KR19980024241A

KR19980024241A - 트랜스-4-히드록시-l-프롤린의 제조법

Info

Publication number: KR19980024241A
Application number: KR1019970045362A
Authority: KR
Inventors: 아끼오 오자끼; 다께시 시바사끼; 히데오 모리; 아끼히꼬 마루야마; 히로아끼 모또야마
Original assignee: 히라따 다다시; 교오와 학꼬 고오교 가부시끼가이샤
Priority date: 1996-09-03
Filing date: 1997-09-01
Publication date: 1998-07-06
Also published as: CA2209889A1; CN1333074C; EP0826773A3; EP0826773A2; TW581813B; KR100591500B1; JPH1075788A; EP0826773B1; CN1178245A; JP3739143B2; ATE287959T1; DE69732327D1; DK0826773T3; CA2209889C; KR100591499B1; DE69732327T2

Abstract

L-프롤린 4- 수산화효소를 사용하여 효율적으로 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 제조하는 방법에 있어서, 보다 공업적으로 유리하게 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 제조하기 위한 방법을 제공하는 것에 있다.

2-케토글루타르산 및 2가 철이온의 존재하, 유리 L-프롤린에 작용하여 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 생성하는, L-프롤린 4- 수상화효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자를 함유하는 DNA 단편을 백터에 삽입하여 수득하는 재조합체 DNA 를 보유하고, 또 L-프롤린의 생합성계의 활성이 강화된 형질전환체, 및 그 형질전환체를 배양하고 그 배양물, 균체 또는 균체 처리물을 효소원으로 하여 2-케토글루타르산 및 2가 철이온의 존재하, 배양액 또는 수성 매체 중에서 L-프롤린을 트랜스-4-히드록시-L-프롤린으로 변환시키고, 생성된 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 그 배양물 또는 그 수성 매체로부터 채취하는 것을 특징으로 하는 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 제조법을 제공한다.

Description

트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 제조법

본 발명은 소염제로 이용되고 있는 N-아세틸히드록시프롤린, 카르바페넴계 항생물질 등의 의약품의 합성 원료 또는 식품 첨가물로서 유용한 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 공업적으로 제조하는 방법, 그 방법에 유용한 L-프롤린 4- 수산화효소 유전자를 함유하고, 또한 프롤린 합성계의 활성이 강화된 형질전환체에 관한 것이다.

미생물을 사용하여 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 제조하는 방법으로는,

1) 에셰리키아(Escherichia)속에 속하는 미생물을 사용하여 4-히드록시-2-옥소글루타르산으로부터 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 제조하는 방법 (특허공개공보 평3-266995호),

2) 세균이나 곰팡이류를 사용하여 적접 발효 생산하는 방법 (유럽 특허 출원 EP 0 547 898 A2, 특허공개공보 평5-236980호, 특허공개공보 평6-245782호),

3) 스트렙토마이세스(streptomyces)속에 속하는 미생물을 사용하여 L-프롤린으로부터 제조하는 방법 [저널 오브 바이올로지컬 케미스트리 (J. Biol. Chem. ), 254 권, 6684 ~ 6690 쪽 (1979년), 바이오케미컬 앤드 바이오피지컬 리서치 커뮤니케이션 (Biochem. Biophys. Res. Comm.), 120 권, 45 ~ 51 쪽 (1984년), 테트라헤드론 레터즈 (Tetrahedron Letters), 34 권, 7489 ~ 7492 쪽 (1993 년), 테트라헤드론 레터즈 (Tetrahedron Letters), 35 권, 4649 ~ 4652 쪽 (1994 년)] 이 알려져 있다.

종래 트랜스-4-리드록시-L-프롤린의 제조 방법은, 1) 4-히드록시-2-옥소글루타르산 등의 트랜스-4-리드록시-L-프롤린을 제조하기 위한 기질이 비용이 비싸기 때문에 입수곤란하며, 2) 트랜스-4-리드록시-L-프롤린의 생산성이 낮고, 3) 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 제조에 관여하는 효소의 활성이 극히 미약하다는 등의 이유 때문에 공업화는 곤란했다. 트랜스-4-리드록시-L-프롤린의 제조에 관여하는 효소에 대해서는, L-프롤린 4-수산화효소를 닥틸로스포란지움 에스피, RH1 (Dactylosporangium sp. RH1) 로부터 정제했다는 보고 (특허공개공보 평7-322885), 및 상술한 스트렙토마이세스속에 속하는 미생물로부터 정제했다는 보고 [바이오케 미컬 저널 (Biochem. j .), 313 권, 185 ~191 쪽, (1996년)]가 있다. 또 2-케토글타르산 및 2가 철이온의 존재하에서, 유리 L-프롤린을 트랜스-4-히드록시-L-프롤린으로 변환시키는 활성을 갖는, L-프롤린 4- 수산화효소를 코드하는 유전자를 상술한 닥틸로스포란지움. 에스피. RH1 (Dactylosporangium sp. RH1) 로부터 클로닝하고, L-프롤린 4- 수산화효소 유전자를 함유하는 플라스미드 pRH71 을 취득하고, 또한 트립토판 탠덤 프로모터 지배하에서 L-플로린 4- 수산화효소 유전자를 발현시키는 플라스미드 pTr2-40H 를 구축하여 대장균에서 활성을 발현시켰다는 보고 (일본농예화학회 1996년도 대회, 강연요지집 257 쪽) 가 있다.

