CN105647899A - 固定化蛋白酶的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开固定化蛋白酶的制备方法及应用。所述制备方法将鸡骨粉碎后，与0.1倍重量有机酸混合后，加热至90-100℃保持10-15min，冷却至25-35℃后，添加蛋白酶3-6h，过滤，得到固定化蛋白酶。本发明利用有机酸对鸡骨进行处理得到的鸡骨渣对蛋白酶具有较好的吸附和保留能力，对蛋白酶的催化活性无影响。本发明在制备固定化蛋白酶过程中未引入任何非食品添加剂，不存在安全隐患。本发明制备的固定化酶尤其适合于鸡肉、鸡骨架等生物资源的酶解。

Description

固定化蛋白酶的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及固定化酶的制备方法及应用，具体涉及生产一种固定化蛋白酶的制备方法及应用。

背景技术

酶的固定化及其酶促反应是最具发展前景的生物技术前沿领域之一。固定化酶已经广泛应用于生物化学、生物技术与工程、生物医学工程、化学化工等方面，将在人类社会可持续发展中发挥重要作用。与游离酶相比，固定化酶具有稳定性更好，分离回收容易，可多次重复利用等优点。根据固定化酶的制备方法，可通过包埋法、交联法、吸附法和共价结合法来实现酶的固定化。

近年来，我国在固定化酶方面做了大量研究。2010年武汉工业学院提供了一种壳聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法（201010103862.9）。该技术以壳聚糖为固定化载体,将壳聚糖在醋酸溶液中溶解后，利用反相悬浮法制备壳聚糖微球，然后利用戊二醛为交联剂对壳聚糖微球进行交联活化，将交联活化后的壳聚糖微球与胰蛋白酶溶液混合进行固定化，制得固定化胰蛋白酶。2011年杭州师范大学提供了一种嗜热菌蛋白酶的固定化方法（201110363336.0），具体方法如下：(1)载体活化：将氨基化的介孔泡沫硅载体MCFs-NH2浸渍在0.5～2.5mM的对苯醌溶液中，振荡活化1～3小时，离心，取沉淀洗涤，洗涤后的沉淀重新分散于MES-NaOH溶液中，得到活化的载体液；(2)酶的固定化：将活化的载体液，按40～100mg嗜热菌蛋白酶/gMCFs-NH2的加酶量，加入嗜热菌蛋白酶得到混合液，将混合液在冰浴中电磁搅拌反应18～20h或者在0～7℃、20～50W微波条件下照射2～4min，离心，取沉淀用MES-NaOH溶液洗涤，得到固定化嗜热菌蛋白酶；通过该发明方法制得的固定化嗜热菌蛋白酶在性能上比自由酶有了很大的提高，还大大地缩短了固定化时间，从20h缩短到了3min，整整缩短了399倍，这使得酶固定化的成本得到了降低。2012年信阳职业技术学院公开了一种基于膨化珍珠岩载体的固定化蛋白酶（201210267418.X），该固定化蛋白酶由以下制备方法制得：将蛋白酶溶解在液体介质中，得到蛋白酶溶液；再将膨化珍珠岩或者表面经改性后的膨化珍珠岩与所述蛋白酶溶液均匀混合，并在20℃--40℃条件下处理3-6个小时，以使所述蛋白酶溶液中的蛋白分子与膨化珍珠岩内部微孔内表面充分接触；最后，以离心或过滤的方法除去液体介质，进行干燥，即得到固定化蛋白酶。这一发明以膨化珍珠岩或者经过表面改性后的膨化珍珠岩为载体材料，其具有稳定性强和酶活性高的特点，与现有方法制作得到的固定化蛋白酶相比，该固定化蛋白酶的活性达到80U/mg以上，提高了25%左右。2014年浙江工商大学熊春华教授公开了一种固定化木瓜蛋白酶的方法（201410265922.5），包括以下步骤：1)将聚丙烯腈树脂用反应溶剂浸泡溶胀后，加入氨基葡萄糖盐酸盐和K2CO3，在氮气保护下进行反应；然后过滤；2)所得滤渣先用无水乙醇浸泡洗涤，然后依次进行酸洗和水洗；接着真空干燥，得PAN-GA载体；3)在PAN-GA载体中加入Nal04溶液避光氧化，洗涤后，再加入pH为6.5～8.5的磷酸缓冲液和木瓜蛋白酶进行固定化反应，接着过滤分离；所得滤饼冲洗后干燥，得固定化木瓜蛋白酶。本发明所采用的用于固定化木瓜蛋白酶的载体(PAN-GA)，能克服现有技术所合成的载体在酶固定化过程中，由于刚性碰撞造成的酶活力损失。

