JPS5813599A - プラスミド、その製法、ｅ・コリ−突然変異体、ｌ−プロリンの製法及び新規菌株物の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、その遺伝子の１個がＬ−プロリンの生合成の
通例存在するアロステリック阻害を失なうように変性さ
れている、Ｌ−プロリンの生合成のための遺伝子を有す
るシラスミＹの製造に関する。

更に、本発明は、Ｌ−ゾロリンを培養液中に生じさせ、
従ってこのアミノ酸の醗酵法による製造のために特に好
適である、エセリシア・コリ一種め菌株を開発するため
にこのシラスミ「を使用することに関する。ここで、こ
の細胞中のこのプラスｉｆは、Ｌ−プロリンを多量生産
する能力をまったくはじめて示すことができるか、又は
既に存在する染色体により決められている生産能力を著
るしく高めることかで會る。

更に、これらのプラスｔ）Ｐと結合して、培養液中に４
Ｉに高い濃度のＬ−プロリンを生じさせるのに好適な宿
主細胞突然変異体の製造も本発明の目的受ある。

Ｌ−グルタミン酸からのＬ−プロリンの生合成は、エセ
リ命ア・コリー（ｌ１ｌｅｃｈａｒｉａｈｉａ　０ｏｌ
ｉ）並びに種々の他の微生物中で、酵素ｒ−グルタミル
−キナーゼ（遺伝子ｐｒｏ　Ｂ　）　、　γ−グルタミ
ルホスフェートーレダクターゼ（遺伝子ｐｒ。

ム）及び１−ピロリン−５−カル？キシレートーレダク
ターゼ（遺伝子ｐｒｏ○　）により触媒作用をうける（
　Ｄ、Ｊ、Ｈａｙｚ＠ｒ及びＴｈ、Ｌｅｉａｉｎｇｅｒ
　。

Ｊ、Ｇ＠ｎ、　ＭｌａｒＯｂｉＯｌ、　　１１８巻（１
９８０年）２８７〜２９３頁参照〕。過剰のＬ−プロリ
ンは、最初の酵素のアロステリック阻害と、この反応の
最初の２つの酵素の生合成を抑制する作用をし、これＫ
より、野生製細胞中でのアミノ酸の多量生産は阻止され
る［　Ｈ，Ｉｌｉ、Ｕｍｂａｒｇ＠ｒ　。

ムｎｎ、Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｓｍ、　　４７巻（１９
７８年）５３６〜６０６頁参照〕。多数のゾロリン−代
謝拮抗物質例えば３．４−デヒｒローＤ／’Ｌ−ゾロリ
ン又はアゼチジン−２−カルボン酸に対して耐性を示し
、培養液中に少量のＬ−プロリンを生じさせる種々のエ
セリキア・コリー菌株の突然変異体は公知である。　　
　　１″′□１゛ムノ々イヒ（Ｂａ１ｃｈ　）　　及び
り、Ｊ、ピアソン（Ｐｉｓｒｓｏｎ　）のＢｉｏｏｈ＠
ｍ　、Ｂ１０ｐｈｙａ　、　ＡＯｔも１０４巻（１９６
５年）３９７〜４０４頁には、例えば、グルコース０．
５憾及びグルタミン酸０．１憾を有する媒体中でＬ−プ
ロリン約２５０〜３５０ダ／ｌを生産する菌株鳳・コＩ
Ｊ　−１７央然費異体が記載されている。これらの菌株
は、明らかにその中の遺伝子ｐｒｏ　Ｂが、相応するｒ
−グルタミル−キナーゼがＬ−ゾロリンによりもはやア
クステリックＫ１１ｌ害されないように突然変異されて
いる［：　Ｈ，Ｏｏｎａａｍｉｎｅ　、　Ａｎｎ、工ｎ
ｓｔ。

Ｐａ５ｔｅｕｒ　１２０巻（１９７１年）１２６〜１４
３頁参照］。

ところで、前記種類の代謝拮抗物質耐性の突然変異体か
ら単離され、密に隣接した遺伝子ｐｒｏ　Ａ及びｐｒｏ
　Ｂ　　を有する染色体ＤＩ日−フラグメントのクロー
ン化により、Ｌ−プロリンの製出能力を、Ｌ−プロリン
の多量生産を示さな（・多くの２・コリー薗＆に伝達す
ることのできる□ 新しく組換えられたデ゛・ラスミｒを得ることができる
ことが判明した。このプラスｆｌＦ上には、アロステリ
ック阻害能力の失なった突然肇異形の遺伝子ｐｒｏＢ（
ここで遺伝子ｐｒｏ　Ｂ　（ｎｕｔ）　　と記載する）
が存在する。この種のシラスミｒは、例１に記載の１）
８Ｂ１２１、ｐ８Ｂ　１２４及びｐ８Ｂ１２５である。

Ｌ−プロリンをシラスミドなしく染色体限定）でも製出
する１株中のＬ−ゾロリンの製出を高めることのできる
その適性を、例３の第１表中に示す（ｐＥｉＢ１２５は
ｐ８Ｂ１２４と同じ値を示した）。

本発明の目的は、まず、突然変異体２・コリー８Ｂ１を
、シラスミｙ１）　８Ｂ　１２　’の製造に使用し、か
つこのシラス（Ｐｐ８Ｂ１２１をシラスミドｐ８Ｂ１２
２、Ｐ８Ｂ１２４、ｐ８Ｂ１２５及びｐ８Ｂ１２６の製
造に使用することである。

更に本発明は、遺伝子ｐｒｏ　Ａ及びｐｒＱ　Ｂ　を有
するＤｌｉ８−配列を有するシラスミＰに関し、ここで
、ｐｒｏ　Ｂは代謝拮抗物質耐性ｒ−グルタミルーキナ
ーゼをブーｒしている失熱変異形で存在する。

Ｌ−ゾロリンの多量生産能力は、ＤＭ８の試験管内組換
え法を用いて、ｐｒｏ　Ａ及びｐｒｏ　Ｂ（ｍｕｔ、）
以外に遺伝子ｐｒｏ　ｏをも有するシラスミＶを製造す
る際に、更に高めることができる。ｐ　８Ｂ１２２．１
）８Ｂ１２り及び９日Ｂ１２＜Ｓ（これらの製造は例２
に記載）は、これらのシラスミｙｆｆｌを代表している
。これらの有利な特性は、特４Ｅ・コリー８Ｂ５（後述
）と同様にその特別な特性に基づきＬ−プロリンの高い
生産を可能とする菌株で認められる。例えば中程度の生
産を可能とする菌株２・コリー８Ｂ２における最大プロ
リン濃度及び生産性は、シラスミ）ｌｊ　ｐ８Ｂ１２２
、ｐｓＢ１２４及びｐ８Ｂ１２６に関して、相互に僅か
に異なっている（第１表）。これに反して、１−：ｙｌ
Ｊ−ＢＨ３テは、ｐＥＩＢ１２２及びｐ　８Ｂ１２６は
、ｐ８Ｂ１２４よりも着るしく良好な値を示す（例４の
第２表参照、ｐ８Ｂ１２５に関しては、ｐ８Ｂ１２２と
同じ値が認められた５゜明もかに、巨・コリー８Ｂ　５
中の構成性染色体遺伝子ｐｒｏ　ｏは、過剰に存在する
この物質代謝工程の最初の２＃素によって形成された中
間体（１−ゾロリン−５−カル？キシレート）ヲ充分迅
速［Ｌ＋−ゾロリンに変えることができる程度に充分な
１−ゾロリン−５−カルざキシレート−レダクターゼを
もはや生産しない。