활성이 높은 L-프롤린 4- 수산화효소를 사용하여 공업적으로 유리하게 트랜스-4-리드록시-L-프롤린을 제조하는 방법이 요구되고 있다.

한편, 프롤린 생합성 경로에 관한 효소 및 그 유전자는 대장균 등에서 이미 분명해져 있다 [저널 오브 제너럴 마이크로바이올로지 (J. Gen. Microbiol.), 118 권, 287 ~ 293 쪽 (1980 년), 및 바이오키미카 바이오피지카 액터 (Biochim. Biophys. Acta), 104 권, 397 ~ 404 쪽 (1965 년)]. 또 프롤린 생합성은 예를 들면 대장균 등에서는 생합성 경로의 제1 효소인 감마-글루타밀 키나아제 (GK) 가 생성물인 프롤린의 피드백 저해를 받음으로써 조절되고 있는 것이 알려져 있다 [바이오키미카 바이오피지카 액터 (Biochim. Biophys. Acta), 192 권, 462 ~ 467 쪽 (1969 년)].

또한 GK를 코드하는 유전자 proB 에 변이를 생기게 함으로써 프롤린의 피드백 저해를 현저하게 감소시킨 GK 를 생성시켜서 프롤린 고생산주를 조성할 수 있다고 알려져 있다 [몰레큘러 제너럴 제네틱스 (Mo1. Gen. Genet.), 182 권, 82 ~ 86 쪽 (1981 년), 저널 오브 박테리올로지 (J . Bacteriol.), 156 권, 1249 ~1262 쪽 (1983 년), 및 저널 오브 박테리올로지 (J . Bacteriol .), 164 권, 1088 ~ 1093 쪽 (1985 년)], 상기 proB 에 변이를 일으킨 유전자로서 proB74 가 알려져 있고, proB74 의 변이점은 proB 코딩영역의 5' 말단에서부터 319 번째의 G 가 A 로 치환됨으로써, proB 단백의 N 말단으로부터 107 번째의 아스파라긴산이 아스파라긴으로 변화한다고 알려져 있다 [ 진 (Gene), 64권, 199 ~ 205 쪽 (1988 년)].

프롤린 분해에 관한 효소계, 그것을 코드하는 유전자, 유전자계의 제어에 대해서도, 대장균, 살모넬라균 등에서 연구가 진행되고 있어 잘 알려져 있다 [저너 오브 박테리올로지 ( J . Bacteriol .) , 146 권, 895 ~ 901 쪽 (1981 년), 저널 오브 몰레큘러 바이올로지 ( J . Mol . Biol . ), 148 권, 21 ~ 44 쪽 (1981 년)].

프롤린의 생합성계의 확성이 강화된 균주를 사용한 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 제조법은 알려져 있지 않다.

본 발명의 과제는 L-프롤린 4- 수산화효소를 사용하여 효율적으로 트랜스-4- 히드록시-L-프롤린을 제조하는 방법에 있어서, 보다 공업적으로 유리하게 트랜스-4- 히드록시-L-프롤린을 제조하기 위하여 L-프롤린 4- 수산화효소 유전자를 함유하고, 이를 높은 효율로 발현시키는 제조합체 DNA 를 보유하고, 또 프롤린 생합성계의 활성이 강화된 형질전환체를 제공하고, 그 형질전환체를 사용하여 트랜스-4- 히드록시-L-프롤린을 공업적으로 값싸게 제조하는 방법을 제공하는 것이 있다.

도 1은 플라스미드 pTr2-40H△ 의 조성 공정을 나타내는 도이다.

도면 중, 검은 굵은 선으로 나타낸 부분이 L-프롤린 4- 수산화효소 유전자를 함유하는 부분을 나타낸다. Ap 는 pBR322 유래의 암피시린 내성 유전자를, Ptrp×2 는 대장균 유래의 트립토판오페론의 프로모터를 두 개 직렬시킨 프로모터(탠덤 트립토판 프로모터) 를 나타낸다. 화살표는 유전자의 전사 및 번역 방향을 나타낸다. 또한, 도면 중에는 플라스미드의 조성에 관계된 제한 효소부위만을 나타내고 있다.

도 2 는 플라스미드 pWFH1 의 조성 공정을 나타내는 도이다.

도면 중, 빗금친 굵은 선으로 나타낸 부분이 Hind Ⅲ 및 Sal Ⅰ 처리한 PCR 증폭단편의 삽입부분을 나타낸다. 검은 굵은 선으로 나타낸 부분이 Dactylosporangium sp. RH1 유래의 L-프롤린 4- 수산화효소 유전자를 함유하는 부분을 나타낸다. Ap 는 pBR322 유래의 암피시린 내성 유전자를, Ptrp×2 는 대장균 유래의 트립토판오페론의 프로모터를 두 개 직렬시킨 프로모터 (탠덤 트립토판 프로모터) 를 나타낸다. 화살표는 유전자의 전사 및 번역 방향을 나타낸다.

