JPH0510076B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は新規微生物を用いるＬ−スレオニンの
製法に関する。 〔従来技術〕 Ｌ−スレオニンは必須アミノ酸の一つであり医
薬品、食品添加物、飼料添加物として有用なアミ
ノ酸である。 Ｌ−スレオニンを発酵法によつて製造する方法
としては種々の微生物の突然変異株を用いる方法
が知られており、セラチア属微生物を用いる方法
としては各種の変異株、例えばスレオニン分解酵
素欠損性でかつスレオニン代謝拮抗物質に耐性の
変異株、或いは更にかかる微生物にリジン代謝拮
抗物質又は／及びメチオニン代謝拮抗物質に対す
る耐性を付与した変異株が用いられる（特公昭52
−48195号、特開昭56−134993号）。 〔解決すべき技術的課題〕 しかしながらこれらの変異株のＬ−スレオニン
生産能は充分工業的に高いとは云えず、よりＬ−
スレオニン生産能の高い微生物を用いてより効率
的にＬ−スレオニンを生産し得る方法が望まれて
いた。 〔発明の構成及び効果〕 本発明はこのような課題を解決したものであつ
て、Ｌ−スレオニン生産能を有するセラチア マ
ルセツセンスから、Ｌ−スレオニン生産に関与す
る４つの酵素即ちアスパルトキナーゼ、ホモセリ
ンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ及びス
レオニンシンターゼの遺伝情報を担うデオキシリ
ボ核酸（以下、DNAと称する）を切り出しベク
タープラスミドに組み込んだのち、セラチア マ
ルセツセンスに移入することによりＬ−スレオニ
ン生産能の高い微生物の調製に成功するととも
に、該微生物を用いることによりＬ−スレオニン
を工業的有利に製造し得ることを見出し本発明を
完成したものである。かかる本発明はＬ−スレオ
ニン生産能を有するセラチア マルセツセンスか
ら採取したアスパルトキナーゼ、ホモセリンデヒ
ドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ及びスレオニ
ンシンターゼの遺伝情報を担うDNAを含む染色
体フラグメントをベクタープラスミドpLG339に
組み込んだハイブリツドプラスミドをセラチア
マルセツセンスに含有せしめた微生物を培地で培
養して、培地中にＬ−スレオニンを生成蓄積せし
め、これを採取することを特徴とするＬ−スレオ
ニンの製法である。 本発明微生物の調製 （染色体DNAおよびその調製） 本発明において、アスパルトキナーゼ、ホモセ
リンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ及び
スレオニンシンターゼの遺伝情報を担うDNAは
フイードバツク阻害から解除されている変異型で
あるのが好ましい。 かかるDNAを含む染色体フラグメント（以下、
染色体DNAと称する）としてはセラチア マル
セツセンスのＬ−スレオニン生産能を有する微生
物から採取された染色体DNAであればいかなる
微生物から採取された染色体DNAであつてもよ
く、野生株の他公知のＬ−スレオニン生産性変異
株、例えば各種アミノ酸（イソロイシン、リジ
ン、メチオニン、ジアミノピメリン酸等）要求
性、スレオニン分解酵素（Ｌ−スレオニン脱水素
酵素、Ｌ−スレオニンデアミナーゼ等）欠損性を
付与されるか、あるいはアスパルトキナーゼ及び
ホモセリンデヒドロゲナーゼに対するスレオニン
によるフイードバツク阻害が解除されている変異
株もしくはこれから更に変異誘導せしめたもので
あつてもよい。かかる染色体DNA供与微生物の
具体例としては例えばセラチア マルセツセンス
HNr1001（微工研菌寄第3121号）、セラチア マ
ルセツセンスHNr21〔アプライド アンド イン
バイロンメンタル マイクロバイオロジー
（Appl.Environ.Microbiol.）35，834（1978）〕、セ
ラチア マルセツセンスＰ−103（微工研菌寄第
5413号）、セラチア マルセツセンスＤ−60〔ジヤ
ーナル オブ バクテリオロジー（J.Bacteriol.）
135，318（1978）〕から誘導されＬ−リジン存在下
でＬ−スレオニンによる生育阻害をうけないセラ
チア マルセツセンスTLr155及びこの菌株から
形質導入操作法により誘導されるセラチア マル
セツセンスＴ−1111、さらにはＴ−1111から形質
導入操作法により誘導されるセラチア マルセツ
センスＴ−1164があげられる。 これらの微生物から染色体DNAを採取するに
は例えば微生物菌体をリゾチーム処理、界面活性
剤〔SDS，ザルコシル（Ｎ−ラウロイルサルコシ
ン酸ナトリウム）等〕で処理したのち、除蛋白し
ついでエタノール沈澱せしめる常法〔ジヤーナル
オブ モレキユラー バイオロジー（J.Mol.
