JPH034575B2

JPH034575B2 -

Info

Publication number: JPH034575B2
Application number: JP62078987A
Authority: JP
Inventors: Kunio Matsumoto; Rokuro Izumi; Hideji Seijo; Hiroyuki Mizuguchi
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1987-03-31
Filing date: 1987-03-31
Publication date: 1991-01-23
Also published as: JPS6322802A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、多孔質構造を有する水不溶性アミノ
基含有アクリロニトリル系ポリマーの製造法に関
するものである。従来より、ニトリル基を有してなるポリアクリ
ロニトリルが生物学的活性物質である酵素を吸着
することは知られている（特開昭51−121592号公
報、特開昭52−7485号公報）。しかし、ポリアク
リロニトリルへの酵素の吸着において、吸着され
る酵素量は少なく、また吸着された酵素が容易に
脱離されるため良好な酵素の支持体となり得るも
のではなかつた。本発明者らは、多孔質構造を有するポリアクリ
ロニトリルの有するニトリル基を固相で一部還元
せしめて得られるアミノ基含有ポリアクリロニト
リルが、意外にも酵素吸着量が著しく大きく、処
理前のポリアクリロニトリルに比べ約２〜30倍も
吸着し得るものであることを知り、さらにこの吸
着された酵素は容易に脱離されない良好なもので
あることを知つた。また、このポリアクリロニト
リルの代りに、アクリロニトリル系モノマー、例
えばアクリロニトリル、メタアクリロニトリル、
α−クロロアクリロニトリル、シンナムニトリル
などのモノマーからなるホモポリマー、コポリマ
ー、さらにこのアクリロニトリル系モノマーと共
重合し得るモノマーとのコポリマーの還元によつ
て得られたアミノ基含有ポリアクリロニトリル系
ポリマーも良好なものであることを知つた。さら
にまた、この支持体と、生物学的活性蛋白質であ
る酵素との結合は物理学的に吸着されるだけでな
く、必要に応じて縮合剤、架橋化剤を用いて、そ
の結合を強固にせしめても、これによつてその生
物学的活性蛋白質は失活または劣化することな
く、著しく強固に固定化されたもので、これらの
支持体と生物学的活性蛋白質との結合した固定材
はその生物学的活性蛋白質に性質に応じて、その
生物学的活性蛋白質の活性により作用を受ける物
質に長期閲安定かつ効率よく使用し得るものであ
ることを知つた。本発明は、上記の知見に基いて完成されたもの
で、その目的は、生物学的活性蛋白質を著しく多
量に、安定に結合せしめた支持体の製造法を提供
するものである。次に、本発明を実施するに当つて、本発明の支
持体について述べる。まず、アクリロニトリル系ポリマーとしては、
例えばアクリロニトリル、メタクリロニトリル、
α−クロロアクリロニトリル、シンナムニトリル
などのアクリロニトリル系モノマーのホモポリマ
ー、コポリマー、さらにこれらのアクリロニトリ
ル系モノマーとエチレン性二重結合を含む他のコ
ポリマー、例えばスチレン、メチルスチレン、エ
チルスチレン、ニトロスチレン、クロルスチレ
ン、プロムスチレン、クロロメチルスチレンなど
のスチレン系モノマー、アクリル酸メチル、アク
リル酸エチル、メタアクリル酸メチル、メタアク
リル酸エチル、メタアクリル酸エチレングリコー
ルエステルなどのアクリル酸エステル系モノマ
ー、メチルビニルケトン、エチルイソプロペニル
ケトンなどのビニルケトン系モノマー、ビニルク
ロライド、ビニリデンクロライドなどのハロゲン
化オレフイン、イソブテン、エチルビニルエーテ
ル、ブチルビニルエーテルなどのビニルケトン系
モノマー、酢酸ビニル、安息香酸ビニルなどのビ
ニルエステル系モノマー、ブタジエン、イソプレ
ンなどの共役ジエン、ジビニルベンゼン、ジビニ
ルトルエンなどの多官能性モノマー、Ｎ−ビニル
スクシンイミド、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビ
ニルフタルイミド（メタ）アクリルアミド、Ｎ，
Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミドなどのアミ
ド系ビニルモノマー、ビニルピリジン、メチルビ
ニルピリジン、ビニルイミダゾール、Ｎ，Ｎ−ジ
エチルアミノエチル（メタ）アクリレートなどの
塩基性モノマー、などとを、必要に応じて架橋重
合剤、例えばジビニルベンゼン、ジビニルトルエ
ンを用いて、共重合せしめたものが挙られ、これ
はまた多成分共重合体でもよく、またこれらの重
合においては公知の方法を適宜使用して行なえば
よく、さらに一般に市販されているニトリル基を
有するポリマー、例えば繊維原料たる未加工のポ
リアクリロニトリルを使用すればよい。次いで、このアクリロニトリル系ポリマーは、
その性質を良好となすため、多孔質構造となすも
のであるが、この多孔質構造となすに当つては、
例えばアクリロニトリルをホモ、あるいはコポリ
マーの条件下、そのモノマーを水系で懸濁重合ま
たは乳化重合せしめるか、または該ポリマーをジ
メチルホルムアミド、ジメチルスルホキサイド、
濃硝酸、ロダン塩水溶液、塩化亜鉛水溶液などの
可溶化溶媒に溶解せしめ、これを水、アセトン含
有水溶液、ジメチルホルムアミド水溶液、エタノ
ール含有水溶液などの凝固浴中に滴下、糸状ある
いはフイルム状にて押し出して、多孔質構造を有
する粒状、繊維状、膜状にせしめればよい。さら
に、中空糸状の繊維状になしてもよい。このよう
にして得られる多孔質構造は、多分、生物学的活
性蛋白質をその内部に浸透せしめる役割を有する
