Przedmiotem wynalazku jest sposób unieruchomiania komórek drobnoustrojów.Enzymy z ich znacznym stopniem specyficznosci sa znacznie lepsze niz konwencjonalne katalizatory w wie¬ lu przemianach chemicznych. Jednak do niedawna ich zastosowanie bylo w znacznym stopniu ograniczone ze wzgledu na takie czynniki, jak wysokie koszty ich izolowania, tendencja do nietrwalosci po usunieciu ich ze srodowiska cale} komórki oraz dostepnosc ich jedynie w postaci rozpuszczalnej.Unieruchomienie enzymów przez przylaczenie ich lub zatrzymanie w stalym materiale nosnikowym pomo¬ glo w rozwiazaniu niektórych z tych trudnosci i spowodowalo, ze zastosowanie enzymów stalo sie bardziej ekonomiczne. W literaturze pojawily sie artykuly, dotyczace róznych metod fizycznych i chemicznych, stosowa¬ nych do unieruchomiania enzymów, na przyklad Immobilized Enzymes - O.R. Zaborsky (CRC Press. 1973).Stosowano równiez unieruchomianie calej komórki jako takiej, aby uniknac koniecznosci izolowania enzy¬ mu i rozwiazac problem stabilnosci. Jednak do chwili obecnej takie unieruchomianie bylo ograniczone jedynie do metod fizycznych. Typowymi przykladami sa adsorpcja komórek Streptomyces phasochromogenes zawieraja¬ cych aktywna izomeraze glukozowa na zregenerowanym kolagenie skóry (Biotech. Bioengr., XV, str. 565 /1973/) oraz zatrzymanie na zelu komórek grzybów, zawierajacych enzym hydroksylazy, w celu konwersji zwiazku S do kortyzolu (Scientific American, Mar. 1971, str. 30). Takie metody unieruchomiania nie pozwalaja uniknac dezasocjacji komórek z srodowiska nosnikowego. Charakter sil wiazacych jest jednak w tym'przypadku taki, ze warunki reakcji musza byc W znacznym stopniu ograniczone, aby zapobiec lub zminimalizowac dezasocjacje oraz towarzyszace jej zmniejszenie aktywnosci enzymatycznej i ewentualnie zanieczyszczenie strumienia reagentów.Stwierdzono, ze komórki drobnoustrojów mozna unieruchomic na sposób trwalszy na drodze chemicznego kowalentnego zwiazania komórek z nierozpuszczalna w wodzie, rozdrobniona polimerowa matryca. Wiazanie chemiczne moze byc uzyskane albo ? uprzednio otrzymanym polimerem, albo z reaktywnym monomerem przed jego polimeryzacja. Dalsza obróbka komórek za pomoca wielofunkcyjnego srodka sieciujacego albo przed, albo po zwiazaniu, zmniejsza znaqwue straty enzymu z komórek.2 94936 Sposób unieruchomienia komórek drobnoustrojowych przez poddanie ich reakcji z wiazacymi ugrupowa¬ niami polimeru polega na wytworzeniu wiazan kowalentnych z nierozpuszczalna w wodzie rozdrobniona matryca polimerowa, co doprowadza do otrzymania kompozycji, zawierajacej komórki drobnoustrojów, kowalentnie zwiazane z nierozpuszczalna w wodzie rozdrobniona matryca, która stanowi polimer.W praktycznej realizacji sposobu wedlug wynalazku nienaruszone komórki drobnoustrojów wiaze sie che-' micznie z nierozpuszczalnym w wodzie, rozdrobnionym polimerem poprzez grupy reaktywne, wystepujace w po¬ limerze. O ile chemiczne wiazanie kowalentrie wyodrebionych enzymów z polimerem jest powszechnie stosowa¬ ne, to fakt, ze cale komórki jako takie, bedace zródlem enzymów, o wiele rzedów przekraczajace je wymiarami, mozna równiez w efektywny sposób unieruchomic przez wiazanie kowalentne, jest stwierdzeniem zaskakujacym.Takie wiazania czesto powstaja w wyniku reakcji grup aminowych komórki z reaktywnymi podstawnikami w po¬ limerze. Ponadto, w komórce znajduja sie inne grupy, takie jak hydroksylowe i sulfonowe, które moga równiez odgrywac role w mechanizmie wiazacym. Jest to prawda, poniewaz reaktywne wobec grup aminowych podsta¬ wniki polimeru, takie jak na przyklad ugrupowania epoksydowe, halogenokarbonylowe i halogenometylokarbo- nylowe, sa równiez reaktywne w odniesieniu do grup hydroksylowej i sulfohydrylowej, wystepujacych w komór¬ kach.Wiazanie moze powstac przed lub po wytworzeniu polimeru. W pierwszym przypadku komórki kontaktuje sie z dajacym sie polimeryzowac monomerem, posiadajacym nienasycone wiazanie typu etylenowego i posiadaja¬ cym grupe reaktywna, a nastepnie zwiazany z komórka monomer polimeryzuje sie lub kopolimeryzuje w obec¬ nosci monomeru sieciujacego i ukladu inicjujacego. W drugim przypadku komórki kontaktuje sie bezposrednio z dowolnym, odpowiednim do tego celu polimerem, zawierajacym reaktywne grupy. Dotyczy to zarówno polime-. rów naturalnych, jak i syntetycznych polimerów organicznych.Dajace sie polimeryzowac nienasycone