도 3은 플라스미드 pBAB51 의 조성 공정을 나타내는 도이다.

도면 중, 검은 빗금으로 나타낸 부분이 프롤린 합성계 효소 유전자 proB74 및 proA 를 함유하는 부분이다. Ap 는 pBR322 유래의 암피시린 내성 유전자를, lacZ 는 β-갈락토시다아제α단편 구조 유전자를 나타낸다. Tc 는 pBR322 유래의 테트라사이클린 내성 유전자를 나타낸다. 화살표는 유전자의 전사 및 번역 방향을 나타낸다. 또한, 도면 중에는 플라스미드의 조성에 관계된 제한 효소부위만을 나타내고 있다.

도 4 는 플라스미드 pPRO74의 조성 공정을 나타내는 도이다.

도 중, 검은 빗금으로 나타낸 부분이 프롤린 합성계 효소 유전자 proB74 및 proA 를 함유하는 부분이다. 검게 칠한 부분은 proB74 와 proB 로 유일하게 다른 염기쌍을 함유하는 proB74 유전자의 일부분을 나타낸다. Tc 는 pBR322 유래의 테트라사이클린 내성 유전자를 나타낸다. 화살표는 유전자의 전사 및 번역 방향을 나타낸다. 또한, 도면 중에는 플라스미드의 조성에 관계된 제한 효소부위만을 나타내고 있다.

도 5 는 플라스미드 pPF1 의 조성 공정을 나타내는 도이다.

도면 중, 검은 굵은 선으로 나타낸 부분이 프롤린 함성계 효소 유전자 proB74 및 proA 를 함유하는 부분을 나타낸다. Cmr 은 Tn9 유래의 크로람페니콜 내성 유전자를 함유하는 부분을 나타낸다. pACYC.ori 는 pACYC184 유래의 복제개시 기점을, Plac 는 lac 프로모터를, lacZ 는 β-갈락토시다아제α단편 구조 유전자를 나타낸다. lacZ. Nterm-proB74 는 β-갈락토시다아제α단편 구조 유전자의 N 말단 부분과 proB74 유전자가 융합한 유전자를 나타낸다. 화살표는 유전자의 전사 및 번역 방향을 나타낸다. 또한, 도면 중에는 플라스미드의 조성에 관계된 제한 효소부위만을 나타내고 있다.

도 6 은 플라스미드 pBⅡ-40H 의 조성 공정을 나타내는 도이다.

도면 중, 검은 굵은 선으로 타나낸 부분이 L-프롤린 4- 수산화효소 유전자를 함유하는 부분을 나타낸다. Ap 는 pBR322 유래의 암피시린 내성 유전자를, lacZ 는 β-갈락토시다아제α단편 구조 유전자를 나타낸다. 화살표는 유전자의 전사 및 번역 방향을 나타낸다. 또한, 도면 중에는 플라스미드의 조성에 관계된 제한 효소부위만을 나타내고 있다.

도 7 은 플라스미드 pBⅡ-40HBA 의 조성 공정을 나타내는 도이다.

도면 중, 검은 굵은 선으로 나타낸 부분이 L-프롤린 4- 수산화효소 유전자를 함유하는 부분을 나타낸다. 검게 빗금친 부분은 프롤린 합성계 효소 유전자 proB74 및 proA 를 함유하는 부분을 나타낸다. Ap는 pBR322 유래의 암피시린 내성 유전자를, lacZ 는 β-갈락토시다아제α단편 구조 유전자를 나타낸다. 화살표는 유전자의 전사 및 번역 방향을 나타낸다. 또한, 도면 중에는 플라스미드의 조성에 관계된 제한 효소부위만을 나타내고 잇다.

도 8 은 플라스미드 pWFP1 의 조성 공정을 나타내는 도이다.

도면 중, 검은 굵은 선으로 나타낸 부분이 L-프롤린 4- 수산화효소 유전자를 함유하는 부분을 나타낸다. 검게 빗금친 부분은 프롤린 합성계 효소 유전자 proB74 및 proA 를 함유하는 부분을 나타낸다. Ap 는 pBR322 유래의 암피시린 내성 유전자를, lacZ 는 β-갈락토시다아제α단편 구조 유전자를 나타낸다. Ptrp×2 는 대장균 유래의 트립트판오페론의 프로모터를 두 개 직렬시킨 프로모터 (탠덤 트립토판 프로모터) 를 나타낸다. 화살표는 유전자의 전사 및 번역 방향을 나타낸다. 또한, 도면 중에는 플라스미드의 조성에 관계된 제한 효소부위만을 나타내고 있다.

도 9 는 플라스미드 pTr2-40H 의 조성 공정을 나타내는 도이다.