従って、本発明には、遺伝子ｐｒｏム及びｐｒｏＢ（ｎ
ｕｔ、）と共に遺伝子ｐｒｏ　ｏをもそのＤＭ８　　配
列上に含有するプラスミドも包含される。

試験管内組換え及びＤＭ８のクローン化するための方法
は、種々の文献中にまとめて記載されている（例えば１
ｓｅｔｈｏａｅｎ　ｔｎ　ＩｎｇｙｍＯｌ　、　６６壱
Ｒａｙ　Ｗｕ　（１（１，）ムａａｄ＠ｍｉａ　Ｐｒｅ
ｓｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７９年）参照）。本発明
の範囲内で例１及び２で製造された新しく組換見られた
プラスミドをまとめると、ＩＩＩ状構造を直線形で示し
た１１Ｅ１ａ〜１ｆ図で示される。これらの図中で波線
は、染色体Ｄ８Ｎからｐ　ＷＢ　２からのベクターＤＭ
８への移行を示している。これは、１４００Ｂｐ　　よ
り小さく、右側に隣接しているＥｌａｌＩ　−配列から
はなれているが、正確には定義されていない。

紛＾ＴＯＯ 配列　　　　　は、ＢｓｕｆｆｌＩ　−１本鎖端Ｂｇｌ
　ＩＩτ０ＴＡＧＧ −１本鎖端との共有結合により生じ、前記の２つの制御
酵素のいずれＫよっても分解不可能である。

本発明は、前記のシラスミ「の製法にも関する。この方
法は、遺伝子ｐｒｏム及びｐｒｏ　Ｂを有する染色体Ｄ
Ｍ８−７ラーメントを、代謝拮抗物質耐性トコリー突然
変異体からクローン化するか又は、試験管内組換えによ
り、遺伝子ｐｒ。

Ａ及びｐｒｏ　Ｂを有するフラグメントとｐｒｏ　ｏを
有するフラグメントとを１プラスｉ？上で一緒にするこ
とよりなる。

本発明のもう１つの目的は、前記種類の新しく組換えら
れたプラスにドとは無関係に、Ｌ　−プロリン−製出の
増加作用をする染色体突然変異の導入により、代謝拮抗
物質耐性トコＩＪ　＋突然変異体を改良することである
。例えば、・新しく組換えられたシラスミｙｐ８Ｂ１２
１を製造１：。

するための染色体ＤＭ８　　もそれから単離した菌株Ｎ
−ｓリ−８Ｂ１（例１ａＫｌｌ法記載）＆Ｃ，唯一の炭
素源又は窒素源としてのＬ−ゾロリンを用いる生長を阻
止する突然変異を導入した。第３図から明らかなように
、こうして得た突然変異体２・コリー８Ｂ２は、トコリ
ー８Ｂ１　よりも約５倍も多くのＬ−ゾロリンを生じる
。

Ｌ−ゾロリンの収量は、細胞生長を限定する物質代謝欠
失の導入により、なお高めることができた。こうして、
他のアミノ酸及び核酸合成先駆物質に関する要求性を有
する思・；リ−ａＢ　２　　の突然変異体は、高いＬ−
ゾロリン濃度を生じた。

トコリー８Ｂ　２　　から、例４に記載の条件下でＬ−
ロイシン６０〜１００．殊に７５〜８５有利ＫＢＯ９／
ｌのｌ−ツリー８Ｂ　２からＬ−ロイシンに関する要求
性の導入により得られた菌株ｌ・コリー８Ｂ　５　は、
特に好適であることが判明した。Ｌ−プロリンの濃度は
、鳳・コリー８Ｂ２に比べて１．５〜２倍増加した。

部分突然変異体例えば２・コ１３　＋　８Ｂ　３　　の
生長に必要なアミノ酸は、有利にアミノ酸混合物の形で
一添加できる。例えば、ｐ８Ｂ１２２を有する２・コリ
ー８Ｂ　３　　の最大ゾロリン濃度及び生産性は、−一
ロイシンを轟量の例えばカブアミノ酸に代えることによ
って１５．８１１／ｌもしくは０−２１１Ｉ／ｊ／ｈま
で高めることができた。

従って１本発明には、鳳・フリー突然変異体特に突然変
異体ｌ−プ１３−８Ｂ２及び８Ｂ　５を醗酵法によるＬ
−ゾロリンの製造に使用することも包含される。従って
、新規菌株の製法とこの菌株を用いるＬ−プロリンの製
法も同時に目的としている（４許請求の範囲第１７項〜
第２２項）。

細１が、高度に不自然な物質代謝効率例えば酵素又はア
ミノ酸の多量生産を誘起するよりなシラスｉｙを容易に
生じることは公知である〔例えばＴ　Ｉｍａｎａｋａ　
　等によるＪ　、Ｇｓｎ　、Ｍｉａｒｏｂｉｏｌ。

１１８巻（１９８０年）２５３〜２６１頁参廂〕。

こ・のことは、殊にシラスミ１Ｐｐ８Ｂ１２２及びｐｓ
ｎ１２５に関しても該轟する。従って、２・コリー８Ｂ
　２　　（ｐ　８Ｂ　　１２２　）及びＺ・コリー８Ｂ
３（ｐ８Ｂ１２２）の実施例５及び４＃ｃ記載の条件下
での醗酵の終りに、細胞の２０〜２５憾もしくは９０−
以上までがシラスミｙ不含である（諺１表及び１１１２
表中の全個体群に対するアンピシリン耐性即ちシラスミ
Ｖ含有細胞分に関する値参照）。

ｐ　８Ｂ１２２の安定性の着るしい改良は、分子量を約
２５８０　ＢＦだけ小さくすることにより達成でき、こ
の際、ｆラスミＰｐ８Ｂ１２６が生じた（例２）。ｐへ
言、トコリー８８５中でも例４に記載の条件下に安定で
あり、同じ菌株中でのｐＢ３１２２よりも相応して高い
ゾロリン濃度並びに良好な生産性を示しく第２表）、鳳
・コリー８Ｂ２中では逆に、ｐ８Ｂ１２２が良好な結果
を示した（第１表）。

