KR100247853B1

KR100247853B1 - D-알파-아미노산의 제조방법

Info

Publication number: KR100247853B1
Application number: KR1019920701904A
Authority: KR
Inventors: 난바히로까즈; 야마다유끼오; 다까노마사유끼; 이께나까야스히로; 다까하시사또미; 야지마가즈요시
Original assignee: 후루타 다케시; 가네가후치 가가쿠고교 가부시키가이샤
Priority date: 1990-12-07
Filing date: 1992-08-07
Publication date: 2000-03-15
Also published as: EP0515698A4; EP0515698B1; CN1063310A; WO1992010579A1; KR920703834A; DE69129899D1; US5695968A; KR100257212B1; US5565344A; CN1057568C; ES2121001T3; DE69129899T2; EP0515698A1

Abstract

본 발명은 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산을 D - α - 아미노산으로 전환시킬 수 있는 효소인 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산 아미도히드롤라아제에 관련된 유전자 ; 유전자를 함유하는 DNA 단편이 벡터내에 혼입된 재조합 플라스미드 ; 재조합 플라스미드를 혼입시킴으로써 형질전환된 에스케리키아, 슈도모나스, 플라보박테리움, 바실러스, 세라티아, 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속 미생물 ; 형질 전환된 미생물을 배양하고, 이로 부터 목적 생성물을 수집하는 단계로 구성된 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산 아미도히드롤라아제의 제조방법 ; 이 방법에 의해 수득된 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산 아미도히드롤라아제 ; 및 효소의 작용에 의한 D - α - 아미노산의 제조방법에 관한 것이다.

D - N - 카르바모일 - α - 아미노산 아미도히드롤라아제는 고정화용 지지체상에 고정되어 고정화 효소로 사용될 수 있다.

Description

[발명의 명칭]

D - α - 아미노산의 제조 방법

[기술분야]

본 발명은 D - α - 아미노산의 제조 방법, 더욱 상세하게는 D - N - 카르바모일 -α - 아미노산을 상응하는 D - α - 아미노산으로 전환시킬 수 있는 효소에 관련된 유전자를 갖는 신규의 형질 전환체를 사용하여 D - α - 아미노산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

[배경기술]

광학 활성 D - α - 아미노산은 약제의 중간 물질로서 중요한 화합물이며, 특히 D - 페닐글리신, D - 파라히드록시 페닐글리신, 및 반합성 페니실린 또는 세팔로스포린 항생 물질의 제조를 위한 기타 중간 물질은 산업적으로 유용한 화합물이다. 이러한 D - α - 아미노산의 제조 방법으로서, 상응하는 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산에서 카르바모일기를 제거하여 목적하는 D - α - 아미노산을 수득하는 방법이 공지되어 있다. 이러한 방법에서, 카르바모일기는 화학적 방법 (예 : 일본국 특허 공보 제 58-4707 호 명세서) 또는 미생물의 효소 반응을 이용한 방법 (예 : 일본국 특허 공보 제 57-18793 호, 제 63-20520 호 및 제 1-48758 호의 명세서) 에 의해 제거된다.

[발명이 해결하고자 하는 과제]

상술된 바와 같이 카르바모일기의 제거를 위해 사용되는 화학적 방법에서는 황산과 같은 무기산이 대량 사용되므로, 그의 폐기 처분 등과 관련된 심각한 환경 문제가 야기될 수도 있다. 한편, 미생물의 효소 반응을 이용한 방법은 종래 효소 공급원으로 알려진 미생물이 충분한 양의 효소를 생산할 수 없고, 효소의 생산을 위하여 값비싼 히단토인 또는 N - 카르바모일 아미노산 화합물이 요구 된다는 몇가지 단점을 가지고 있다.

[과제를 해결하기 위한 수단]

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 효소의 생산성이 높은 미생물을 제조하는 것 뿐만 아니라, 이렇게 수득된 효소 공급원을 사용하여 D - α - 아미노산을 높은 효율로 생산하는 것을 목적으로 한다.

일본국 특허 공개 공보 제 63-24894 호에는 유사한 기술이 개시되어 있다. 그러나, 이 기술은 L - α - 아미노산의 제조에 관한 것으로서, D - α - 아미노산의 제조를 설명하는 실험 실시예는 없다.

본 발명은 에스케리키아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 플라보박테리움(Flavobacterium), 바실러스(Bacillus), 세라티아(Serratia), 코리네박테리움(Corynebacterium) 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 미생물에서 선택되는 숙주 세균 세포를, D - N - 카르바모일 - α - 아미노산에서 카르바모일기를 제거하여, 이를 상응하는 D - α - 아미노산으로 전환시킬 수 있는 효소에 관련된 유전자를 함유한 DNA 단편 및 벡터 DNA 로 구성된 재조합 DNA 로 형질 전환시킴으로써, 이에 의해 수득되는 형질 전환체로부터 생성된 효소의 작용을 받아 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산을 수성 매질중에서 상응하는 D - α - 아미노산으로 전환시킨 후, 생성된 D - α - 아미노산을 수집함을 특징으로 하는 D - α - 아미노산의 제조 방법에 관한 것이다.

종래에는, D - N - 카르바모일 -α - 아미노산을 카르바모일기의 제거에 의해 상응하는 D - α - 아미노산으로 전환시킬 수 있는 효소와 관련된 유전자, 및 벡터로 이루어진 재조합 DNA 를 미생물내에 도입하여 유전자의 발현을 달성한 예가 알려져 있지 않았다. 이러한 기술은 본 발명이 완성되고 나서야 비로소 성공하였다.

사실상, D - N - 카르바모일 - α - 아미노산을 카르바모일기의 제거에 의해 상응하는 D - α - 아미노산으로 전환시킬 수 있는 효소는 D - 이성체에 특정하게 작용하는 효소나 D - 또는 L - 이성체에 작용하는 효소로 한정되지 않는다. 특히, D - N - 카르바모일 - α - 아미노산에 대해 엄격한 입체 특이성을 갖는 효소를 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산 아미도히드롤라아제라고 언급할 수도 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 유전자 함유 DNA 단편의 예는 진핵 생물, 원핵 생물, 비루스, 박테리오파아지 또는 플라스미드에서 유래된 것이며, 특히 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산 아미도히드롤라아제에 관련된 유전자를 함유하는 것이다. 원핵 생물 유래의 유전자로는 예를 들어 슈도모나스(Pseudomonas), 아그로박테리움(Agrobacterium), 에어로박터(Aerobacter), 에어로모나스(Aeromonas), 브레비박테리움(Brevibacterium), 바실러스(Bacillus), 플라보박테리움(Flavobacterium), 세라티아 (Serratia), 미크로코커스 (Micrococcus), 알트로박터 (Arthrobacter), 알칼리제네스 (Alkaligenes), 아크로모박터(Achromobacter), 모라젤라(Moraxella) 또는 파라코커스(Paracoccus) 속의 세균에서 유래되고, D - N - 카르바모일 - α - 아미노산 아미도히드롤라아제에 관련된 것이 바람직하다. 이러한 균주의 특정예는 다음과 같다 : 에어로박터 클로아카에(Aerobacter cloacae) IAM 1221, 바실러스 마크로이데스(Bacillus macroides) ATCC 12905, 바실러스 알베이(Bacillus alvei) IFO 3343, 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes) IFO 12071, 플라보박테리움 플라베센스(Flavobacterium flavescens) IFO 3086, 사르시나 루테아(Sarcina lutea) IFO 1099, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) IFO 3054, 미크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) IFO 12708, 에어로모나스 히드로필리아(Aeromonas hydrophilia) IFO 3820, 아그로박테리움 종(Agrobacterium species) KNK 712 (FERM BP-1900), 슈도모나스 sp. KNK 003A (FERM BP-3181), 슈도모나스 sp. KNK 505 (FERM BP-3182), 아그로박테리움(Agrobacterium) 1302 NRRL B11291, 알칼리게네스 아쿠아마리누스(Alkaligenes aquamarinus) AJ 11199, 아크로모박터 리쿼파시엔스(Achromobacter liquefaciens) AJ 11198, 모라젤라 논리쿼파시엔스(Moraxella nonliquefaciens) AJ 11221, 파라코커스 데니트리피칸스(Paracoccus denitrificans) AJ 11222, 아트로박터 프라질러스(Arthrobacter fragilus) AJ 11223 등.

상기 세균의 전형적인 예로서, 아그로박테리움 종(Agrobacterium species) KNK 712 (FERM BP-1900), 슈도모나스 sp. KNK 003A (FERM BP-3181), 및 슈도모나스 sp. KNK 505 (FERM BP-3182) 의 미생물학적 특징을 하기에 설명한다.

아그로박테리움 종(Agrobacterium species) KNK 712 (FERM BP-1900)

(a) 형태

(1) 세포 크기 및 형상 : 0.5 내지 1.0 × 2.0 내지 4.0 ㎛, 간상균

(2) 세포 이형 : 없음

(3) 운동성 및 편모 배열 : 활동적, 서브폴라(subpolar)

(4) 포자 형성 : 없음

(5) 그람 - 염색 : 음성

(b) 각종 배지상에서의 배양 특성

(1) 육 추출물 한천 플레이트 배양 : 만족스런 생육, 원형, 이랑 모양으로 융기됨, 매끄러운 가장자리, 매끄럽고 습한 표면, 백색 내지 크림색, 광택, 불투명, 액체 형태.

