NO144220B - Fremgangsmaate for immobilisering av mikrobielle celler - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for immobilisering av mikrobielle celler ved binding til en bærer.

Enzymer, som er meget spesifikke, er meget bedre enn kon-vensjonelle katalysatorer ved mange kjemiske omsetninger.

Inntil nylig har imidlertid slike faktorer som høye isolerings-kostnader, tendensen til instabilitet når de fjernes fra miljøet inne i den intakte celle og tilgjengeligheten bare i løselig form, sterkt begrenset anvendelsen av enzymer.

Immobiliseringen av enzymer ved binding til, eller inne-sperring i, fast bærermateriale har medført at man har over-vunnet noen av disse vanskeligheter og har gjort enzymanvendelsen mer økonomisk. De forskjellige fysikalske og kjemiske metoder som anvendes for immobiliseringen er omtalt i slike oversikter som Immobilized Enzymes av O.R.Zaborsky (CRC Press, 1973).

Immobiliseringen av hele cellen for å unngå enzymisolering og stabilitetsproblemer har også blitt anvendt. Anvendelsen er imidlertid blitt begrenset til fysikalske metoder for immobilisering. Typiske eksempler er adsorpsjon av celler av Streptomyces phaeochromogenes som inneholder aktiv glykoseisomerase på re-kondisjonert hudkollagen (Biotech. & Bioengr., XV, side 565

(1973)), og gel-inneslutning av soppceller som inneholder hydroksylaseenzym for overføringen av Forbindelse S til cortisol (Scientific American, mars 1971, side 30). Disse immobili-seringsmetoder forebygger imidlertid ikke disassosieringen av cellene fra bærermediet. Arten av bindingskrefter er slik at reaksjonsbetingelsene kan være meget begrenset for å hindre eller gjøre en slik disassosiasjon minst mulig med samtidig tap av enzymatisk virkning og mulig forurensning av prosess-strømmen. Foreliggende oppfinnelse vedrører således en fremgangsmåte for

å oppnå et mer stabilt materiale av immobiliserte celler.

Det har nå vist seg at mikrobielle celler effektivt kan immobiliseres ved hjelp av kjemisk kovalent binding av cellene til vannuløselig, partikkelformet polymermatriks. Den kjemiske bindingen kan oppnås enten med på forhånd fremstilt polymer eller med reaktiv monomer før polymerisasjonen. Ytterligere behandling av cellene med et polyfunksjonelt, tverrbindende middel enten før, under eller efter bindingen reduserer enzymtapet fra cellen.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det skaffet tilveie en fremgangsmåte for immobilisering av mikrobielle celler. Fremgangsmåten karakteriseres ved at man efter omsetning med glutaraldehyd bringer disse celler i kontakt i et vannholdig medium med en monomer eller dens polymer for å danne kovalente bindinger mellom nevnte celler og monomeren eller polymeren, hvilken monomer har følgende formel hvor er hydrogen eller metyl, W er

R2 er halogen eller 2,3-epoksypropoksy, Y er alkylen med 2 eller 3 karbonatomer, n er 1 eller 2, og Z er hydrogen eller halogen-acetyl, idet når Z er hydrogen, aktiveres monomeren eller polymeren før reaksjon med cellene med et karboksylsyre-aktiverende reagens, og når cellene bringes i kontakt med monomeren, polymeriseres denne derefter i nærvær av en tverr-bindingsmonomer og en polymerisasjonsinitiator.

Ifølge foreliggende oppfinnelse bindes intakte mikrobielle celler kjemisk til vann-uløselig, partikkelformet polymer ved hjelp av reaktive grupper på polymeren. Mens kjemisk kovalent binding av isolerte enzymer til polymer er vanlig praksis idag, er det overraskende at hele celler, som er kilden til eller som av størrelsesorden er større enn enzymene, effektivt, også kan immobiliseres ved kjemisk kovalent binding. Slik binding vil ofte finne sted ved omsetning av celleaminogrupper med reaktive polymersubstituenter. I tillegg, er andre grupper slik som hydroksyl og sulfhydryl også tilgjengelig i cellene, og kan spille en rolle i bindingsmekanismen. Dette er tilfelle siden amino-reagerende polymersubstituenter, f.eks. epoksyd-, halogen-karbonyl- og halogenmetylkarbonylgrupper også er reaktive over-for hydroksyl- og sulfhydrylgrupper som er til stede i cellene.