プラス電ｒ含有細胞のみが生長できる条件を４える場合
にもプラス電ｙ彎定化が達成され翫このことは、ここに
記載のプラスｔｌＰにおいて、抗生物質アンピシリンを
媒体に添加することにより可能であった。それというの
も、これらシラスミｒは、それらの宿主細胞中で、アン
ピシリンに対して抵抗作用をしたからである。従って、
菌株１−＝ｙｌＪ−８Ｂ　２（Ｐ８Ｂ　　１２２）及び
罵・＝リーＢＢ５　　（ｐＢＢ　　１２２）の最大プロ
リン頻度を、醗酵媒体にアンピシリン１００ｅｐ／ｌを
添加することにより、６．０１１／ｌから６．８　Ｉｉ
／　ｊまで、もしくは１２．５１１／ｌから１６、ＩＪ
Ｆ／ｊまで高めることかできた（例５へと の結果をＩｌｔＩ表及び第２表の相応する値−比較）。

すべての会知の方法は、もっばら璽−四ツパ特許出願菖
、００２５８８２号明細書に記載されているので、個々
には述べなかった。

１９８１年７月８日に、西ｒイツＤ６ｕｔａＯｈ＠ｎ８
ａｍｍｌｕｎｇ　Ｗｏｎ　Ｍｎｃｒｏｏｒｇａｎｔｓｍ
　（Ｄ８Ｍ　）（１ｎ　Ｇｏｔｔｔｎｇｓｎ　、　Ｂｕ
ｎｌｅｓｒ＠ｐｕｂｌｉｋ　ｐ＠ｕｔｓｃｈｘａｎａ　
）ｌ： （Ｉｌｓａｈｓｒｉａｈｉａ　”ｏｏｘｌ）　　５ｉｓ
１　　　　　　　　　（Ｄ８Ｍ２１２０）１゛χ エセリキア・コリー８Ｂ２　　　　　　（Ｄ８Ｍ２１２
１）エセリ中ア・コリー８ＢＡ　　　　　　（Ｄ８Ｍ２
１２２）−＾啓ｉ有スルト：ｌ　１３−’１ｉｒａ　２
　　　　　　　（ｌｌｌ５Ｍ　２１２３）ｐ　８Ｂ１２
２！に有するｌ・エリ−８Ｂ５　　　　（Ｄ８Ｍ　２１
２４　　）次に、本発明で使用されている微生物及びシ
ラスミｙ４既に寄託されている： Ｉｆ−：ｙ１３−８Ｂ４４　　　（Ｄ８Ｍ　　１６０６
　　１９７９年７月１６日）Ｅ・コリー１！Ｂ１０１　
　（Ｄ８Ｍ　　１６０７．　１９７９肉Ｑ′月１６日）
プラスｉドｐＷＢ２　　　　（ムＴｏ０　４００１３．
１９７９年７月１６日）プラスζＹｐＢＲ５２２（ムＴ
ｏｏ　４００１５．　１９７９ｍ月１６日）プラス０１
８ＢＳ！　　　（ＡＴＯｏ　　４０Ｃ２０，１９７９年
７月１６日）。

菌株２・コリーｘ４７４は、ｐ、デロダ（Ｂｒｏｄａ　
）　（Ｉｌｌｎｇｌａｎｄ　）から取りよせ、菌株ｍ。

コリーｒ、ｔＩＩＩＰ１はｍ−ヤｅ　ル（Ｙａｇｔｘ　
）　（ＴａＩＡｖｉｖ　）及び０Ｇ８０　（Ｙａｋｓ　
ｕｎｉｖ、Ｎｅｗ　１ｉａｖ＠ｎ　Ｕ、日、ム、）から
取りよせた。

例　　１ 遺伝子ｐｒｏ　Ａ及びｐｒｏ　Ｂ　（ｎｕｔ、）　　を
有するシラスミ「の製 亀）代謝拮抗物質耐性突然変異体重・コリーＢＢ　１あ
単離 ２−培地［！１０．Ｔ、Ｖｏｇｅｌ及びり、Ｍ、Ｂｏｎ
ｎ＠ｒ、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｏｈ＠ｍ　、　２１８巻（１９５６年）９７〜１０６頁
］中でコ・コリーに１２（野生ｍ）を１夜培養した培養
液各０．１ｄを、寒天デレー）（Ｚ−培地中アガロース
１．５憾、これはＤ／Ｌ−ヂヒｒロゾロリｙ　１５４／
ｌｊ（シａ、Ｃ！ｓｌｂｌｏｃｈｓｍ　Ｇｍｂ　ＩＩ　
％６３００　Ｇｉｅｓｓｅｎ　、　ＦＲＧから入手）ｔ
−含有ス６”）上で平面培養した。２４４時間インキュ
ページンの後に、自然集熱変異により生じたデヒｒロゾ
ロリンに対して抵抗する個々のコロニーは野生型細胞５
　ｘ　Ｉ　Ｑ’　　当り約１；ロニーの頻度で生長した
。これを滅菌楊子を用いで、最小培地（ダルコース２１
１／Ｉ１．１−一トリデトファン２０Ｍｆ／ｊＡびアヂ
ニｙ４Ｑ１９／ｌを含有するＭ９−培地：　Ｒ，Ｗ、Ｄ
ａｖｉ−勢によるムａＷａｎａｅｌＢａｏｔｅｒｉ＆ｌ
　ＧＩｎ＠ｔｉｏｓ、　００１４８ｐｒｌｎｇ　Ｈａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　％１ｉｅｖ　Ｙｏｒｋ　
（１９８０年）２０３頁参照）を有する寒天プレート上
に移し、こめ上リーＸＸＰ　１　［ｐｒｏ　Ｏ％ｐｕｒ
　ｌ、　　ｔｒｐ　Ｉｌｔ　：　Ｍ、Ｂｒａｏｈａ及び
ＩＣ，ＹａｇｉｌのＭｏ１ｅａ　０ｇ＠ｎ、Ｇ＠ｎｅｔ
、　　１２２巻（１９７３年）５６〜６０頁参照〕を平
面培養した。３７℃での２４時間インキュベーションの
後に、Ｌ−プロリン製出コロニーを指標菌株のマイクロ
コロニーの量により同定することがでｔた。このＬ−ゾ
ロリン生童性コ四ニーの１つを次の実験用に取って移植
し１名称２・コリー８Ｂ１を付した。この菌株は、代謝
拮抗物質アセチジン−２−カルｌン酸に対しても抵抗す
ることが判明した。

ｂ）シラスば）ｐ８Ｂ１２１の製造 ベクターとして、制限酵素Ｈ１ｎｄ　ＩＩ　　に対する
１切断部位を有し、アンピシリン及びコリシンｉｃ１に
対する耐性を伝達するデラスミＰｐＷＢ）を使用した（
　Ｗ、Ｂｏｉｌｅ’１等によるＭｏ１ｓｏ、ｇ＠ｎ。