(2) 육 추출물 한천 슬랜트 배양 : 뛰어난 생육, 접종 라인에서도 생육, 두꺼운 융기, 매끄럽고 습한 표면, 매끄러운 가장자리, 백색 내지 크림색, 광택, 불투명, 배지 변화 없음.

(3) 육 추출물 젤라틴 천자 배양 : 약한 생육, 천자 라인을 따라 생육, 천자 라인 주위에서 생육, 젤라틴 액화 없음, 백색 내지 크림색, 투명성 변화 없음, 배지 변화 없음.

(4) 육 추출물 액체 배양 : 중간 생육, 불균질 혼탁, 침전 형성, 표면 생육 없음.

(5) 리트머스 밀크 : 약산성

(c) 생리학적 특징

(1) 질산염 환원 : +

(2) 탈질산 반응 : +

(3) MR 시험 : +

(4) Vp 시험 : -

(5) 인돌 형성 : -

(6) 황화 수소 형성 : -

(7) 전분 가수분해 : -

(8) 시트르산염 : - (스몬스 배지)

(9) 무기 질소원 : + (질산염, 암모늄염)

(10) 우레아제 : -

(11) 옥시다아제 : +

(12) 카탈라아제 : +

(13) 생육 범위 : 20 내지 37 ℃, pH 6.5 내지 8.5

(14) 산소에 대한 태도 : 호기성

(15) O - F 시험 : O 형

(16) 사카라이드로부터 산과 가스의 형성 :

산 형성, - ; 가스 형성, - (D - 글루코오스).

(17) 말로네이트 이용 : -

(18) 페닐알라닌의 데아미나아제 반응 : -

(19) 데카르복실라아제 반응 : - (리신)

(20) 아르기닌 디히드롤라아제 반응 : -

(21) 카제인 분해 : -

(22) DNA 분해 : -

(23) 영양 요구성 : 없음.

(24) 탄소 화합물의 이용 :

D - 글루코오스 : +

L - 아라비노오스 : +

사카로오스 : +

D - 프락토오스 : +

말로네이트 : -

셀로비오스 : +

에탄올 : -

D - 크실로오스 : +

D - 타르트레이트 : -

소르비톨 : +

시트레이트 : -

락토오스 : +

D - 만니톨 : +

메조 - 이노시톨 : +

라피노오스 : +

L - 람노오스 : +

말토오스 : +

α - 메틸 - D - 글루코시드 : +

D - 만노오스 : +

살라신 : -

N - 아세틸글루코사민 : +

글루코네이트 : -

카프레이트 : -

아디페이트 : -

페닐아세테이트 : -

메탄올 : -

(25) 에그 요크 (Egg york) 반응 : -

(26) β - 갈락토시다아제 : +

(27) 에스쿨린 가수분해 : +

(28) 시토크롬 옥시다아제 : +

(29) 트윈(Tween)분해 : -(Tween 80)

(30) 3 - 케토락토오스 형성 : -

슈도모나스 sp. KNK 003A (FERM BP-3181)

(a)형태 :

(1) 세포 크기 및 형상 ; 0.5 내지 0.7 × 1.2 내지 2.5 ㎛, 간상균

(2) 세포 이형 : 없음

(3) 운동성 : 활동적

(4) 포자 형성 : 없음

(5) 그람 - 염색 : 음성

(6) 콜로니 형상 : 원형, 규칙적, 완전함, 편평, 매끄러움, 광택, 반투명, 황갈색.

(b) 생리학적 특징

(1) 3 % KOH 에 의한 세포 용해 : +

(2) 아미노펩티다아제 : +

(3) 옥시다아제 : +

(4) 카탈라아제 : +

(5) 세포 생육

혐기 조건 : -

37 / 40 ℃ : +/+

pH 5.6 : -

맥 - 콘키 (Mac - Conkey) 한천 : -

SS 한천 : -

세트리미드 한천 : -

(6) 산 형성 (O - F 시험)

글루코오스 호기 조건 : -

글루코오스 혐기 조건 : -

(7) 글루코오스로부터 가스 형성 : -

(8) 산 형성 (ASS)

글루코오스 : +

프락토오스 : -

크실로오스 : +

(9) ONPG : -

(10) ADH : -

(11) ODC : -

(12) VP : -

(13) 인돌 형성 : -

(14) 질산염 환원 : -

(15) 탈질산 반응 : -

(16) 페닐알라닌 데아미나아제 : -

(17) 슈크로오스로부터 레반 형성 : -

(18) 레시티나아제 : -

(19) 우레아제 : -

(20) 가수분해

전분 : -

젤라틴 : -

카제인 : -

DNA : -

트윈 (Tween) 80 : -

에스쿨린 : -

(21) 티로신 분해 : -

(22) 각종 화합물의 이용

아세테이트 : 약함

아디페이트 : -

카프레이트 : -

시트레이트 : -

시트라코네이트 : -

글리콜레이트 : -

락테이트 : +

레불리네이트 : -

말레이트 : -

말로네이트 : -

메사코네이트 : -

페닐아세테이트 : -

수베레이트 : -

m - 타르트레이트 : -

D - 타르트레이트 : -

L - 아라비노오스 : +

프락토오스 : +

글루코오스 ; +

만노오스 : +

말토오스 : -

크실로오스 : +

사카로오스 : -

트레할로오스 : -

리보오스 : -

사카레이트 : -

히드록시부틸레이트 : -

벤조에이트 : -

만니톨 : +

글루코네이트 : +

2 - 케토글루코네이트 : +

N - 아세틸글루코사민 : -

L - 세린 : -

L - 히스티딘 : -

L - 발린 : -

(23) 주요 호흡 퀴논형 : 유비퀴논 10

슈도모나스 sp. KNK 505 (FERM BP-3182)

(a) 형태 :

(1) 세포 크기 및 형상 ; 0.5 내지 0.7 × 1.2 내지 2.5 ㎛, 간상균

(2) 세포 이형 : 없음

(3) 운동성 : 활동적

(4) 포자 형성 : 없음

(5) 그람 - 염색 : 음성

(6) 콜로니 형상 : 원형, 규칙적, 완전함, 편평, 매끄러움, 광택, 반투명, 황갈색

(b) 생리학적 특징

(1) 3 % KOH 에 의한 세표 용해 : +

(2) 아미노펩티다아제 : +

(3) 옥시다아제 : +

(4) 카탈라아제 : +

(5) 세포 생육 :

혐기 조건 : -

37 / 40 ℃ : +/+

pH 5.6 : -

맥 - 콘키 한천 : -

SS 한천 : -

세트리미드 한천 : -

(6) 산 형성 (O - F 시험)

글루코오스 호기 조건 : -

글루코오스 혐기 조건 : -

(7) 글루코오스로부터 가스 형성 : -

(8) 산 형성 (ASS)

