Annu.Rev.Physiol. 」出版中；I.
Herskowitzの「Microbiol.Rev.」52、 536ページ(1988)
を参照。高濃度のｈβＡＲを発現する酵母で、接合シグ
ナル伝達の作動薬依存活性化は任意の代表的なインビボ
アッセイ；例えば、Ｇ1 期停止の賦課物(impositoin)、
遺伝子発現の誘導、形態の変化（いわゆる「シュモー」
形成）または接合の刺激により検出することができな
い。応答の欠如に対する適当な解釈はｈβＡＲが内因性
酵母Ｇタンパク質と結合することができないことであ
る。
【００２３】実施例４ 酵母におけるｈβＡＲおよび哺乳類Ｇ S αサブユニット
の同時発現 哺乳類ＧS αサブユニットの発現はＧＰＡ１遺伝子によ
り暗号化された対応する内因性タンパク質を欠如する酵
母細胞における増殖の欠陥を修正することができる。シ
ー．ディーツェル(C.Dietzel) およびジェイ．クルジャ
ン(J.Kurjan)の「Cell」50、1001ページ(1987)を参照。
さらに、哺乳類細胞の受容体結合の特異性はＧタンパク
質のαサブユニットにより与えられる。L.Stryerおよび
H.Bourneの「Ann.Rev.Cell Biol.」 2、 391ページ(198
8)を参照。このように、酵母でのｈβＡＲおよび哺乳類
ＧS αサブユニット（ＧS α）の同時発現は酵母をアド
レナリン性リガンドに対し感受性にするめに試みられ
た。従って、銅誘導可能(copper-inducible)ＣＵＰ１プ
ロモーターの制御下にラットＧS αを暗号化するｃＤＮ
Ａを第２のプラスミド、ｐＹＳＫ 136Ｇαｓに導入し
た。C.Dietzel およびJ.Kurjanの 「Cell」50、1001ペ
ージ(1987)を参照。ｈβＡＲおよびラットＧS αを同時
発現するが、野性型ＧＰＡ１を含む酵母（ＮＮＹ19）
で、アドレナリン性作動薬誘導シュモー形成は観察され
ず、接合フェロモンに応じた酵母の特有な形態変化が観
察された。
の同時発現 哺乳類ＧS αサブユニットの発現はＧＰＡ１遺伝子によ
り暗号化された対応する内因性タンパク質を欠如する酵
母細胞における増殖の欠陥を修正することができる。シ
ー．ディーツェル(C.Dietzel) およびジェイ．クルジャ
ン(J.Kurjan)の「Cell」50、1001ページ(1987)を参照。
さらに、哺乳類細胞の受容体結合の特異性はＧタンパク
質のαサブユニットにより与えられる。L.Stryerおよび
H.Bourneの「Ann.Rev.Cell Biol.」 2、 391ページ(198
8)を参照。このように、酵母でのｈβＡＲおよび哺乳類
ＧS αサブユニット（ＧS α）の同時発現は酵母をアド
レナリン性リガンドに対し感受性にするめに試みられ
た。従って、銅誘導可能(copper-inducible)ＣＵＰ１プ
ロモーターの制御下にラットＧS αを暗号化するｃＤＮ
Ａを第２のプラスミド、ｐＹＳＫ 136Ｇαｓに導入し
た。C.Dietzel およびJ.Kurjanの 「Cell」50、1001ペ
ージ(1987)を参照。ｈβＡＲおよびラットＧS αを同時
発現するが、野性型ＧＰＡ１を含む酵母（ＮＮＹ19）
で、アドレナリン性作動薬誘導シュモー形成は観察され
ず、接合フェロモンに応じた酵母の特有な形態変化が観
察された。
【００２４】実施例５ 内因性Ｇタンパク質αサブユニットを欠如する酵母にお
けるｈβＡＲおよび哺乳類Ｇ S αサブユニットの同時発
現 内因性酵母Ｇタンパク質αサブユニットによる干渉を防
止するため、ｇｐａ１突然変異細胞（８ｃ株）を用い
た。酵母株８ｃ（ＭＡＴａ ｕｒａ３ ｌｅｕ２ ｈｉ
ｓ３ ｔｒｐｌ ｇｐａｌ：：Ｈ１Ｓ３）、アイ．ミ
ヤジマ(I.Miyajima)らの「Cell」50、1011ページ(198
7)、担体プラスミド(carrying plasmid)ｐＹＳＫ 136Ｇ
αｓ（ＴＲＰ１）、C.Dietzel およびJ.Kurjanの「Cel
l」50、1001ページ(1987)、ｐＭＴＬ９（ＬＥＵ２）、
J.Salmeronらの「Mol.Cell.Biol.」 9、2950ページ(198
9)、およびｐＹβＡＲ２（ＵＲＡ３）を３％のグリセロ
ール、２％の乳酸、50μＭのCuSO4 および３％のガラク
トースを含むグルコースフリーの最小選択プレートに維
持した。コロニーを0.5mＭのアスコルビン酸および望ま