Bindingen kan finne sted enten før eller efter polymer-dannelsen. I det første tilfelle bringes cellene i berøring med den polymeriserbare etylenisk umettede monomer som inneholder en reaktiv gruppe, og den cellebærende monomer polymeriseres eller kopolymeriseres derefter i nærvær av en tverrbindende monomer og et initiatorsystem. I det siste tilfelle bringes cellene direkte i berøring med en partikkelformet polymer som inneholder en reaktiv gruppe.

I tilfelle av monomerer og polymerer som inneholder ikke-reaktive funksjonelle grupper, slik som når Z er hydrogen i monomerformelen I ovenfor, kan de funksjonelle gruppene overføres til reaktive substituenter efter kjente metoder.

Dette krever ofte anvendelse av en multifunksjonell reagens

med lav molekylvekt. Når Z er hydrogen i formel I, kan monomeren eller polymerhydroksylgruppene likeledes aktiveres efter standard metoder med halogen-Z, særlig bromacetylbromid.

Fremgangsmåten for immobilisering er anvendbar på mikrobielle celler, slik som bacteria, gjær, strålesopper og sopper. Foretrukne celler er de hvor det i det primære enzymsystem inngår oksidoreduktaser, særlig slik som glukoseoksidase som ikke krever løselige kofaktorer, hydrolaser slik som a,p-amylaser og peptidaser, og særlig penicillinacylase, lyaser, fortrinnsvis de som vedrører spaltningen av karbon-oksygen-bindinger og spesielt slike som fenyl-alaninammoniakk-lyase og aspartatammoniakk-lyase som vedrører spaltningen av karbon-nitrogen-bindinger; og isomeraser slik som racemaser, epimeraser, cis-trans-isomeraser, og særlig glukoseisomerase. Foretrukne bakterie-genera omfatter:Pseudomonas, Xanthomonas, Acetobacter, Alcaligenes, Flavobacterium, Escherichia, Aerobacter, Erwinia, Serratia, Proteus, Micrococcus, Sarcina, Lactobacillus, Bacillus, Nocardia, Streptomyces og Corynebacterium. Foretrukne sopp- og gjærgenera omfatter: Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces, Mucor, Fusarium, Penicillium, Aspergillus, Glomerella, Rhizopus, Saccharomyces, Conidiobolus, Byssochlamys, Candida, Chaetomium, Trichoderma, Septoria, Coprinus, Neurospora, Humucola, og Trichosporon. Foretrukne strålesopper er Micropolyspora. Særlig foretrukne arter er: Escherichia coli, Bacterium cadaveris, Proteus rettgeri, Rhodotorula gracilis, Penicillium chrysogenum og Aspergillus niger.

Den kovalente bindingen av cellene til reaktiv polymer, eller bindingen til reaktiv monomer etterfulgt av mono-merpolymerisasjon eller kopolymerisasjon, utføres i vandig medium. Mens temperaturen for binding til polymer eller monomer, eller for polymerisasjon etter binding til monomer, kan variere over et stort område, ligger det foretrukne område fra 5 - 50°0, særlig fra 10 - ^ >0°0. Nødvendig tid for binding vil avhenge av systemet og bindingstemperaturen, men vil normalt være fra 0,5 - 35 timer; den foretrukne bindingstid til polymer er 15 - 30 timer, mens bindingen til monomer er 1 - 5 timer. Polymeri-sas jonene er vanligvis avsluttet etter 1-6 timer. Vektfor-holdet mellom polymer og cellene (tørrstoffbasis) kan variere betraktelig, foretrukket forhold ligger på 0,1 - 25, spesielt fra 0,5 - 4.

Når cellene er bundet til reaktiv monomer, utføres den følgende vandige addisjonspolymerisasjon med eller uten en eller flere komonomerer i nærvær av difunksjonell tverrbindende monomer og et initiatorsystem. Det kan anvendes komonomerer, tverrbindende monomerer og initiatorsystemer som vanligvis anvendes for denne type av polymerisasjon og som ikke ødelegger den enzymatiske virkning av cellen.

Egnede komonomerer er for eksempel akrylsyre, a-klorakrylsyre, metakrylsyre og glycidyl, laverealkylestere, N,N-(disubstituerte aminoalkylestere, amider, laverealkylsub-stituerte amider, metylolsubstituerte amider, N-monosubstituerte aminoalkylamider og N,N-disubstituerte aminoalkylamider derav, styren, butadien og isopren. Foretrukne komonomerer er styren, akrylsyre, £ 2-hydroksy-3- (1-/" 4-metylpiperazinyl_7)-propy.l_7 metakrylat og særlig metylmetakrylat.