글루코오스 : +

프락토오스 : -

크실로오스 : +

(9) ONPG : -

(10) ADH : -

(11) ODC : -

(12) VP : -

(13) 인돌 형성 : -

(14) 질산염 환원 : -

(15) 탈질산 반응 : -

(16) 페닐알라닌 데아미나아제 : -

(17)슈크로오스로부터 레반 형성 : -

(18) 레시티나아제 : -

(19) 우레아제 : -

(20) 가수분해

전분 : -

젤라틴 : -

카제인 : -

DNA : -

트윈 80 : -

에스쿨린 : -

(21) 티로신 분해 : -

(22) 각종 화합물의 이용

아세테이트 : 약함

아디페이트 : -

카프레이트 : -

시트레이트 : -

시트라코네이트 : -

글리콜레이트 : -

락테이트 : +

레불리네이트 : -

말레이트 : -

말로네이트 : -

메사코네이트 : -

페닐아세테이트 : -

수베레이트 : -

m - 타르트레이트 : -

D - 타르트레이트 : -

L - 아라비노오스 : +

프락토오스 : +

글루코오스 : +

만노오스 : +

말토오스 : -

크실로오스 : +

사카로오스 : -

트레할로스 : -

리보오스 : -

사카레이트 : -

히드록시부틸레이트 : -

벤조에이트 : -

만니톨 : +

글루코네이트 : +

2 - 케토글루코네이트 : +

N - 아세틸글루코사민 : -

L - 세린 : -

L - 히스티딘 : -

L - 발린 : -

(23) 주요 호흡 퀴논형 : 유비퀴논 10

D - N - 카르바모일 - α - 아미노산을 카르바모일기의 제거에 의해 상응하는 D - α - 아미노산으로 전환시킬 수 있는 효소에 관련된 유전자를 상기 균주들로부터 수득하기 위하여, 통상, 미생물의 염색체에서 유전자 DNA 를 통상의 절차에 따라 추출해낸 후, 원하는 유전자를 함유하는 DNA 단편을 수득하고, 이것의 염기 서열을 분석한다. 또한, D - N - 카르바모일 - α - 아미노산을 카르바모일기의 제거에 의해 상응하는 D - α - 아미노산으로 전환시킬 수 있는 효소를 생성하는 미생물, 뿐만 아니라 이러한 효소 유전자가 도입된 형질 전환 미생물을 배양하고, 생성된 효소를 정제한 후, 단백질의 분자량을 측정하고, 아미노 말단의 부근에 있는 아미노산 서열을 기체상 단백질 서열 분석기등에 의해 결정한다. 이어서, 이 DNA 염기 서열을 단백질의 아미노 말단 서열과 비교하여, 카르바모일기의 제거에 관련된 효소 단백질을 코딩하는 염기 서열 부분에 있어서 단백질로의 유전자 번역 개시 부위를 결정하고, 단백질의 분자량을 고려하여, 상기 개시 부위로부터 종료 코오돈으로 뻗은 유전자 부분에서 효소 단백질이 코딩됨을 확인함으로써 목적 유전자를 검증할 수 있다 (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Chaps. 4 및 13). 상기 절차에 따라서, 균주 아그로박테리움 종(Agrobacterium species) KNK 712 및 슈도모나스 sp. KNK 003A 로부터, 첨부된 서열 표에 있어서의 SEQ ID 번호 1 및 2 의 DNA 단편이 얻어진다. 이 유전자를 함유하는 상기 효소 및 / 또는 DNA 단편을 코딩하는 상기 수득된 유전자는, 통상 하나의 아미노산이 다수의 염기 코돈에 상응하기 때문에, 상기 유전자 및 / 또는 DNA 단편에 상응하는 아미노산 서열을 코딩하는 기타 염기 서열을 가진 DNA 단편과 동등함이 명백하다.

본 발명에서 사용된 벡터로는, 미생물로부터 유래되고 에스케리키아, 슈도모나스, 플라보박테리움, 바실러스, 세라티아, 크로이네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 세균 세포내에서 자발적으로 생육 가능한 플라스미드, 파아지 또는 그의 유도체를 사용할 수 있다. 예를 들면, "Guidelines on Recombinant DNA Experiments" (Ed., the Life Science Section of the Research Development Office in the Science and Technology Agency; 1987. 9 .16 개정판) 제 55 면에 기술된 숙주 - 벡터 체계를 사용할 수 있다. 또한, 효소의 생성량을 증가시키기 위하여 강력한 구조 프로모터를 갖도록 개량된 벡터를 사용할 수도 있다.

벡터 DNA 및 유전자 - 함유 DNA 단편을 포함하는 재조합체의 제조는 공지된 시험관내 재조합 DNA 기술을 자유롭게 사용하여 수행될 수 있다. 시험관내 DNA 재조합은 통상 목적 유전자를 함유하는 공여 DNA 와 벡터 DNA 의 절단 및 결찰 (리가아제 반응) 에 의해 수행된다 (예 : 일본국 특허 출원 제 56-211908 호 및 미합중국 특허 제 4,237,224 호의 명세서 참조). 목적하는 재조합 DNA 에 추가로 많은 종류의 재조합 DNA 가 리가아제 반응에 의해 생성되므로, 목적하는 재조합 DNA 를 선택적으로 수득하기 위해서는 에스케리키아, 슈도모나스, 플라보박테리움, 바실러스 세라티아, 크로이네박테리움 또는 브레비박테리움 속 미생물을 리가아제 반응 혼합물로 직접 형질 전환시킬 수도 있고, 목적하는 유전자의 유전 정보로부터 물려받은 특징이 부여된 형질 전환체를 선택적으로 분리해낼 수도 있고, 원하는 재조합 DNA 를 배양 세균 세포로부터 추출 및 단리할 수도 있다.

예를 들어, 상기 미생물속중의 어느 하나에 속하는 세균종을 직접 형질 전환시키지 않은 채로 재조합체를 수득할 수도 있다 : 다시 말해서, 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) 와 같은 다른 미생물을 사용하여 원하는 유전자를 일단 숙주 벡터 체계내에 클로닝시킨 다음, 적절한 벡터를 가진 재조합 DNA 를 시험관내 생성하고, 이어서 상기 세균종을 형질 전환시킨 후, 상술한 바와 동일한 방식으로 형질 전환체를 선택 분별한다.

하기 문헌들의 상세한 설명은 재조합체의 생성에 널리 적용된다 : 미합중국 특허 제 4,237,224 호 (S.N. Cohen, et al.) 의 명세서 ; "Idenshi - sousa Jikken - hou (유전자 조작의 실험 방법)" [Ed. Yasuyuki Takagi, Kohdan - sha Scientific (1980)] ; Method in Enzymdogy, 68, Recombinant DNA [Ed., Ray Mv, Academic Press (1979)] ; 일본국 특허 출원 제 56-211908 호의 명세서등.

다양한 종류의 재조합 DNA 로 형질 전환된 에스케리키아 콜리의 경우에, 목적 유전자, 즉 특정 D - N 카르바모일 - α - 아미노산 아미도히드롤라아제의 유전자를 갖고 이 유전자가 형질 발현되는 특정한 형질 전환 균주를 전체 형질전환 균주로부터 선별하는 방법은 다음과 같다 : 먼저, 암피실린과 같은 선별 마커를 함유하는 플레이트상에서 형질 전환 균주의 콜로니를 생육시킨다. 이어서, 재조합 DNA 를 갖는 형질 전환 균주의 다양한 콜로니를 수집하고 생리 식염수에 현탁시킨 후, 단독 질소원으로 특정한 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산을 함유하는 최소 액체 배지에 상기 현탁액을 접종한다. 이 배지에서는, D - N - 카르바모일 - α - 아미노산을 이용할 수 있는 형질 전환 균주, 다시 말해서 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산 아미도히드롤라아제 활성이 부여된 형질 전환 균주만이 생육 가능하다. 이렇게 수득된 배양액을 상기 최소 배지에 접종하고, 이러한 조작을 반복하여, 목적하는 형질 전환 균주를 다량으로 얻을 수 있다. 이렇게 증균된 배양액으로부터, 통상적 방법에 따라 세균 세포를 분별하고, 분별된 형질 전환 균주를 배양하여, 기질인 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산과 세균 반응시키고, D - α - 아미노산의 생성을 확인함으로써 목적 유전자를 함유하는 형질 전환 균주를 수득할 수 있다.

이렇게 수득된 형질 전환 균주로부터, 알칼리 변성을 이용한 방법과 같은 통상의 방법에 따라 재조합 DNA 를 추출한다 (참조. Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Chap. 1) ; 클로닝된 목적 유전자를 함유하는 DNA 단편에 있는 목적 효소의 구조 유전자를 서브클로닝하고, 불필요한 DNA 를 제거한다 ; 강력한 프로모터를 갖도록 개량된 재조합 DNA 를 벡터내에 제조한다 ; 이것으로 상기 숙주 세균을 형질 전환시킨다 ; 얻어진 형질 전환 균주를 사용하여 목적 효소의 생성량을 증가시킨다.

통상의 영양 배지에서 형질 전환 균주를 배양함으로써 재조합 DNA 의 도입 형질이 발현될 수 있다. 유전자 DNA 또는 벡터 DNA 로부터의 형질이 재조합 DNA 에 부여되는 경우, 그 형질에 의존하여 임의의 약제를 배지에 보충할 수도 있다.

이렇게 수득 형질 전환 균주를 효소 공급원으로 취하기 위하여, 통상의 배지를 사용하여 배양액을 제조할 수도 있고, 필요한 경우, 히단토인 화합물, D - N - 카르바모일 - α - 아미노산, 이소프로필 -1 - 티오 -β - D - 갈락토시드 (IPTG) 등의 첨가, 및 온도 상승과 같은 효소 유도 처리를 수행할 수도 있다.

통상, 형질 전환 균주의 배양을 위해 사용되는 배지는 탄소원, 질소원 및 무기 이온을 함유하는 통상의 배지일 수도 있다. 비타민 및 아미노산과 같은 유기 미량 영양소를 첨가한다면, 많은 경우에 만족스런 결과가 얻어질 수도 있다. 탄소원으로는, 글루코오스 및 슈크로오스와 같은 탄수화물 ; 아세트산과 같은 유기산 ; 알코올 등이 편리하게 사용된다. 질소원으로는, 암모니아 가스, 암모니아수, 암모니아염 등이 사용된다. 무기 이온으로는, 인산염 이온, 마그네슘 이온, 칼륨 이온, 철 이온 등을 사용할 수도 있다.

pH 를 4 내지 8 의 적절한 범위, 온도를 25 내지 45 ℃ 로 조정하면서, 호기 조건하에서 1 내지 10 일 동안 배양액을 제조한다면, 만족스런 결과를 얻을 수 있다.

형질 전환 균주에 의해 생성되는 효소로서 작용하는 구현예로는 형질 전환 균주의 배양액, 세균 세포, 처리된 세균 세포, 세균 세포에서 추출된 효소, 고정화 세균 세포 등이 있다.