monomery, zawierajace wiazanie typu etylenowego oraz wyprowa¬ dzone z nich polimery, nadajace sie do wykorzystania w sposobie wedlug wynalazku zarówno metoda wiazania przed polimeryzacja, jak i po polimeryzacji, okreslone sa wzorem 1, w którym R! oznacza atom wodoru lub chloru albo grupe metylowa, zas W oznacza grupe o wzorze 2, 3, 4 lub 5. We wzorach tych R2 oznacza atom chlorowca, grupe azydowa, grupe 2,3-epoksypropoksy, grupe 2,3-epitiopropoksy, grupe N-/2,3-epoksypropy- lo/-aminowa, grupe N-[/p-dwuazoniochloro/-fenylo]-aminowa, grupe akryloiloksy, nizsza grupe alkoksykarbony- loksy lub grupe benzenosulfonylóksy, X oznacza atom tlenu lub grupe NR3, w której R3 oznacza atom wodoru lub grUpe alkilowa, zawierajaca 1-6 atomów wegla, Y oznacza ugrupowanie alkilenowe, zawierajace 2 lub 3 atomy wegla, n oznacza liczbe calkowita, wynoszaca 1 lub 2, Z oznacza grupe chlorowcoacetylowa, 2-/4,6-dwu- chloro/-s-triazynylowa, p-toluenosulfonylowa, p-/chlorowcometylo/-benzoilowa lub grupe cyjanowa, zas X' = X z tym, ze jesli oznacza grupe p-toluenbsulfonylowa, wówczas X* oznacza atom tlenu.Do wiazania najkorzystniejsze sa monomery i polimery, zawierajace grupy epoksydowe, chlorowcokarbony- lowe i chlorowcometylokarbonylowe. Szczególnie korzystne sa te polimery, które zawieraja reaktywne moiróme- ry metakrylanu 2,3-epoksypropylu (metakrylan glicydylu), metakrylan 2,3-epitiopropylu, chlorek metakryloilu oraz metakrylan bromoacetylohydroksyetylu.W przypadku monomerów i polimerów, zawierajacych niereaktywne grupy funkcyjne, jak na przyklad w przypadku, gdy R2 oznacza grupe hydroksylowa lub Z oznacza atom wodo/u w podanym wyzej monomerze o wzorze 1, wówczas takie grupy funkcyjne mozna przeprowadzic znanymi metodami w podstawniki reaktywne.Operacja ta wymaga czesto zastosowania wielofunkcyjnych reagentów o^maly^i ciezarze czasteczkowym.I tak, gdy R2 we wzorze 1 oznacza grupe hydroksylowa, wówczas karboksylowe grupy monomeru lub polimeru mozna uaktywnic w reakcji z odpowiednim reagentem, uaktywniajacym grupy karboksylowe, takimjak karbodwuimid, na przyklad dwucykloheksylokarbodwuimid lub etylomorfolipokarbodwuimid. Z równym powo¬ dzeniem uzyc mozna 3'-sulfonian N-etylo-5-fenyloizoksyazoliowy (reagent K. Woodwarda), ketonoiminy, takie jak pieciometylenoketenocykloheksyloimina, estry acetylenowe, na przyklad etoksyacetylen, szesciochlorowco- cyklotrójfosforotriazyny, N-hydroksyftalimid lub N-hydroksysukcynimid oraz inne reagenty, stosowane do two¬ rzenia wiazan peptydowych.Gdy Z we wzorze 1 oznacza atom wodoru, wówczas grupy hydroksylowe monomeru lub polimeru mozna w podobny sposób uaktywnic znanymi metodami przy uzyciu zwiazków o wzorze chlorowiec-Z, w którym Z oznacza grupe chlorowcoacetylowa, grupe 2-/4,6-dwuchloro/-s-triazynylowa, grupe p-toluenosulfonylowa, gru¬ pe p-/chlorowcometylo/benzoilowa lub grupe cyjanowa, zwlaszcza bromku bromoacetylu lub bromocyjanu.Sposób unieruchomienia znajduje zastosowanie w odniesieniu do fcomórek drobnoustrojów, takich jak bakterie, drozdze, promieniowce i grzyby. Korzystnymi komórkami sa^koraórki, w których pierwotnymi uklada¬ mi enzymowymi sa oksydoreduktazy, szczególnie takie, jak oksydazy glukozowe, nie wymagajace rozpuszczal¬ nych kofaktorów, hydrolazy, jak na przyklad a, 0-amyla^y i peptydazy, a szczególnie acylazy penicylinowe,94936 3 liazy, korzystnie te, które powoduja rozrywanie wiazan wegiel-tlen, a zwlaszcza takie, jak amonoliaza fenyloala- ninowa i amonoliaza asparaginianowa, które sa zwiazane z rozrywaniem wiazan wegiel-azot oraz izomerazy, takie jak racemazy, epimerazy, cis-trans izomerazy, a zwlaszcza izomeraza glukozowa.Korzystnymi rodzajami bakterii sa: Pseudomonas, Xanthomonas, Acetobacter, Alcaligenet^Flayobacterium, , Escherichia, Aerobacter, Erwinia, Serratia, Proteus, Micrococcus, Sarcina, Lactobacillus, Bacillus, Nocardia, Strep- tomyces i Corynebacterium. Korzystne rodzaje grzybów i drozdzy obejmuja: Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces, Mucor, Fusarium, Penicillum, Aspergillus, Glomerella, Rhizopus, Saccharomyces, Conidiobolus, Byssochlamys, Candida, Chaetomium, Trichoderma, Septoria, Coprinus, Neurospora, Rumucola i Trichoderma.Korzystnym promieniowcem jest rodzaj Micropolyspora. Szczególnie korzystne sa gatunki Escherichia coli, Bacterium cadaveris, Proteus rettgeri, Rhodotorula gracilis, Penicillium chrysogenum i Aspergillus