大孔径の孔と、その表面および内部で生物学的活
性蛋白質を捕捉する役割を有する小孔径とを有し
ているものと推定され、これにより、生物学的活
性体が結合されるものと認められるもので、その
孔は約40〜9000Å、好ましくは約50〜4000Å、さ
らに平均的には約100〜2000Å程度の孔径と推定
される。本発明の多孔質構造を有する水溶性アミノ化ポ
リアクリロニトリル系ポリマーは、この多孔質構
造を有したアクリロニトリル系ポリマーを、好ま
しくは不活性非溶媒中還元されるものであるが、
この還元の目的は該ポリマー中に存在するニトリ
ル基の一部をアミノメチル基に還元せしめて、多
孔質構造を有するアミノ基含有アクリロニトリル
系ポリマーとなすものであつて、この還元に使用
される不活性非溶媒としてはジエチルエーテル、
ジオキサン、テトラヒドロフランなどの媒体にて
行なわれるもので、また還元剤としては通常水素
化リチウムアルミニウムが挙げられる。その使用
割合は目的とする遊離アミノ基含量によつて異な
るが、そのニトリル基の推定量に対し等モル以上
の還元剤を用いればよく、一般にその反応は室温
ないし、使用する媒体の沸点温度で行なえばよ
く、反応時間は、反応温度、使用するポリマーの
形状、構造、重合度などにより異なるが、通常10
分程度から48時間程度の間で適宜行なわれる。このようにして得られたアミノ基含有アクリロ
ニトリル系ポリマーは、必要に応じて水冷、水
洗、酸水溶液洗浄、アルカリ水溶液洗浄などを行
なえばよい。また、この環元によつて得られる遊
離アミノ基の含量は、アミノ基含有アクリロニト
リル系ポリマーが実質的に水溶性にならないまで
の範囲内で有し、通常は該ポリマーｇ当り20μM
から1000μM有する。さらにこの本発明の支持体
は、あらかじめ多孔質構造となしているアクリロ
ニトリル系ポリマーから製造されるため、その還
元はポリマーを溶解しない媒体を使用して固体状
にて反応せしめて、多孔質構造のまま得られるも
のである。アクリロニトリル系該アクリロニトリ
ル系ポリマーの孔が多孔質構造となつていない場
合には、そのニトリル基のアミノメチル基への還
元は弱いため遊離のアミノ基のニトリル基に対す
る比率は少なくなるので、還元されるアクリロニ
トリル系ポリマーは予め多孔質構造であるのが好
ましい。本発明のアミノ基含有ポリアクリロニトリル系
ポリマーは、生物学的活性体を固定化するための
支持体として有用である。その使用に当つては必
要に応じて生物学的活性体と結合せしめる以前
に、不活性媒体、例えば水性媒体下にグルタルア
ルデヒドなどの架橋化剤を用いて、グルタルアル
デヒドの重合を防止のために冷却化にて処理し、
さらにこれに例えばヘキサメチレンジアミン、ド
デカメチレンジアミンなどのアルキレンジアミ
ン、リジンなどのスペーサーとしての化合物を、
同様な水性媒体下０℃〜室温にて処理し、再度架
橋化剤にて処理して、目的の支持体となしてもよ
い。この多孔質構造を有する不水溶性のアミノ基含
有アクリロニトリル系ポリマーからなる支持体と
生物学的活性蛋白質とを結合せしめるものである
が、この生物学的活性蛋白質としては、酵素、例
えば酸化還元酵素、加水分解酵素、転位酵素、リ
アーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどであつて、
また酸化還元酵素としてはアルコールデヒドロゲ
ナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、グリセ
ロールリン酸デヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒ
ドロゲナーゼ、ガラクトースデヒドロゲナーゼ、
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、３−
ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、コレステロールオキシター
ゼ、ガラクトースオキシダーゼ、コリンオキシダ
ーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、グルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アミン
オキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ジアホ
ラーゼ、ウリカーゼ、パーオキシダーゼ、カタラ
ーゼ、リポキシゲナーゼなどが挙られ、加水分解
酵素としてはリパーゼ、ホスホリパーゼ、アセチ
ルコリンエステラーゼ、コレステロールエステラ
ーゼ、ホスフアターゼ、アミラーゼ、グルコシダ
ーゼ、ガラクトシダーゼ、ペプシン、トリプシ
ン、キモトリプシン、パパイン、プロメライン、
ウレアーゼ、アミノアシラーゼ、ペニシリンアシ
ラーゼ、セフアロスポリンアシラーゼ、ペニシリ
ナーゼ、セフアロスポリナーゼ、クレアチナー
ゼ、クレアチニナーゼなどが挙げられ、転位酵素
としてはクレアチンホスキナーゼ、ピルベートキ
ナーゼ、ヘキソキナーゼ、グリセロールキナーゼ
などが挙られ、イソメラーゼとしてはアラニンイ
ソメラーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコー
スホスフエートイソメラーゼなどが、リガーゼと
してはグルタチオンシンテターゼが挙られ、以上
の外に、蛋白質であつて生物学的活性を有してい
るもので、該支持体と結合し得るものであればよ
く、またこれらの蛋白質を公知の種々の手段をも
つて、その誘導体となしたものであつてもよく、
さらに使用される該生物学的活性蛋白質は、単独
または２以上を同時に用いてもよい。次いで、上
記の種々な支持体とこの支持体をカラムに充填し
たカラム法、または容器に分散せしめたバツチ法
のいずれかを用いてもよく、その際に用いられる
不活性媒体としては使用する生物学的活性蛋白質