세균 세포로는, 배양 완결후의 배양액 자체, 배양액에서 분리된 세균 세포, 세척된 세균 세포 등을 사용할 수 있다. 처리된 세균 세포로는, 동결 건조 세균 세포, 아세톤 - 건조 세균 세포, 톨루엔 또는 청정제와 접촉시킨 세균 세포, 리소자임 - 처리 세균 세포, 초음파에 노출된 세균 세포, 기계적 분쇄 세균 세포 등을 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 처리된 세균 세포로부터 수득된 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산을 카르바모일기의 제거에 의해 상응하는 D - α - 아미노산으로 전환시킬 수 있는 효소 활성을 지닌 효소 추출물 ; 고정화 세균 세포 ; 불용화 처리된 세균 세포 ; 고정화용 지지체 (예 : 음이온 교환 수지) 에 고정된 효소 단백질 등을 사용할 수 있다. 고정화 방법을 위하여, 예를 들면, 일본국 특허 공개 공보 제 63-185382 호의 명세서를 참조할 수 있다.

고정화를 위해 사용되는 지지체로는, 듀올라이트 A 568 또는 DS 17186 (Rohm ＆ Haas Co. : 등록 상표) 와 같은 페놀 - 포름알데히드 음이온 교환 수지 ; 및 각종 아민, 암모늄염 또는 디에탄올아민계의 작용기를 함유하는 다양한 음이온 교한 수지, 예를 들면 앰버라이트 IRA 935, IRA 945, IRA 901 (Rohm ＆ Haas Co. : 등록 상표), 레베티트 OC 1037 (Bayer A.G. : 등록 상표) 및 디아이온 EX-05 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd. : 등록 상표 ) 와 같은 폴리스티렌 수지가 적절하다. 또한, DEAE - 셀룰로오스와 같은 기타 지지체를 사용할 수도 있다.

또한, 보다 강력하고 안정한 효소 흡착을 얻기 위하여, 통상 가교제를 사용하며, 그의 바람직한 예는 글루타르알데히드이다. 사용되는 효소로는, 정제된 효소 뿐만 아니라, 부분 정제 효소, 붕괴된 세균 세포의 현탁액 및 세포 - 유리 추출물과 같이 상이한 정제도를 갖는 효소를 사용할 수 있다.

고정화 효소의 제조는 효소 용액을 사용하고, 예를 들면 효소를 지지체상에 흡착시킨 다음, 가교 처리하는 통상적인 방법을 사용함으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 효소 반응 기질로 사용되는 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산은 식 : R-CH(NHCONH₂)-COOH 로 표시될 수 있으며, 실제적 구현예로서는, 사용되는 효소가 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산에 대해 엄격한 입체 선택성을 갖고 있는 경우에, D - 형태 또는 D - 및 L - 형태의 혼합물로 사용될 수 있다. 또한, 효소가 L - 카르바모일 아미노산에 대해서도 작용할 수 있기 때문에 입체 선택성이 엄격하지 않은 경우, 또는 효소가 L - 형태에 대해서도 작용하는 효소 혼합물로서 사용되는 경우에는, D - 형태의 효소만을 사용하여 D - 형태의 α- 아미노산을 생성하는 것이 바람직하다.

치환제 R 은 일본국 특허 공고 제 57-18793 호, 제 63-20520 호 및 제 1-48758 호의 명세서에 기술된 바와 같이 넓은 범위에서 선택될 수 있으며 ; 특히, 약제의 중간 물질과 같이 산업적으로 유용한 화합물을 제공하기 위해서는, R 이 페닐, 히드록시로 치환된 페닐, 알킬, 치환된 알킬, 아르알킬 또는 티에닐인 것이 바람직하다. 히드록시로 치환된 페닐의 경우에, 히드록시의 수는 1 이상이며, o -, m - 및 p - 위치의 어느 하나에 결합될 수도 있고, 그의 전형적인 예는 p - 히드록시페닐이다. 알킬기는 상응하는 아미노산이 D - 알라닌, D - 발린, D - 루이신, D - 이소루이신등으로 되는 1 내지 4 개 탄소 원자의 기이다. 치환된 알킬기는 히드록시, 알킬티오, 카르복실, 아미노, 페닐, 히드록시로 치환된 페닐, 아미도등으로 치환된 1 내지 4 개의 탄소 원자를 갖는 알킬이며, 상응하는 아미노산이 D - 세린, D - 트레오닌, D - 메티오닌, D - 시스테인, D - 아스파라긴, D - 글루타민, D - 티로신, D - 트립토판, D - 아스파르트산, D - 글루탐산, D - 히스티딘, D - 리신, D - 아르기닌, D - 시트룰린등으로 되는 것이다. 아르알킬기는 예를 들어 벤질 또는 펜틸과 같은 7 내지 8 개의 탄소 원자를 갖는 기이며, 상응하는 아미노산이 D - 페닐알라닌 등으로 되는 것이다.

수성 매질로는 물, 완충액 또는 에탄올 같은 유기 용매를 함유하는 것을 사용할 수 있다. 또한, 필요한 경우, 미생물 생육에 요구되는 영양소, 산화방지제, 청정제, 조효소, 히드록실아민, 금속 등을 또한 수성 매질에 첨가할 수 있다.

상기 미생물의 세균 세포를 수용성 매질중에서 배양하면서, 세균 세포를 특정 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산과 접촉시키는 경우에, D - N - α - 아미노산 뿐만 아니라, 미생물 생육에 필요한 영양소, 예컨대 탄소원, 질소원 및 무기 이온을 함유하는 수성 매질이 사용된다. 또한, 비타민 및 아미노산과 같은 유기 미량 영양소를 수성 매질에 첨가한다면, 많은 경우에 만족스런 결과가 얻어질 수 있다. 탄소원으로는, 글루코오스 및 슈크로오스와 같은 탄화수소 ; 아세트산과 같은 유기산 ; 알코올 등이 편리하게 사용된다. 질소원으로는, 암모니아 가스, 암모니아수, 암모늄염 등이 사용된다. 무기이온으로는, 인산염 이온, 마그네슘 이온, 칼륨 이온, 철이온 등이 사용될 수도 있다.

pH 를 4 내지 8, 온도를 25 내지 45 ℃ 의 적절한 범위로 조정하면서, 호기 조건하에 배양을 수행한다. 배양을 1 내지 10 일간 수행한다면, D - N - 카르바모일 - α - 아미노산이 고효율로 단지 D - α -아미노산으로 전환될 수 있다.

반대로, 특정 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산이 용해되거나 현탁된 수성 매질중에서, 상기 미생물의 배양액을 그 자체로 배양 세균 세포, 처리된 세균 세포, 효소 추출물, 고정화 세균 세포, 불용화 세균 세포 또는 고정된 효소 단백질과 반응시키는 경우, 반응 온도를 10 내지 80 ℃ 의 적절한 온도, pH 를 4 내지 9.5 로 유지시키면서, 반응 혼합물을 잠시 동안 정치시키거나 교반할 수도 있다. 이 과정을 5 내지 100 시간 동안 계속한다면, 상응하는 D - α - 아미노산이 다량으로 생성되며 수성 매질중에 풍부하게 존재한다. 또한, D - N - 카르바모일 - α - 아미노산을 반응이 진행됨에 따라 소량씩 나누어 첨가할 수도 있다. 생성된 D - α - 아미노산을 통상의 분리 방법으로 분리 및 정제할 수 있다.

이렇게 수득된 D - α - 아미노산은 식 : R-CHNH₂COOH (R 은 상기 정의된 것과 같다) 로 표시될 수 있다.

[실시예]

본 발명의 실시 양태를 이하에 설명할 것이다. 생성된 D - α - 아미노산은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 얇은 막 크로마토그래피 (TLC)에 의해 검출 및 측정된다.

[실시예 1]

아그로박테리움 종(Agrobacterium species) KNK 712 (FERM BP-1900) 으로부터의 염색체 DNA 및 벡터 DNA 로 이루어진 재조합 DNA 의 제조 :-

아그로박테리움 종 KNK 712 (FERM BP-1900) 을 L - 브로쓰 (펩톤 10 g/ℓ, 효모 추출물 5 g/ℓ, 염화나트륨 5 g/ℓ; pH 7.0) 2ℓ 중에서 33 ℃ 에서 27시간 동안 배양한 후, 배양액을 회수하여 20 g 의 세균 세포를 얻는다. 수득된 세균 세포에서 염색체 DNA 를 마르무어 (Marmur) 법에 따라 추출한다. 이 염색체 DNA 250 ㎍ 에 Sau3AI 2U 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 30 분간 반응시켜 부분적으로 소화시킨다. 부분 소화된 DNA 로부터, 아가로오스겔 전기 영동에 의해 4 내지 9 kbp DNA 단편을 수득한다. 한편, 플라스미드 pUC 18 을 BamHI 으로 완전히 소화시키고, 이를 염색체로부터 상기 - 수득된 DNA 단편에 T4 DNA 리가아제를 사용하여 결찰시켜, 다양한 재조합 플라스미드의 혼합 용액을 얻는다.

[실시예 2]

아그로박테리움 종 KNK 712 (FERM BP-1900) 에서 유래되고, 상응하는 D - α - 아미노산으로 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산의 전환에 관련된 유전자를 함유하는 플라스미드의 선별 : -

실시예 1 의 혼합 플라스미드 용액을 사용하여, 통상의 방법에 따라 에스케리키아 콜리 JM 109 를 형질 전환시킨다. 이것을 선별 마커로서 암피실린을 함유하는 하기 표 1 의 배지에 접종한다 :

물을 1ℓ 부피까지 첨가한다 (pH 7.0).