Biol.）３，208，（1961）；（ビオシミ エ ビオ
フイジ アクタ（Biochim.Bihys.Acta.）72，
619（1963）〕により容易に実施することができる。 （ベクタープラスミドDNA及びその調製） 上記の如き染色体DNAを組み込むベクタープ
ラスミドとしてはセラチア属に属する微生物へ移
入でき、かつ移入微生物中で複製可能なプラスミ
ドであればよく特に限定されないが、例えば
pSC101〔プロシーデイングス オブ ナシヨナル
アカデミー オブ サイエンシス ユー エス
エー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）70，3240
（1973）〕，pLG339〔ジーン（Gene）18，332
（1982）〕，pBR322〔ジーン（Gene.）２，95
（1977）〕，pBR325〔ジーン（Gene.）４，121
（1978）〕，pACYC177〔ジヤーナル オブ バク
テリオロジー（J.Bacteriol.）134，1141（1978）〕，
pKP1155〔ＦプラスミドのEcoRI f5 断片（プロ
シーデイングス オブ ナシヨナル アカデミー
オブ サイエンシス（Proc.Natl.Acad.Sci.））
73，64（1976）から複製開始点を含むＢ，Ｃ，A2
断片を切出し、これにアンピシリン耐性、クロラ
ムフエニコール耐性、スペクチノマイシン耐性、
ストレプトマイシン耐性遺伝子を結合したプラス
ミド〕を用いることができる。これらのプラスミ
ドはこれらを保持するエシエリシア コリの菌体
から〔クリヤード ライゼート（cleared
lysate）法〔遺伝子操作実験法125頁（高木康敬
著，講談社，1980）〕；モレキユラー クローニン
グ（Molecular Cloning P.86〔Maniatis et al.，
ed.，コルード スプリング ハーバー ラボラ
トリー（Cold Spring Harbor Laboratory）
（1982）〕等の常法によつて調製することができ
る。 （ハイブリツドプラスミドDNAの調製） 上記で得られた染色体DNAとベクタープラス
ミドDNAからハイブリツドプラスミドDNAを調
製するには制限エンドヌクレアーゼ（例えば
Hind，Pst，BamHI，SalI等）を用いて染
色体DNAとプラスミドDNA鎖を切断したのち、
リガーゼ（例えば、T4DNAリガーゼ、大腸菌
DNAリガーゼ等）で処理するか、或いはその切
断末端によつてはターミナルトランスフエラー
ゼ、DNAポリメラーゼ等で処理したのちリガー
ゼを作用させてDNA鎖を結合する等の常法〔メ
ソツズ イン エンザイモロジー（Menthods in
Enzymology）69，41（1979）、遺伝子操作実験法
135頁（高木康敬著，講談社，（1980）〕により実
施することができる。 かくして得られたハイブリツドプラスミド
DNAはそのまま形質転換に用いることもでき、
又ハイブリツドプラスミドDNAを各種の変異を
有する変異株に移入して目的とするハイブリツド
プラスミドDNAを保持する菌株を予め選択した
のち該菌株からハイブリツドプラスミドを常法に
より抽出しこれを宿主微生物に移入することもで
き、かかる方法によるときは形質転換株の選択が
容易であり好ましい。かかる目的に用いる変異株
としては例えばセラチア属、エシエリシア属に属
する微生物であつてＬ−スレオニン生産能を有し
ない微生物であるか、アンピシリン感受性、カナ
マイシン感受性等の変異の一部または全部を有す
る変異株があげられ、例えばエシエリシア コリ
Ｋ−12C600r^-m^-（ATC33525）を好適に用いる
ことができる。 （宿主微生物） ハイブリツドプラスミドDNAを含有せしめる
宿主微生物としてはセラチア属に属し、形質転換
可能な微生物であればよく、前記染色体DNAの