En rekke tverrbindende monomerer som gir et 3-dim-ensjonelt nettverk og som gir vann-uløselighet til den resulterende polymer kan anvendes, for eksempel akrylmonomerer eller olefinforbindelser eller andre som er kjente på området. Repre-sentative eksempler på slike monomerer er 1,3-butylendiakrylat, etylenglykoldimetakrylat, 1,3-butylendimetakrylat, 1,6-heksa-metylendiakrylat, etylendiakrylat, dietylenglykoldimetakrylat, N,N'-metylen-bisakrylamid, neopentylglykoldimetakrylat, 1,1,1-tri-raetyloletantrimetakrylat og divinylbenzen. En foretrukket tverrbindende monomer er N,N'-metylenbisakrylamid.

Polymerisasjons- og kopolymerisasjonsreaksjonene initieres av frie radikaler. Egnede fri-radikal-initiatorsystemer er de som gir frie radikaler i en passende hastighet for polymerisasjon eller kopolymerisasjdn under milde! betingelser som er nødvendig på grunn av celle-enzym-gruppens varmefølsomhet. Det er foretrukket å anvende r.edoksinitiatorsystemer av denne grunn. Eksempler på slike systemer er peroksyforbindeiser, slik som ammonium, natrium eller kaliumpersulfat, benzoylperoksyd og. di(sek-butyl)-peroksydikarbonat i kombinasjon med et reduksjons-middel slik som natriumtiosulfat, natriummetabisulfit, ferro-ammoniumsulfatheksahydrat, dimetylaminopropionitril eller ribo-flavin. Foretrukne initiatorsystemer er dimetylaminopropionitril-ammoniumpersulfat.

Sammensetning av polymeren kan variere sterkt, og den foretrukne sammensetning, angitt i mol-% av total monomer er 15 - SO prosent celle-reaktiv monomer, 0 - 60 prosent komono-mer og 10 - 4-0 prosent tverrbindende monomer. Dette er foretrukne mengder enten cellene er bundet til monomer eller til på forhånd dannet polymer.

I visse tilfeller behandles cellene med et polyfunksjonelt, tverrbindende reagens for å redusere enzymtapet fra cellene. Selvom den nøyaktige mekanisme ikke er fullt ut forstått, er det antatt at én klasse av polyfunksjonelle reagenser reagerer med, og derved tverrbinder, aminogrupper i celle-membranen, og således effektivt reduserer porøsiteten av membranen; den annen klasse oppnår det samme resultat ved å aktiv-ere karboksylgruppene som er tilstede i membranen, som deretter reagerer med membranaminogruppene ved dannelse av amidbinding. Typiske eksempler på den første klassen omfatter slike reagenser som pyrodruesyrealdehyd, glyoksal, hydroksy-adipaldehyd, cyanur-klorid, tetraazatisert o-dianisidin, bis-diazatisert benzidin, 1,3-difluor-4,6-dinitrobensen, toluen-2,4-diisocyanat og særlig glutaraldehyd, mens den annen klasse omfatter slike reagenser som etylklorformat og vann-løselige karbodiimider, for eksempel l-etyl-3-(3'dimetylaminopropyl)karbodiimid-hydrogenklorid.

Cellene kan behandles enten før, under eller etter bindingen til reaktiv monomer eller polymer. Som for celle-bindingen utføres behandlingen i vandig medium. Mens cellene kan behandles over et stort temperaturområde, er det foretrukne område fra 5 - 50°C, særlig fra 10 - 30°C. Avhengig av temperaturen og det anvendte middel, krever behandlingen vanligvis fra 0,5 - 10 timer, fortrinnsvis fra 2-4 timer. Nødvendig mengde reagens kan variere meget, og er vanligvis fra 1 til 50 vekt-% av cellene (på tørrstoffbasis), fortrinnsvis fra 5 - 25 vekt-$.

Celle-immobiliseringen til vann-uløselig polymer ved kjemisk kovalent binding, med eventuelt behandling for å gjøre enzymtapet fra cellene minst mulig, gir et stabilt, immo-bilisert enzymsystem hvor man ikke behøver å isolere et ønsket enzym. Og på grunn av stabiliteten og lett filtrerbar, partikkelformet form, kan produktet anvendes i vandige katalytiske kjemiske metoder som enten krever kontinuerlig drift eller sats-vis drift med resirkulering.