생육된 콜로니를 수집하고, 단독 질소원으로 D - N - 카르바모일 알라닌을 함유하는 표 2 의 액체 배지에 이를 접종한 다음, 배양한다.

물을 1ℓ의 부피까지 첨가한다 (pH 7.0).

D - N - 카르바모일 - 알라닌을 질소원으로 사용함으로써, 표 2 의 배지에서는 목적 유전자를 발현하는 형질 전환 균주만이 생육 가능하다. 표 2 의 배지중의 배양액을 상기 사용된 것과 동일한 배지에 접종하고, 원하는 형질 전환 균주의 증식을 위해 이 조작을 반복한다. 증균된 배양액으로부터, 형질 전환 균주를 표 1 의 배지로 순수하게 분리한다. 이렇게 순수 분리된 세포를 100 ㎎/ℓ의 암피실린을 함유하는 100 ml 의 L - 브로쓰(펩톤 10 g/ℓ, 효모 추출물 5 g/ℓ, 염화나트륨 5 g/ℓ ; pH 7.0) 에 접종하고, 37 ℃에서 16 시간 동안 배양한 후, 배양액 1 ml 를 회수하고, 이로부터 상층액을 제거한 다음, 0.5 ml 의 기질 용액 (0.5 % D - N - 카르바모일 - 파라히드록시페닐글리신, 0.05 % 트리톤 X - 100, 0.1 M 인산염 완충액 (이하, KPB 라고함) ; pH 7.0) 중의 세균 세포 현탁액을 37 ℃ 에서 3 시간 동안 반응시킨다. 이 반응 혼합물을 TLC 상에 점으로 찍고, 전개시킨 다음, 닌히드린으로 염색하면, 표준과 일치하는 D - 파라히드록시페닐글리신의 점이 얻어진다. 이로부터, 순수 분리된 형질 전환 균주가 원하는 효소에 관련된 유전자를 함유한 플라스미드를 가짐을 확인할 수 있다. 이 균주에 함유된 플라스미드를 pAHD 101 이라 명명한다.

이어서, 상기 형질 전환 균주로부터, 알칼리 변성법에 따라 pAHD 101 을 다량으로 제조한 다음, 지도화 하면 제 1 도에 나타낸 구조를 가짐을 알 수 있다.

pAHD 101 로 형질 전환된 에스케리키아 콜리 JM 109 를 에스케리키아 콜리 JM 109 pAHD 101 이라 명명한다.

[실시예 3]

슈도모나스 sp. KNK 003A (FERM BP-3181) 로부터 유래되고, 상응하는 D - α - 아미노산으로 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산의 전환에 관련된 유전자를 함유하는 플라스미드의 선별 : -

실시예 1 에서와 동일한 방식으로, 슈도모나스 sp. KNK 003A (FERM BP-3181) 의 염색체 DNA 단편 및 플라스미드 pUC 18 로부터 형성된 다양한 재조합 플라스미드 혼합 용액을 수득한다. 이 혼합 용액을 사용하여, 통상의 방법에 따라 에스케리키아 콜리 JM 109 를 형질 전환시킨다. 표 2 의 액체 배지 대신에 100 mg/ℓ 의 IPTG 를 함유하는 표 2 의 액체 배지를 사용하는 것 이외에는, 실시예 2 에서와 동일한 방식으로, 다양한 형질 전환 균주로부터, D - N - 카르바모일 - α - 아미노산을 상응하는 D - α - 아미노산으로 전환시킬 수 있는 효소에 관련된 유전자 함유 플라스미드를 가진 특정 형질 전환 균주를 수득한다. 이 균주에 함유된 플라스미드를 pPHD 301 이라 명명한다.

이어서, 상기 형질 전환 균주로부터, pPHD 301 을 다량으로 제조한 다음, 지도화 하면, 제 2 도에 나타낸 구조를 갖고 있음을 알 수 있다.

pPHD 301 로 형질 전환된 에스케리키아 콜리 JM 109 를 에스케리키아 콜리 JM 109 pPHD 301이라 명명한다.

[실시예 4]

pAHD 101 의 서브클로닝 :

실시예 2 에서 수득된 pAHD 101 을 SmaI 및 EcoRI 으로 완전히 소화시키고, 아가로오스겔 전기 영동에 의해 2.7 kbp SmaI - EcoRI 단편을 수득한다. 한편, 플라스미드 pUC 19 를 SmaI 및 EcoRI 으로 완전 소화시키고, T4 DNA 리가아제를 사용하여 이를 pAHD 101 의 SmaI - EcoRI 단편에 결찰시킨 후, 이 결찰된 플라스미드로 에스케리키아 콜리 JM 109 을 형질 전환시키고, 형질 전환된 균주를 이소프로필 - 1 - 티오 -β - D - 갈락토시드 (IPTG), 5 - 클로로 - 4 - 브로모 -3 - 인돌릴 -β - D - 갈락토오스 (Xgal) 및 암피실린을 함유하는 L - 배지 (1 % 펩톤, 0.5 % 효모 추출물, 0.5 % 염화나트륨, 1.5 % 한천 ; pH 7.0) 에서 배양시킨다.

pAHD 101 의 SmaI - EcoRI 단편을 함유하는 pUC 19 에 상응하는 플라스미드는 푸른색을 띄지 않는 백색의 콜로니를 형성하므로, 따라서 백색 콜로니들을 선별해낸다. 선별된 세균이 원하는 효소 활성을 갖고 있는가를 확인하기 위하여 이를 100 mg/ℓ 의 암피실린 함유 L - 브로쓰 (1% 펩톤, 0.5 % 효모 추출물, 0.5 % 염화나트륨) 10 ml 에 접종하고 배양한 후, 배양액 1 ml 를 회수하고 이로부터 상층액을 제거하고, 0.5 ml 의 기질 용액 (0.5 % D - N - 카르바모일 - 파라히드록시페닐글리신, 0.05 % 트리톤 X - 100, 0.1 M 인산염 완충액 ; pH 7.0) 에 세균 세포를 현탁시킨 다음, 37 ℃ 에서 3 시간 동안 반응시킨다. 이 반응 혼합물을 TLC 상에 점으로 찍고 전개시킨 다음, 닌히드린으로 염색하면, 표준과 일치하는 D - 파라히드록시페닐글리신의 점이 얻어진다. 이 형질 전환 균주에 함유된 플라스미드를 pAD 107 이라 명명한다.

이어서, 플라스미드 pAD 107 을 제조하고, SalI 으로 부분적 가수분해 시킨 다음, 아가로오스겔 전기 영동에 의해 pUC 19 부분을 함유하는 405 kbp 단편을 수득한다. 이 단편 T4 DNA 리가아제로 원형화하고, 이 플라스미드를 사용하여 에스케리키아 콜리 JM 109 를 형질 전환시킨다. 암피실린을 함유하는 L - 배지로부터 형질 전환 균주를 수득하고, 상기 기술된 것과 동일한 방식으로 세균 반응을 수행하여, D - N - 카르바모일 - 파라히드록시페닐글리신을 D - 파라히드록시페닐글리신으로 전환시키는 능력을 가진 형질 전환 균주를 수득한다. 이 형질 전환 균주에 함유된 플라스미드를 pAD 108 이라 명명한다. 상기 형질 전환 균주로부터 pAD 108 을 제조한 다음 지도화하면 제 3 도에 나타낸 구조를 가짐을 알 수 있다.

pAD 108 로 형질 전환된 에스케리키아 콜리 JM 109 를 에스케리키아 콜리 JM 109 pAD 108 이라 명명한다. 미생물공업 연구소에서 받은 수탁 번호는 FERM BP-3184 이다.

[실시예 5]

pPHD 301 의 서브클로닝 :

실시예 3 에서 수득된 pPHD 301 을 AccI 으로 완전히 소화시키고, pUC 18 부분을 함유하는 5.2 kbp 단편을 아가로오스겔 전기 영동에 의해 수득한다. 이 단편을 T4 DNA 리가아제로 원형화하고, 이 플라스미드를 사용하여 에스케리키아 콜리 JM 109 를 형질 전환시킨다. 암피실린 함유 L - 배지로부터 형질 전환 균주를 수득하고, 실시예 4 에서와 동일한 방식으로 세균 반응을 수행하여, D - N - 카르바모일 - 파라히드록시페닐글리신을 D - 파라히드록시 - 페닐글리신으로 전환시키는 능력을 가진 형질 전환 균주를 수득한다. 이 형질 전환 균주에 함유된 플라스미드를 pPD 302 라 명명한다.