しいアドレナリン性リガンドを含む同様のプレートに移
しかえた。30℃で16〜20時間の後、コロニーを106 〜10
7 細胞／mlの密度で同様の液体培地に移しかえ位相差顕
微鏡により試験した。ｐＹβＡＲ２、ｐＭＴＬ９、およ
びｐＹＳＫ 136Ｇαｓで共形質転換した酵母細胞の形態
は(A) アドレナリン性薬品を含まず；(B)100μＭの
（−）イソプロテレノール；(C)100μＭの （−）イソ
プロテレノールおよび50μＭの（−）アルプレノロー
ル；および(D)100μＭの（＋）イソプロテレノールとと
もに温置した後試験した。結果はｈβＡＲおよびラット
ＧS αを同時発現する８ｃ細胞のβアドレナリン性作動
薬イソプロテレノールを用いた処理が実際にシュモー形
成を誘導し、この効果が特定の拮抗薬アルプレノロール
により阻害されることを示した。
けるｈβＡＲおよび哺乳類Ｇ S αサブユニットの同時発
現 内因性酵母Ｇタンパク質αサブユニットによる干渉を防
止するため、ｇｐａ１突然変異細胞（８ｃ株）を用い
た。酵母株８ｃ（ＭＡＴａ ｕｒａ３ ｌｅｕ２ ｈｉ
ｓ３ ｔｒｐｌ ｇｐａｌ：：Ｈ１Ｓ３）、アイ．ミ
ヤジマ(I.Miyajima)らの「Cell」50、1011ページ(198
7)、担体プラスミド(carrying plasmid)ｐＹＳＫ 136Ｇ
αｓ（ＴＲＰ１）、C.Dietzel およびJ.Kurjanの「Cel
l」50、1001ページ(1987)、ｐＭＴＬ９（ＬＥＵ２）、
J.Salmeronらの「Mol.Cell.Biol.」 9、2950ページ(198
9)、およびｐＹβＡＲ２（ＵＲＡ３）を３％のグリセロ
ール、２％の乳酸、50μＭのCuSO4 および３％のガラク
トースを含むグルコースフリーの最小選択プレートに維
持した。コロニーを0.5mＭのアスコルビン酸および望ま
しいアドレナリン性リガンドを含む同様のプレートに移
しかえた。30℃で16〜20時間の後、コロニーを106 〜10
7 細胞／mlの密度で同様の液体培地に移しかえ位相差顕
微鏡により試験した。ｐＹβＡＲ２、ｐＭＴＬ９、およ
びｐＹＳＫ 136Ｇαｓで共形質転換した酵母細胞の形態
は(A) アドレナリン性薬品を含まず；(B)100μＭの
（−）イソプロテレノール；(C)100μＭの （−）イソ
プロテレノールおよび50μＭの（−）アルプレノロー
ル；および(D)100μＭの（＋）イソプロテレノールとと
もに温置した後試験した。結果はｈβＡＲおよびラット
ＧS αを同時発現する８ｃ細胞のβアドレナリン性作動
薬イソプロテレノールを用いた処理が実際にシュモー形
成を誘導し、この効果が特定の拮抗薬アルプレノロール
により阻害されることを示した。
【００２５】実施例６ βガラクトシダーゼのシグナル配列を含む酵母における
ｈβＡＲおよび哺乳類Ｇ S αサブユニットの同時発現 ｈβＡＲおよびラットＧS αを同時発現する８ｃ細胞を
イソプロテレノールで誘導した形態学的応答はこれらの
成分が互いにおよび内因性Ｇαサブユニットを欠如する
酵母でフェロモン応答経路の下流成分に結合することが
できることを示唆している。フェロモンシグナル経路が
ｈβＡＲおよびラットＧS αにより活性化されることを
確認するため、フェロモン応答ＦＵＳ１遺伝子プロモー
ターの作動薬誘導をＦＵＳ１−ｌａｃＺ遺伝子融合がゲ
ノムに確実に組み込まれた８ｃ細胞（８ｃ１）から誘導
した酵母の系統で測定した。エス．ノモト(S.Nomoto)ら
の「EMBO J. 」 9、 691ページ(1990)を参照。系統８ｃ
（図３、凡例）およびＮＮＹ19（ＭＡＴａ ｕｒａ３
ｌｅｕ２ ｈｉｓ３ ｔｒｐ１ ｌｙｓ２ ＦＵＳ１−
ＬａｃＺ：：ＬＥＵ２）をＹＩｐＦＵＳ 102（ＬＥＵ
２）での組み込み形質転換により修飾し、S.Nomotoらの
「前記」、それぞれ８ｃｌおよびＮＮＹ19と略記した。
これらの系統をｐＹβＡＲ２、およびｐＹＳＫ 136Ｇα
ｓで形質転換しグルコースおよび50μＭのCuSO4 を含む
最小選択プレートに維持した。コロニーを最小選択培地
（３％のグリセロール、２％の乳酸、50μＭのCuSO4 ）
に接種し、初期対数期(OD600=1.0) まで増殖させ、さら
に３％のガラクトースの添加により12時間誘導した。細
胞を洗浄し0.5mＭのアスコルビン酸および望ましいリガ
ンドを含む誘導培地(OD600=5.0) に再び懸濁した。30℃