도면 중, 검은 굵은 선으로 나타낸 부분이 L-프롤린 4- 수산화효소 유전자를 함유하는 부분을 나타낸다. Ap 는 pBR322 유래의 암피시린 내성 유전자를, Ptrp×2 는 대장균 유래의 트립토판오페론의 프로모터를 두 개 직렬시킨 프로모터 (탠덤 트립토판 프로모터) 를 나타낸다. 화살표는 유전자의 전사 및 번역 방향을 나타낸다. 또한, 도면 중에는 플라스미드의 조성에 관계된 제한 효소부위만을 나타내고 있다.

본 발명은 2-케토글루타르산 및 2가 철이온의 존재하, 유리 L-프롤린에 작용하여 트랜스-4- 히드록시-L-프롤린을 생성하는, L-프롤린 4- 수산화효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자를 함유하는 DNA 단편을 벡터에 삽입하여 수득하는 제조합체 DNA 를 보유하고, 또 L-프롤린의 생합성계의 활성이 강화된 형질전환체, 및 그 형질전환체를 배양하고, 그 배양물, 균체 또는 이들의 처리물을 효소원으로 하여 2-케토글루타르산 및 2가 철이온의 존재하, 수성 매체 중에서 L-프롤린을 트랜스-4- 히드록시-L-프롤린으로 변환시키고, 생성된 트랜스-4- 히드록시-L-프롤린을 상기 수성 매체로부터 채집하는 것을 특징으로 하는 트랜스-4- 히드록시-L-프롤린의 제조법에 관한 것이다.

이하에 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 관계된 L-프롤린 4- 수산화효소는 2-케토글루타르산 및 2가 철이온의 존재하에서, 유리 L-프롤린을 수산화하여 트랜스-4- 히드록시-L-프롤린을 생성하는 효소이다.

본 발명의 L-프롤린 4- 수산화효소를 코드하는 DNA 를 함유하는 프라스미드로는 , 예를 들면 pRH71 을 들 수 있다. pRH71 을 함유하는 대장균인 Escherichia coli .SOLR/pRH71 은 1995년 3월 2일자로 공업기술원 생명공학 공업기숙 연구소, 일본국 이바라키현 쓰쿠바시 히가시 1쵸메 1방 3고 (우편번호 305) 에 FERM BP-5025 로서 기탁되어 있다.

L-프롤린 4- 수산화효소 유전자를 숙주 중에서 발현시키기 위해서는, 먼저 L-프롤린의 4- 수산화효소 유전자를 함유하는 DNA 단편을 제한효소류 혹은 DNA 분해효소류에서 L-프롤린 4- 수산화효소 유전자를 함유하는 적당한 길이의 DNA 단년으로 한 후에, 발현 벡터 중 프로모터의 하류에 삽입하고, 이어서 상기 DNA한 발현 벡터를 발현 벡터에 적합한 숙주 안으로 도입한다. 숙주로서는, 목적으로 하는 유전자를 발현시킬 수 잇는 것은 모두 사용할 수 있다. 예를 들면, 에셰리키아속, 세라티아속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 바실루스(Bacillus)속 등에 속하는 미생물 균주 외에, 호모균주나 동물세포 숙주 등을 들 수 있다.

발현 벡터로는, 상기 숙주에서 자립복제 가능 내지는 염색체 중으로의 삽입이 가능하고, L-프롤린 4- 수산화효소 유전자를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다.

대장균 등의 미생물을 숙주로 하여 사용하는 경우는, L-프롤린 4- 수산화효소 발현 벡터는 미생물 중에서 자립복제 가능함과 동시에, 프로모터, 리보솜 결합 배열, L-프롤린 4- 수산화효소 유전자, 전사 종결 배열로 구성되어 있는 것이 바람직하다. 프로모터를 제어하는 유전자가 함유되어 있어도 된다.

발현 벡터로는, 예를 들면 pBTtrp2, pBRac1, pBTac2 ( 모두 베링거만하임사로부터 시판), pKYP10 (특허공개공보 소58-110600), pKYP200 [애그리컬처럴 바이올로지컬 케미스트리 (Agric . Biol . Chem . ) , 48 권, 669 ~ 675 쪽 (1984 년)], pLSA1 [애그리컬처럴 바이올로지컬 케미스트리 (Agric . Biol . Chem . ) , 53 권, 277 쪽 (1989 년)], pGEL1 [프로시딩 오브 더 내셔널 아카데키 오브 사이언스 (Prec . Natl . Acad . Sci ., USA), 82 권, 4306 쪽 (1985 년)], pBluescript, (STRATAGENE사), pTrs30 [E. coli JM109/pTrS30 (FERM BP-5407) 로부터 조제] 및 pTrs32 [E. coli JM109/pTrS32 (FERM BP-5408) 로부터 조제]등을 예시할 수 있다.