Oppfinnelsen illustreres ved hjelp av de følgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Til 80 g glycidylmetakrylat pluss 1,0 liter vann ble tilsatt under omrøring 30 g N,N'-metylenbisakrylamid. Etter omrøring av blandingen i 15 minutter ved værelsestemperatur ble tilsatt 10 g metylmetakrylat, blandingen ble avkjølt til ca. 5°C og det ble boblet nitrogengass inn i den kalde blandingen i 15 minutter. Deretter ble tilsatt 20 ml dimetylaminopropionitril og 2 g ammoniumpersulfat. Blandingen under nitrogen ble omrørt ved 10°C inntil polymerisasjonen begynte, deretter ytterligere en time ved omgivelsestemperatur og til slutt henstand i 2 timer. Ca. 750 ml vann ble tilsatt til det resulterende faste materiale og blandingen ble omrørt kraftig for å bryte opp polymeren. Det faste materiale ble filtrert, vasket med vann, lufttørket, og man fikk 120 g hvit, partikkelformet polymer.

En fermenteringsbuljong av A. niger (NRRL-3; Pfizer Culture FD 2454) fremstilt under neddykkede aerobe betingelser ved 33°C og pH 5>8-7»0 på glukosesubstrat, ble filtrert, og cellene ble vasket med vann og presset ut til en halvtørr pasta. Cellene (250 g, 55 g tørre) ble overført til en løsning som inneholder 22 g av en 25 vekt-% vandig glutaraldehyd i 1000 ml vann. Suspensjonen ble justert til pH 6,2 og omrørt i 1 3/4 time ved værelsestemperatur. Det faste materiale ble filtrert fra og vasket med vann, og man får 104 g av fuktige, behandlede celler som har 76% av opprinnelig glukoseoksidasevirkning.

En suspensjon av 32 g av fuktig behandlede celler

og l6 g glycidylmetakrylatpolymer i 24O ml vann ble omrørt i 30 timer ved værelsestemperatur og ble deretter filtrert. Det faste materiale ble vasket med vann, og man får 126 g av fuktige, immobiliserte celler som har ^ 8% av glukoseoksidasevirkningen av de opprinnelige ubehandlede cellene.

EKSEMPEL 2

Til en suspensjon av 600 mg av fuktig behandlede celler av A. niger fremstilt som angitt i Eksempel 1 (23 en-

heter glukoseoksidase-virkning/100 mg) i 20 ml acetonitril ble samtidig tilsatt 600 mg metakryloylklorid og 400 mg trietylamin. Blandingen ble omrørt ved værelsestemperatur i 2 timer og ble deretter tilsatt til 20 ml vann (resulterende pH 6,03). Til den vandige blandingen under nitrogen ble tilsatt 1,3 g N,N'-metylenbisakrylamid, 750 mg metylmetakrylat og 300 mg akrylsyre. Blandingen ble justert til pH 6,7 og behandlet med 0,5 ml dimetylaminopropionitril og 250 mg ammoniumpersulfat. Etter 2 timers reaksjonstid ble blandingen behandlet med ytterligere 150 mg ammon-iumpersulf at og fikk stå under omrøring ytterligere en time.

Et tilsvarende volum vann ble tilsatt til reaksjonsblandingen

og blandingen ble sentrifugert. Resten ble filtrert og vasket

med vann, og man får 32,25 g fuktige, immobiliserte celler som inneholder " J& fo av glukoseoksidasevirkningen av de opprinnelige ubehandlede cellene.

EKSEMPEL 3

De fuktige immobiliserte cellene i Eksempel 1

(47>3 g) ble tilsatt til 100 ml av en vandig løsning som inneholder 10 g glukose og blandingen ble omrørt under tilførsel av luft i 21 timer ved værelsestemperatur. Man fikk en 99$ over-føring til en blanding av glukonsyre og delta-glukonolacton, og man oppnådde 75% av glukoseoksidasevirkningen hos de opprinnelige immobiliserte celler ifølge Eksempel 1.

Denne oksydasjonen kan gjentas ved å anvende 30 g

av fuktige, immobiliserte celler fra Eksempel 2 i 20 ml av en vandig løsning som inneholder 2 g glukose, og man får en tilsvarende overføring og gjenvunnet enzymaktivitet.

EKSEMPEL 4

En fermenteringsbuljong av Proteus rettgeri (ATCC 9250; Pfizer Culture FD I847O-76-6O) , fremstilt under neddykkede aerobe betingelser ved 28°C og pH 6,8-7,0 på et substrat av melkesyrekasein, ble sentrifugert og cellene ble slått opp i vann og presset ut til en halvtørr pasta. Til en suspensjon av de fuktige cellene (7,5 g tørrstoffvekt) i 100 ml vann ble tilsatt 4 g av en 25 vekt-$ vandig glutaraldehyd. Blandingen ble omrørt ved pH 7,0 i 3 timer og ble deretter sentrifugert. De behandlede cellene ble suspendert igjen i 100 ml vann og ble tilsatt 7,5 g glycidylmetakrylatpolymer fra Eksempel 1 under omrøring. Blandingen ble omrørt ved pH 7,0 og værelsestemperatur i 30 timer. Det faste materiale ble filtrert fra, vasket med vann og lagret som en fuktig1 kake inntil, det skulle anvendes. De immobiliserte cellene inneholder 65$ av virkningen av de opprinnelig behandlede cellene målt ved hjelp av overføringshastig-heten av penicillin G til 6-aminopenicillansyre.