が失活しない媒体であればよく、水、または種々
のPHに調整した緩衝液（例えばPH４〜６酢酸緩衝
液、PH６〜８のリン酸緩衝液、PH８〜９のホウ酸
緩衝液など）、含水アセトンなどの水性媒体が好
ましく、また結合における温度は同様に失活しな
い温度であればよく、通常０〜30℃程度であり、
さらに使用する生物学的活性蛋白質の量として
は、該支持体の結合容量が充分満されるまで使用
してもよく、その際は結合後の不活性媒体中の生
物学的活性蛋白質の活性の有無により判断しても
よく、また得られた固定材の生物学的活性の測定
を行なつてもよく、例えば後述実施例における、
アクリロニトリル55部、ジビニルベンゼン25部、
ビニルエチルベンゼン20部よりなる共重合体の多
孔質構造の還元後の遊離アミノ基およびニトリル
基を有してなる支持体のバチルス・メガテリウム
−Ｂ−400（Bacillus megateriumB−400：
FERM−Ｐ No.748）の生産するアシラーゼに対
する結合は150u／mg、コマモナス・エス・ピ
ー・SY−77−１−（Co−mamonas sp.SY−７−
１：FERM−Ｐ No.2410）の生産するアシラー
ゼに対する結合は670u／mg、アスロバクター・
グロビフオーミス・Ｂ−0577（Arthrobactor
globiformis Ｂ−0577：FERM−Ｐ No.3518）の
生産するコリンオキシターゼに対する結合は
7.0u／ｇであつて、このように、使用する生物学
的活性体に応じて適宜その結合における使用量を
変更すればよい。このように処理することにより、アミノ基含有
アクリロニトリル系ポリマーからなる支持体と生
物学的活性蛋白質とを結合した固定材が得られる
ものであつて、さらにこれは必要に応じて、同一
系または別の系として結合化剤を使用して固定化
してもよい。使用される結合化剤としては、該支
持体の反応性の基、例えば遊離アミノ基と生物学
的活性蛋白質の遊離基例えばアミノ基、カルボキ
シル基、ヒドロキシル基、などを利用するもので
あつて、例えばヘキサメチレンジイソシアネー
ト、ヘキサメチレンジイソチオシアネート、トル
エンジイソチオシアネート、キシレンジイソシア
ネート、グルタルアルデヒド、ジアルデヒドスタ
ーチ、ジメチルアジピミデート、ジメチルスベリ
イミデート、ジメチル−３，3′−ジチオビスプロ
ピオンイミデート、無水コハク酸、クロトンアル
デヒド、アクロレインなどの架橋化剤を用いるこ
とにより、該支持体と生物学的活性蛋白質が架橋
結合される。また、支持体と生物学的活性蛋白質
とを直接共有結合する場合には、縮合剤、例えば
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
−カルボジイミドなどの水溶性縮合剤が使用され
る。上記の如くの、結合化剤を用いるに当つて
は、不活性媒体、例えばテトラヒドロフラン、ア
セトン、エタノールなどを含有してもよい水性媒
体中で行なわれる。その際、室温下の条件が好ま
しく、また使用する生物学的活性蛋白質の安定な
PHの範囲、一般にPH４〜12の範囲にて選宜選択し
て行なえばよく、また使用する結合化剤は結合せ
しめる遊離基に対し１〜２倍モル程度でよい。以上の如くして得られた固定材において、その
生物学的活性は著しく良好であり、この固定材は
その生物学的活性蛋白質の性質に応じて種々に利
用されるものである。従つてまた、以上の如くし
て得られた固定材は、その一定量をカラムなどの
一定容器に入れ、これを遊離アミノ基およびニト
リル基を有してなる支持体を生物学的活性蛋白質
とを結合した固定材の系となし、この際に必要に
応じて生物学的活性蛋白質の安定を保つため緩衝
液を使用することが好ましく、またこの系に対し
て、用いた生物学的活性蛋白質の活性により作用
を受ける物質を含有する系を設けるものである
が、この系に使用される物質としては、前記の生
物学的活性蛋白質に対応するものであればよく、
例えば、前記の種々の酵素の場合においてはその
基質が挙られるものであつて、またその基質は状
態により種々有るが、水溶液、水性媒体（例えば
緩衝液など）、血液、尿溶液またはこれらの処理
液などの体液の状態のものであつてもよく、例え
ば前記の生物学的活性蛋白質が酵素である場合に
おいては、酵素としてアシラーゼを挙げるならば
基質としては７−アシル−セフアロスポラン酸誘
導体の溶液、６−アシル−ペニシラン酸誘導体の
溶液、７−アミノ−３−セフエム−４−カルボン
酸またはその誘導体または６−アミノ−ペナム−
３−カルボン酸またはその誘導体とチエニル酢酸
メチルエステルとの溶液が一例として挙られるも
ので、また酵素としてコリンオキシターゼ、種々
のホスホリパーゼ、ウリカーゼ、グルコースオキ
シダーゼを挙げるならば対応するリン脂質、尿
酸、グルコースなどの血液、尿溶液などの体液が
挙られるものである。以上の如くして、アミノ基含有アクリロニトリ
ル系ポリマーからなる支持体と生物学的活性蛋白
質とを結合した固定材を使用することにより、良
好になし得るものである。さらにこの支持体に、
前記の生物学的活性蛋白質として、酵素以外の蛋
白質、例えばホルモン、抗体などの支持体として
使用し得るものである。次に、実施例および参考例を挙げて本発明を具
体的に述べるが、本発明は何んらこれらによつて
限定されるものではない。また、以下の実施例、参考例において、生物学
的活性体として酵素を利用した際のその活性測定
法は、次に述べる方法を用いたものである。（ペニシリンアシラーゼの力価測定法）１酵素液の場合酵素液0.5ml、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）4.0
ml、４（Ｗ／Ｖ）％PcGカリウム塩10.1Mリン酸
緩衝液（PH7.5）0.5mlよりなる反応液を37℃、30
分間反応せしめた後、これから0.5mlをとり、
0.05NNaOH／ml、20％酢酸２mlよりなる緩衝液