niger.Wytworzenie wiazania kowalentnego miedzy komórka i reaktywnym polimerem lub zwiazanie reaktywne¬ go monomeru, a nastepnie jego polimeryzacje lub kopolimeryzacje prowadzi sie w srodowisku wodnym. Chociaz temperatura zwiazania komórki z polimerem lub monomerem lub tez temperatura polimeryzacji po zwiazaniu komórki z monomerem moze sie wahac w szerokim zakresie, to jednak najkorzystniejszy jest zakres 5—50°C, a zwlaszcza 10-30°. Czas potrzebny na wytworzenie wiazania, zalezy od charakteru ukladu i temperatury reakcji, lecz zwykle wynosi 0,5-35 godzin, przy czym korzystny czas wiazania do polimeru wynosi 15-30 godzin, natomiast wiazania komórki z monomerem 1-5 godzin. Polimeryzacja zwykle zachodzi calkowicie w czasie 1-6 godzin. Stosunek wagowy polimeru do komórek (substancja sucha) moze sie wahac w szerokich granicach, lecz najkorzystniejszy stosunek wynosi 0,1—25, a zwlaszcza 0,5—4.Jesli komórki wiaze sie z reaktywnym monomerem, to nastepnie prowadzi sie polimeryzacje addytywna w srodowisku wodnym, z udzialem lub bez, jednego lub wiekszej liczby komonomerów w obecnosci dwufunk- cyjnego monomeru sieciujacego oraz ukladu inicjatora. W tym przypadku mozna zastosowac z latwoscia dowol¬ ny komonomer, monomer sieciujacy lub uklad inicjujacy sposród zwykle stosowanych w tym typie polimeryza¬ cji, które nie niszcza aktywnosci enzymatycznej komórki.Odpowiednimi komonomerami sa na przyklad kwasy akrylowy, a-chloroakrylowy i metakrylowy oraz estry glicydylowy, nizsze estry alkilowe, dwupodstawione przy azocie estry aminoalkilowe, amidy, amidy podsta¬ wione nizszymi grupami alkilowymi, amidy podstawione grupa metylolowa,jednopodstawione przy atomie azotu, aminoalkiloamidy jednópodstawione przy atomie azotu oraz aminoalkiloamidy dwupodstawione przy atomie azotu wspomnianych wyzej kwasów, a takze styren, butadien i izopren. Korzystnymi komonomerami sa styren, kwas akrylowy, metakrylan [2-hydroksy-3-/l-[^-metyl°pJPerazynyl0]-ProPylu» a zwlaszcza metakrylan metylu.Jesli chodzi o monomery sieciujace, to mozna tu zastosowac wiele róznych zwiazków, które nadaja polime¬ rowi charakter sieci trójwymiarowej oraz nierozpuszczalnosc w wodzie koncowego produktu, na przyklad mono¬ mery akrylowe lub zwiazki olefinowe i inne znane, stosowane w tym celu substancje. Przykladami takich mono¬ merów sa: dwuakrylan 1,3-butylenu, dwumetakrylan glikolu etylenowego, dwumetakrylan 1,3-butylenu, dwu- akrylan 1,6-heksametylenu, dwuakrylan etylenu, dwumetakrylan glikolu dwumetylenowego, N^-metylenobis- akrylamid, dwumetakrylan glikolu neopentylowego, trójmetakrylan 1,1,1-trójmetyloetanu oraz dwuwinyloben- zen. Korzystnym monomerem sieciujacym jest N,N*-metylenobisakrylamid.Reakcje polimeryzacji i kopolimeryzacji inicjowane sa wolnymi rodnikami. Odpowiednimi wolnorodniko- wymi ukladami inicjujacymi sa te uklady, które wytwarzaja wolne rodniki z szybkoscia odpowiednia dla polime¬ ryzacji lub kopolimeryzacji w warunkach lagodnych, narzucanych czuloscia termiczna enzymowej reszty komór¬ ki. Z tego tez wzgledu najkorzystniejsze sa inicjujace uklady redukujaco-utleniajace. Przykladami takich ukla¬ dów sa zwiazki nadtlenowe, takie jak nadsiarczany amonu, sodu lub potasu, nadtlenek benzoilu oraz nadtleno- dwuweglan dwu-/H-rzed.butylu/ w polaczeniu ze srodkami redukujacym), {^i^j jak tiosiarczan sodu, metadwu- siarczyn sodu, szesciowodzian siarczanu zelazowo-amonowego, nitryl k^Si, / Wyjj)ptylpa|pnppropionowegp lub ryboflawina. Szczególnie korzystnym ukladem inicjafprowyii! jest uklac^ zluzafif z D^y'1! kwasu dwuinetylp- aminopropionowego i nadsiarczanu amonu.Sklad polimeru moze sie *wahac w szerokich granicach, przy czyni najkorzystniejszy slclad, wyrazony w procentach molowych calej ilosci monomeru wynosi 15-§@$ fgajc^|^g|8 wzgledem komórek monomery 0-60% komonomeru i 10-40% monomeru sieciujacego. Pjroppjgjg |§Jt}e §| kpfzystne zarówno przy wiazaniu komórek z monomerem, jak i uprzednio wytworzonym polimerem.W niektórych przypadkach komórki poddaje sie dzialaniu y^elof^ll^cyjnego reagenta sieciujacego celem zmniejszenia strat enzymu z komórek. Chociaz dokladny mechanizm tegp zjawiska nie jest w pelni zrozumialy, to jednak przyjmuje sie, ze jedna klasa reagentów wielofunkcyjnych reaguje i przez to sieciuje grupy aminowe w blonie komórki, efektywnie zmniejszajac jej porowatosc. Inna klasa tych zwiazków daje taki wynik przez