で４時間温置した後、細胞を収穫し１mlのＺ緩衝液、ジ
ェイ．ミラー(J.Miller)の「Experiments in Molecular
Genetics 」（ニューヨーク州コールドスプリングハー
バー所在の、コールドスプリングハーバー研究所、197
2）を参照、に0.0075％のSDS を追加して、再び懸濁
し、さらにβガラクトシダーゼ活性を以前記載したよう
に３〜４回の独立した試験で測定した。J.Millerの「前
記」を参照。図３にはフェロモン誘導可能な遺伝子活性
に及ぼすβアドレナリン性作動薬の影響を比較して示
す。α−ＭＦ、10μＭα接合因子；（−）ＩＳＯ、50μ
Ｍ（−）イソプロテレノール； （−）ＡＬＰ、50μＭ
（−）アルプレノロール；（＋）ＩＳＯ、 100μＭ
（＋）イソプロテレノールである。ｈβＡＲおよびラッ
トＧ S αを同時に発現する８ｃｌ（ｇｐａ１）細胞にお
いて、イソプロテレノールで刺激されたβガラクトシダ
ーゼ活性の劇的な誘導を観察した。作動薬刺激は立体特
異的であり特定の拮抗薬を添加することにより阻害され
た。作動薬応答はｈβＡＲおよびラットＧS αの発現に
依存し、内因性Ｇタンパク質αサブユニットが分裂した
系統を必要とした。形質転換した８ｃｌ細胞でイソプロ
テレノールに応じて達成した最終的βガラクトシダーゼ
活性はＧＰＡ１（ＮＮＹ19）を発現する形質転換してい
ない細胞でα因子により誘導したものに匹敵したが、Ｎ
ＮＹ19細胞の基底の(basal) βガラクトシダーゼ活性は
８ｃｌ細胞よりかなり低かった。総合して、本発明者ら
の結果はｈβＡＲおよびラットＧS αの同時発現が酵母
の接合シグナル伝達経路のカテコールアミン制御キー観
点(control key aspect)の下に配置するのに十分である
ことを示した。しかし、アドレナリン性作動薬は酵母フ
ェロモン受容体が、結合フェロモンに加え、接合に必要
な他の認識事象に関連するという最近の観察結果と一致
して、ｈβＡＲおよびラットＧS αを同時に発現する８
ｃ細胞またはＮＮＹ19細胞のどちらの接合をも刺激しな
い。エイ・ベンダー(A.Bender)およびジー・スプラーグ
(G.Sprague) の「Genetics」 121、 463ページ(1989)を
参照。ｈβＡＲは動物細胞のアデニル酸シクラーゼをＧ
タンパク質のαサブユニットの作用を介して刺激する。
対照的に、酵母の接合因子受容体はこれらのエフェクタ
ーをβγサブユニットの作用を介して誘発する。エム．
ホワイトウェイ(M.Whiteway)らの「Cell」56、 476ペー
ジ(1989)を参照。本発明者らの本結果は酵母のｈβＡＲ
の活性化が酵母のβγから哺乳類ＧS αを解離させるこ
と、およびこれがおそらく応答を誘い出すβγサブユニ
ットであることを示している。上述の例は本発明の例示
であり、制限と解釈すべきではない。本発明は、ここに
含まれる請求の範囲と均等なものとともに、次の請求の
範囲により明確となる。
ｈβＡＲおよび哺乳類Ｇ S αサブユニットの同時発現 ｈβＡＲおよびラットＧS αを同時発現する８ｃ細胞を
イソプロテレノールで誘導した形態学的応答はこれらの
成分が互いにおよび内因性Ｇαサブユニットを欠如する
酵母でフェロモン応答経路の下流成分に結合することが
できることを示唆している。フェロモンシグナル経路が
ｈβＡＲおよびラットＧS αにより活性化されることを
確認するため、フェロモン応答ＦＵＳ１遺伝子プロモー
ターの作動薬誘導をＦＵＳ１−ｌａｃＺ遺伝子融合がゲ
ノムに確実に組み込まれた８ｃ細胞（８ｃ１）から誘導
した酵母の系統で測定した。エス．ノモト(S.Nomoto)ら
の「EMBO J. 」 9、 691ページ(1990)を参照。系統８ｃ
（図３、凡例）およびＮＮＹ19（ＭＡＴａ ｕｒａ３
ｌｅｕ２ ｈｉｓ３ ｔｒｐ１ ｌｙｓ２ ＦＵＳ１−
ＬａｃＺ：：ＬＥＵ２）をＹＩｐＦＵＳ 102（ＬＥＵ
２）での組み込み形質転換により修飾し、S.Nomotoらの
「前記」、それぞれ８ｃｌおよびＮＮＹ19と略記した。
これらの系統をｐＹβＡＲ２、およびｐＹＳＫ 136Ｇα
ｓで形質転換しグルコースおよび50μＭのCuSO4 を含む
最小選択プレートに維持した。コロニーを最小選択培地
（３％のグリセロール、２％の乳酸、50μＭのCuSO4 ）
に接種し、初期対数期(OD600=1.0) まで増殖させ、さら
に３％のガラクトースの添加により12時間誘導した。細