３ml、0.5（Ｗ／Ｖ）％Ｐ−ジメチルアミノベンズ
アルデヒド／メタノール溶液0.5ml中に加え、室
温下10分間反応させ、415nmにおける吸光度を測
定し、生成する６−APA量を求める。酵素活性は、１分間に1μモルの６−APAを生
成する活性を１単位（1U）とする。２固定化酵素の場合 0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）4.5ml、４（Ｗ／Ｖ）
％PcGカリウム塩／0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）
0.5mlよりなる溶液中にあらかじめ重量を測定し
た固定化酵素を添加し、37℃、30分間反応せしめ
る。以下上記酵素液の場合と同様にして生成する
６−APA量を求める。（アシラーゼ活性測定法１）アシラーゼ含有液0.25mlおよび基質たる７−
（４−カルボキシブタンアミド）−デスアセトキシ
セフアロスポラン酸の１％、0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.5）溶液0.25mlからなる系、またはアシラー
ゼと支持体とを結合した固定材、上記と同一の基
質溶液2.0mlおよび0.1Mリン酸緩衝液2.0mlからな
る系を、37℃、30分間反応せしめ、反応後生成し
た７−アミノ−デスアセトキシセフアロスポラン
酸（７−ADCA）含有液0.5mlに、
0.05NNaOH／ml、20％酢酸２mlよりなる緩衝液
３ml、0.5％ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒ
ドメタノール溶液0.5mlを加え、室温下10分間反
応させ、その後415nmにおける吸光度を測定し、
７−ADCAの検量線より試料中の７−ADCA量
を算定するもので、100r1mlの７−ADCAを生成
する力価を100uとする。この測定法は、コマモナス・エス・ピー・SY
−77−１の生産するアシラーゼを利用した場合に
行なつたものである。（アシラーゼ測定法２）上記のアシラーゼ測定法−１において、基質と
して１％７−フエニルアセトアミド−デスアセト
キシセフアロスポラン酸の0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.5）を用いて、上記のアシラーゼ測定法−１
と同様に行なつたもので、この測定法はバチル
ス・メガテリウム・Ｂ−400の生産するアシラー
ゼを利用した場合に行なつたものである。（コリンオキシダーゼ活性測定法）コリンオキシダーゼ含有液5μ、またはコリ
ンオキシダーゼと支持体とを結合した固定材１〜
５mg、0.2Mトリス塩酸緩衝液（PH8.0）0.05ml、
３mg１ml４−アミノアンチピリン0.05ml、0.1％
フエノール0.10ml、2u1mgパーオキシダーゼ0.10
ml、0.1M塩化コリン0.10mlおよび蒸留水0.1mlか
らなる系を、37℃、５分間反応させた後、2.5ml
のエタノールを加えて反応を停止せしめ、次いで
480nmにおける吸光度を測定し、１分間に
1μmoleの過酸化水素を生成する活性を1uとする。
また該固定材の力価の算出は次式に従う。力価（ｕ／ｇ）＝△480nm×0.35×1000／反応時間（分
）×固定材（mg）この測定法は、アースロバクター・グロビフオ
ーミス・Ｂ−0577の生産するコリンオキシターゼ
を利用した場合に行なつたものである。参考例１ 500ml容三つ口フラスコを約35℃の恒温水浴に
ひたし、約15分間窒素で置換せしめ、次いで、フ
ラスコ内に120mlの蒸留水を加え、さらにアルキ
ルスルホン酸ナトリウム２ｇ、アクリロニトリル
80ｇ、過硫酸ナトリウム0.1ｇ、亜硫酸水酸ナト
リウム0.033ｇを加え、約３時間撹拌せしめて乳
濁液を得、次いでこれを約500mlの水に注ぎ、撹
拌下塩を加えて凝固せしめて生成物を析出し、こ
れを別、水洗し、通風乾燥してポリアクリロニ
トリル（0.5％、30℃におけるジメチルホルムア
ミドでの対数粘度は約10.5である）を得た。次い
でこのポリアクリロニトリル10ｇをジメチルホル
ムアミド150mlに溶解し、これを20％ジメチルホ
ルムアミド含有水浴中に、糸状に成形して、多孔
質構造を有するポリアクリロニトリル（アクリロ
ニトリル90％以上）繊維（太さ20〜35ミクロン）
を得た。同様に、ポリアクリロニトリル10ｇを20
％ジメチルホルムアミド含有水浴中に、アトマイ
ザーカツプを用いて滴下して、多孔質構造を有す
るポリアクリロニトリル（アクリロニトリル90％
以上）粒状物（平均粒径100メツシユ）を得た。この様にして得られたポリアクリロニトリルは
後述実施例の如く使用する。実施例１水素化リチウムアルミニウム25ｇを三つ口フラ
スコに加え、乾燥エーテル100mlを添加・撹拌し、
これに参考例１の如くして得られた多孔質構造を
有するポリアクリロニトリルの粒状物２ｇを加え
て50℃にて16時間加熱還流し、反応後氷冷下、水
を滴下して未反応の水素化リチウムアルミニウム
を分解せしめ、さらに1N HClを滴下して、その
分解物を溶解せしめ、次いでこれを別して、ア
ミノ化された該ポリアクリロニトリルを回収し、
次いで1N HCl、水、1N NaOH、水0.1Mリン酸
緩衝液（PH7.5）の順で洗浄して薄黄色の多孔質
構造を有するアミノ化ポリアクリロニトリルの粒
状物（平均粒径100メツシユ）を得た。同様に、上記の多孔質構造を有するポリアクリ
ロニトリルの粒状物の代りに、多孔質構造を有す
るポリアクリロニトリル繊維を用いて行なつた結
果、多孔質構造を有するアミノ化ポリアクリロニ
トリル繊維を得た。実施例２水素化リチウムアルミニウム２ｇを乾燥エーテ
ル50mlに添加し、撹拌し、これに参考例１と同様
にして得られた多孔質構造を有するポリアクリロ
ニトリル系ポリマー（アクリロニトリル55部、ジ
ビニルベンゼン25部、ビニルエチルベンゼン20部