aktywacje grup karboksylowych, wystepujacych w blonie komórkowej, które to grupy reaguja nastepnie z gro-4 94936 parni aminowymi blony komórkowej, tworzac wiazania amidowe. Typowymi przykladami pierwszej z tych klas reagentów sa takie zwiazki, jak aldehyd pirogronowy, glioksal, aldehyd hydroksyadypinowy, chlorek cyjanutu, czteroazanowana o-dwuanizydyna, bis-dwuazanowana benzydyna, 1,3-dwufluofo-4,6-dwtmttrobenzen, tolue- no-2,4-dwuizocyjanian, a zwlaszcza aldehyd glutarowy. Druga klasa zwiazków obejmuje takie reagenty, jak chloromrówczan etylu oraz rozpuszczalne w wódzie karbodwuimidy, na przyklad chlorowodorek l-etylo-3-/3'- dwumetyloaminopropylo/-karbodwuimidu.Komórki mozna poddac dzialaniu tych zwiazków w czasie, przed, lub tez po przylaczeniu ich do reaktyw¬ nego monomeru, badz tez polimeru. Podobnie jak zwiazanie komórki, równiez te obróbke prowadzi sie w srodo¬ wisku wodnym. Reakcje te mozna prowadzic efektywnie w szerokim zakresie temperatur,' lecz korzystny zakres temperatur wynosi 5-50°C, a zwlaszcza 10--30°C. Zaleznie od zastosowanej temperatury i charakteru reagenta obróbka taka wymaga zwykle czasu od 0,5-10 godzin, najkorzystniej 2-4 godziny. Niezbedna ilosc uzytego reagentu zmienia sie znacznie i wynosi zwykle 1-50% wagowych masy komórek w stanie wysuszonym, a najko¬ rzystniej 5-25% wagowych.Opisany sposób unieruchomienia komórek przez wytworzenie chemicznych wiazan kowalentnych z nieroz¬ puszczalnym w wodzie polimerem i ewentualna obróbke, zmniejszajaca utrate enzymu z komórek, daje caly unieruchomiony uklad enzymowy bez koniecznosci wyodrebniania odpowiedniego enzymu. Dlatego tez, ze wzgledu na jego stabilnosc i szczególna postac, ulatwiajaca odfiltrowanie, produkt ten mozna w efektywny sposób stosowac w srodowisku wodnym jako katalizator w procesach, wymagajacych badz stosowania zawrotów, badz tez prowadzonych w sposób ciagly.Sposób wedlug wynalazku zilustrowano w ponizszych przykladach.Przyklad I. Do 80 g metakrylanu glicydylu i 1,0 l wody dodano podczas mieszania 30 N,N'-metyleno- bisakrylamidu. Calosc mieszano przez 15 minut w temperaturze pokojowej, dodano 10 g metakrylanu metylu i mieszanine ochlodzono da temperatury okolo 5°C, po czym przepuszczano przez nia na zimno przez okres 15 minut gazowy azot. Nastepnie do mieszaniny dodano 20 ml nitrylu kwasu dwumetyloaminopropionowego i 2 g nadsiarczanu amonu i calosc mieszano w atmosferze azotu, w temperaturze I0°C do chwili rozpoczecia polime¬ ryzacji, a nastepnie mieszano nadal 1 godzine w temperaturze pokojowej, po czym calGsc odstawiono na okres 2 godzin. Do otrzymanego ciala stalego dodano 750 ml wody i calosc energicznie mieszano w celu rozbicia polimeru. Cialo stale odsaczono, przemyto woda i wysuszono na powietrzu, uzyskujac 120 g bialego rozdrobnio¬ nego polimeru.Przesaczono bulion fermentacyjny Aspergillus niger (NRRI-3, szczep Pfizera FD 2454), fermentowany w zanurzeniu w warunkach aerobowych w temperaturze 33°C przy wartosci pH = 5,8-7,0 na podlozu glukozo¬ wym/Komórki przemyto woda i odcisnieto do postaci pól suchej pasty. Komórki w ilosci 250 g, 55 g suchej masy umieszczono w roztworze zawierajacym 22gv25% wagowo, wodnego roztworu aldehydu glutarowego w 1000 ml wody. Wartosc pH zawiesiny doprowadzono do 6,2 i mieszano przez 1 i.3/4 godziny w temperaturze pokojowej. Cialo stale odsaczono i przemyto woda, uzyskujac 104 g obrobionych wilgotnych komórek, posiada¬ jacych 76% poczatkowej aktywnosci oksydazy glukozowej.Zawiesine 32 g wilgotnych obrobionych komórek i 16 g polimeru metakrylanu glicydylu w 240 ml wody mieszano przez okres 30 godzin w temperaturze pokojowej, a nastepnie przesaczono. Cialo stale przemyto woda, uzyskujac 126g wilgotnych unieruchomionych komórek, posiadajacych 58% aktywnosci oksydazy gjdkozowej w stosunku do aktywnosci oryginalnych, nieobrabianych komórek.Przyklad II. Do zawiesiny 600 mg obrabianych, wilgotnych komórek Aspergillus, otrzymanych w sposób podany w przykladzie I (23 jednostki aktywnosci oksydazy glukozowej na 100 mg), w 20 ml acetoni- trylu, dodano jednoczesnie 600 mg chlorku metakroilu i 400 mg trójetyloaminy. Calosc mieszano w temperatu¬ rze pokojowej przez okres 2 godzin, a nastepnie przeniesiono do 20 ml wody (wartosc pH mieszaniny wynosila 6,3). Do mieszaniny wodnej dodano w atmosferze azotu 1,3 g N,N*-metylenobis-akrylamidu, 750 mg metakryla¬ nu i 300 mg kwasu akrylowego, po