EKSEMPEL 5

Til en suspensjon av 20 g (5,0 g tørrstoffvekt)

av immobiliserte celler av Proteus rettgeri fra Eksempel 4 i 500 ml vann ved pH 8,0 og 37°Q ble tilsatt 5 g kalium-penicillin G. pH av suspensjonen ble holdt ved 8,0 ved å regulere tilsetningen av IN NaOH, og hydrolysen var avsluttet etter 3 timer. De immobiliserte cellene ble filtrert fra, vasket med vann og lagret som en fuktig kake for senere bruk. Filtratet ble justert til pH 2 med 2N HC1 og ekstrahert med etylacetat. Det resulterende vandige sjiktet ble justert til pH 4,3 med

2N NaOH, konsentrert og avkjølt, og man får et hvitt krystallinsk fast stoff. Krystallene ble filtrert, vasket med vann og luft-tørket, og man får 2,17 g (75$ utbytte) av ren 6-aminopenicillansyre. De immobiliserte cellene har bibeholdt ca. 50$ av penicillinacylasevirkningen av de opprinnelige immobiliserte cellene fra Eksempel 4 etter 20 hydrolysecykler.

EKSEMPEL 6

Til en omrørt blanding under nitrogen av 3,6 g bromacetylhydroksyetylmetakrylat i 15 ml vann ble tilsatt 375 mg N,N'-metylenbisakrylamid. Blandingen ble avkjølt til 5°c og behandlet med 0,25 ml dimetylaminopropionitril og 38 mg ammoniumpersulfat. Blandingen ble omrørt langsomt ved værelsestemperatur inntil polymerisasjonen begynte. Omrøringen ble deretter stoppet og reaksjonsblandingen fikk lov til å stå ved værelsestemperatur i 2 timer. Den resulterende suspensjon ble fortynnet med 25 ml vann og filtrert. Kaken ble vasket med vann og luft-tørret, og man får 3,7 g partikkelformet polymer.

Fuktige, utpressede celler av Proteus rettgeri som var fremstilt og isolert som angitt i Eksempel 4 (10 g, 2 g tørre) ble tilsatt til en løsning som inneholder 0,8 g av 25 vekt-$ vandig glutaraldehyd i 50 ml vann. Suspensjonen ble deretter justert til pH 7>0, omrørt i 3 timer ved værelsestemperatur og sentrifugert. De behandlede cellene ble slått opp i 50 ml vann og presset ut til en halvtørr pasta.

En suspensjon av 10 g av behandlede celler og 20 g bromacetylhydroksyetylmetakrylatpolymer i 120 ml vann ble omrørt i 30 timer ved værelsestemperatur og pH 7,0. Blandingen ble filtrert og kaken ble vasket med vann, og man får 36,8 g av fukoige, immobiliserte celler som har 75$ av penicillinacylasevirkningen av de opprinnelige ubehandlede cellene.

EKSEMPEL 7

Til en suspensjon av 46 g av fuktige,. immobiliserte celler fra Eksempel 6 i 500 ml vann ved pH 8,0 og 37°C ble tilsatt 5 g kalium-penicillin G. pH av suspensjonen.ble holdt ved 8,0 ved regulert tilsetring av IN NaOH, og hydrolysen var avsluttet etter 3 timer. De immobiliserte cellene ble filtrert, vasket med vann og lagret som en fuktig kake for senere anvendelse. Filtratet ble justert til pH 2 med 2N HC1 og ekstrahert med etylacetat. Det resulterende vandige sjikt ble justert til pH 4,3 med 2N NaOH, konsentrert og avkjølt, og man får krystallinsk 6-aminopenicillansyre.

EKSEMPEL 8

En suspensjon av 25 g av fuktige, behandlede celler av A. niger fra Eksempel 1 og 2 g glycidylmetakrylat i 60 ml vann ble omrørt i 17 timer ved 7°C Suspensjonen ble deretter tilsatt til en blanding av 2,2 g N,N'-metylenbisakrylamid, 2 ml styren, 450 mg metylmetakrylat, 0,5 ml dimetylaminopropionitril og 1,5 g ^~ 2-hydroksy-3- (l-/~4-nietylpiperazinyl_7)pr'opyl_7metakrylat i 40 ml vann ved pH 6,8. Blandingen ble behandlet under nitrogen med 200 mg ammoniumpersulfat og omrørt i 3 timer ved værelsestemperatur. Det faste materiale ble filtrert fra og vasKei; mea vann, og man iar 4.5,0 g av iuKxige, lmmoDiiiserte celler som har 75$ av glukoseoksidasevirkningen av de opprinnelige ubehandlede cellene.