이어서, 플라스미드 pPD 302 를 제조하고, SphI 및 AccI 으로 완전 소화시킨 후, 아가로오스겔 전기 영동에 의해 1.8 kbp SphI - AccI 단편을 수득한다. 한편, 플라스미드 pUC 19 을 SphI 및 AccI 으로 완전 소화시키고, T4 DNA 리가아제로 pPD 302 의 SphI - AccI 단편에 결찰시킨 후, 이 결찰된 플라스미드로 에스케리키아 콜리 JM 109 를 형질 전환시킨다. 암피실린 함유 L - 배지로부터 형질 전환 균주를 수득하고, 실시예 4 에서와 동일한 방식으로 세균 반응을 수행하여, D - N - 카르바모일 - 파라히드록시페닐글리신을 D - 파라히드록시페닐글리신으로 전환시키는 능력을 가진 형질 전환 균주를 수득한다. 이 형질 전환 균주에 함유된 플라스미드를 pPD 304 라 명명한다. 상기 형질 전환 균주로부터 플라스미드 pPD 304 를 제조한 다음 지도화하면, 제 4 도에 나타낸 구조를 갖는 것을 알 수 있다.

pPD 304 로 형질 전환된 에스케리키아 콜리 JM 109 을 에스케리키아 콜리 JM 109 pPD 304 라 명명한다. 미생물공업 연구소에서 받은 수탁 번호는 FERM BP-3183 이다.

[실시예 6]

형질 전환 균주에서 수득된 효소를 사용한 D - α - 아미노산으로의 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산의 전환 : -

실시예 4 에서 수득된 플라스미드 pAD 108 을 사용하여, 에스케리키아 콜리 JM 109 를 형질 전환시킨다. 암피실린 100 ㎍/ml 및 IPTG 100 ㎍/ml 을 함유하는 L - 브로쓰내에서 상기 균주를 37 ℃ 에서 16 시간 동안 배양시킨다. 이 배양액 100 ml 로 부터 세균 세포를 회수한 다음, 10 ml 의 부피까지 0.1 M KPB (pH 7.0) 중에 현탁시킨다. 이를 빙냉시키면서 초음파 처리한 다음, 원심 분리하여 상층액을 조효소 용액으로 수득한다. 이 조효소 용액을 사용하여, 표 3 에 나타낸 각종 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산을 기질로 하여 반응을 수행한다. 40 mM D - N - 카르바모일 - α - 아미노산 (표 3) 및 0.2 M KPB (pH 7.0) 의 2 ml 에, 상기 조효소 용액 100 ㎕ 를 첨가하고, 이를 40 ℃ 에서 20 분간 반응시키고, D - α - 아미노산의 생성량을 측정한다. 그 결과를 표 3 에 나타낸다. 또한, 아그로박테리움 종 KNK 712 (FERM BP-1900) 로 부터의 조효소 용액과 비교하였을때, JM 109 pAD 108 로부터 수득된 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산 아미도히드롤라아제의 고유 활성도가 10배 증가된다.

[실시예 7]

실시예 5 에서 수득된 플라스미드 pPD 304 를 사용하여 에스케리키아 콜리 JM 109 를 형질 전환시킨다. 이 균주로부터 실시예 6 에서와 동일한 방법으로 조효소 용액을 수득한다. 이 조효소 용액을 사용하여, 실시예 6 에서와 동일한 방식으로 반응을 수행한다. 그 결과를 표 3 에 나타낸다. 슈도모나스 sp. KNK 003A (FERM BP-3181) 로부터의 조효소 용액과 비교하였을때, JM 109 pPD 304 로부터 수득된 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산 아미도히드롤라아제의 고유 활성도가 40 배 증가된다.

[실시예 8]

형질 전환 균주에서 수득된 효소를 사용한 D - N - 카르바모일 - 파라히드록시페닐글리신의 D - 파라히드록시페닐글리신으로의 전환 : -

실시예 4 에서 수득된 플라스미드 pAD 108 을 사용하여 에스케리키아 콜리 JM 109 를 형질 전환시킨다. 이 균주를 실시예 6 에서와 동일한 방식으로 배양시킨다. 배양액 100 ml 로부터 세균 세포를 회수하고, 0.1 M KPB (pH 7.0) 로 세척한 후, 이를 5 % D - N - 카르바모일 - 파라히드록시페닐글리신, 0.05 % 트리톤 X - 100, 및 0.1 M KPB (pH 7.0) 의 100 ml 에 현탁시킨 다음, 40 ℃ 에서 20 시간 동안 교반하면서 반응을 일으킨다. 이렇게 수득된 반응 혼합물을 6000 rpm 에서 10 분 동안 원심 분리하여 세균 세포를 제거하고, 진한 염산의 첨가에 의해 pH 를 2.7 로 저하시킨 다음, 양이온 교환 수지 IR - 120B (H⁺형) 상에 흡착시키고, 5 % NH₄OH 로 용출시킨다. 이어서, 용출액을 IRC - 84 (H⁺형) 로 탈염시키고, AF 수지로 탈색한다. 탈색된 용액을 농축하여 결정화하고, 침착된 결정을 물에서 재결정하여 백색 분말 3.8 g 을 수득한다. 이 결정들은 고유 광회전도 [α]²⁰= -158 (c = 1, 1N HCl) 을 나타내고, TLC 상에 한개의 점으로 나타나며, IR 스펙트럼은 D - 파라히드록시페닐글리신 표준의 것과 일치한다.

[실시예 9]

고정된 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산 아미도 히드롤라아제의 제조:-

pAD 108 로 형질 전환된 에스케리키아 콜리 JM 109 의 균주로부터 실시예 6 에서와 동일한 방법으로 수득된 배양액 200 ml 를 회수한 후, 0.1 M KPB (pH 7.0) 로 세척하고, 0.1 M KPB (pH 7.0) 20 ml 에 현탁시킨 다음, 세균 세포를 초음파 처리한다. 붕괴된 세균 세포의 현탁액을 12000 rpm 에서 20 분간 원심 분리하여 상층액을 조효소 용액으로 수득한다. 이 조효소 용액에, 0.1 M KPB (pH 7.0) 로 평형화된 2 g 의 음이온 교환 수지 듀올라이트 A - 568 을 첨가하고, 4 ℃ 에서 15 시간 동안 교반하여, 효소를 여기에 흡착시킨다. 0.1 % 의 최종 농도를 갖도록 이 용액에 글루타르알데히드를 첨가하고, 1 시간 동안 교반한 다음, 가교 처리한 후, 여과에 의해 수지를 수집하고, 0.1 M KPB 로 세척하여, 고정된 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산 아미도히드롤라아제 2 g 을 얻는다.

[실시예 10]

고정화 효소를 사용한 D - N - 카르바모일 - 파라히드록시페닐 글리신의 D - 파라히드록시페닐글리신으로의 전환 : -

실시예 9 에서 수득된 고정화 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산 아미도히드롤라아제 2g 을 2% D - N - 카르바모일 - 파라히드록시페닐글리신 및 0.1 M KPB (pH 7.0) 의 100 ml 에 첨가하고, 1 N HCl 첨가에 의해 pH 를 7.0 으로 유지시키면서 40 ℃ 에서 20 시간 동안 교반하여 반응을 일으킨다. 반응 후에, 혼합물을 정치시키고, 반응 혼합물을 흡인 수집한 후, 생성 아미노산을 실시예 8 에서와 동일한 방법으로 정제하여, d -파라히드록시페닐글리신 1.5 g 을 수득한다.

[실시예 11]

아그로박테리움 종 KNK 712 (FERM BP-1900) 에서 유래되고, D - N - 카르바모일 - α - 아미노산을 상응하는 D - α - 아미노산으로 전환시킬 수 있는 효소의 유전자에 대한 DNA 염기 서열의 분석 : -

아그로박테리움 종 KNK 712 (FERM BP - 1900) 에서 유래된 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산 아미도히드롤라아제 (이하, 아미도히드롤라아제 라고함) 의 유전자를 함유하는 플라스미드 pAD 108 을 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI 및 Hind III (Takara Shuzo Co., Ltd. 제품) 으로 소화시키고, 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 1.8 kb DNA 단편을 분리해낸다. 이 단편을 각종 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키고, T 4 - DNA 리가아제(Takara Shuzo Co., Ltd. 제품) 을 사용하여 M13mp18 또는 M13mp19 에 결찰시킨 후, 이것으로 에스케리키아 콜리 JM 109 를 감염시키면 플라그가 형성된다. 한개의 플라그를 1 % JM 109 를 접종시킨 2 YT 배지 (박토트립톤 (Difco Co.) 16 g/ℓ, 효모 추출물 (Difco Co.) 10 g/ℓ, 및 NaCl 5 g/ℓ) 1.5 ml 에 접종시키고, 이를 37 ℃ 에서 5 시간 동안 진탕 배양한다. 원심 분리후에, 20 % 폴리에틸렌 글리콜 6000 및 25 M NaCl 용액 200 ㎕ 를 상층액에 첨가하고, 실온에서 15 분간 정치시킨후, 원심 분리에 의한 침전물로 파아지 입자를 회수한다. 이것을 100 ㎕ 의 TE 용액 [10 mM 트리스 HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA] 에 용해시키고, 50 ㎕ 의 페놀 (TE 용액으로 포화시킴) 로 추출한 후, 3 M 아세트산 나트륨 용액 10 ㎕ 및 에탄올 250 ㎕ 를 첨가하고, -20 ℃ 에서 밤새 정치시킨 다음 원심 분리한다. 건조후에 침전물을 TE 용액 50 ㎕ 에 용해시킨다. 이어서, 용액 7 ㎕ 를 반응에 사용하고, 전기 영동하며, SEQUENASE (등록 상표) ver. 2 를 사용하여, 그의 사용 안내서에 따라서 DNA 서열 키트(United States Biochemical Corp. 제품) 에 의해 방사성 사진 촬영한다. 얻어진 결과로부터, 균주 KNK 712 에 대한 아미도히드롤라아제 유전자의 DNA 염기 서열이 첨부된 서열 표에서 SEQ ID No.1 로 나타낸 바와 같이 결정된다.