czym pH mieszaniny doprowadzono do wartosci 6,7 i dodano 0,5 ml nitrylu kwasu dwumetyloaminopropionowego i 250 mg nadsiarczanu amonu.Po dwóch godzinach-do srodowiska reakcji wprowadzono dalsze 150 mg nadsiarczanu amonu i mieszano dalej przez 1 godzine, a nastepnie do mieszaniny reakcyjnej dodano równa jej objetosc wody i odwirowano.Pozostalosc odsaczono i przemyto woda, uzyskujac 32,25 g wilgotnych unieruchomionych komórek, posiadaja¬ cych 78% aktywnosci oksydazy glukozowej w stosunku do aktywnosci oryginalnych nieobrabianych komórek.Przyklad III. Wilgotne unieruchomione komórki, otrzymane w sposób opisany w przykladzie I (47,3 g), umieszczono w 100 ml wodnego roztworu/zawierajacego 10 g glukozy i calosc mieszano w temperatu¬ rze pokojowej z napowietrzeniem przez okres 21 godzin. Uzyskano 99% konwersje do mieszaniny kwasu glute¬ nowego i delta gjukonolaktonui oznaczono 67% oryginalnej aktywnosci enzymatycznej.94936 5 Utlenianie 1o mozna powtórzyc przy uzyciu 30 g wilgotnych unieruchomionych komórek z przykladu II w 20 ml wodnego roztworu, zawierajacego 2 g glukozy, uzyskujac porównywalna konwersje i odzysk aktywnosci enzymatycznej. ^ Przyklad IV. Bulion 'fermentacyjny Proteus rettgeri (ATCC 9250, szczep Pfizera FD 13470--76-60), fermentowany w zanurzeniu w warunkach aerobowych w temperaturze 28°C przy wartosci pH - 6,8-7,0 na podlozu z kazeiny mlecznej odwirowano i komórki rozdrobniono w wodzie i odcisnieto do poataci pólsuchej pasty. Do zawiesiny wilgotnych komórek (7,5 g suchej masy) w 100 ml wody dodano 4 g 25% wagowo wodnego roztworu aldehydu glutarowego. Calosc mieszano przez okres 3 godzin przy wartosci pH = 7,0, a nastepnie odwirowano.Obrabiane komórki ponownie zawieszono w 100 ml wody i dodano podczas mieszania 7,5 g polimeru metakrylanu glicydylu z przykladu 1. Calosc mieszano przy wartosci pH = 7,0, w temperaturze pokojowej, przez okres 30 godzin. Cialo stale odsaczono, przemyto woda i przechowywano w poataci wilgotnego produktu do czasu uzycia. Unieruchomione komórki wykazywaly 65% aktywnosci komórek nleobrabianych, przy czym po¬ miar oparto na szybkosci konwersji penicyliny G do kwasu 6-aminopenicylanowego (6-APA). ^ Przyklad V. Do zawiesiny 20 g (5,0 g suchej masy) unieruchomionych komórek Proteus rettftrl z przykladu IV w 500 ml wody przy wartosci pH = &,0 i w temperaturze 37°C dodano 5 g soli potasowej penicy¬ liny G. Wartosc pH mieszaniny utrzymywano na poziomie 8,0, dodajac ijednoczesnie dokonujac pomiaru 1 n roztwór NaOH, az do calkowitego zakonczenia hydrolizy, co nastapilo po uplywie 3 godzin.Unieruchomione komórki odsaczono, przemyto woda i przechowywano w postaci wilgotnego produktu do dalszego uzycia. Wartosc pH przesaczu doprowadzono do 2 przy uzyciu 2 n roztworu HCI i ekstrahowano octa¬ nem etylu. Wartosc pH otrzymanej warstwy wodnej doprowadzono do 4,3 przy uzyciu 2 n roztworu NaOH, zatezono i ochlodzono, uzyskujac biale, krystaliczne cialo stale. Krysztaly odsaczono, przemyto woda i wysu¬ szono na powietrzu, otrzymujac 2,17* g (wydajnosc 75%) czystego kwasu 6-aminopenicylanowego. Po 20 cyklach hydrolizy unieruchomione komórki zachowywaly nadal okolo 50% aktywnosci acylazy penicyliny w stosunku do oryginalnych unieruchomionych komórek z przykladu IV.Przyklad VI. Do energicznie mieszanych w atmosferze azotu 3,6 g metakrylanu bromoacetylohydro* ksyetylu w 15 ml wody dodano 375 mg N,Nf-melylenobisakryloainidu. Mieszanine ochlodzono do temperatury °C i dodano 0,25 ml nitrylu kwasu dwumetyloaminopiopionowego i 38 g nadsiarczanu amonu. Calosc mieszano powoli w temperaturze pokojowej az do rozpoczecia polimeryzacji. Mieszadlo nastepnie zatrzymano i mieszani¬ ne reakcyjna utrzymywano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Otrzymana zawiesine rozcienczono ml wody i odsadzono. Osad przemyto woda i wysuszono na powietrzu, uzyskujac 3,7 g polimeru.Odcisniete do stanu wilgotnego komórki Proteus rettgeri hodowane i wyodrebnione, jak w przykladzie IV (10 g, 2 g suchej masy), umieszczono w roztworze, zawierajacym 0,8 g 25% wagowo wodnego roztworu aldehydu glutarowego w 50 ml wody. Wartosc pH zawiesiny doprowadzono do 7,0, calosc mieszano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej i odwirowano. Obrobione komórki rozdrobniono w 50 ml wody i odcisnieto do poata¬ ci pólsuchej pasty. x Zawiesine 10 g obrabianych komórek i20g polimeru metakrylanu