Ｇｅｎ＠ｔ、　１５２巻（１９７７年）２３１−２３７
頁参照〕。すべてのプラスミド−ｍＭ８　ヲＧ、Ｏ，／
−ンフリイ（Ｈｕｍｐｈｒ＠ｙ　）等によるＢｉｏｃＭ
ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｇ　。

ムａｔａ！ｉ８５巻（１９７５年）４５７〜４６３頁に
記載の方法で単一し、　ｍＭ８−緩衝液（トリスＨＵ　
４５　ｍＭ　１１１ＤＴム０．１　ｍＭ　、　ｐＨ７，
９）　Ｉｃ対して透析させた。２・コリー８Ｂ　１から
の高分子量の染色体ＤＮＳを、Ｈ，サイトウ（８ａｌｔ
ｏ　）及ヒに、ミウラ（Ｍｔｕｒａ　）ＣよるＢｉｏｃ
ｈ＠ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ＋、ムｅｔａ　７２巻（１９６
５年）６１９〜６２９貞に記載のフェノール抽出法（Ｐ
ｈ＠ｎｏｌｅｚｔｒａｋｔｉｏｎｓｖｅｒｆａｈｒｅｎ
）によるが、ＲＭＡアーゼ消化の省略下に単離し、かつ
同様Ｋ　ｍＭ８−緩衝液に対して透析させた。

Ｅ・コリー８Ｂ　１　　からのｐ　ＷＢ　２及び染色体
ＤＮＳを制限酵素Ｈｉｎ（ｌ　ｌ［と反応させた。反応
混合物は、染色体ＤＮ８　（１４０ｓｉ／ｍｌ）　８０
　ｔｔｔ。

ｐＷＢ２（！＋００ａνｍｌ　）　２０　ｓｌ　、反応
１ｊｉ衝液（トリスＨＣ１２０ｍＭ　、メルヵゾトエタ
ノール２０　ｍＭ　％ＭｇＣ１ｇ　２０　ｍＭ”、Ｎａ
Ｃｊ　１８０　ｍＭ　、ｐｋｉ７．４　）７５　ｍ及び
定量的反応に充分な酵素濃度（これは予備実験で測定し
た）を有する稀１１１ｎ（１■溶液５０μｌを含有した
。この混合物を５７゛℃で７５分保持し、引続き酵素の
インキュページ冒ンのために６５℃゛□゛い０分間保持
した。Ｈｌｎｄ　ｍ−反応の１８０μＩＫ対し、リガー
ゼ緩衝液（トリスＨＣｊ　（、６Ｑ　ｄ、ＭｇｃＪ４６
６　ｍＭ　、ジチオエリスリトール１００　ｍＭ、Ｐ）
１７．６　）　２５　ＡＡ’、ムＴＰ　（４ｍＭ　）　
２５　ｆｉｌ、　［１＋０１５／ｊＪ及ヒＴａ−リガー
ゼ（１００単位／　１１７　：　Ｂｔｏｘａｂｓ、Ｂ８
Ｖ＠ｒ１７゜Ｍ（１，Ｕ、８．ム）　５　ｓｌを加えた
。混合物を１３℃で１７７時間インキュページンし、予
めＴ］Ｉｉ８緩１１ｉ液（トリスＢＣｌ３０　ｍＭ　、
　ＭａＣｌ　５０１１１Ｍ、ＩＤＴＡ５ｍ！１Ｍ、ｐ）
ｊ８．０）で飽和したフェノール各２５０μ！で、、２
回かつエーテル各２５０　ａｌ　　で３回抽出した。Ｄ
Ｉ日を引続き常法でエタノールで沈殿させ、ｍＭ８−緩
衡液中和溶かした。

クローン化の受容１株として良好に形質転換可能でゾロ
リン要求性曹株Ｅ・コＩＪ　＋　ＨＢ　１０１を用いた
（　ｐｒｏム、ｌ＠ｕ　Ｂ、　ｔｈｉ、　ｈｓａＲｌｈ
ｓＬ　Ｍ。

ｒ＠ｅ　Ａ　：　Ｒ，Ｗ、　Ｄａｖｌ−等によるムｄｖ
ａｎｃＭ　ＢａｃｔｅｒｉａｌＧ・ｎ＠ｔｌＱａ、０ｏ
１４８ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｋ
ｙ　、ＮａＷＹｏｒｋ　　１９８０年、７頁参照）。細
胞をＭ、ダーｌ’ルト（Ｄａｇ＠ｒｔ　）及び８，０．
ｃ−ＪＳ／リツヒ（ＴｈｒｌｉＯｈ　）の方法（：Ｇ＠
ｎ、６巻（１９７９年）２３〜２８頁〕で、りが−ゼ反
応からのｍＭ８を用いて形質転換させた。この形質転換
の後に細胞懸濁液（０，６１１１１Ｊ）を、Ｌ−媒体［
’ＩＣ０Ｓ、！、＋ｅｌｎｎＯＸ。

ＶｌｒＯＩＯｇ７１巻（１９５５年）１９０〜２０６頁
］８１で稀釈し、３７℃で１時間インキュベー）・した
。更ＫＬ−媒体１００ｗＬｌ及びアンピシリン５４／１
の添加の後に、６７℃で１夜イン中ユベートした。細胞
懸濁液をグルコース２１１／ｌ、Ｌ−ロイシン２０ｙｖ
／Ｉ及びビタミンＢ１１１ノを有するＭ９１天上で平面
培養した。３７℃で４８時間の後に個々のゾロリン原栄
養性コロニーが増殖した。

プロリン要求性指標菌株Ｘ・コ１７　＋　Ｌ四１を用い
る養分供与実験で例１ａＫおけると同様ＫＬ−プロリン
の製出を立証できたこれらのいくつかのコロニーから、
デラスミｙ−ＤＮＳを単離した。アガロース−ゲル電気
泳動による分析の際に、この単一物は単一ではないこと
が判明し、このことは、クローン化されたｍＭ８−フラ
グメントの不安定性を立証していた。改めて形質転換し
、かつアンピシリン耐性及びプロリン原栄養性細胞を選
択することにより、結局、１クロ−ンが得られ、それか
ら均一で安定なシラスミｒ（これをｐ　８Ｂ１２１と称
した）を単離することがで幹た。

ｐ８Ｂ１２１の制限地図を第１ａ図に示す。

これは、唯１個のＨｌＭ　ｍ　　−配列を有し、もはや
全ベクターを有しない。このことは、１次的に形成され
た新しく組換えられたＤＮＳから、ベクターの配列及び
クローン化された染色体フラグメントの配列及び双方の
間に存在する！！ｉｎｌ　ｍ−配列を包含する部分領域
が分離除去されたことを示している。