EKSEMPEL 9

De fuktige, immobiliserte cellene (28,3 g) fra Eksempel 8 ble tilsatt til 200 ml av en vandig løsning som inneholder 20 g glukose, og blandingen ble omrørt under tilførsel av luft i 21 timer ved værelsestemperatur. Man får 80$ utbytte av en blanding av glukonsyre og delta-glukonolacton. Suspensjonen ble filtrert og det faste materiale ble vasket med vann, og man får 28 g fuktige, immobiliserte celler som har 82$ av den opprinnelige enzymvirkning.

EKSEMPEL 10

En suspensjon av 5 g fuktige, pressede celler av Proteus rettgeri, fremstilt og isolert som angitt i Eksempel 4, og 10 g glycidylmetakrylatpolymer fra Eksempel 1 i 65 ml vann ble omrørt i 24 timer ved værelsestemperatur. Blandingen ble filtrert og filterkaken ble vasket med vann, og man får 26,9 g fuktige, immobiliserte celler som har 62% av opprinnelig peni-cillina cy la sevirkning.

De immobiliserte cellene (25 g, 1 g tørr cellevekt) ble tilsatt til en løsning som inneholder 0,4 g av 25 vekt-% vandig glutaraldehyd i 50 ml vann. Suspensjonen ble justert til pH 7,0 og omrørt i 3 timer ved værelsestemperatur. Suspensjonen ble filtrert og filterkaken ble vasket med vann, og man får 23,2 g av fuktig behandlede, immobiliserte celler som har 79$ av penicillinacylasevirkningen av ubehandlede, immobiliserte celler.

EKSEMPEL 11

Til en suspensjon av 12 g fuktig behandlede, immobiliserte celler fra Eksempel 10 i 100 ml vann ved pH 8,0 og 37°C ble tilsatt 1 g kalium-penicillin G. pH av reaksjonsblandingen ble holdt ved 8,0 ved regulert tilsetning av IN NaOH og reaksjonen var avsluttet etter 3 timer. Det immobiliserte celle-materiale ble filtrert, vasket med vann og lagret som en fuktig kake for senere bruk. Filtratet ble justert til pH 2 med 2N HC1 og ekstrahert med etylacetat. Det resulterende vandige sjikt ble justert til pH 4,3 med 2N NaOH, konsentrert og avkjølt, og

man får krystallinsk 6- aminopenicillansyre.

EKSEMPEL 12

En suspensjon av celler av A. niger, fremstilt og isolert som i Eksempel 1 (20 g, 4 g tørt) og 8 g glycidylmetakrylat i 100 ml vann ble justert til pH 7,5 og ristet ved værelsestemperatur i 18 timer. Det ble tilsatt N,N'-metylenbisakryl-amid (1,5 g) og den resulterende suspensjon ble omrørt under nitrogen i 15 minutter og deretter avkjølt til 5°C, behandlet med 150 mg ammoniumpersulfat pluss 1 ml dimetylaminopropionitril og omrørt ved omgivelsestemperatur i 3 timer. Det faste materiale ble filtrert og vasket med vann, og man får 71 g fuktige, immobiliserte celler som har 62$ av opprinnelig glukoseoksidasevirkning.

De immobiliserte cellene (18 g, 1 g tørr cellevekt) ble tilsatt til en løsning som inneholder 0,4 g av 25 vekt-$ vandig glutaraldehyd i 100 ml vann. Suspensjonen ble justert til pH 7,0 og omrørt i 3 timer ved værelsestemperatur. Det faste materiale ble filtrert og vasket med vann, og man får 17,3 g fuktig behandlede, immobiliserte celler som har 75$ av glukoseoksidasevirkningen som var tilstede i de immobiliserte cellene før behandlingen med glutaraldehyd.