采用交联法或共价结合法制备的固定化蛋白酶在制备过程中需要引入有毒、有害试剂，如戊二醛、Nal04等，在食品制造过程中存在安全隐患。采用包埋法制备的固定化蛋白酶在使用过程中存在固定化蛋白酶物理强度不够，易破坏等难题。采用吸附法制备的固定化蛋白酶在使用过程中蛋白酶损失较大，难以多次利用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提供一种固定化蛋白酶的制备方法及应用。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

固定化蛋白酶的制备方法，该方法将鸡骨粉碎至50-100目，与1-5倍质量的有机酸溶液混合后，加热至90-100℃保持10-15min，冷却至5-35℃后，添加蛋白酶后保温3-6h，过滤去除上清液和油脂，得到固定化蛋白酶。

进一步优化地，所述有机酸溶液为琥珀酸、柠檬酸、乙酸溶液中任意一种。

进一步优化地，所述有机酸溶液中有机酸含量为10%（g/ml）。

进一步优化地，所述蛋白酶的添加量为鸡骨重量的10-20%。

进一步优化地，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶中任意一种或多种。

进一步优化地，所述保温条件为：温度10-20℃。

进一步优化地，固定化蛋白酶在水解食物蛋白质制备呈味基料及调味品中的应用。

进一步优化地，固定化蛋白酶在水解鸡胸肉制备鸡肉粉中的应用。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和技术效果：

（1）本发明利用有机酸对鸡骨进行处理得到的鸡骨渣对蛋白酶具有较好的吸附和保留能力，对蛋白酶的催化活性无影响。

（2）本发明在制备固定化蛋白酶过程中未引入任何非食品添加剂，不存在安全隐患。本发明制备的固定化酶尤其适合于鸡肉、鸡骨架等生物资源的酶解。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的施舍保护不限于此，其中若有未特别详细说明之过程或工艺参数，均是本领域技术人员可参照现有技术实现的。

蛋白酶活力的测定：SB/T10317-1999

固定化酶蛋白酶的酶活力回收率：商品酶制剂的总酶活/固定化蛋白酶的总酶活*100%。

固定化酶蛋白酶的评价：将鸡胸肉磨碎后，添加鸡胸肉重量5%的实施例制得的固定化蛋白酶，50℃水解12h后，离心去除鸡肉酶解液，清洗，回收固定化酶，作为使用1次。

实施例1

将100g鸡骨粉碎至50目，与1倍重量10%（g/ml）琥珀酸混溶液混合后，加热至100℃保持10min，冷却至35℃后，添加10g碱性蛋白酶后保温3h，过滤去除上清液和油脂，得到固定化蛋白酶。固定化酶蛋白酶的酶活力回收率为80.4%。

表1

由表1可见，固定化蛋白酶在使用3次以后仍保留着90.3%的活力；固定化蛋白酶在使用7次以后仍保留着87.4%的活力。

实施例2

将1kg鸡骨粉碎至100目，与2倍10%（g/ml）柠檬酸溶液混合后，加热至90℃保持15min，冷却至5℃后，添加20g风味蛋白酶后保温6h，过滤去除上清液和油脂，得到固定化蛋白酶。固定化蛋白酶的酶活力回收率为88.2%。

表2

由表2可见，固定化蛋白酶在使用3次以后仍保留着89.9%的活力；固定化蛋白酶在使用7次以后仍保留着83.9%的活力。

实施例3

将3kg鸡骨粉碎至80目，与5倍10%（g/ml）乙酸溶液混合后，加热至95℃保持12min，冷却至15℃后，添加15g木瓜蛋白酶后保温4h，过滤去除上清液和油脂，得到固定化蛋白酶。固定化蛋白酶的酶活力回收率为82.9%。

表3

固定化酶使用次数	固定化酶活力保留率（%）
		0	100
1	91.3
		3	88.2
5	84.7
		7	80.2
8	69.2

由表2可见，固定化蛋白酶在使用3次以后仍保留着89.9%的活力；固定化蛋白酶在使用7次以后仍保留着80.2%的活力。

Claims (8)

1.固定化蛋白酶的制备方法，其特征在于：将鸡骨粉碎至50-100目，与1-5倍质量的有机酸溶液混合后，加热至90-100℃保持10-15min，冷却至5-35℃后，添加蛋白酶后保温3-6h，过滤去除上清液和油脂，得到固定化蛋白酶。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述有机酸溶液为琥珀酸、柠檬酸、乙酸溶液中任意一种。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述有机酸溶液中有机酸含量为10%（g/ml）。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述蛋白酶的添加量为鸡骨重量的10-20%。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述蛋白酶为木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶中任意一种或多种。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述保温条件为：温度10-20℃。

7.权利要求1所述制备方法制得的固定化蛋白酶的应用，其特征是固定化蛋白酶在水解食物蛋白质制备呈味基料及调味品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于固定化蛋白酶在水解鸡胸肉制备鸡肉粉中的应用。