よりなるコポリマー）の粒状物３ｇを冷却下少量
づつ添加し、45℃で各々10分〜８時間加熱還流
し、次いで氷浴中、冷却撹拌下に２mlの水を添加
して未反応の水素化リチウムアルミニウムを分解
せしめ、さらに1N HClを添加した後その不溶物
たるアミノ基を有する該ポリマーを取し、これ
を洗浄して多孔質構造を有する該ポリマーを取
し、これを洗浄して多孔質構造を有するアミノ化
ポリアクリロニトリル系ポリマーの平均粒径100
メツシユ、湿重量９ｇを得た。得られたアミノ化コポリマー粒状物の物理化学
的性質が次の通りである。色；淡黄色、還元時間長くなるに従い、黄色味
が強くなる。粘度；不明（下記の溶媒に対して溶解しないた
め測定不可能）溶媒に対する溶解性；DMSO、DMF、濃硝
酸、65％KSCN溶液（60℃）、クロロホルム、ア
セトニトリル、ピリジン、ニトロメタン、シクロ
ヘキサン、ジエチルエーテル、30％NaOH溶液
の各溶媒に不溶性。アミノ基含量；実施例１に記載の塩酸測定法に
よりアミノ基含量を測定すると、各還元時間にお
ける支持体の推定アミノ基含量は次のとおりであ
る。還元時間アミノ基含量（消費塩酸量） 10分間 545μM1支持体ｇ１時間 738 〃８時間 780 〃また、この原料である多孔質構造を有するポリ
アクリロニトリル系ポリマー（アクリロニトリル
55部、ジビニルベンゼン25部、ビニルエチルベン
ゼン20部よりなるコポリマー）（対照）と、これ
を還元して得られた多孔質構造を有するアミノ化
コポリマーの粒状物（本発明）との、後述参考例
で得られる種々の酵素に対する結合能は次の通り
である。

【表】また、結合能の測定は、本発明または対照50〜
100mgをＬ型試験管に加え、これに酵素含有緩衝
液を加えて、30℃、60分間撹拌した後、これを
取し、次いで0.5M食塩10.1Mリン酸緩衝液（PH
7.5）で洗浄し、次いで0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.5）で洗浄し、得られたものについて、上記の
活性測定法を用いて行なつたものである。実施例３実施例２の如くして得られた多孔質構造を有す
るアミノ化ポリアクリロニトリルの粒状物９ｇを
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で洗浄した後、あら
かじめ氷冷した125％グルタルアルデヒド／ホウ
酸緩衝液（PH8.5）200mlに加えて０℃、20分間撹
拌し、このグルタルアルデヒド処理支持体を取
して0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で充分に洗浄し
て、これを、バチルス・メガテリウム・Ｂ−400
の生産するアシラーゼ酵素液（60u／ml）60ml中
に加えて４℃で一夜撹拌した。次いで、これを
取し、0.5M食塩／0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）、
次いで0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で洗浄して、
該粒状物とアシラーゼとを結合した固定材8.7ｇ
（アシラーゼ活性324u／mg）を得た。実施例４実施例３で得られたグルタルアルデヒド処理支
持体とアシラーゼとを結合した固定材をジヤケツ
ト付カラム（径1.2×８cm）に充填し、37℃にて
７−フエニルアセトアミド−デスアセトキシセフ
アロスポラン酸／0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）の
１％溶液をSV0.5で20日間連続的にチヤージし、
得られた反応液中の７−ADCA含量は、
0.05NNaOH1ml、20％酢酸２mlよりなる緩衝液、
0.5％ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドメタ
ノール溶液0.5mlを用いて10分間反応後415nmに
て吸光度を測定する方法（PDAB法）にて測定
し、その７−ADCAの検量線より求められ、黄
軸に、反応液量／カラム容量、およびチヤージ日
数、縦軸に７−ADCAの生成率をとつて示せば、
第２図に示す通りで、その結果、本発明の固定材
は著しく長期間使用し得るものであることが明ら
かである。実施例５水素化リチウムアルミニウム3.8ｇを乾燥エー
テル120mlに加え、これに多孔質構造を有するポ
リアクリロニトリル（アクリロニトリル95％）繊
維25ｇを加え、45℃、24時間撹拌下還元せしめ、
次いでこれに、氷浴中、冷却撹拌下３mlの水を滴
下し、さらに1NHClを少量づつ滴下し、水素ガ
スの発生が止つた時点にて、これを別し、多孔
質構造を有するアミノ化ポリアクリロニトリル繊
維125ｇ（湿重量）を得た。参考例２実施例５で得られた該繊維物600mg（湿重量）
を、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で洗浄し、これ
を冷却した125％グルタルアルデヒド／ホウ酸緩
衝液（PH8.5）50ml中に加えて、０℃、20分間撹
拌した後これを取し、さらに0.1Mリン酸緩衝
液（PH7.5）で洗浄し、この洗浄物を、コモナ
ス・エス・ピー・SY−77−１の生産するアシラ
ーゼ酵素液８ml（129.7u／ml）中に加え、室温下
５分間撹拌した後、さらにこれに25％グルタルア
ルデヒド10μlを添加し、30℃、60分間撹拌し続け
た。その後これを別して、その固形物を回収
し、0.5M食塩／0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で洗
浄し、さらに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で洗浄
して、該繊維物とアシラーゼとを結合した固定材
8.7ｇ（アシラーゼ活性1.92u／mg）300mg（湿重