供与微生物として例示したものをいずれも用いる
ことができる。 （ハイブリツドプラスミドDNAによる形質転換） 形質転換方法は例えば低温下に宿主微生物細胞
を塩化カルシウム溶液で処理し、菌体の膜透過性
を増大させ、ハイブリツドプラスミドDNAを宿
主微生物中に取り込ませる方法〔ジヤーナル オ
ブ モレキユラー バイオロジー（J.Mol.Biol.）
53，159（1970）〕等の常法を採用することができ
る。 かくして得られた形質転換株のうち、目的とす
るハイブリツドプラスミドを含有する菌株の選択
は成育したコロニーのうちＬ−スレオニン分泌能
を要する菌株を釣菌・分離することにより実施で
きる。 かくすることにより本発明に係る微生物、即
ち、Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物から採
取したアスパルトキナーゼ、ホモセリンデヒドロ
ゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ及びスレオニンシ
ンターゼの遺伝情報を担うDNAを含む染色体フ
ラグメントを組み込んだハイブリツドプラスミド
を含有せしめたセラチア マルセツセンスを得る
ことができる。 かかる微生物としては具体的に例えばセラチア
マルセツセンス（Serratia marcescens）
TA5011（微工研菌寄第7817号）、セラチア マル
セツセンス（Serratia marcescens）TA5012（微
工研菌寄第7818号）、セラチア マルセツセンス
（Serratia marcescens）TA5013（微工研菌寄第
7819号）等があげられる。 Ｌ−スレオニンの製法 かくして得られた微生物を培地で培養し、培地
中に生成蓄積せしめたＬ−スレオニンを採取する
ことによりＬ−スレオニンを製することができ
る。 本発明において使用されるＬ−スレオニン生産
用培地としては、炭素源としてブドウ糖、蔗糖、
糖蜜の如き糖類、フマール酸、クエン酸の如き有
機酸、グリセロールの如きアルコール類等を10〜
20％、窒素源として酢酸アンモニウムの如き有機
アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウムの如き無機アンモニウム塩、尿素等を１〜
２％、有機栄養物としてコーンステイープリカ
ー、ペプトン、酵母エキス等を０〜１％の範囲で
それぞれ適当量含有する培地を好適に用いること
ができる。これらの他にリン酸カリウム、硫酸マ
グネシウム等を少量加え、更に培地のPHを６〜８
に保つため酢酸カルシウムあるいは必要に応じア
ンモニアを添加してもよい。また更にこのような
培地にスレオニン生合成に関与する物質、例えば
Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−リジ
ン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン等を適宜
添加した培地を使用することもできる。 本発明によれば、上記培地に本発明の微生物を
接種し、25〜40℃にて振とうあるいは通気攪拌の
如き好気的条件下で２〜６日間培養することによ
つて培地中にＬ−スレオニンを著量蓄積せしめる
ことができる。生成したＬ−スレオニンは培養終
了後菌体その他の不溶物を除去したのち、例えば
イオン交換樹脂に吸着せしめ、アンモニア水で溶
離し、これを濃縮・結晶化するなどの通常の分離
精製操作によつて容易に採取することができる。 以下、実施例および参考例をあげて本発明を説
明するが、実施例中Ｌ−スレオニンの確認はペー
パークロマトグラムのニンヒドリン反応によつて
行い、その定量はロイコノストツク・メセンテロ
イデスＰ−60によるバイオアツセイによつて行つ
た。 実施例 １ (1) 染色体DNAの調製 後記参考例１で得たセラチア マルセツセンス