프로모터로는 대장균 등의 숙주 안에서 발현할 수 있는 것이라면 어떤 것이라도 된다. 예를 들면 trp 프로모터 (Ptrp), lac 프로모터 (Plac), P_L프로모터, P_R프로모터 등의, 대장균이나 파지(phage) 등에서 유래하는 프로모터를 들 수 있다. 또 Ptrp 를 두 개 직렬시킨 프로모터 (Ptrp×2 ), tac 프로모터와 같이 인위적으로 설계 개변된 프로모터 등도 사용할 수 있다.

리보솜 결합 배열로는, 대장균 등의 숙주 안에서 발현할 수 있는 것이라면 어떤 것이라도 되지만, 리보솜 결합 배열과 개시 코돈의 사이를 적절한 거리 (예를 들면 6 ~ 18 염기) 로 조절한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.

L-프롤린 4- 수산화효소 유전자는 L-프롤린의 4- 수산화 효소를 코드하는 유전자라면 어떤 것이라도 사용할 수 있지만, 그 유전자의 DNA 배열을 숙주 미생물에서의 발현에 적합한 코돈이 되도록, 염기를 치환하여 사용함으로써 고발현화를 달성할 수 있다. 대장균을 숙주로 하여 발현에 적합한 코돈이 되도록 염기를 치환한 L-프롤린의 4- 수산화효소 유전자의 구체예로서, 배열번호 1 로 나타내는 염기 배열 등을 들 수 있다.

본 유전자의 발현에는 전사 종결 배열은 반드시 필요한 것은 아니지만, 적당하게는 구조 유전자 바로 아래에 전사 종결 배열을 배치하는 것이 바람직하다.

숙주로는, Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacines, Brevibacterium immariophilum ATCC14068, Brevibacterium saccharolyticum ATTC14066, Brevibacterium flavum ATT14067, Brevibacterium lactofermentum ATTC13869, Corynebacterium glutamicum ATTC13032, Corynebacterium acetoacidophilum ATTC13870, Microbacterium ammoniaphilum ATTC15354 등을 들 수 잇다.

효모균주를 숙주로 사용하는 경우에는, 발현 벡터로, 예를 들면 YEp13(ATCC37115), YEp24(ATCC37051), YCp50(ATCC37419) 등을 예시할 수 있다.

프로모터로는, 효모균주의 숙주 안에서 발현할 수 있는 것이라면 어떤 것이라도 된다. 예를 들면 헥소스키나아제 등의 해당계(解糖系) 유전자의 프로모터, gal 1 프로모터, gal 10 프로모터, 힛쇼크(heat shock) 단백질 프로머터, MF α 1 프로모터, CPU 1 프로모터 등의 프로모터를 들 수 있다.

숙주로는, Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius 등을 들 수 있다.

동물세포를 숙주로 사용하는 경우에는, 발현 벡터로, 예를 들면 pcDNA Ⅰ/Amp, pcDNA I, pcDM8 (모두 후나코시사로부터 시판) 등을 예시할 수 있다. 프로모터로는 동물세포의 숙주 안에서 발현할 수 있는 것이라면 어떤 것이나 된다. 예를 들면 인체 CMV의 IE(immediate early) 유전자의 프로모터 등의 프로모터를 들 수 있다. 또 인체CMV의 IE 유전자의 인헨서(enhancer)를 프로모터로 함께 사용해도 좋다. 숙주로는, 나마르바세포, HBT5637 (특허공개공보 소63-299), COS세포, CHO세포 등을 들 수 있다.

동물세포로의 DNA 도입법으로는, 동물세포에 DNA를 도입하는 것이 가능하다면 어떤 방법도 사용할 수 있다. 예를 들면, 일렉트로포레이션법 [Miyaji 등 : 사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133 (1990)], 인산칼슘법 (특허공개공보 평2-227075), 리포펙션법 [필립 엘 펠그너 (Philip L. Felgner) 등 : 프로시딩 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스 (Proc. Natl. Acad. Sci., USA), 84, 7413 (1987)] 등을 사용할 수 있다. 형질전환주의 취득 및 배양은 특허공개공보 평2-227075호, 혹인 특허공개공보 평2-257891 호에 기재되어 있는 방법에 준하여 행할 수 있다.

숙주를 프롤린 생합성계의 활성이 강화된 것으로 하기 위해서는, 1) 숙주중의 프롤린 합성계 유전자의 카피수를 증가시키고, 2) 프롤린에 의해 피드백 저해를 받는 프롤린 합성계 효소를 코드하는 유전자에 변이가 생기게 하여, 프롤린에 의한 피드백 저해가 현저하게 감소한 효소를 코드하는 유전자를 숙주에 도입하며, 3) 프롤린의 분해활성을 결여시키고, 또는 4) 이들을 조합시킴으로써 달성할 수 있다.

프롤린 합성계 유전자 또는 프롤린에 의한 피드백 저해가 현저하게 감소한 프롤린 합성계 효소를 코드하는 유전자는 숙주의 염색체상에 존재해도 되고, 또 플라스미드 등의 숙주 안에 벡터 위에 존재해도 된다.