量）を得た。さらに、この様にして得られた固定材4.5ｇ
（湿重量）をジヤケツト付カラム（１×５cm、Ｖ
＝４ml）に充填し、これを0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.5）で洗浄し、次いでこれに99.2mg１mlの７
−（４−カルボキシブタンアミド）−セフアロスポ
ラン酸の0.1Mリン酸緩衝液をSV1.5にて連続的に
チヤージし、得られた７−アミノ−セフアロスポ
ラン酸（７−ACA）を含有する流出後は、
PDAB法を用いて、その７−ACAの検量線より、
その７−ACA含量が求められ、横軸に通液量、
縦軸に７−ACAの生成率である切断率として示
せば、第３図に示す通りであつて、本発明の固定
材は何んら、その酵素活性の劣化しないもので長
期間良好に使用し得るものであつた。さらに、上
記の７−ACAを含有する流出液600ml（切断率
84.5％）を用い、これをPH3.2に調節した後濃縮
して約55mlとなし、次いでこれを４℃、１晩放置
して析出した７−ACA3.22ｇ（純度86.3％）を得
た。参考例３コリンオキシダーゼ160mg（3.6u／mg）を0.1M
リン酸緩衝液（PH7.5）５mlに溶解し、これに、
実施例５の如くして得られた95％アクリロニトリ
ルからなるポリアクリロニトリルを用いて得られ
た多孔質構造を有するアミノ化ポリアクリロニト
リル繊維100mg（湿重量）を加え、氷溶中で撹拌
し、次いでこれに１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）−カルボジイミド20μを加
え、1NHC1でPH7.5に調節し、氷溶中で３時間、
さらに４℃で一夜撹拌した後、これを取し、
0.5M食塩／0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で洗浄し
さらに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で洗浄して、
該フイラメント状物とコリンオキシダーゼとを結
合した固定材（コリンオキシダーゼ活性5.6u／
ｇ）を得た。参考例４参考例３において、コリンオキシダーゼの代り
に、バチルス・メガテリウム・Ｂ−400の生産す
るアシラーゼ酵素液（96u／ml）５mlを用い、ま
た１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミド40μを用いて、実施例10
と同様に行なつて、該フイラメント状物とアシラ
ーゼとを結合した固定材（アジラーゼ活性
264u／ｇ）を得た。参考例５実施例２と同様にして得られた、多孔質構造を
有するアミノ化ポリアクリロニトリル系コポリマ
ーの粒状物（平均粒径100メツシユ）500mg（湿重
量）を、125％グルタルアルデヒド／ホウ酸緩衝
液（PH8.5）30ml中に加え、０℃、20分間撹拌し
た後取し、これを0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）
にて充分洗浄し、次いでこれを0.5Mヘキサメチ
レンジアミン水溶液（PH9.5）30ml中に加えて、
４℃、24時間撹拌して取し、充分に水洗した。
さらに、これを125％グルタルアルデヒド／ホウ
酸緩衝液（PH8.5）で処理し、洗浄した後バチル
ス・メガテリウム・Ｂ−400の生産するアシラー
ゼ酵素液72u／ml）５mlに加えて４℃、12時間撹
拌し、その後これを取し、0.5M食塩／0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH7.5）、さらに0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.5）にて洗浄して、該球状物とアシラーゼと
を結合した固定材（アシラーゼ活性250u／ｇ）
440mg（湿重量）を得た。実施例６〜８ ○イ 500ml容三つ口フラスコに窒素導入管、撹拌
機、還流コンデンサーを取り付け、フラスコを
約40℃の恒温水浴にひたし、15分間窒素で置換
した。次いで、このフラスコ内に、１ｇのアル
キルスルホン酸ナトリウムを溶解した120mlの
蒸留水を加えて撹拌し、さらに禁止剤を除いた
70ｇのアクリロニトリルと10ｇのスチレンを加
えて乳化し、その後これに過硫酸カリウム0.1
ｇを加えて20〜22時間重合せしめて、0.1〜
1.0μの粒径を有する乳濁液を得、これを500ml
の水に注ぎ、撹拌しながら食塩を加えて凝固さ
せ、この生成物たるアクリロニトリル−スチレ
ンコポリマーを取し、水洗、乾燥し、さらに
減圧して未反応の該モノマーを除去し、ジメチ
ルホルムアミドにおける極限粘度1.3の該コポ
リマーを得、さらにこのコポリマー10ｇを200
mlのジメチルホルムアミドに溶解し、これをア
トマイザーカツプを用いて20％アセトン水浴50
中に液滴状に滴下して、含水状の多孔質構造
の球状物（径0.5〜１mm）を得た。 ○ロ上記○イと同一の装置を用いて、２ｇのトリト
ン（Triton）と720（ローム・アンド・ハス社
製）と２ｇのテルギトール（Tergitol）（ユニ
オン・カーバイド社製）とを溶解した蒸留水
300mlに、0.2ｇの過硫酸カリウムを加えて撹拌
し、さらにあらかじめ禁止剤を除いた80ｇのア
クリロニトリルと20ｇの蒸留したアクリル酸メ
チルを加えて40〜50℃に加熱して重合せしめ、
約30分後に還流温度90℃になるように重合せし
め、反応後その懸濁液を15〜20分間水蒸気蒸留
して、未反応の該モノマーを除去し、その後、
○イと同様にして、塩析、通風乾燥して、ジメチ
ルホルムアミド中の極限粘度1.2を有するアク
リロニトリル−アクリル酸メチルコポリマーを
得た。次いでこのコポリマー10ｇをジメチルス
ルホキサイド100mlに溶解して、アトマイザー
カツプを用いて液滴状に、20％ジメチルスルホ
キサイド水浴中に滴下して、該コポリマーの含