ｐ８Ｂ１２１を用いる形質転換により、ｐｒｏ　Ｂ−突
然変異体ｚ・コリーＸ　４７４　（Ｐ、’Ｂｒ０１ａ。

Ｊ、Ｂａｏｔｅｒｉｏｌ、　１１７巻（１９７４年）７
４１〜７４６頁〕は、ゾロリン原栄養性となり、このこ
とから、］＞８Ｂ１２１はｐｒｏムと共に密に隣接した
遺伝子ｐｒｏ　Ｂをも有等ることが明らかとなった。前
記のような養分□°門１給実験は、菌株Ｅ・コリーＨＢ
　　１０１（ｐ８Ｂ　　１２１）がＬ−ゾロリンを生産
するが、ｍ・コリーＨＢ１０１はプラスミドなしにはＬ
−プロリンを製出しないことを示している。

Ｃ）プラスミドｐ８Ｂ１２４及びｐｓＢ１２５の製造 ｐ　８Ｂ１２１を制限酵素ＢｓＬｍＨ工及びＢｇｌ　　
■との反応により、分子量５８６０　Ｂｐ及び１１５０
Ｂｐの２フラグメントに分け、小さいフラグメントな、
０．７憾ア／ａ−ス中での調製用ゲル電気泳動及び電気
溶出（Ｈ，０，８ｍ１ｔｈ　ｔｒ＞　Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎｌｌｌｎｍｙｍｏｌｏｇｙ　６５巻（１９８０年）
　ＡｃａｄｅｍｉａＰｒｅｓｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　５
７１頁参照）Ｋより、混合物から分離した。ベクターシ
ラスミ）”Ｉ）ＢＲｌ、２２〔ν、１３（１１ｖａｒ等
によるＧ・ｎｅ　２巻（１９７７年）９５〜１１３頁参
照〕を、Ｂａｎ　ＨＩ　　との反応により直線化した。

線状ｐ　Ｂａ５２２　２．５４　及びｐ８Ｂ１２ＩＴｈ
らの５８６０　Ｂ　”ｐのＢａｍＨ工／Ｂｇ１１１［−
７う／メントロ塵を、′４）・′：１ｂと同様にＴ４−
リガーゼとの反応により共有結：釡させた。Ｂａｎ　Ｈ
Ｉ及びＢｇｉｌ［により得られた１本鎖端は同じ配列な
有するので、このことは可能である。例１ｂにおけると
同様に、リガーゼ−反応からのＤＮＳを用いるｌ・コ１
３−ＨＢ１０１の形質転換及びアンぎタリン耐性でゾロ
リン原栄養性の細胞の選択により、数個の細胞クローン
が得られ、これらからｐ８Ｂ１２４及びｐ８Ｂ１２５と
称される２種のシラスミ「が単離できた。双方は、ｐ８
Ｂ１２１からの７ラグメントの分子及びＢａｎ　ＨＩで
直線化されたｐ　Ｂａ５２２の分子各々１個を有し、双
方の７ラグメントの配向性の入で相互に異なっている。

ｐ８Ｂ１２４及びｐ８Ｂ１２５の制限地図を第１ａ図及
び館１ｃ図に示す。これらは、１３ａｍＩＩ−１本鎖端
とＢｇｉｌＩ−１本鎖端との結合により生じた配列が双
方の酵素のいずれによっても再び分解することはできな
いので、１個のＢａｍＩＩＩ　　配列を有し、　Ｂｇｌ
　ＩＩ配列を有しない。

菌株トコリー１１Ｂ１０１　（ｐ　８Ｂ１２４　）及び
ｌ・コリー１１Ｂ１０１　（ｐ　８Ｂ１２５　）は、双
方共、例１１の養分供給実験により示されるように、Ｌ
−プロリンを製出する能力がある。このことは、遺伝子
ｐｒｏム及びｐｒｏ　Ｂ　（ｎｕｔ、）がｐ　８Ｂ１２
１中の５８６０Ｂｐｎｂ ート上に局在することを立証している。　°□例２　　
　　　　　′・ 遺伝子ｐｒｏム、ｐｒｏ　Ｂ　（ｎｕｔ　）及びｐｒｏ
　ｏを有す癒 ４６００ＢｐのＥ・コリー［１２からの染色体ｔｉｔｎ
ａ　ｍ　／　Ｂａｍ　Ｉ！エニーフラグメント上遺伝子
ｐｈｏム及びｐｒｏ　ｏを有するｐ８Ｂ５５は、ヨーロ
ッパ特許出願第００２５８８２号明細書に記載されてい
る。このシラスミ「の制限地図を第２図に示す。遺伝子
ｐｒｏ　ｏはＸｈＯＩ　Ｉ−配列とＢａＪ！ｌＨＸ蟻−
配列との間で２０２０Ｂｐの７ラグメント上に存在する
。

１）　８Ｂ１２２及びｐ８Ｂ１２５は、例１Ｃでｐ８Ｂ
１２４及びｐｓｎ１２５の製造に使用され遺伝子ｐｒｏ
　＆及びｐｒｏ　Ｂ　（ｍｕｔ　）　　を有する５８６
０Ｂｐの同じＢｕｎ凪／Ｂｇｉｌ［−フラグメートを、
ｐ８Ｂ５３０Ｂａｍ　ＦＡＸ−配列中へ２つの可能な配
向で挿入することにより得られた。

ＤＮ８−緩衝液５０　ｐｉ　　中のＢａｍ１ｉｘテ直線
化されたｐ　１ｉＢ５５　１２４及びＢａｎ　ＨＸ及び
Ｂｇｌｌ［で解装されたｐ８Ｂ１２１　９４の溶液に、
ＩＪガーぜ緩衝液（例１ｂ参照）１０μｍ　ＡＴＰ　（
４ｍＭ　）１０Ｉ４％水２５＃ｊ及びＴ４−リガー＋ｐ
５Ａｌを加えた。混合物を例１ｂと同様にインキユベー
トし、後処理した。形質転換用宿主として、菌株鳶・コ
リー８Ｂ４４即ち、２−コリー１１Ｂ１０１のホスファ
ターゼネガチデ（ｐｈｏム）−突然変異体を用いた。こ
の菌株並びにホスファターゼボジチデ細胞の選択法は、
同様ＫＮ−ロツパ特許出願總００２５８８２号明細書に
記載されている。

２・コリー８Ｂ　４４の形質転換の後に、アンピシリン
耐性で、プロリン原栄養性で、かつホスファターゼ？ジ
チデな細胞を選択した。これから、制限地図を第１ｄ図
及び第１ｆ図に示されるプラス電ｙｐ８Ｂ１２２及びｐ
８Ｂ１２５が単ｐｒｏ　Ｂ及びｐｒｏ　ｃ−突然変異体
２・コリーＩ４７４及びトコリーＬＩＣＰ　　１の形質
転換により。

ｐ８Ｂ１２２及びｐ８Ｂ１２Ａはｐｒｏムと共に、遺伝
子ｐｒｏ　Ｂ及びｐｒｏ　Ｏをも有することを示すこと
ができた。ｐ　８Ｂ　１２２又はｐ８Ｂ１２５を有する
すべての菌株は、例１ａＫ記載の養分供給試験で正の結
果を示し、従ってＬ−プロリンを製出することができる
。