胞を洗浄し0.5mＭのアスコルビン酸および望ましいリガ
ンドを含む誘導培地(OD600=5.0) に再び懸濁した。30℃
で４時間温置した後、細胞を収穫し１mlのＺ緩衝液、ジ
ェイ．ミラー(J.Miller)の「Experiments in Molecular
Genetics 」（ニューヨーク州コールドスプリングハー
バー所在の、コールドスプリングハーバー研究所、197
2）を参照、に0.0075％のSDS を追加して、再び懸濁
し、さらにβガラクトシダーゼ活性を以前記載したよう
に３〜４回の独立した試験で測定した。J.Millerの「前
記」を参照。図３にはフェロモン誘導可能な遺伝子活性
に及ぼすβアドレナリン性作動薬の影響を比較して示
す。α−ＭＦ、10μＭα接合因子；（−）ＩＳＯ、50μ
Ｍ（−）イソプロテレノール； （−）ＡＬＰ、50μＭ
（−）アルプレノロール；（＋）ＩＳＯ、 100μＭ
（＋）イソプロテレノールである。ｈβＡＲおよびラッ
トＧ S αを同時に発現する８ｃｌ（ｇｐａ１）細胞にお
いて、イソプロテレノールで刺激されたβガラクトシダ
ーゼ活性の劇的な誘導を観察した。作動薬刺激は立体特
異的であり特定の拮抗薬を添加することにより阻害され
た。作動薬応答はｈβＡＲおよびラットＧS αの発現に
依存し、内因性Ｇタンパク質αサブユニットが分裂した
系統を必要とした。形質転換した８ｃｌ細胞でイソプロ
テレノールに応じて達成した最終的βガラクトシダーゼ
活性はＧＰＡ１（ＮＮＹ19）を発現する形質転換してい
ない細胞でα因子により誘導したものに匹敵したが、Ｎ
ＮＹ19細胞の基底の(basal) βガラクトシダーゼ活性は
８ｃｌ細胞よりかなり低かった。総合して、本発明者ら
の結果はｈβＡＲおよびラットＧS αの同時発現が酵母
の接合シグナル伝達経路のカテコールアミン制御キー観
点(control key aspect)の下に配置するのに十分である
ことを示した。しかし、アドレナリン性作動薬は酵母フ
ェロモン受容体が、結合フェロモンに加え、接合に必要
な他の認識事象に関連するという最近の観察結果と一致
して、ｈβＡＲおよびラットＧS αを同時に発現する８
ｃ細胞またはＮＮＹ19細胞のどちらの接合をも刺激しな
い。エイ・ベンダー(A.Bender)およびジー・スプラーグ
(G.Sprague) の「Genetics」 121、 463ページ(1989)を
参照。ｈβＡＲは動物細胞のアデニル酸シクラーゼをＧ
タンパク質のαサブユニットの作用を介して刺激する。
対照的に、酵母の接合因子受容体はこれらのエフェクタ
ーをβγサブユニットの作用を介して誘発する。エム．
ホワイトウェイ(M.Whiteway)らの「Cell」56、 476ペー
ジ(1989)を参照。本発明者らの本結果は酵母のｈβＡＲ
の活性化が酵母のβγから哺乳類ＧS αを解離させるこ
と、およびこれがおそらく応答を誘い出すβγサブユニ
ットであることを示している。上述の例は本発明の例示
であり、制限と解釈すべきではない。本発明は、ここに
含まれる請求の範囲と均等なものとともに、次の請求の
範囲により明確となる。
【００２６】 配列表 (1) 一般的情報： (i) 出願人：キング，クリム(King,Klim) ドールマン，ヘンリク ジー．(Dohlman, Henrik G.) キャロン，マーク ジー．(Caron,Mark G.) レフコウィッツ，ロバート ジェイ．(Lefkowitz,Robert J.) (ii)発明の名称：酵母におけるＧタンパク質結合受容体の発現 (iii) 配列の数：３ (iv)通信先： (A) 受信人：ケネス ディー．シブレー(Kenneth D. Sibley) ；ベル，セルツァー，パーク アンド ギブソン(Bell,Seltzer,Park and Gibson) (B) 通り：ポストオフィスドローワァー34009 (C) 都市：シャーロット (D) 州：ノースカロライナ州 (E) 国：米国 (F) 郵便番号：28234 (v) コンピューター判読可能形態： (A) 媒体形式：フロッピー（登録商標）ディスク (B) コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ コンパチブル (IBM PC compatible) (C) オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ ＭＳ−ＤＯＳ (D) ソフトウェア：パテントイン(PatentIn) リリース＃1.0 ，バージョン＃1.25 (vi)本出願のデータ： (A) 出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ91／06605 (B) 出願日：1991年９月12日 (C) 分類： (vii) 前出願のデータ： (A) 出願番号：ＵＳ07／581714 (B) 出願日：1990年９月13日 (viii)代理人／代行業者の情報 (A) 名前：シブレー，ケネス ディー．