TLr155をＬ−ブロス（ペプトン１％、酵母エキ
ス0.5％、塩化ナトリウム0.5％、PH7.2）１に接
種し、30℃で４時間振とう培養し対数増殖期の菌
体を遠心分離により集めた。この菌体をリゾチー
ム処理、SDS処理して溶菌し、フエノール処理に
より除蛋白したのちエタノール処理して染色体
DNAを沈澱させた。ついでRNase（最終濃度
10μg／ml）を加え、37℃で１時間処理して染色
体DNAを精製することによつて染色体7.2mgを得
た。 (2) ベクタープラスミドDNAの調製 エシエリシア コリＫ−12C600株にプラスミ
ドpLG339を含有させた菌株、〔ジーン（Gene）
18，335（1982）〕Ｌ−グリコース0.2％を含有する
Ｌ−ブロス800mlに接種し、37℃で７時間振とう
培養した後、菌体を遠心分離により集めた。つい
で得られた菌体をリゾチーム処理、SDS処理して
溶菌させた後、最終1Mとなるように酢酸ナトリ
ウムを加えて100000×ｇ，30分の遠心分離を行つ
た。ついで上清を採取しフエノール処理した後、
エタノールを加え、遠心分離してDNAを沈澱さ
せた。沈澱したDNAを10mMトリス塩酸−
1mMEDTA溶液（PH7.5）に溶解し、塩化セシウ
ム・エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心法に
より分離精製することによつて0.9mgのベクター
プラスミドpLG339DNAを得た。 (3) ハイブリツドプラスミドDNAの調製 前記(1)で得られた染色体DNA20μgに制限エン
ドヌクレアーゼSalIを通常条件で作用させDNA
鎖を部分的に切断した。又、上記(2)で得たベクタ
ープラスミドDNA7μgにSalIを通常条件で作用さ
せDNA鎖を完全に切断した。65℃、10分間の熱
処理後、両反応液を混合しT4フアージ由来の
DNAリガーゼを通常条件で作用させDNA鎖を連
結させた。 (4) スレオニン生産能を有するハイブリツドプラ
スミドDNAの選択 制限エンドヌクレアーゼ欠損性かつホモセリン
キナーゼの欠損性エシエリシア コリＫ−
12C600r^-m^-（ATCC33525）をＬ−ブロス50mlに
接種し、37℃で振とう培養しその対数増殖期の中
期まで生育せしめた菌体を集菌した。ついで氷冷
した0.1M塩化マグネシウム溶液50mlにけん濁し
たのち集菌し、氷冷した0.1M塩化カルシウム溶
液５mlにけん濁した。この細胞けん濁に(3)で得た
DNA溶液を加えて30分間氷冷したのち42℃で２
分間熱処理することによりDNAを細胞内にとり
こませた。ついでこのけん濁液にＬ−ブロス50ml
を加え37℃で１時間振とう培養して遠心分離し、
菌体を生理食塩水５mlにけん濁した。このけん濁
液の少量を培地（グリコース0.5％、リン酸第二
カリウム0.7％、リン酸第一カリウム0.3％、硫酸
アンモニウム0.1％、硫酸マグネシウム・７水和
物0.01％、Ｌ−ロイシン0.001M、チアミン塩酸
塩0.0005％、DL−β−ヒドロキシノルバリン0.01
％、硫酸カナマイシン0.01％、寒天1.5％）に塗
布し、37℃で３日間培養した。生じたコロニーを
釣菌分離し、ハロー法〔アプライド アンド イ
ンバイロンメンタル マイクロバイオロジー
（Appl.Environ.Microbiol.）38，1045（1979）〕に
よりスレオニン分泌能を有する菌株を選択した。
かくして得られた菌株から前記(2)と同様にしてハ
イブリツドプラスミドDNAを抽出し精製・分離
した。 (5) 形質転換株の調製 上記(4)で得たハイブリツドプラスミドDNAと
細胞外ヌクレアーゼ欠損性、制限エンドヌクレア
ーゼ欠損性のセラチア マルセツセンスTT392
〔生化学，55，1024（1983）〕を(4)と同様に処理し
てハイブリツドプラスミドDNAをTT392にとり