EKSEMPEL 13

De fuktig behandlede, immobiliserte cellene (14 g) fra Eksempel 12 ble tilsatt til 15 ml av en vandig løsning som inneholder 1,5 g glukose, og blandingen ble omrørt under til-førsel av luft i 21 timer ved værelsestemperatur, med overføring til glukonsyre og gjenvinning av enzymvirkning tilsvarende som for Eksempel 3-

EKSEMPEL 14

Celler av Rhodotorula gracilis (NRRL YIO9I; Pfizer Culture FD 6521) ble isolert fra en fermenteringsbuljong, fremstilt under neddykkede, aerobe betingelser ved 28°C og pH 6,8-7,0 på glukosesubstrat, ved sentrifugering. Femti g vaskede celler i 25O ml vann ble behandlet med 5 g glycidylmetakrylatpolymer fra Eksempel 1. Blandingen ble omrørt ved værelsestemperatur i 20 timer. Suspensjonen ble filtrert og filterkaken ble vasket med vann, og man får 63 g fuktige, immobiliserte celler som inneholder 49$ av opprinnelig fenylalanin-ammoniakk-lyasevirkning.

En suspensjon av 14,74- g fuktige, immobiliserte celler fra Eksempel 14 i 30 ml vann som inneholder 2,25 g trans-kanelsyre, 652 mg ammoniumklorid og 3,3 ml konsentrert ammoniumhydroksyd ble justert til pH 9>5« Blandingen ble ristet ved 37°C i l8 timer, og man får 90$ utbytte av L-fenylalanin, basert på gjenvunnet kanelsyre. Det faste materiale ble filtrert og vasket med vann, og man får 14 g fuktige, immobiliserte celler som inneholder 77$ av opprinnelig :fenylalaminammoniakk-lyasevirkning. L-fenylalanin ble isolert fra filtratet ved hjelp av standard metoder.

EKSEMPEL 16

En suspensjon av 40 g vaskede celler av Rhodotorula gracilis, fremstilt og isolert som angitt i Eksempel 14, pluss 8 g glycidylmetakrylat i 80 ml vann ble justert til pH 7,2 og omrørt ved værelsestemperatur i 1,5 timer. Det ble tilsatt N,N'-metylenbisakrylamid (1,5 g) og den resulterende suspensjon ble omrørt under nitrogen i 10 minutter, deretter av-kjølt til 5°0, behandlet med 150 mg ammoniumpersulfat pluss 1 ml dimetylaminopropionitril og omrørt ved værelsestemperatur i 3 timer. Den resulterende suspensjon ble fortynnet med vann og filtrert. Polymerkaken ble vasket med vann, og man får 62,3 g fuktige, immobiliserte celler som<:>har 44$ av opprinnelig fenylalanin-ammoniakk-lya se-virkning.

EKSEMPEL 17

En suspensjon av 15 g fuktige, immobiliserte celler fra Eksempel 16 i 30 ml vann som inneholder 1,12 g trans-kanelsyre, 320 mg ammoniumklorid og 1,6 ml konsentrert ammoniumhydroksyd justeres til pH 9>5- Blandingen ristes ved 37°C i 18 timer under dannelse av L-fenylalanin tilsvarende Eksempel 15-EKSEMPEL l8

En suspensjon av 15 g av fuktige, pressede celler av Proteus rettgeri, fremstilt og isolert som i Eksempel 4>°g 30 g glycidylmetakrylatpolymer fra Eksempel 1 i 100 ml vann ble omrørt ved værelsestemperatur og pH 7 i 18 timer. Suspensjonen ble deretter sentrifugert og det faste materiale ble vasket med vann, og man får 100 g fuktige, immobiliserte celler som inneholder 100% av den opprinnelige penicillinacylasevirk-ning.

Til en suspensjon av 25 g av fuktige, immobiliserte celler i 70 ml vann ved pH 8,0 og 37°C ble tilsatt 1 g kalium-penicillin G. Suspensjonens pH ble holdt ved pH 8,0 ved regulert tilsetning av IN NaOH. Hydrolysen var avsluttet efter 3 timer. Suspensjonen ble deretter filtrert og de immobiliserte cellene ble vasket med vann og lagret som en fuktig kake for senere anvendelse. Virkningene av disse cellene for fremstil-lingen av 6-aminopenicillansyre var ikke så stor som for de immobiliserte cellene fra Eksempel 4, siden cellene bare hadde bibeholdt 15$ av penicillinacylasevirkningen av de opprinnelige cellene etter bare 2 hydrolysecykler.