(Sibley, Kenneth D.) (B) 登録番号：31,665 (C) 参照／摘要番号：5405-17-1 (iv)遠距離通信情報： (A) 電話：919-881-3140 (B) 電話ファックス：919-881-3175 (C) テレックス：575102 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の情報： (i) 配列特性： (A) 長さ：80塩基対 (B) 種類：核酸 (C) 鎖の型：一本鎖 (D) トポトジー：直線 (ii)分子の種類：ｃＤＮＡ (ix)特徴： (A) 名称／キー(KEY) ：ＣＤＳ (B) 位置：30..80 (xi)配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１： GAATTCAACG TTGGATCCAA GAATCAAAA ATG TCT GAT GCG GCT CCT TCA TTG 53 Met Ser Asp Ala Ala Pro Ser Leu 1 5 AGC AAT CTA TTT TAT GAC GTC ACG CAG 80 Ser Asn Leu Phe Tyr Asp Val Thr Gln 10 15 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の情報： (i) 配列特性： (A) 長さ：17アミノ酸 (B) 種類：アミノ酸 (D) トポトジー：直線 (ii)分子の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２： Met Ser Asp Ala Ala Pro Ser Leu Ser Asn Leu Phe 1 5 10 Tyr Asp Val Thr Gln 15 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の情報： (i) 配列特性： (A) 長さ：６塩基対 (B) 種類：核酸 (C) 鎖の型：一本鎖 (D) トポトジー：直線 (ii)分子の種類：ｃＤＮＡ (xi)配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３： AACGTT 6
【図１】 図１には酵母ヒトβ2 アドレナリン受容体発
現プラスミド、ｐＹβＡＲ２の構成を示す。
現プラスミド、ｐＹβＡＲ２の構成を示す。
【図２】 図２にはｐＹβＡＲ２で形質転換した酵母細
胞由来の膜に対するｈβＡＲリガンド結合を示す。
胞由来の膜に対するｈβＡＲリガンド結合を示す。
【図３】 図３にはフェロモン誘導遺伝子活性に与える
βアドレナリン性作動薬、α−ＭＦ、10μＭα交配因
子；（−）ＩＳＯ、50μＭ（−）イソプロテレノール；
（−）ＡＬＰ、50μＭ（−）アルプレノロール；（＋）
ＩＳＯ、 100μＭ（＋）イソプロテレノールの効果を比
較して示す。
βアドレナリン性作動薬、α−ＭＦ、10μＭα交配因
子；（−）ＩＳＯ、50μＭ（−）イソプロテレノール；
（−）ＡＬＰ、50μＭ（−）アルプレノロール；（＋）
ＩＳＯ、 100μＭ（＋）イソプロテレノールの効果を比
較して示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ドールマン ヘンリク ジー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94705 バークレイ スチュワート スト リート 2226 (72)発明者 キャロン マーク ジー アメリカ合衆国 ノースカロライナ州 27705 ダーラム エヴァンス ドライブ 2606 (72)発明者 レフコウィッツ ロバート ジェイ アメリカ合衆国 ノースカロライナ州 27707 ダーラム ハムステッド コート 3539 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA63 CA04 DA12 EA04 FA02 GA11 HA20 4B065 AA72X AA72Y AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA60