프롤린에 의한 피드백 저해가 현저하게 감소한 프롤린 합성계 효소를 코드하는 유전자로는, proB74 유전자, DHP^rproB 유전자 [진 (gene), 39권, 109 ~ 112쪽, (1984년)] 등, 프롤린에 의한 피드백 저해가 현저하게 감소한 프롤린 합성계 효소를 코드하는 유전자를 들 수 있다.

또, 프롤린 합성계 유전자 또는 프롤린에 의한 피드백 저해가 현저하게 감소한 프롤린 합성계 효소를 코드하는 유전자를 프롤린 4-수산화 효소 유전자와 함께 플라스미드 등의 숙주 안에 벡터 위에 존재시키는 경우는, 양 유전자가 하나의 플라스미드 상에 존재하고 있어도 되고, 다른 공존가능한 플라스미드 상에 존재하고 있어도 된다.

공존가능한 플라스미드로는, 예를 들면 대장균에서는, 콜리신 E1 계의 플라스미드 (예, pBR322)와 pACYC계의 플라스미드, 콜리신 E1 계의 플라스미드와 F 인자계의 플라스미드, 콜리신 E1 계의 플라스미드와 R 인자계의 플라스미드 등을 들 수 있다.

프롤린 생합성계 유전자를 숙주 안에서 발현시키기 위해서는, 전술한 L-프롤린 4-수산화효소 유전자에서의 발현과 동일한 방법으로 사용할 수 있다.

숙주의 프롤린 분해활성을 결여시키기 위해서, 변이제로 숙주를 처리한 후, 예를 들면 세균 등에서는 Pro-TTC 플레이트 [어플라이드 앤드 인바이런멘탈 마이크바이올로지(Appl. Environ. Microbiol.), 33권, 434 ~ 444쪽, (1977년)] 상에서 백색의 콜로니를 형성하는 것을 선택함으로써 취득할 수 있다.

또한, 대장균 등에서는 put 유전자의 적당한 위치에 트랜스포손(transposon)이 삽입됨으로써 프롤린의 자화성(資化性)이 없어진다는 것이 알려져 있으므로 [제네틱스 (Genetics), 92권, 741 ~ 747쪽 (1979년)], 트랜스포손을 삽입한 후, 약제 내성이라고 전술한 Pro-TTC 플레이트에 의해, 프롤린 분해활성 결여주를 취득할 수도 있다.

또 트랜스포손에 의해 프롤린 분해활성이 결여한 주로부터 P1 트랜스덕션 [A Short Course In Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, J.H.Miller, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1922, Laboratory Manual, pp.263]에 의해 다른 균주로 프롤린 분해활성 결여라는 형질을 옮길 수 있다.

상기한 바와 같이 하여 프롤린 생합성계의 활성이 강화된 숙주를 사용하여 수득한 형질전환체의 배양은, 통상의 배양방법에 따라 행할 수 있다.

대장균이나 효모균 등의 미생물을 숙주로 사용한 형질전환체를 배양하는 배지는 미생물이 자화(資化)할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 형질전환체의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지라면 천연배지, 합성배지 어떤 것이라도 된다.

탄소원으로는, 각각의 미생물이 자화할 수 있는 것이면 좋고, 글루코스, 프룩토스(fructose), 슈크로스, 이들을 함유하는 당밀, 전분 또는 전분 가수분해 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알콜류를 사용할 수 있다.

질소원으로는, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄, 등의 각종 무기산이나 유기산의 암모늄염, 기타 함질소 화합물, 그리고 펩톤, 육(肉)엑기스, 효모엑기스, 콘스티플리커, 카제인 가수분해물, 대두박 및 대두박 가수분해물, 각종 발효균체 및 그 소화물 등을 사용할 수 있다.

무기물로는 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 황산동, 탄산칼륨 등을 사용할 수 있다.

배양은 진탕(振湯) 배양 또는 심부 통기 교반 배양 등의 호기적 조건하에서 행한다. 배양 온도는, 15 ~ 40℃가 좋고, 배양 시간은 통상 16 ~ 100시간이다. 배양 중 pH는 3.0 ~ 9.0으로 유지된다. pH의 조정은 무기 또는 유기산, 알칼리용액, 요소, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 행한다.

또 배양중 필요에 따라 암피시린이나 테트라사이클린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.

프로모터로 유동성 프로모터를 사용한 발현 벡터에서 형질전환한 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라 인듀서를 배지에 첨가하여도 된다. 예를 들면 lac 프로모터를 사용한 발현 벡터에서 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG) 등을, trp 프로모터를 사용한 발현 벡터에서 형질전환한 미생물을 배양할 때는 인돌아크릴산(IAA) 등을 배지에 첨가해도 된다.

동물세포를 숙주로 하여 사용한 형질전환체를 배양하는 배지는, 일반적으로 사용되고 있는 RPMI1640 배지, Eagle의 MEM 배지 또는 이들 배지에 소 태아 혈청 등을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.

배양은 5% CO₂존재하 등의 조건하에서 행한다. 배양 온도는 35 ~ 37℃가 좋고, 배양 시간은 통상 3 ~ 7일간이다.

또 배양중 필요에 따라 카나마이신, 페니실린 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다.