ｂ）ｐＢＢ　　１２６の製造 １）８Ｂ１２６は、ｐ８Ｂ１２２から遺伝子ｐｈｏムを
有する２５８０Ｂｐノ１ｉｉｎｄｌ［ｉ／Ｗｈｏ　Ｉ−
フラグメントを除去することにより得られたｐ　８Ｂ　
１２２を、Ｍｉｎｉ　ｍ及びＷｈｏ　ｆ　との反応によ
り２５８０Ｂｐ及び１１９ｏｏＢｐの２７ラグメントに
分萱し１．、大ｔいフラグメントを例１−におけると同
様に調製用ゲル電気泳動及び電気溶出により分ｍ”ｔ＜
かっ単離させた。

このフラグメントの１本鎖端をＴ４−＆リメラーゼ（１
１ＣＱＯ単位／１、Ｐ　、Ｌ、ＢｉｏａｈｅｍｉＣ１ａ
ｌｌ工！１０．　Ｍｉ１ｗａｕｋ＊ｅ　、　Ｗｉｇ、、
υ、ｅ、ム　Ｉｌ）との反応により２本鎖端にした。こ
の反応混合物は、１１９００ＢｐのＷｈｏ　１　／　Ｈ
ｌｎｌ　ｍ−フラグメント８４の溶液ｓ　Ｏ＃、　リガ
ーゼ−緩衝液（例１ｂ参照）１０４．４種のデソキシヌ
クレオシｒ−三燐酸（Ｉ　ＡＴＰ　％（１（）ＴＦ　、
　ｄＴＴＰ及び４０７Ｆの１ｍ溶液各５ｍ。

水１０μＩ及び２．２単位のＴ４−ポリメラーゼの稀釈
物１０Ｉ４を含有した。合計１００７４Ｊの混合物を５
７℃で３０分、かつ、ポリメラーゼの失活のために６５
℃で１０分間保持した。その後リガーゼ緩衝液５＃、Ａ
ＴＰ　（４ｍＭ　）　１５μ！、水１０μ！及びＴ４−
リガーゼ２０μノ　を添加した。混合物を例１ｂと同様
にインキユベートし、かつ後処理した。ＤＮ８を用いて
鳳・コリー８Ｂ４４を形質転換し、この形質転換パッチ
からアンピシリン耐性で、プロリン原栄養性で、ホスフ
丁ターゼネがチデな細胞を選択した。これから、シラス
（）”ｐ８Ｂ１２６が単離でき、これを鎮１・図の制限
地図に示した。

例２ａＫ記載と同じ方法で、９８Ｂ１２６ＫＨ４しても
ｐｒｏ　Ａ以外Ｋ　ｐｒｏ　Ｂ及びｐｒｏ　Ｏをも有し
。

Ｌ−プロリンの多量生産作用をすることが立証された。

例３ 突然変異体２・コ１３−８Ｂ２の単離及び例１及び２か
らのプラス電Ｖと組入合せたＬ−プロリン製造のための
その使用 ａ）　　ＩＩ・コリーＢＢ　２の単離 ｍ−コ１７−ＢＢ　２は、代謝拮抗物質耐性突然変異体
２・コリー８Ｂ１　（例１）から、１−ニトロソ−３−
エトロー１−メチル−グアニジン（ＮＭＧＭ　）　を用
いる集熱変異形成及びＬ−プロリンを炭素源としても窒
素源としても利用することのできない細胞を選択するこ
とにより得られた。このために、公知方法〔１，ム、ム
ｄ＠ｌｔｌ＠ｌｒｇ等によるＢｉｏａｈ＠ｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、　Ｒ＠ｍ、Ｏｏｍｍ、　１８４（１９６５年）
７８８〜７９５頁参照〕で。

Ｍａｃ１９ＪＩ　／　ｊ　ＩＦ）溶液中ノＮ　−５１３
−８Ｂ　１　１０’細胞／＠ｌの懸濁液ＫＩＮ遊１０４
／―を１０分間作用させることにより失熱変異を起こさ
せた。

その後、過剰の突然変異原を無菌ＮａＣｊで洗浄するこ
とにより除去し、細胞を適当に稀釈して、グルコース２
１１／Ｉを〇−源として有するＭ９−寒天上で平面培養
し、３７℃で固有のコロニーが形成されるまでインキエ
ベートシタ。ステンベル法を用いて、このコロニーをグ
ルコースの代りＫＬ−プロリン２．５１／Ｉｃ唯一のＣ
−源としてのＬ−プロリン）を有するＭ９−＊天上に並
びにダルコース２１／ｌ及ＵＭＨ，ｃｔ　　ノ代りのＬ
−プロリン２．５ＩＩ／ｊ（Ｍ−源としてのＬ−プロリ
ン）を有するＭ９−寒天上にも移した。

双方のＬ−プロリン含有培地上では生長しなかった数個
のコロニーを同定できた。この１個を罵・コリー８Ｂ　
２と称して次の実験に使用した。

ｂ）６１１＃法によるＬ−ゾロリンの製造デラｘｉｙｐ
ａｓ１２１、ｐ　ｌｉＢ　１２２、ｐ　ＢＢ１２４及び
ｐ８Ｂ１２＋６を用いるＥ・コリー８Ｂ□ ２の形質＆換及びアンビタリン耐性コロニーの選択によ
り、相応するシラスミｒ含有Ｅ・コリー菌株が得られた
。

アンピシリン１００ダ／ｊを有するＬ−寒天上でのこの
種の菌株の新しい１個の固有コロニーから出発して、テ
ンピシリン１０（ｉｆ／１が添加されているＬ−媒体２
０１Ａｌｔ−接種する。培養液（鎮１予備培ＩＩ）を３
７℃で１夜振動し、次いで接種のために、グルコー：ｌ
Ｋ、５１１／Ｉｔ、　カブアミノ酸（ＩＸｆｏｏ　）　
　１　ｌ／ｌ及びアンピシリン１００雫／ｊを有するＭ
９−媒体５００１１７を用い、これを５７℃で６〜７時
間振動させる（第２予備培養）。

水８７中のＭＡ＠ＨＰＯ４”γ−７０１、ＫＨ，Ｐｏ。

５０１１、ＮＨ４ｃ１１０Ｉｉ及び１Ｉａｃｊ　５　＃
の無菌溶液を含有する２０１−ｆラス醗酵容器中に、グ
ルコース５０ＯＮ／ｊの無菌溶液１ｊ並びＫＩＪ　−グ
ルタミン酸モノナトリウム２００１１／ｊｌ。