brornoacetylohydroksyloacetyhi w 120 ml wody energicznie mieszano przez okres 30 godzin w temperaturze pokojowej przy wartosci pH ¦ 7,0.Mieszanine przesaczono i cialo stale pTzemyto woda, uzyskujac 36,8 g wilgotnych unieruchomionych komórek, posiadajacych 75% aktywnosci acylazy penicylinowej w stosunku do oryginalnych komórek, nie poddawanych obróbce.Przyklad VII. Do zawiesiny 46 g wilgotnych, unieruchomionych komórek z przykladu VI w 500 ml wody o wartosci pH = 8,0 i w temperaturze 37°C dodano 5 g soli potasowej penicyliny G i wartosc pH zawiesiny utrzymywano na poziomie 8,0 przez stale dodawanie 1 n roztworu NaOH. W czasie dodawania rejestrowano wartosc pH i hydrolize doprowadzono do konca w ciagu 3 godzin. Unieruchomione komórki odsaczono, przemy¬ to woda i przechowywano w stanie wilgotnym do dalszego uzycia. Wartosc pH przesaczu doprowadzono do 7 przy uzyciu 2 n roztworu HCI i elcstrahowano octanem etylu. Wartosc pH warstwy wodnej doprowadzono przy uzyciu 2 n roztworu NaOH do 4,3, zatezono i ochlodzono, uzyskujac krystaliczny kwas framinopeiiicylanowy.Przyklad VIII. Zawiesine 25 g wilgotnych, poddanych.obróbce komórek Aspergillus nl|rt, taluchjak w przykladzie I i 2 g metakrylanu glicydylu w 60 ml wody mieszano przez okres 17 god/in w temperaturze TC.Zawiesine te dodano do mieszaniny 2,2g N^metylenobis-akryloamidu, 2ml styrenu, 450mg metakrylanu metylu, 0 5 ml nitrylu kwasu dwumetyloaminopropionowego i 1,5 metakrylanu [2-hydroksy-3-/l- [4-metylopipi razynyloj-propylu] w 40 ml wody przy wartosci pH = 6,8. Mieszanine w atmosferze azotu zadano 20Ó«g*id- siarczanu amonu i mieszano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Cialo stale, uzyskai* w wyifot ttifceji, odsaczono, przemyto woda, uzyskujac 43,6 wilgotnych unieruchomionych komórek, posiadajacych 73* aktyw- nosci oksydazy glukozowej w stosunku do oryginalnych komórek, nie poddawanych obróbce.6 94936 "Przyklad IX. Wilgotne unieruchomione komórki (28,3 g) z przykladu vifiumieszczoao^v 200 ml wodnego roztworu; zawierajacego 20 g glukozy i calosc mieszano napowietrzajac przez okres 21 godzin w tempe* raturze pokojowej. Otrzymano z wydajnoscia 80% mieszanine kwasu glukonowegp i delta gjukonolaktoruj, Za- , wiesine reakcyjna przesaczono i cialo stale przemyto woda, otrzymujac 28 g wiljgcstnych unieruchomionych komórek, posiadajacych 82% oryginalnej aktywnosci enzymatycznej.P r z y k l ad X. Zawiesine 5 g odcisnietych do stanu wilgotnego komórek Proteus rettgeri hodowanych; i wyodrebnionych, jak w przykladzie IV i 10 g polimeru metakrylanu glicydylu z przykladu 1 w 65 ml wody, ;mi'eszano energicznie przez okres 24 godzin w temperaturze pokojowej. Mieszanine przesaczono i osad przemyto, .uzyskujac 26,9 g wilgotnych unieruchomionych komórek, wykazujacych 62% poczatkowej aktywnosci acylazy penicylinowej.;:. ;: Unierttchornione komórki (25 g, Ig suchych komórek) umieszczono w roztworze zawierajacym 0,4 g 25% ? wodhe^b roztworu aldehydu gJutafoWego w 50 ml wody, Wartosc pH zawiesiny doprowadzono do 7,0 i mieszano SjSrzdz 3 godziny w temperaturze pokojowej. Zawiesine przesaczono i osad przemyto woda, uzyskujac 23,2 g wilgotnych, obrobionych, unieruchomionych komórek, wykazujacych 79% aktywnosci acylazy penicylinowej WstBsunku do unieruchomionych komórek, nie poddawanych obróbce. i^^z;ytta d XI. Do zawiesiny 12 g wilgotnych, unieruchomionych komórek, otrzymanych wprzykla- 'diU X, w 100 mf wody przy wartosci pH = 8,0 i w temperaturze 37°C dodano l g soli potasowej penicyliny G f wartosc pH mieszaniny reakcyjnej utrzymywano na poziomie 8,0, dodajac 1 n roztwór NaOH przy jednocze¬ snym pomiarze pHi Rekcje doprowadzono do konca po uplywie 3 godzin. Unieruchomione komórki odsaczono, przerhyto woda i przechowywano w postaci wilgotnej do dalszego uzycia. Wartosc pH filtratu doprowadzono do ytertósci 2 za pomoca 2 n HCl i ekstrahowano octanem etylu. pH otrzymanej warstwy wodnej doprowadzono do wartosci 4,3 za pomoca 2 n NaOH, zatezono te warstwe i ochlodzono, otrzymujac krystaliczny kwas 6- APA. j ^ Przy kla d XII. Zawiesine komórek Aspergillus niger, hodowanych i wyodrebnionych jak w przykla¬ dzie 1 (20 g, 4 g suchej masy) i 8 g metakrylanu glicydylu w 100 ml wody wytrzasano w temperaturze pokojowej przez oktas 18 godzin, po uprzednim doprowadzeniu pH do wartosci 7,5. Nastepnie dodano 1,5 g N,N'-metyleno- bisakrytamidu i otrzymana zawiesine mieszano