이렇게 배양하여 수득한 형질전환체 중에는, 유전자원으로 사용한 미생물 균주, 예를 들면 닥틸로스포란지움·에스피 RH1 등 및 pTr2-40H를 보유하는 재조합 대장균과 비교하여 L-프롤린 4-수산화효소가 현저한 양으로 생성축적되어 있고, 프롤린 생합성 활성도 강하고, 트랜스-4-히드록시-L-프롤린 제조를 유전자원으로 사용한 미생물 균주, 예를 들면 닥틸로스포란디움·에스피 RH1 등 및 pTr2-40H를 보유하는 재조합 대장균을 사용한 경우와 비교하여 더욱 효율적으로 행할 수 있다.

상기 형질전환체 중에 L-프롤린 4-수산화효소가 생성되어 있다는 것은, 배양물, 균체 또는 그들의 처리물을 효소반응에 적당한 수성 매체 중에 L-프롤린, 2가 철이온, 2-케토글루타르산과 함께 가하고 또 필요에 따라 계면활성제나 유기용제를 첨가함으로써, 생성되는 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 검출함으로써 알수가 있다. 생성된 L-프롤린 4-수산화효소의 활성은 하기 측정조건하, 1분간에 1 nmol의 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 생성하는 활성을 1 단위 (U)로 표시한다. 또 여기에서는 미생물 균체외에 동물세포를 포함해서 균체라고 부른다.

L-프롤린 4-수산화효소 활성의 측정 :

12 mM L-프롤린, 24 mM 2-케토글루타르산, 4 mM 황산제1철 및 8 mM L-아스코르빈산을 함유하는 240 mM의 MES [2-(N-몰포리노)에탄술폰산] 완충액 (pH 6.5)에 균체, 균체 처리물 또는 효소 표품 등을 첨가하여 합계 250μl로 하고 35℃, 10분간 반응한다. 반응액을 100℃, 2분간 가열하여 반응을 정지한 후에 반응액 중 생성된 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 고속액체 크로마토그래피(이하, HPLC로 약기한다)를 사용하여 정량한다.

정량에는 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 정량할 수 있는 방법이라면 어떠한 방법을 사용해도 되지만, 예를 들면 반응액 중의 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 배위자 교환 크로마토그래피 칼럼, 예를 들면 주식회사 스미카 분석센터제 SUMICHIRAL OA5000 등을 사용하여 HPLC로 분리용출 후, 7-클로로-4-니트로벤노-2-옥사-1, 3-디아졸(이하, NBD로 약기한다)에 의해 포스트 칼럼 유도체화하여 검출하는 방법(포스트 칼럼 유도체화법), 또는 반응액 중의 목적화합물을 미리 NBD 유도체화해 두고, 이것을 HPLC를 사용한 역상 크로마토그래피에 의해 NBD 유도체화물을 분리후 검출하는 방법 [William J. Lindbla and Robert F. Diegelmann, 어낼리티칼·바이오케미스트리(Analytical Biochemistry), 138권, 390 ~ 395쪽, 1984년] (프레칼럼 유도체화법) 등을 들 수 있다. NBD 유도체 측정에 의해 행해진다.

상기와 같이 하여 배양균체 중에 L-프롤린 4-수산화효소의 생성이 확인된 형질전환체를 상기한 형질전환체의 배양조건과 동일한 조건으로 배양하고, 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 생성 축적시키고 그 배양물로부터 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 채취함으로써 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 제조할 수 있다.

상기 배양에서, 필요에 따라 2-케토글루타르산 및 2가 철이온을 배양액 중에 첨가해도 된다.

본 발명에 의해 제조된 트랜스-4-히드록시-L-프롤린은, 상술한 포스트 칼럼 유도체화법이나 프레칼럼 유도체화법에 의해 정량 분석할 수 있다.

[실시예]

실시예 1L-프롤린 4-수산화효소 고발현 플라스미드의 구축

배열번호 2 기재의 DNA와 배열번호 3 기재의 DNA를 어플라이드·바이오시스템즈(Applied Biosystems) 사제 380A·DNA 합성기를 사용하여 합성하였다.

상기 합성 DNA의 3' 말단 25 bp는 서로 상보적인 배열이 되도록 설계되어 있다. 또한 상기 합성 DNA에는, Dactylosporangium sp. RH1 유래의 L-프롤린 4-수산화효소 단백의 N 말단부분을 코드하는 염기배열이 함유되어 있으나, 그 염기 배열에는 Dactylosporangium sp. RH1 유래의 염기배열을 대장균에서의 발현에 최적의 코돈이 되도록 부위 특이적인 염기 치환이 되어 있다.

상기 합성 DNA를 프라이머 또한 주형으로서 PCR을 행하였다.