ＭｇＳＯ３・７ＨｓＯ２，５１／　ｌ及びビタ＜　ｙ　
Ｂ　１　１０１１１Ｐ／１を含有する無菌−液１１を装
入する。この＃１＃容器に第２予備培養物を接種し、３
７℃、０．７ａｔ！圧、で、かつ１０１／ｗｉｎの通気
下に、２２ｈ／ｗｉｎで最大ゾロリン濃度に達成するま
で（１００〜２００時間）攪拌する。１２憾Ｍｉ！！ｓ
−溶液の連続的添加により、自動−一調節を用いてβ値
を６．５に保持する。

３〜４時間の規則的間隔で試料を敗り出し、その中のＬ
−プロリン含分を１．Ｐ、シナルｒ（０ｈｌｎａｒｌ　
）　ＫよるＪ、Ｂ１１１．　Ｏｈ＠ｍ、　１９９巻（１
９５２年）９１頁に記載の方法で測定する〔これは、酢
酸中でのＬ−ゾロリンとニンヒドリンとの反応に基づ（
：　Ｒ，Ｂ、アペレス（ムｂ・１・ａ）によるＭｏｔｈ
ｏａｓ　ｉｎ　ｋｇｙｍｏｌ　、　ｎ１１８巻（１９７
１年）ムｏａａ＠ｍｉｏ　Ｐｒｅｓｓ　、　ｌｉ＠ｖ　
Ｙｏｒｋ参照〕。確認のために、試料小量中のゾロリン
含分を、ｐｒｏ　Ｏ−突然変異体ｌ−コ＋）　−Ｌｔｌ
Ｐ　１を用いる定量的微生物学的試験により測定する。

更に、醗酵の終期のいくつかの試料中で、プラスミド損
失の尺度としてのテンピシリン耐性細胞対全菌数の割合
を測定する。デラスミＶ不含の菌株トコリー８Ｂ　　２
を、予備培養媒体がアン−シリン不吉である点を変えて
同様に醗酵させる。

この醗酵の結果を第３図及び次の第１表にまとめる。

１１Ｎ１表 ｚ−；り一８Ｂ２及びこの菌株のシラスミレ含有類縁体
を用いる、グルコース５０１／／１及びＬ−グルタミン
酸モノナトリウム２０Ｉ／Ｉを含有するＭ９−媒体（−
６，５）中での醗酵法によるＬ−ゾロリンの製造の結果
畳０１！１０　’及びｔｏｏ　：　　最大ｆｖｓリン濃
度０．８の９０憾に達する際のゾロ リン湯度と醗酵時間。

例　　４ 突然変異体２・コＩＪ−ＢＢ５の単離及びデラスミｙｐ
８Ｂ１２２、ｐ　８Ｂ　１２４及びｐＢＢ１２６を用い
る形質転換後のそれを使用するＬ−プロリンの製造 １）ＩＣ−コリー８Ｂ、５の単離 出発菌株として、例５ｈＫ記載の方法で。

ＭＮＭＧ　　を用いて突然変異誘起させ、生長させた菌
株鳶・コリー８Ｂ２を用いた。この後、この細胞を適当
に稀釈して、グルコース２．０１１／ｌ及びＬ−ロイシ
ン２０ｊ％Ｆ／ｊを有するＭ９−寒天上で平面培養し、
６７℃で固有コロニーが形成されるまでインキユベート
した。グルコース２．０１１／ｌを有しアミノ酸添加さ
れていないＭ９−１１天上へのステンベルにより、Ｌ−
ロイシン要求性を有するいくつかのコロニーヲ同定でき
た・七″１個をト、・、、１．、ごり−８Ｂ５と称して
次の実験に用いた。例３ａ’におけると同様にＬ−プロ
リンを唯一の〇−源又はＮ−源として有する寒天培地上
に移すことにより、とのＺ・コリー　ＳＢ５は、トコリ
ー８Ｂ２と同様ＫＬ−プロリンを炭素源又は窒素源とし
て利用できないことが明らかにすることができた。

ｂ）ｔＩｉ酵法によるＬ−プロリンの製造例３ｂと同様
にしてデラスミ）ｐ８Ｂ１２２、ｐ８Ｂ１２４及びｐ８
Ｂ１２６を用いる形質転換により、相応する兄・コリー
ｓＢ５から誘導されたシラスミド含有菌株を製造した。

醗酵を、主醗酵用媒体［Ｌ−ロイシン８０ｐ／ｌを添加
した点を変えて、例６ｂの記載と同じ条件下に実施した
。プラス（Ｐ不含の２・コＩＪ−８Ｂ、５の予備培養は
、アンビシリン不含の培地中で行なったこの実験の結果
を第２表にまとめる。

槙２表 ２・コリー８Ｂ５及びこの菌株のデラスミｒ含有類縁体
をグルコース５０１１／ｌ、Ｌ−Ｐルタミン酸モノナト
リウム ２０１／／１１及びＬ−ロイシン８０ダ／ｌを含有する
Ｍ９−媒体（ｐ）Ｉ　６．５　）中で＃＃させた結果： 例　　５ アンビシリン添加のもとでの醗酵法によるＬ主醗酵用媒
体にアンぎシリン１００Ｍ９／ｌを添加した点を代えて
、例３ｂ）もしくは例４ｂ）と同様にして、菌株Ｅ・コ
リー８Ｂ２　（ｐ　８Ｂ１２２）及び鳳・コリー８Ｂ３
（ｐＳＢ１２２）ｉ醗酵させた。

ｎ−プロリンの最大濃度”Ｔｎ＆Ｘ　”最大濃度の９０
参に達するまでの醗酵時間（ｔｏｏ　）及びこれらの双
方の値から算出された生産性（Ｃ，。／、１．。）Ｋ関
する次の値が得られた：例　　６ Ｌ−プロリンの代りにカブアミノ酸を有するｍ体中テノ
１−　＝ｙ　＋）　−ＢＨ３（Ｐ８Ｂ１２２　）　１７
’）Ｌ−ロイシン８０ｗ／ｌの代りに、カブアミノ酸５
．５９／　ｌを含有する主醗酵用媒体を用いる点を変え
て、例４ｂ）Ｋ記載と同機にして菌株を醗酵させた。