Claims (13)
- 【請求項１】 酵母細胞の細胞膜中にトランスメンブラ
ンタンパク質を発現させることができるＤＮＡ発現ベク
ターであって：酵母Ｇタンパク質結合受容体の少なくと
も一番端のアミノ末端暗号配列のフラグメントから成る
第１セグメント；および前記第１セグメントから下流で
さらに正確な読み取り枠内の第２セグメントであって、
異種Ｇタンパク質結合受容体を暗号化するＤＮＡ配列か
ら成る第２セグメントから成り、前記異種Ｇタンパク質
結合受容体がＧタンパク質と機能的に相互作用し得るこ
とを特徴とするＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項２】 前記異種Ｇタンパク質結合受容体の一番
端のアミノ末端暗号配列のフラグメントが欠如している
ことを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項３】 前記第１および第２セグメントが、酵母
細胞において操作可能なプロモーターと動作可能に結合
していることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ発現ベ
クター。 - 【請求項４】 前記プロモーターがＧＡＬ１プロモータ
ーであることを特徴とする請求項３記載のＤＮＡ発現ベ
クター。 - 【請求項５】 前記第１セグメントが酵母フェロモン受
容体の少なくとも一番端のアミノ末端暗号配列のフラグ
メントから成ることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ
発現ベクター。 - 【請求項６】 前記第１セグメントがＳＴＥ２遺伝子お
よびＳＴＥ３遺伝子から成る群より選ばれる酵母フェロ
モン受容体の少なくとも一番端のアミノ末端暗号配列の
フラグメントから成ることを特徴とする請求項１記載の
ＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項７】 さらに前記第１セグメントの上流に配置
され動作可能に結合されている酵母Ｇタンパク質結合受
容体遺伝子の少なくとも５′非翻訳領域のフラグメント
を含んでいることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ発
現ベクター。 - 【請求項８】 さらに前記第１セグメントの上流に配置
され動作可能に結合されている酵母フェロモン受容体遺
伝子の少なくとも５′非翻訳領域のフラグメントを含ん
でいることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ発現ベク
ター。 - 【請求項９】 酵母フェロモン受容体遺伝子がＳＴＥ２
遺伝子およびＳＴＥ３遺伝子から成る群より選ばれてい
ることを特徴とする請求項８記載のＤＮＡ発現ベクタ
ー。 - 【請求項１０】 前記ベクターがプラスミドから成るこ
とを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項１１】 前記第２セグメントが哺乳類Ｇタンパ
ク質結合受容体を暗号化するＤＮＡ配列から成ることを
特徴とする請求項１記載のＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項１２】 前記第２セグメントが、ドーパミン受
容体、ムスカリン性コリン作動性受容体、αアドレナリ
ン受容体、βアドレナリン受容体、オピエート受容体、
カンナビノイド受容体、およびセロトニン受容体から成
る群より選ばれている哺乳類Ｇタンパク質結合受容体を
暗号化するＤＮＡ配列から成ることを特徴とする請求項
１記載のＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項１３】 請求項１記載のＤＮＡ発現ベクターを
有することを特徴とする酵母細胞。
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