込ませた。ついでこの菌株を硫酸カナマイシン
100μg／mlを含むＬ−ブロス寒天培地で培養し、
生じたコロニーを釣菌分離した。この菌株をグル
コース0.2％を含むＬ−ブロス１に接種し、37
℃、18時間振とう培養した後集菌し、前記(2)と同
様に処理することによりハイブリツドプラスミド
DNA（pTA509）1.1mgを得た。 得られたpTA509とスレオニン分解酵素欠損性
を有しスレオニン生産能を有しない変異株セラチ
ア マルセツセンスＤ−60〔ジヤーナル オブ
バクテリオロジー（J.Bacteriol.，135，318
（1978）〕とを前記(4)と同様に形質転換し、硫酸カ
ナマイシン 100μg／ml含有のＬ−ブロス寒天培
地で培養することにより目的の高いスレオニン生
産能を有するセラチア マルセツセンスTA5011
（微工研菌寄第7817号）を得た。 (6) Ｌ−スレオニン生産能の確認 上記で得られたセラチア マルセツセンス
TA5011を硫酸カナマイシン0.01％含有Ｌ−ブロ
ス斜面培地に一夜培養したのち発酵培地〔尿素
1.5％、硫酸アンモニウム0.05％、第二リン酸カ
ルシウム0.1％、硫酸マグネシウム・７水和物0.1
％、Ｌ−イソロイシン0.1％、コーンステイープ
リカー0.1％および炭酸カルシウム１％を含む溶
液15mlを500ml容振とうフラスコに注入し加熱滅
菌したものにシヨ糖を15％となるように別に加熱
滅菌して添加したもの。PH7.0〕に一白金耳植菌
した。又、親株たるセラチア マルセツセンスＤ
−60を上記と同様の栄養培地に植菌した。それぞ
れ菌株を27℃で96時間往復振とう培養したときの
培地中におけるＬ−スレオニン生産量は下記第１
表の通りであつた。 【表】 尚、上記で得られたTA5011の菌体を前記(2)と
同様に処理して該菌体からハイブリツドプラスミ
ドDNAを抽出し、Sal で切断したのち生じた
DNA断片をアガロース・ゲル電気泳動法で調べ
た。その結果、ベクターpLG339をSalで切断し
た時生じる約6.2kbのDNA断片の他に約4.1kb、
約1.5kb、約0.9kbのDNA断片が認められ、
TA5011に含まれるハイブリツドプラスミド
DNAはベクターpLG339のSal切断部位に約
6.5kbの染色体DNAが組み込まれたハイブリツド
プラスミドであることが確認できた。 実施例 ２ 実施例１(5)で得たpTA509と後記参考例２で得
たセラチア マルセツセンスＴ−1111を実施例１
(5)と同様に形質転換し、硫酸カナマイシン
100μg／ml含有Ｌ−ブロス寒天培地で培養するこ
とにより目的とする形質転換株セラチア マルセ
ツセンスTA5012（微工研菌寄第7818号）を得た。 得られたセラチア マルセツセンスTA5012及
び親株たるセラチア マルセツセンスＴ−1111を
それぞれ実施例１(6)と同様の条件で培養した場合
のＬ−スレオニン生産量は下記第２表に示す通り
であつた。 【表】 実施例 ３ 実施例１(5)で得たpTA509と後記参考例３で得
たセラチア マルセツセンスＴ−1164を実施例１
(5)と同様に形質転換し、硫酸カナマイシン
100μg／ml含有Ｌ−ブロス寒天培地で培養するこ
とにより目的とする形質転換株セラチア マルセ
ツセンスTA5013（微工研菌寄第7819号）を得た。 得られたTA5013を硫酸カナマイシン0.01％含
有Ｌ−ブロス斜面培地に一夜培養したのち前発酵
培地〔シヨ糖15％、尿素1.5％、硫酸アンモニウ
ム0.05％、第二リン酸カリウム0.1％、硫酸マグ
ネシウム・７水和物0.1％、Ｌ−イソロイシン
0.04％、Ｌ−メチオニン0.04％、コーンステイー
プリカー0.1％、酵母エキス0.2％、硫酸カナマイ
シン0.01％および炭酸カルシウム１％を含む溶液
15mlを500ml容振とうフラスコに注入し、滅菌し
たもの（但し、シヨ糖は別途加熱滅菌後添加し、