[실시예 12]

슈도모나스 sp. KNK 003 A (FERM BP-3181) 에서 유래되고, D - N - 카르바모일 - α - 아미노산을 상응하는 D - α -아미노산으로 전환시킬 수 있는 효소의 유전자에 대한 DNA 염기 서열 분석 : -

균주 KNK 003 A 에서 유래된 아미도히드롤라아제 유전자를 함유하는 플라스미드 pPD 304 를 제한 엔도뉴클레아제 BamHI 및 HindIII (Takara Shuzo Co., Ltd 제품) 으로 소화시키고, 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 1.8 kb DNA 단편을 분리한다. 이 단편을 각종 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키고, T4-DNA 리가아제 (Takara Shuzo Co., Ltd.) 를 사용하여 M13mp18 또는 M13mp19 에 결찰시킨 후, 이것으로 에스케리키아 콜리 JM 109 를 감염시키면 플라그가 형성된다. 하나의 플라그를 1 % JM 109 를 접종한 2YT 배지 (박토트립톤 (Difco Co.) 16 g/ℓ, 효모 추출물 (Difco Co.) 10 g/ℓ 및 NaCl 5 g/ℓ) 1.5 ml 에 접종시키고, 37 ℃ 에서 5 시간 동안 진탕 배양한다. 원심 분리후에, 200 ㎕ 의 20 % 폴리에틸렌 글리콜 6000 및 25 M NaCl 용액을 상충액에 첨가하고 실온에서 15 분간 정치한 후, 원심 분리에 의해 파아지 입자를 침전물로 회수한다. 이것을 100 ㎕ 의 TE 용액 [10mM 트리스 HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA] 에 용해시키고, 페놀 (TE 용액으로 포화) 50 ㎕ 로 추출한 후, 3 M 아세트산 나트륨 용액 10 ㎕ 및 에탄올 250 ㎕ 를 첨가하고, -20 ℃ 에서 밤새 정치한 다음 원심 분리한다. 건조 후에, 침전물을 TE 용액 50 ㎕ 에 용해시킨다. 이어서, 이 용액 7 ㎕ 를 사용하여 반응시키고, 전기 영동하며, SEQUENASE (등록 상표) ver.2 를 사용하여, 그의 사용 안내서에 따라 DNA 서열 키드 (United states Biochemical Corp. 제품) 에 의해 방사성 사진 촬영 한다. 얻어진 결과로부터, 균주 KNK 003A 에서 유래된 아미도히드롤라아제 유전자의 DNA 염기 서열이 첨부된 서열 표에서 SEQ ID No. 2 로 나타낸 것과 같이 결정된다.

[실시예 13]

아그로박테리움 종 KNK 712 (FERM BP - 1900) 에서 유래된 D - N - 카르바모일 - α - 아미도히드롤라아제의 정제 : -

아그로박테리움 종 KNK 712 (FERM BP - 1900) 를 표 4 의 배지에서 33 ℃ 에서 25 시간 동안 배양한다.

물을 1ℓ의 부피까지 첨가한다 (pH 6.5).

상기 배양액 21ℓ를 회수하고, 세균 세포를 초음파 처리한다. 원심분리에 의해 잔류물을 제거한 후, 프로타민 설페이트 처리 (0.1 ㎎/㎎ 단백질) 에 의해 핵산을 제거한다. 원심 분리 상층액을 50 ℃ 에서 20 분 동안 열처리하고, 침전물을 제거한 후, 암모늄 설페이트를 첨가하여 단백질을 침전시키고, 15 내지 35 % 포화 암모늄 설페이트와 함께 침전된 활성 단백질 분획을 회수한다. 이 분획을 용해시키고, DEAE -5pw 컬럼(Toso Co., Ltd. 제품) 을 사용하여 HPLC 한 다음, NaCl 의 농도 구배로 용출시켜, 활성 분획을 회수한다. 이 단계에서, 붕괴된 세균 세포의 현탁액과 비교하면, 아미도히드롤라아제의 고유활성도가 약 20 배 증가한다. 이 분획을 SDS - 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 분석할 때, 이 아미도히드롤라아제는 분자량 약 35,000 에 상응하는 위치 근처로 이동한다.

[실시예 14]

아그로박테리움 종 KNK 712 (FERM BP - 1900) 에서 유래된 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산 아미도히드롤라아제의 단백질 아미노 말단 부근의 아미노산 서열 결정 : -

실시예 13 에서 수득된 아그로박테리움 종 KNK 712 (FERM BP - 1900) 에 의해 생성되는 정제 아미도히드롤라아제 제제를 역상 HPLC 컬럼 (AP - 303 ; YMC Co. 제조) 에 넣고, 아세토니트릴의 농도 구배로 용출시킨다. 아미도히드롤라아제를 함유하는 분획을 분석을 위해 기체상 단백질 서열 분석기 (Applied Biosystems Co., Ltd. 제품) 내에 넣고 분석하면, 아미도히드롤라아제는 첨부된 서열 표에서 SEQ ID - No. 1 의 1 내지 20 번째 아미노산으로 구성된 서열을 아미노 말단 부위에 갖는 단백질임을 알 수 있다.

[실시예 15]

슈도모나스 sp. KNK 003A (FERM BP - 3181) 에서 유래된 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산 아미도히드롤라아제의 정제 : -

슈도모나스 sp. KNK 003A (FERM BP - 3181) 를 표 5 의 배지에서 45 ℃ 에서 3 일간 배양한다.

물을 1ℓ 부피까지 첨가한다 (pH 7.0).

배양액 26ℓ를 회수하고, 실시예 13 에서와 동일한 방식으로 하기 조작을 수행한다 : 세균 세포의 초음파 처리 ; 프로타민 설페이트 처리에 의한 핵산 제거 ; 열처리 (65 ℃, 20 분) ; 암모늄 설페이트 침전에 의한 분획화 (아미도히드롤라아제 활성을 갖고 50 내지 70 % 포화 암모늄 설페이트로 침전된 단백질 분획의 분리) ; 및 DEAE -5pw 컬럼을 사용한 HPLC. 이 활성 분획들은 Biogel - HT (Bio - Rad Laboratories Co., Ltd) 에 흡착시키고, 암모늄 설페이트의 농도 구배로 용출시킨 후, 활성 분획을 농축하고 세파크릴 S - 300 (Pharmacia LKB Biotechnology Co., Ltd.) 컬럼을 사용하여 겔 여과한다.

이어서, 등전 집중법 (pH 4 내지 6.5) 을 수행할때, 상기 아미도히드롤라아제는 pH 5.7 위치 근처로 이동하며, 활성을 갖는 이 밴드 위치의 겔을 잘라내어, 이로부터 단백질을 추출한다. 이 단계에서, 붕괴된 세균 세포의 현탁액과 비교하면, 아미도히드롤라아제의 고유 활성도가 약 100 배 증가한다. 이 시료를 SDS - 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 분석할때, 아미도히드롤라아제는 약 38,000 의 분자량에 상응하는 위치 근처로 이동한다. 또한, 이 시료를 세파크릴 S - 200 컬럼을 사용하여 겔 여과할 때, 약 67,000 의 분자량에 상응하는 위치에서 용출된다.

[실시예 16]

슈도모나스 sp. KNK 003A (FERM BP - 3181) 에서 유래된 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산 아미도히드롤라아제의 단백질 아미노 말단 부근의 아미노산 서열 결정 : -

실시예 15 에서 수득된 슈도모나스 sp. KNK 003A (FERM BP - 3181) 로 부터의 정제된 아미도히드롤라아제 제제를 역상 HPLC 컬럼에 넣고, 아세토니트릴의 농도 구배로 용출시킨다. 아미도히드롤라아제를 함유하는 분획을 기체상 단백질 서열 분석기에 넣고 분석하면, 아미도히드롤라아제가 첨부된 서열 표에서 SEQ ID No. 2 의 1 내지 20 번째 아미노산으로 구성된 서열을 아미노 말단 위치에 갖는 단백질임을 알 수 있다.