w atmosferze azotu wciagu 15 minut, po czym ochlodzono do "iemperatury* 5**C, dtfdario 150 mg nadsiarczanu amonu i 1 ml nitrylu kwasu dwumetyloaminopropionowego i ca- ^Sc\itieizAiio'y/'iirn^et^tutze otoczenia przez okres 3 godzin. Powstale w reakcji cialo przesaczono, przemyto WodaTuzyskujac 71 g wilgotnych unieruchomionych komórek, wykazujacych 62% oryginalnej aktywnosci oksy¬ dazy glukozowej. . ' * : I 'Unieruchomione komórki (18 g, 1 g suchych komórek) umieszczono w roztworze, zawierajacym 0,4 g 25% wagoiyb wodnego roztworu aldehydu glutarowego w 100 ml wody. pH zawiesiny doprowadzono do wartosci 7,0 i cklosc mieszano przez okres 3 godzin w temperaturze pokojowej. Cialo stale odsaczono, przemyto woda, uzyskujac 17,3 wilgotnych unieruchomionych komórek, poddanych obróbce, posiadajacych 75% aktywnosci oksydazy glukozowej w porównaniu z unieruchomionymi komórkami przed poddaniem ich obróbce za pomoca atóehy.du glutarowego.Pi zy k*l a d XIII. Wilgotne, poddane obróbce unieruchomione komórki (14 g) z przykladu XII umiesz- ^zonp^ w 15 Ml wodnego roztworu, zawierajacego 1,5 g glukozy i calosc mieszano przy napowietrzaniu w ciagu 21Jgodzmj w temperaturze pokojowej, uzyskujac konwersje do kwasu glukonowego oraz pozostala aktywnosc enzymatyczna porównywalna z wynikami, uzyskanymi w przykladzie III.Przyklad XIV. Komórki Rhodotorula gracilis (NRRL Y1091, hodowla Pfizera FD 6521) wyodre¬ bniono przez wirowanie z bulionu fermentacyjnego, poddawanego fermentacji w zanurzeniu w warunkach aero- bowych w temperaturze 28°C, przy wartosci pH = 6,8-7,0 na podlozu glukozowym. 50 g przemytych komórek w 50 ml wódy poddano dzialaniu 5 g polimerycznego metakrylanu glicydylu z przykladu I. Calosc mieszano wtemperaturze pokojowej przez okres 20 godzin. Zawiesine przesaczono i osad przemyto woda, uzyskujac 63 g wilgotnych unieruchomionych komórek, posiadajacych 49% oryginalnej aktywnosci amonoliazy fenyloalanino- wej. : Przyklad XV. pH zawiesiny 14,74 g wilgotnych, unieruchomionych komórek z przykladu XIV w 30 ml wody, zawierajacej 2,25 g kwasu transcynamonowego, 6,52 g chlorku amonu i 3,3 ml stezonego wodoro¬ tlenku amonowego doprowadzono do wartosci pH = 9,5. Mieszanine wytrzasano w temperaturze 37°C przez 18 gocMii, uzyskujac wydajnosc okolo 90% w odniesieniu do 1-fenyloalaniny, obliczone z odzyskanego kwasu ^n^ttóWowego. Stale reagentyodsaczono, przemyto woda, uzyskujac 14 g wilgotnych unieruchomionych komó- t&;Htf#atityacych 77% ich pierwotnej aktywnosci amonoliazy fenyloalaninowej. 1-fenyloalanine wyodrebniono z przesaczu przy uzyciu znanych metod.94 936 7 Przyfc-Jtirf' XVI. Zawiesine 40 g przemytych komórek Rhodatorula ^racilis, lMJddwanych i wyodre¬ bnionych jak wf^kladzie XIV oraz 8 g metakrylanu glicydylu w 80 ml wody miewano w temperaturze poko¬ jowej prze/ okfcs 1.5 godzin, po uprzednim doprowadzeniu pH do wartAftf7^f. Nastepnie dodano l ,5 g NJ4-me- tylenobisakrylaroidu i otrzymana zawiesine mieszano w atmosferze azotu przez 10 minut, po C2ym ochlodzono do temperatury 50C, dodano 150 mg nadsiarczanu amonu i 1 ml nitrylu kwasu dwumetyl6arnifio^ropknawcgo i calosc mieszano w temperaturze pokojowej pr^z. okres 3 godzili. Mieszanine reakcyjna rozcienczono woda i przesaczono. Polimeryczny osad przemyto woda, uzyskujac 6 62,3 g wilgotnych unieruchomionych komórek, wykazujacych 44% oryginalnej aktywnosci amonoliazy fenyloalaninowej.Przyklad XVII. pH zawiesiny 15 g wilgotnych, unieruchomionych komórek z przykladu XVI w 30 ml wody, zawierajacej 1,12 g kwasu transcynamonowego, 320 mg chlorku amonu i 1,6 ml stezonego roz¬ tworu amoniaku doprowadzono do wartosci pH = 9,5. Mieszanine wytrzasano w temperaturze 37°C przez 18 godzin, uzyskujac wydajnosc 1-fenyloalaniny, porównywalna z uzyskana w przykladzie XV.Przyklad XVIII. Zawiesine 15 g odcisnietych do stanu wilgotnego komórek Proteus rettgeri, wyhodo¬ wanych i wyodrebnionych, jak w przykladzie IV oraz 30 g polimeru metakrylanu glicydylu z przykladu I w 100 ml wody energicznie mieszano w temperaturze pokojowej przy wartosci pH = 7 przez okres 18 godzin* Zawiesine nastepnie odwirowano i cialo stale przemyto woda, uzyskujac lOOg wilgotnych, unieruchomionych komórek, posiadajacych 100% poczatkowej aktywnosci acylazy penicylinowej.Do zawiesiny 25 g wilgotnych, unieruchomionych komórek w 70 ml wody przy wartosci pH = 8,0, w tem¬ peraturze 37°C dodano l g soli