水ゲル状の多孔質構造を有する球状物（径0.5
〜１mm）を得た。 ○ハ上記の○イのスチレンの代りに、ジビニルベン
ゼン10ｇを用いて、○イと同様に行なつて、アク
リロニトリル−ジビニルベンゼンコポリマーの
含水ゲル状の多孔質構造の球状物（径0.5〜１
mm）を得た。上記○イ，○ロ，○ハで得られたコポリマーの多孔質
構造を有する球状物各々２ｇを用いて、各々以下
の通りの還元を行なつた。即ち、水素化リチウム
アルミニウム25ｇを三つ口フラスコに加え、乾燥
エーテル100mlを添加して撹拌し、これに上記コ
ポリマー２ｇを加え、50℃の恒温にて、16時間加
熱還流し、反応後氷浴中で、水、1NHClで処理
し、さらに1NHCl、水、1NHaOH、水、0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH7.5）の順で洗浄して、多孔質構
造を有するアミノ化アクリロニトリル系コポリマ
ーの粒状物を得た。さらに、上記の各々の多孔質
構造を有するアミノ化アクリロニトリル系ポリマ
ーの粒状物300mg（湿重量）を、氷冷した125％グ
ルタルアルデヒド／ホウ酸緩衝液（PH8.5）50ml
に加えて０℃、20分間撹拌し、次いでこれを取
し、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）にて洗浄後、こ
れをＬ型試験管に入れたバチルス・メガテリウ
ム・Ｂ−400の生産するアシラーゼ酵素液
（72u／ml）３ml中に加え、30℃、60分間撹拌し、
その後これを取し、0.5M食塩／0.1Mリン酸緩
衝液（PH7.5）、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で洗
浄して、各々目的とするアシラーゼと結合した固
定材を得た。さらに実施例１で得られた多孔質構造を有する
アミノ化ポリアクリロニトリルの粒状物を用い
て、上記と同様にして、アシラーゼを結合せしめ
て固定材を得た。その結果、○イにおいて得られたコポリマーを使
用した場合の固定材におけるアシラーゼ活性は
162u／ｇ、○ロにおいて得られたコポリマーを使
用した場合の固定材におけるアシラーゼ活性は
218u／ｇ、○ハにおいて得られたコポリマーを使
用した場合の固定材のアシラーゼ活性は192u／
ｇ、および実施例２における多孔質構造を有する
アミノ化ポリアクリロニトリルの粒状物を使用し
た場合の固定材のアシラーゼ活性は252u／ｇで
あつた。参考例６実施例１と同様にして得られた、多孔質構造を
有するポリアクリロニトリルの粒状物1.5ｇを、
アセトン25mlに浸け、トリエチルアミン１mlを加
え、さらにこれに無水コハク酸１ｇのアセトン溶
液12mlを約５分にて滴下して６時間撹拌し続け、
反応後これを取し、水洗し、1NHClで洗浄し
た後水洗し乾燥した。次いでこの反応生成物１ｇ
を、塩化カルシウム管を付した50ml容三角フラス
コに加え、ジオキサン３ml、さらにＮ−ヒドロキ
シスクシンイミド１ｇを添加し、氷冷し、これに
撹拌下、Ｎ，N′−ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド１ｇを溶解したジオキサン２mlを約10分にて
滴下し、10℃で１夜撹拌した。反応後、これを
取し、その20倍量のジオキサンを用いてデカンテ
ーシヨンによる洗浄を行ない、不溶物を除去し、
さらに、ジオキサンで洗浄し、これを減圧乾燥
し、次いでこの活性エステルを有する反応生成物
30mgを0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で充分膨潤せ
しめ、取した後これをバチス・メガテリウム・
Ｂ−400の生産するアシラーゼ酵素液（7.2u／ml）
５mlに添加し、氷浴中にてPH7.5で４時間撹拌し、
反応後取し、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で洗
浄した後、1Mグリシン／0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.5）中にて室温下60分撹拌して未反応の活性エ
ステル基を除去し、次いでこれを取して、その
固体相を0.5M食塩／0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）
で洗浄し、さらに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で
洗浄して、該粒状物とアシラーゼとを結合した固
定材（177.6u／ｇ）840mg（湿重量）を得た。実施例９多孔質構造を有するアミノ化ポリアクリロニト
リル繊維の製造水素化リチウムアルミニウム1.5ｇに乾燥ジエ
チルエーテル120mlを加え、これに実施例１で得
た多孔質構造を有するポリアクリロニトリル（ア
クリロニトリル90％以上）繊維1.5ｇを加え、還
流冷却管を取り付け、50℃の油浴中で10分〜30時
間加熱還流する。反応後、繊維を取り出し、乾燥
ジエチルエーテルを洗浄した後、1N塩酸、水、
1N水酸化ナトリウム水溶液、水の順で充分に洗
浄して多孔質構造を有するアミノ化ポリアクリロ
ニトリル繊維（太さ20〜35ミクロン）を得る。未
反応の水素化リチウムは少量の水を滴下して分解
する。得られたアミノ化ポリアクリロニトリル繊維の
物理化学的性質は次の通りである。色；ポリアクリロニトリルよりもやゝ黄色味を
帯びている。還元時間が長くなるに従い黄色味が
強くなる。粘度；不明（下記の溶媒に対して溶解しないた
め測定不可能）溶媒に対する溶解性；

【表】

【表】 ※繊維の太さが殆んど変化することなく繊維の
形態で残存して完全に溶解しない。溶媒に水を加
えると白濁し、次の実験により重量が減少してい
ることからみて、一部溶解していることが分る。各還元時間で得たアミノ化ポリアクリロニトリ
ル繊維30mgをDMF5ml中に入れ、60℃で３分間加