最大プロリン濃度Ｃｍａ！、醗酵時間ｔ９０及び生産性
’９０　／　ｔｏｏ　　Ｋ関して次の値が測定された：

【図面の簡単な説明】

１ 票１ａ図はシラスミ）ｐ１５Ｂ１２１の制限地図、！１
Ｅ１ｔ＋図はシラスミＰｐ８Ｂ１２４の制限地図。 第１０図はプラス＃１Ｆｐ８Ｂ１２５の制限地図、第１
ｄ図はシラスミ）ｌ’ｐｓＢ１２２の制限地図、第１ｅ
図はシラスミｙｐａｓ１２６の制限地図、１ＥＩｆ図は
シラスミ）Ｐｐ８Ｂ１２３の制限地図であり、第２図は
、プラス、’）”ｐ８Ｂ５５の制限地図であり、第３図
は、本発明の実施例３における醗酵法によるＬ−プロリ
ンの製造に関する醗酵時間と培養液中のＬ−プロリンの
濃度との関係を示す図である。 第２図 ｐＳＢ５３　の拳す戸ｌ　＃＆−図 第図面 ３図口子閏（ｈ） 窮１頁の続き ■Ｉｎｔ、　Ｃ１，３識別記号　　　庁内整理番号（Ｃ
１２Ｐ　　１３／２４ ＣＩ２　Ｒ１／１９　） ０発　明　者　ヴエルナー・ボイドル ドイツ連邦共和国ベルリン１５シ ャベルシュトラーセ１９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　遺伝子ｐｒｏム及びｐｒｏ　Ｂを有するＤＩ日−
   配列を有し、ここでｐｒｏ　Ｂは代謝拮抗物資耐性ｒ−
   ／ルタ電ルーキナーゼをブーｒしている突然変異源で存
   在していることを特徴とするプラスｔ　Ｐ。 ２、　　ｆラスζドア日Ｂ　１２１である、特許請求の
   範Ｓ纂１項記載のシラスζｒ６ ＆　シラスｔＰｐｌｉＢ１２４である、特許請求の範囲
   ＩＩＥ１項記載のプラスξＦ。 ４、　シラスンＹｐＢＢ　　１２５である。特許請求の
   範ａ鎮１項記載のプラスｉ　ｙ。 ５、遺伝子ｐｒｏム及び遺伝子ｐｒｏ　Ｂを有するＤＭ
   ８−配列を有し、ここでｐｒｏ　ｍは代謝拮抗物質耐性
   ｒ−メルタ電ルーキナーゼをローｒしている突然変異渥
   で存在しているプラス電ｒを１造するために、Ｌ−プロ
   リンの生合成に関する遺伝子ｐｒｏム及びｐｒｏ　Ｂを
   有する染色体ＤＩｉｌ−７う〆メントを１代謝拮抗物質
   耐性２−コリー突然変異体からクローン化することを特
   徴とする。ｆラス電Ｖの製法。 ６、遺伝子ｐｒｏム、代謝拮抗物質耐性ｒ−グルタミル
   ーキナーゼをブーｒしている突然変異源の遺伝子ｐｒｏ
   　Ｂ及び遺伝子ｐｒｏ　Ｏを有するＤＮ８−配列を有す
   る、プラス電ｒ。 ２　シラスｔＰｐ８Ｂ１２２である、特許請求の範囲Ｉ
   ＩＥ６項記載のシラスミド。 ８６　　シラスｔＰｐ８Ｂ１２５である、特許請求の範
   囲第６項記載のプラスζｒ０ ９　プラス電ＰＰ８Ｂ１２６である。特許請求の範囲諺
   ６項記載の！ラスミド。 １０、遺伝子ｐｒｏム、代謝拮抗物質耐性ｒ−グルメ電
   ルーキナーゼをブーｒしている突然変異源の遺伝子ｐｙ
   ｏ　Ｂ及び遺伝子ｐｒｏ　ａを有するＤｌｉｌｌ−配列
   を有するプラスｔ　Ｙを製造するため、試験管内新規組
   換えにより、遺伝子ｐｒ。 ム及び代謝拮抗物質耐性ｒ−グルタミルーキナーゼをニ
   ー？している突然変異型の遺伝子ｐｒｏ　Ｂを有するフ
   ラグメントと、遺伝子ｐｒ。 ○を有するフラグメントとを、１プラスｉｆ上で一緒に
   することを特徴とする、プラスミドの製法。 １１、突然変異体通・コリー８Ｂ１゜ １２、突然変異体２・コリー８Ｂ１をプラスミドｐ８Ｂ
   １２１の製造に使用する方法。 １３、突然変異体トコリーａｓ２゜ １４、遺伝子ｐｒｏム、代謝拮抗物質耐性ｒ−グルタミ
   ルーキナーゼをニーＶしている突然変異型遺伝子ｐｒｏ
   　Ｂを有し、遺伝子ｐｒｏ　Ｏを有していてもよいＤＭ
   Ｂ−配列を有するプラスｆｉ＆を含有する突然変異体ト
   コ１７−８Ｂ２を使用することを特徴とする醗酵法によ
   るＬ−ゾロリンの製法。 １５、突然変異体Ｅ・コリー８Ｂ３゜ １６、遺伝子ｐｒｏム、代紺拮抗物質耐性ｒ−グル型遺
   伝子ｐｒｏ　Ｂを有し、遺伝子ｐｒｏ　Ｏを有していて
   もよいＤＮＳ−配列を有するシラスミｒを含有する突然
   変異体トコ１７−８Ｂ　５　　を使用することを特徴と
   する。醗酵法にょるＬ−ゾロリンの製法。 １ｚ　　遺伝子ｐｒｏ　Ａ及びｐｒｏ　Ｂ　（ｎｕｔ　
   ）を有するシラスｔｐを含有する新規菌株を製造するた
   めに、当皺―株の反応性細胞を形質転換条件下にシラス
   ミｙ−ｒｎｉｅと共にインキユベートし、細胞個体群か
   ら抗生物質耐性細胞を単離することを特１黴とする新規
   菌株の製法。 １８、テラスミド含有ｌ・コリー８Ｂ２　１１１株ヲＩ
   ｔ造する、特許請求の範囲第１９項記載の方丸１９　　
   遺伝子ｐｒｏム、ｐｒｏ　Ｂ　（ｎｕｔ　）及びｐｒｏ
   ○を有するプラスζ゛ｒを含有する新規菌株を製麺する
   ために、ニー菌株の反応性細胞を形質転換。件下えデへ
   オリＮｓと＃ｃイｙや−イートシ、細胞個体群から抗生
   物質耐性細胞を単離することを特徴とする新規菌株の製
   法・２０、デラスミ？含有Ｅ・コリー８Ｂ　５菌株を特
   徴する特許請求の範囲第１９項記載の方法。 ２ｔ　　デ９ＪｔｙｐＥＩＢ　　１２１、ｐ８Ｂ１２２
   、ｐ８Ｂ１２４又はｐ８Ｂ１２６から選択したプラス９
   　ｙを含有するＥ・コリー突然変異体例えばＥ・コリー
   ８Ｂ　　２を用いてＬ−ゾロリンを製造するために、菌
   株をグルタミン酸含有鉱物塩媒体中で醗酵させ、生じる
   Ｌ−ゾロリンを公知方法で単離させることを特徴とする
   、Ｌ−プロリンの製法。 ２２、プラスミドｐ８Ｂ１２２．ｐ８Ｂ　　１２４又は
   ｐｓｇ１２６から選択したプラスミーを含有するｍ・コ
   リー突然変異体例えば２・コリー８Ｂ　３　　を用いて
   Ｌ−プロリンを製造するために、菌株をグルタミン酸含
   有鉱物塩媒体中でＬ−ロイシンの添加下に醗酵させ、生
   じたＬ−プロリンを公知方法で単離させることを特徴と
   する、Ｌ−プロリンの製法。