potasowej penicyliny G. Hydrolize prowadzona przy wartosci pH - 8.0, utrzymy¬ wanym przez ciagle dodawanie l n roztworu NaOH zjednoczesnym pomiarem pH, doprowadzono do konca w ciagu 3 godzin. Nastepnie zawiesine przesaczono i unieruchomione komórki przemyto woda i przechowywano w postaci wilgotnej do dalszego wykorzystania. Efektywnosc tych komórek w procesie wytwarzania kwasu 6-aminopenicylanowego nie byla tak duza, jak efektywnosc unieruchomionych komórek z przykladu IV, ponie¬ waz komórki zachowywaly po dwóch cyklach hydrolizy jedynie 15% aktywnosci acylazy penicylinowej w po¬ równaniu z oryginalnymi komórkami.Przyklad XIX. Do 25 g metakrylanu 2-hydroksyetylu w 100 ml wody dodano 12,5 g bromocyjanu, rozpuszczonego w 100 ml wody, pH mieszaniny natomiast doprowadzono do wartosci 11 5 n roztworem NaOH, co spowodowalo wzrost temperatury reakcji do 46°C, wartosc pH utrzymywano na tym samym poziomie az do momentu, gdy przestalo byc konieczne dalsze dodawanie zasady. Mieszanine ochlodzono do temperatury poko¬ jowej, pH doprowadzono do wartosci 6,6 i dodano zawiesine 50 g suszonych przez wymrazanie komórek Proteus rettgeri, uprzednio wyhodowanych i wyodrebnionych w sposób opisany w przykladzie IV. które rozdrobiono w 500 ml wody.Otrzymana zawiesine mieszano 45 minut. Nastepnie dodano 25 g akryloamidu i 2,5 g N,N'-metylenobis- akrylamidu i zawiesine mieszano 15 minut, ochlodzono do temperatury 4°C i dodano 4 ml nitrylu kwasu dwu- metyloaminópropionowego i 425 mg nadsiarczanu amonu. Mieszanine poliincryzacyjna odstawiono celem ogrza¬ nia do temperatury pokojowej i utrzymywano wciagu I godziny. Nastepnie calosc wymieszano w mieszalniku Waringa i odwirowano. Uzyskane cialo stale, podobne do zelu rozdrobniono do postaci zawiesiny w wodzie, powtórnie odwirowano, przemyto woda i suszono przez wymrazanie, uzyskujac 112 g suchych, unieruchomio¬ nych komórek, wykazujacych 19% poczatkowej aktywnosci acyla/y penicylinowej.Przyklad XX. Do zawiesiny 20g odcisnietych do stanu wilgotnego komórek Proteus rettgeri, hodo¬ wanych i wyodrebnionych jak w przykladzie IV, w 80 nil wody dodano I g 25% wagowo, wodnego roztworu aldehydu glutarowego i 10 g metakrylanu glicydylu. pH zawiesiny doprowadzono do wartosci 6,8 i calosc mie¬ szano w temperaturze, pokojowej przez 2 godziny. Mieszanine w atmosferze azotu poddano dzialaniu 1,9 g NjN^-rnetylenobisakrylamidu i 2 g nitrylu kwasu dwumetyloaminopropionowego, jej pH doprowadzono do war¬ tosci 7 i dodano 200 mg nadsiarczanu amonu.Otrzymana zawiesine mieszano przez 0,5 godziny, a nastepnie odstawiono w temperaturze pokojowej na J ,5 godziny. Cialo stale odsaczono i przemyto woda, uzyskujac 81,3 g wilgotnych unieruchomionych komórek, wykazujacych 54% oryginalnej aktywnosci acylazy penicylinowej, w porównaniu z nieobrabianymi komórkami.Wilgotne, unieruchomione komórki stosowano w reakcji konwersji soli sodowej penicyliny G do kwasu 6-aminopenicylanowego, zgodnie z przykladem VII, uzyskujac porównywalne wyniki.Przyklad XXI. Bulion fermentacyjny Bacterium cadaveris (ATCC 9760, szczep Pfizera FD 24016), hodowany w zanurzeniu w warunkach aerobowych w temperaturze 28°C, przy wartosci pH « 6-8 na podlozu hydrolizatu bialkowego odwirowano i komórki rozdrobniono w wodzie i odcisnieto do postaci pólsuchej pasty.Do zawiesiny wilgotnych komórek (7,5 g suchej masy) w 100 ml wody dodano 4g 25% wagowo, wodnego roztworu aldehydu glutarowego. Calosc mieszano przez okolo 2 godzin przy wartosci pH = 7, a nastepnie8 94 936 odwirowano. Poddane obróbce komórki rozdrobniono do postaci zawiesiny w 100 ml i dodano 7,5 g polimeru metakrylanu glicydylu z przykladu I podczas mieszania. Calosc mieszano przy wartosci p pH = okolo 7,0, w temperaturze pokojowej przez okres 30 godzin. Cialo stale odsaczono, przemyto woda i przechowywano w postaci wilgotnej do czasu uzycia.Przyklad XXII. 120 g kwasu fumarowego dodano do 140 ml stezonego roztworu amoniaku. pH mieszaniny poprowadzono do wartosci 8,5 wodorotlenkiem amonowym, a objetosc ukladu doprowadzono do 600 ml przez dodanie wody. Unieruchomione komórki z przykladu XXI, posiadajace 7000 aktywnosci amonolia- zy asparginianowej, dodano do mieszaniny i calosc mieszano w temperaturze 37°C przez okres 4 godzin. Po przesaczeniu mieszaniny reakcyjnej pH przesaczu doprowadzono do wartosci 2,8 kwasem siarkowym, co spowo¬ dowalo wytracanie sie kwasu asparginowego. PL