熱処理した後、繊維を取、水洗いして乾燥時の
重量を測定すると次の結果が得られた。還元時間重量減少率５分 31.3％１時間 29.0％５時間 27・０％２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ソ
ーダに対する呈色性；ポリアクリロニトリル繊維
は呈色しないが、アミノ化ポリアクリロニトリル
繊維は黄色に呈色し、アミノ基を有することが確
認された。アミノ基含量；得られた支持体の固定化蛋白質、推定アミノ基
含有量につき次の試験方法により求めた結果を第
１表ないし第３表に示す。固定化蛋白質上記で得た各反応時間における支持体18mgを
125％グルタルアルデヒド／ホウ酸緩衝液（PH
8.5）10ml中に加え、０℃で20分間撹拌する。繊
維を過し、ホウ酸緩衝液（PH8.5）、0.1Mリン
酸緩衝液（PH7.5）で洗浄した後、直ちに0.3％牛
血清アルブミンまたは、バチルス・メガテリウム
Ｂ−400のペニシリンアシラーゼ（140u／mg）／
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）２ml中に加え、30℃
で１時間振盪した後、過し、母液中に残存する
牛血清アルブミン含量およびペニシリンアシラー
ゼをLowry法〔O.H.Lowry，J.Biol.Chem.193，
265（1951）〕で測定し、牛血清アルブミンまたは
ペニシリンアシラーゼの該支持体への結合量を求
めた。また、該支持体をグルタルアルデヒド処理せず
に直接牛血清アルブミン溶液またはペニシリンア
シラーゼ溶液中に入れ、30℃で１時間振盪した
後、上記と同様にして牛血清アルブミンまたはペ
ニシリンアシラーゼの該支持体への吸着量を求め
た。アミノ酸結合による推定アミノ基含有量上記で得た各反応時間における支持体18mgを前
記）と同様にして125％グルタルアルデヒド溶
液で処理した後、これを0.3％濃度のグルタミン
酸（Glu）、スレオニン（Thr）、７−アミノデス
アセトキンセフアロスポラン酸（７−ADCA）
の各アミノ酸／0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）２ml
中に加え、30℃で１時間振盪する。反応混合物を
取し、上澄液のアミノ酸含量をアミノ酸自動分
析機にて定量し、該支持体中のアミノ基含有量を
アミノ酸結合容量として求めた。尚、本試験を実
施するに当つて、使用アミノ酸が該支持体に対し
て吸着特性のないことをアミノ酸の代りにアミノ
酸ヒドラチドを用いる試験により確認した。また
アミノ酸として７−ADCAを使用した場合は、
上澄液中の７−ADCA含量は高速液体クロマト
グラフイーを用い254nmの紫外部吸収値から求
め、該支持体の７−ADCA結合容量を求める。滴定による推定アミノ基含有量各還元時間における支持体80mgを2mM塩酸15
ml、蒸留水30mlと共に１時間撹拌する。過剰の塩
酸を2mM水酸化トナトリウム水溶液で滴定し、
試料支持体中のアミノ基含量を塩酸基として消費
した塩酸量として求める。試験結果

【表】

【表】酵素（ペニシリンアシラーゼ）吸着量；前項）において、バチルス・メガテリウムＢ
−400（FERM−Ｐ−400）の生産するペニシリン
アシラーゼについて、その結合量を求める代り
に、前記のペニシリンアシラーゼ活性測定法によ
りペニシリンアシラーゼ活性を求めた。その結果
は次の通りである。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１多孔質構造を有するアクリロニトリル系ポリ
マーを不活性非溶媒中ニトリル基を部分的にアミ
ノ基に還元することを特徴とする多孔質構造を有
する水不溶性のアミノ基含有アクリロニトリル系
ポリマーの製法。２多孔質構造が平均孔径40〜9000Åの範囲にあ
る多数の孔を有する構造である特許請求の範囲第
１項記載の製法。３アクリロニトリル系ポリマーが繊維状、粒
状、膜状または中空状成型物である特許請求の範
囲第１項または第２項記載の製法。４アクリロニトリル系ポリマーがアクリロニト
リル系モノマーのポリマーまたはこれとエチレン
性二重結合を含む他のコモノマーとのコポリマー
である特許請求の範囲第１項記載の製法。５アクリロニトリル系ポリマーがアクリロニト
リル、メタアクリロニトリル、α−クロロアクリ
ロニトリルまたはシンナムニトリルである特許請
求の範囲第４項記載の製法。６コモノマーがスチレン系モノマー、アクリル
酸エステル系モノマー、共役ジエン、ハロゲン化
オレフイン、ビニルエーテル系モノマー、ビニル
ケトン系モノマー、ビニルエステル系モノマー、
アミド系ビニルモノマー、塩基性モノマーまたは
多官能性モノマーである特許請求の範囲第４項記
載の製法。７アクリロニトリル系ポリマーが、多孔質構造
を有し、アクリロニトリル90％以上からなるポリ
アクリロニトリルの繊維状、粒状、膜状または中
空状成型物である特許請求の範囲第４項記載の製
法。８アクリロニトリル系ポリマーが、多孔質構造
を有し、アクリロニトリル、ジビニルベンゼンお
よびビニルエチルベンゼンよりなるコポリマーの
繊維状、粒状、膜状または中空状成型物である特
許請求の範囲第４項記載の製法。９非溶媒がアクリロニトリル系ポリマーおよび
アミノ基含有アクリロニトリル系ポリマーを溶解
しない有機溶媒である特許請求の範囲第１項記載
の製法。１０有機溶媒がジエチルエーテル、ジオキサン
またはテトラヒドロフランである特許請求の範囲
第９項記載の製法。１１還元を水酸化リチウムアルミニウムで行う
特許請求の範囲第１項記載の製法。１２還元をアミノ基含有アクリロニトリル系ポ
リマーが実質的に水溶性にならないまでの範囲で
行う特許請求の範囲第１１項記載の製法。１３アミノ基含有アクリロニトリル系ポリマー
が実質的に水溶性にならないまでの量のアミノ基
を有するアクリロニトリル系ポリマーである特許
請求の範囲第１項記載の製法。