EKSEMPEL 19

Til 25 g 2-hydroksyetylmetakrylat i 100 ml vann

ble tilsatt 12,5 g cyanogenbromid oppløst i 100 ml vann. Blandingen ble umiddelbart justert til pH 11 med 5N NaOH, og dette gjør at reaksjonstemperaturen stiger til 46°C og holdes deretter ved denne pH inntilsetningen var avsluttet. Blandingen ble deretter avkjølt til værelsestemperatur, justert til pH 6,5 og behandlet med en suspensjon av 50 g frysetørrede celler av Proteus rettgeri, fremstilt og isolert som angitt i Eksempel 4 før tørking, i 500 ml vann. Den resulterende suspensjon ble omrørt i 45 minutter. Deretter ble tilsatt 25 g akrylamid og 2,5 g NjN^metylenbisakrylamid, og suspensjonen ble omrørt i 15 minutter, avkjølt til /\ °C og behandlet med 4 ml dimetylaminopropionitril pluss 425 mg ammoniumpersulfat. Polymerisa-sjonsblandingen fikk lov til å oppvarmes til værelsestemperatur og fikk stå i 1 time. Blandingen ble deretter blandet ved anvendelse av en "Waring blender* og ble deretter sentrifugert. Det gel-lignende faste materiale etter sentrifugeringen ble suspendert igjen i vann, sentrifugert igjen, vasket med vann og frysetørret, og man får 112 g tørre, immobiliserte celler som inneholder 19$ av den opprinnelige penicillinacylasevirk-ning. ;EKSEMPEL 20 ;Til en suspensjon av 20 g fuktige, pressede celler av Proteus rettgeri, fremstilt og isolert som angitt i Eksempel 4, i 80 ml vann ble tilsatt 1 g av 25 vekt-% vandig glutaraldehyd og 10 g glycidylmetakrylat. Suspensjonen ble justert til pH 6,8 og omrørt ved værelsestemperatur i 2 timer. Blandingen ble behandlet under nitrogen med 1,9 g N,N'-metylenbisakryl-amid og 2 ml dimetylaminopropionitril, justert til pH 7 og behandlet med 200 mg ammoniumpersulfat. Den resulterende suspensjon ble omrørt i l/2 time og fikk deretter stå ved henstand ved værelsestemperatur i 1-1/2 time. Det faste materiale ble filtrert og vasket med vann, og man får 8l,3 g fuktige, immobiliserte celler som inneholder 54% av opprinnelig penicillinacylasevirkningen av de ubehandlede cellene. ;De fuktige, immobiliserte cellene er anvendbare ;for overføringen av kalium-penicillin G til 6-aminopenicillansyre slik som angitt i Eksempel 7 med sammenlignbare resultater. ;EKSEMPEL 21 ;En fermenteringsbuljong av Bacterium cadaveris ;(ATCC 9760; Pfizer Culture FD-24016) fremstilt under neddykkede, aerobe betingelser ved 28°C og pH 6-8 på proteinhydrolysatsub-strat, ble sentrifugert og cellene ble slått opp igjen i vann og presset ut til en halvtørr pasta. Til en suspensjon av de fuktige cellene (7,5 g tørrstoffbasis) i 100 ml vann ble tilsatt 4 g av en 25 vekt-% vandig glutaraldehyd. Blandingen ble omrørt i ca. 2 timer ved pH 7 og ble deretter sentrifugert. De behandlede cellene ble suspendert igjen i 100 ml vann og 7>5 g glycidyLmetakrylatpolymer fra Eksempel 1 ble tilsatt under om-røring. Blandingen ble omrørt ved ca. pH 7,0 og værelsestemperatur i 30 timer. Det faste materiale ble filtrert fra, vasket med vann og lagret som en fuktig kake for senere bruk. ;EKSEMPEL 22 ;Fumarsyre (120 g) ble tilsatt til 140 ml konsentrert ammoniumhydroksyd. Blandingen ble justert til pH 8,5 ;med ammoniumhydroksyd og reaksjonsvolumet ble justert til 600 ;ml med vann. Det ble tilsatt immobiliserte céler fra Eksempel 21 som inneholder 7000 p. av aspartatammoniakk-lyasevirkning og blandingen ble omrørt ved 37°C i 4 timer. Suspensjonen ble filtrert og filtratet ble justert til pH 2,8 med svovelsyre for å felle ut aspartinsyre. *

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for immobilisering av mikrobielle celler med binding til en bærer, karakterisert ved at man efter omsetning med glutaraldehyd bringer disse celler i kontakt i et vannholdig medium med en monomer eller dens polymer for å danne kovalente bindinger mellom nevnte celler og monomeren eller polymeren, hvilken monomer har følgende formel

   hvor

   er hydrogen eller metyl, W er R2 er halogen eller 2,3-epoksypropoksy, Y er alkylen med 2 eller 3 karbonatomer, n er 1 eller 2, og Z er hydrogen i eller halogen-acetyl, idet når Z er hydrogen, aktiveres monomeren eller polymeren før reaksjon med cellene med et karboksylsyre-aktiverende reagens, og når cellene bringes i kontakt med monomeren, polymeriseres denne derefter i nærvær av en tverr-bindingsmonomer og en polymerisasjonsinitiator.