[실시예 17]

형질 전환된 에스케리키아 콜리 에 의해 생성된 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산 아미도히드롤라아제의 정제 : -

실시예 4 에서 수득된 에스케리키아 콜리 JM 109. pAD 108 및 실시예 5 에서 수득된 에스케리키아 콜리 JM 109 pPD 304 를 실시예 6 에서와 동일한 방법에 의해 배양한다. 각 배양액으로부터 세균 세포를 원심 분리에 의해 수집하고, 초음파 처리한다. 잔류물을 제거한 후, 이 조효소 용액을 SDS - 폴리아크릴 아미드 전기 영동으로 분석한다. 에스케리키아 콜리 JM 109 pAD 108 의 배양 및 붕괴된 세균 세포 현탁액에 있어서, 아미도히드롤라아제는 약 35,000 의 분자량에 상응하는 위치로 이동하며, 염색후 덴시토미터에 의해 분석하면 아미도히드롤라아제가 세균 세포의 총 가용성 단백질의 약 50 % 에 달함을 알 수 있다. 또한, 에스케리키아 콜리 JM 109. pPD 304 의 배양 및 붕괴된 세균 세포 현탁액에 있어서, 아미도히드롤라아제는 약 38,000 의 분자량에 상응하는 위치로 이동하며, 염색후 덴시토미터에 의해 분석하면, 아미도히드롤라아제의 양이 세균 세포의 총 가용성 단백질의 약 15 % 에 달함을 알 수 있다.

[실시예 18]

형질 전환 에스케리키아 콜리에 의해 생성된 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산 아미도히드롤라아제의 단백질 아미노 말단 서열의 결정 : -

실시예 17 에서 수득된 에스케리키아 콜리 JM 109. pAD 108 의 배양 및 붕괴된 세균 세포 현탁액을 50 ℃ 에서 30 분간 열 처리하고, 원심 분리에 의해 침전물을 제거한 후, 암모늄 설페이트를 첨가하여 30 % 포화도를 제공함으로써 단백질 침전을 일으킨다. 침전된 단백질을 원심 분리에 의해 제거하고, 탈이온수에 용해시킨 다음, NAP - 10 컬럼(Pharmacia LKB Biotechnology Co., Ltd.) 을 사용하여 탈염시키고, 기체상 단백질 서열 분석기에 넣는다. 수득된 결과로부터, 대략 동일한 양으로 혼합 단백질이 존재함을 알 수 있으며, 그중 하나는 첨부된 서열 표에서 SEQ ID No. 1 의 1 내지 16 번째 아미노산으로 구성된 서열을 아미노 말단부에 갖고, 다른 하나는 상기 서열의 아미노 말단에 추가로 메티오닌 잔기가 부착된 아미노 말단부의 서열을 갖는다.

[발명의 효과]

상술된 바와 같이, 본 발명은 유전자 기술을 사용함으로써 D - N - 카르바모일 - α - 아미노산으로부터 D - α - 아미노산을 고 효율로 제조할 수 있다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 본 발명의 의해 수득된 플라스미드 pADH 101 의 제한 엔도뉴클레아제 지도를 나타낸다.

제2도는 본 발명의 의해 수득된 플라스미드 pPHD 301 의 제한 엔도뉴클레아제 지도를 나타낸다.

제3도는 본 발명의 의해 수득된 플라스미드 pAD 108 의 제한 엔도뉴클레아제 지도를 나타낸다.

제4도는 본 발명의 의해 수득된 플라스미드 pPD 304 의 제한 엔도뉴클레아제 지도를 나타낸다.

[서열 표]

Claims

첨부된 서열표에서 SEQ ID No.1 에 나타낸 1 내지 303 번째 아미노산의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 단편.
첨부된 서열표에서 SEQ ID No.1 의 167 내지 232 번째 염기의 염기 서열 또는 이에 상응하는 염기 서열이 제1항에 따른 DNA 단편의 5'말단의 상류쪽에 부착된 DNA 단편.
첨부된 서열표에서 SEQ ID No.1 의 1 내지 1785 번째 염기의 염기 서열 또는 이에 상응하는 염기 서열을 가지는 DNA 단편.
아그로박테리움 sp. KNK 712 (FERM BP - 1900) 에서 유래되는 D-N-카르바모일-α- 아미노산 아미도히드롤라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편과 플라스미드 pUC 18 또는 pUC 19 의 재조합에 의해 수득된 재조합 플라스미드.
제1도 및 제3도의 제한 엔도뉴클레아제 지도중의 하나를 갖는 재조합 플라스미드.
제1항 내지 제3항의 DNA 단편과 플라스미드 벡터를 함유하는 재조합 플라스미드.
제6항에 있어서, 플라스미드 벡터는 pUC 18 또는 puC 19 인 것을 특징으로 하는 재조합 플라스미드.
D-N-카르바모일-α-아미노산을 상응하는 D-α-아미노산으로 전환시킬 수 있는 효소를 코딩하는 유전자를 가진 DNA 단편 및 벡터 DNA 로 구성된 재조합 DNA를 포함하며, 여기서 유전자는 아그로박테리움 종 KNK 712(FERM BP-1900)에서 유래되는 것을 특징으로 하는 미생물.
제8항에 있어서, 재조합체를 포함하는 상기 미생물이 에스케리키아, 슈도모나스, 플라보박테리움, 바실러스, 세라티아, 코리네박테움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 미생물에서 선택되는 미생물.
제8항에 있어서, 상기 재조합 DNA는 제1도 및 제3도의 제한 엔도뉴클레아제 지도중의 하나인 것을 특징으로 하는 미생물.
제5항 또는 제6항의 재조합 플라스미드를 포함하는 미생물.
제9항에 있어서, 재조합 DNA를 포함하는 상기 미생물이 에스케리키아 콜리 JM 109 pAHD 101 또는 에스케리키아 콜리 JM 109 pAD 108 (FERM BP - 3184) 인 미생물.
첨부된 서열표에서 SEQ ID No.1 의 1 내지 303 번째 아미노산의 아미노산 서열을 가지는 효소 단백질.
제8항 내지 제12항중 어느 한항의 미생물에 의해 제조된 D-N-카르바모일-α-아미노산 아미도히드롤라아제가 그 효소를 담지할 수 있는 고정화용 지지체상에 고정됨을 특징으로 하는 고정화 효소.
제13항의 효소 단백질이 그 효소를 담지할 수 있는 고정화용 지지체상에 고정됨을 특징으로 하는 고정화 효소.
D-N-카르바모일-α-아미노산을 그의 카르바모일기의 제거에 의해 상응하는 D-α-아미노산으로 전환시킬 수 있는 효소를 코딩하는 유전자를 가진 DNA 단편 및 벡터 DNA 로 구성된 재조합 DNA 로, 에스케리키아, 슈도모나스, 플라보박테리움, 바실러스, 세라티아, 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 미생물에서 선택된 숙주 세균 세포를 형질전환시킴으로써 수득되는 형질 전환체를 사용하며, 여기서 유전자는 아그로박테리움 종 KNK 712(FERM BP-1900)에서 유래되는 것을 특징으로 하는 D-N-카르바모일-α-아미노산 아미도히드롤라아제의 제조방법.
제16항에 있어서, D-N-카르바모일-α-아미노산이 하기 일반식의 화합물인 방법 :

R - CH (NHCONH₂) - COOH

상기 식중에서, R 은 페닐, 히드록시로 치환된 페닐, 알킬, 치환된 알킬, 아르알킬 또는 티에틸이다.
제8항 내지 제11항중 어느 한항의 형질전환체를 사용하는 것을 특징으로 하는 D-N-카르바모일-α-아미노산 아미도히드롤라아제의 제조방법.
D-N-카르바모일-α-아미노산을 그의 카르바모일기의 제거에 의해 상응하는 D-α-아미노산으로 전환시킬 수 있는 효소를 코딩하는 아그로박테리움 종 KNK 712 (FERM BP-1900)에서 유래된 유전자를 가진 DNA 단편 및 벡터 DNA 로 구성된 재조합 DNA 를 사용하여, 에스케리키아, 슈도모나스, 플라보박테리움, 바실러스, 세라티아, 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 미생물에서 선택된 숙주 세균 세포를 형질전환시킴으로써, 수득되는 형질 전환체에 의해 생성된 상기 효소의 작용을 받아 수성매질 중에서 D-N-카르바모일-α-아미노산을 상응하는 D-α-아미노산으로 전환시킨 다음, 생성된 D-α-아미노산을 수집함을 특징으로 하는 D-α-아미노산의 제조방법.
제19항에 있어서, D-N-카르바모일-α-아미노산이 하기 일반식의 화합물인 방법 :

R - CH (NHCONH₂) - COOH

상기 식중에서, R 은 페닐, 히드록시로 치환된 페닐, 알킬, 치환된 알킬, 아르알킬, 또는 티에닐이다.
제19항 또는 제20항에 있어서, 형질전환체에 의해 생성된 효소를 상기 형질 전환체, 세균 세포, 처리된 세균 세포, 세균 세포에서의 추출물, 고정화 세균 세포, 또는 고정화 효소의 배양액으로 사용하는 방법.
제13항 내지 제15항중 어느 한항의 효소의 작용을 받아 수성매질 중에서 D-N-카르바모일-α-아미노산을 상응하는 D-α-아미노산으로 전환시키는 것을 특징으로 하는 D-α-아미노산의 제조방법.
제8항 내지 제11항중 어느 한항의 형질전환체에 의해 제조된 효소의 작용을 받아 수성매질 중에서 D-N-카르바모일-α-아미노산을 상응하는 D-α-아미노산으로 전환시키는 것을 특징으로 하는 D-α-아미노산의 제조방법.