硫酸カナマイシンは無菌ろ過後添加した。PH7.0）
に一白金耳植菌した。ついで27℃で24時間培養し
た。かくして得られた前培養液60mlを発酵培地
〔シヨ糖15％、尿素1.5％、硫酸アンモニウム0.05
％、第二リン酸カリウム0.1％、硫酸マグネシウ
ム・７水和物0.1％、Ｌ−イソロイシン0.04％、
Ｌ−メチオニン0.04％、コーンステイープリカー
0.1％、酵母エキス0.1％および炭酸カルシウム２
％を含む溶液1.2（但し、シヨ糖は別途加熱滅
菌後添加した。PH7.0）に接種し、2.4容ジヤー
フアーメンターで27℃、通気量1.2／分で攪拌
下に本培養した。培養開始後24時間経過毎に乾熱
滅菌（105℃、１時間）したＬ−アスパラギン酸
1.2ｇを添加した。これを３度くり返した。又、
対照としてセラチア マルセツセンスＴ−1164を
上記前培養培地（但し、硫酸カナマイシンは用い
ない）に一白金耳植菌し27℃で24時間培養して得
られる培養液を上記と同様の発酵培地に接種し、
上記と同様の条件で本培養した。 120時間後におけるそれぞれの培地中における
Ｌ−スレオニン生産量は下記第３表に示す通りで
あつた。 【表】 実施例 ４ 前記実施例３で得られたTA5013の本培養液１
を集めて滅菌処理した後、ろ過して不溶物を除
去した。ついでろ液を陽イオン交換樹脂アンバー
ライトIR−120B（H⁺）を充填したカラムに導通
した。水洗後吸収したＬ−スレオニンを５％アン
モニア水で溶出した。溶出液を減圧下に濃縮しメ
タノールを加えて冷却し析出晶をろ取した。得ら
れた結晶を含水メタノールから再結晶することに
よりＬ−スレオニン51ｇを得た。 参考例 １ セラチア マルセツセンスTLr155の調製 セラチア マルセツセンスＤ−60〔ジヤーナル
オブ バクテリオロジー（J.Bacteriol.）153，
318（1978）〕をＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジンで変異誘起処理し、栄養寒天培
地（グルコース0.5％、ペプトン1.0％、肉エキス
0.3％、酵母エキス1.0％、塩化ナトリウム0.5％、
寒天1.5％）に１平板あたり100〜300個のコロニ
ーが生じるように塗布した。生じたコロニーのう
ち、Ｌ−スレオニンによつて生育が著しく遅れる
菌株、即ちスレオニン感受性株、セラチア マル
セツセンスＤ−600をレプリカ法〔マニユアル
オブ メソツズ フオア ジエネラル バクテオ
ロジー（Mannual of Methods for General
Bacteriology，Page222ジヤーハート等、アメリ
カン ソサイエテイー フオア マイクロバイオ
ロジー（Gerhardt et al.，ed.，Amerlcan
Society for Microbiology，）（1981）〕により選
択した。得られたセラチア マルセツセンスＤ−
600をＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジンで変異誘起処理した後Ｌ−スレオニン
100mM，Ｌ−リジン100mMおよびＬ−イソロイ
シン100mMを含む最少寒天培地（グルコース0.5
％、硫酸アンモニウム0.1％、第一リン酸カリウ
ム0.3％、第二リン酸カリウム0.7％、硫酸マグネ
シウム・７水和物0.01％、寒天1.5％）１平板あ
たり１×10⁸個の細胞を塗布し、30℃で４日間培
養した。生じる大きなコロニーを釣菌分離するこ
とによりＬ−リジン存在下でＬ−スレオニンによ
る生育阻害をうけない菌株であるスレオニン耐性
株、セラチア マルセツセンスTLr155株を得た。 参考例 ２ セラチア マルセツセンスＴ−1111の調製 参考例１で得たセラチア マルセツセンス
TLr155にPS20フアージ〔ジヤパニーズ ジヤー
ナル オブ マイクロバイオロジー（Jpn.J.
Microbiol.）17，473（1973）〕を感染させ〔アプ
ライド アンド インバイロンメンタル マイク
ロバイオロジー（Appl.Environ.Microbiol.）38，
1045（1979）〕フアージ液を調製した。ついでセラ
チア マルセツセンスＥ−60〔アプライド アン
ド インバイロンメンタル マイクロバイオロジ
ー（Appl.Environ.Microbiol.）38，1045（1979）〕
の培養液と該フアージ液を混合し、30℃で30分間
放置し菌体にフアージDNAをとり込ませた。該
菌体を生理食塩水で２回洗浄して菌体を調製し
た。このけん濁液をＬ−イソロイシン1mMを含
有する最少寒天培地（参考例１）に１平板あたり
菌数が３×10⁸個となるよう塗布した。30℃で４
日間培養し生じたコロニーを釣菌分離することに
よりセラチア マルセツセンスＴ−1111を得た。 参考例 ３ セラチア マルセツセンスＴ−1164の調製 セラチア マルセツセンスＮ−16〔アプライド
アンド インバイロンメンタル マイクロバイ
オロジー（Appl.Environ.Microbiol.）45，1445
（1983）〕をＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジンで変異誘起処理し、栄養寒天培地
（参考例１）１平板あたり１〜３×10²個のコロニ
ーが生じるように塗布する。生じたコロニーにつ
いて参考例１と同様にしてレプリカ法によりイソ
ロイシン、スレオニン、アルギニン及びメチオニ
ン要求性株たるセラチア マルセツセンスＮ−31
株を選択した。 参考例２で得たセラチア マルセツセンスＴ−
1111株に紫外線照射する〔細菌、フアージ遺伝実
験法、64頁 共立出版（1972）〕ことによりフア
ージ液を調製する。ついでフアージ液と上記で得
たＮ−31株の培養液を混合し、参考例２と同様に
してフアージDNAをＮ−31株にとり込ませた。
該菌体を遠心分離した後、生理食塩水を用いて菌
体けん濁液を調製した。このけん濁液をＬ−イソ
ロイシン1mM、Ｌ−アルギニン1mMおよびＬ−
メチオニン1mMを含有するする最少寒天培地
（参考例１）に１平板あたり３×10⁸個となるよう
塗布した。30℃で４日間培養し生じたコロニーを
釣菌分離することによりセラチア マルセツセン
スＴ−1129を得た。 セラチア マルセツセンスETr17〔アプライド
アンド インバイロンメンタル マイクロバイ
オロジー（Appl.Environ.Microbiol.）45，1445
（1983）〕にpS20フアージを参考例２と同様にし
て感染させてフアージ液を調製し、参考例２と同
様にしてＴ−1129とり込ませて菌体けん濁液を調
製した。このけん濁液をＬ−イソロイシン1mM
およびＬ−メチオニン1mMを含有最少寒天培地
１平板あたり３×10⁸個となるよう塗布した。30
℃で４日間培養した後、生じたコロニーを釣菌分
離した。かくすることによりセラチア マルセツ
センスＴ−1164を得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ Ｌ−スレオニン生産能を有するセラチア マ
   ルセツセンスから採取したアスパルトキナーゼ、
   ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナー
   ゼ及びスレオニンシンターゼの遺伝情報を担うデ
   オキシリボ核酸を含む染色体フラグメントをベク
   タープラスミドpLG339に組み込んだハイブリツ
   ドプラスミドをセラチア マルセツセンスに含有
   せしめた微生物を培地で培養して、培地中にＬ−
   スレオニンを生成蓄積せしめ、これを採取するこ
   とを特徴とするＬ−スレオニンの製法。