PCR은 Pfu DNA 폴리머라아제 (STRATAGENE사제) 0.5 U, Pfu DNA 폴리머라아제 × 10 완충액 (STRATAGENE사제) 2μl, DMSO 2μl, 각 2.5 mMdNTP 액 1μl, 배열번호 2 기재의 합성 DNA와 배열번호 3 기재의 합성 DNA 각 2μM을 함유하는 반응액 20μl을 사용하여 96℃, 5분간 인큐베이션 후, 96℃ - 2분간, 50℃ -1분간, 75℃ - 1분간의 인큐베이션 공정을 35회 반복하는 조건으로 행하였다.

반응 종료후, 상기 반응액을 15% 폴리아크릴아미드겔 (아토 주식회사제, 파젤 NPU-15L) 전기 영동을 통해, 107 bp의 증폭 단편의 생성을 확인하였다.

상기 107 bp의 증폭 단편을 일본 에이드 주식회사제의 다빈치군 (펜터치 리커버리 NB-7000형)을 사용하여 회수후, 상기 107 bp의 DNA 단편의 양 말단을 HindⅢ 및 SalⅠ로 절단하였다.

상기 HindⅢ - SalⅠ 절단 단편을 Bio, Inc. 제 MERmaid Kit를 사용하여 회수하였다. 회수액량은 16μl가 되었다.

참고예 1에 기재한 방법에 따라 작성한 플라스미드 pTr2-40HDNA를 Bam HI 및 PvuⅡ로 절단 후, 반응액을 아가로스 겔 전기영동을 통해 2개의 단편이 생성되어 있는 것을 확인하였다. 상기 단편 중, L-프롤린 수산화효소의 구조 유전자를 함유하는 긴 단편을 바이오 래드 사제 Prep-A-gene을 사용하여 회수, 다카라 주조사제의 브랜팅 키트를 사용하여 말단을 평활화한 후, 다카라 주조사제의 라이게이션 키트를 사용하여 연결 환상화하였다.

상기 연결 환상화한 플라스미드를 사용하여 E.coli JM109 균주를 상법에 도포후, 37℃에서 하루 밤 배양하였다.

생육해 온 형질전환체의 콜로니로부터 상법에 따라 플라스미드를 추출, 그 구조를 제한효소 소화에 의해 확인하였다.

이상의 결과, pTr2-40H의 일부 배열을 삭제한 플라스미드 pTr2-40H△ (도 1)을 수득하였다.

취득한 플라스미드 pTr2-40H△DNA을 HindⅢ 및 SalⅠ으로 절단후, 그 절단 부위에 HindⅢ 및 SalⅠ처리한 상기 PCR 증폭 단편을 다카라 주조사제의 라이게이션 키트를 사용하여 삽입하였다.

수득한 플라스미드를 사용, E.coli XL1-Blue MRF' 주를 상법에 따라 형질전환하고, 그 형질전환체를 50㎍/㎖의 암피시린을 함유하는 LB 한천배지에 도포후, 37℃에서 하루 밤 배양하였다.

생육해 온 형질전환체의 콜로니로부터 상법에 따라 플라스미드를 추출, 플라스미드 pWFH1 (도 2)을 취득하였다.

상기 플라스미드의 구조를 제한 효소 소화에 의해 확인하였다. PCR 증폭 단편 삽입부분에 대해서는 어플라이드 바이오시스템즈사제의 염기배열 결정 키트(Taq DyeEeoxy^TMTerminator Cycle Sequencing Kit)를 사용하여 염기배열을 결정하였다. 그 염기배열을 배열번호 1로 나타낸다.

상기 플라스미드는 구조유전자의 5' 말단으로부터 SalⅠ부위에 있어서 Dactylosporangium sp. RH1 유래의 염기배열과 일부 다른 이외에는 Dactylosporangium sp. RH1 유래의 L-프롤린 4-수산화효소와 거의 같은 아미노산 배열을 코드하는 구조 유전자 DNA 단편이 Ptrp×2의 전사방향과 동방향으로 삽입된 구조를 가지고 있다 (도 2).

제 1 표에 나타낸 바와 같이, pWFH1을 보유하는 형질전환체는 유전자원으로 사용한 타크틸로스포란지움 에스피 RH1 주와 비교하여 1400배, pTr2-40H를 보유하는 형질전환체와 비교하여 약 5.4배의 L-프롤린 수산화효소를 생산하고 있다.

[표 1]

¹⁾: 균체 활성은 습균체 1mg 당의 효소활성 (U/mg wet cells)으로 표시하였다. 1U는 1분간당 1nmol의 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 생성하는 효소 활성으로 하였다.

²⁾: 상대 활성은 Dactylosporangium sp. RH1 균주가 생산하는 효소 활성을 1로 하여 표에 나타내었다.

³⁾: 참고예 2에 기재한 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 생성량으로부터 균체 활성을 산출하였다.

⁴⁾: 실시예 8에 기재한 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 생성량으로부터 균체 활성을 산출하였다.

실시예 2프롤린 분해계 결손주의 조성

E.coli ATCC12435의 프롤린 분해에 관여하는 유전자 putA를 이하의 방법으로 파괴하고 프롤린 분해계 결손주를 조성하였다.

국립 유전학 연구소 보존균주인 E.coli ME8395 균주 [F^-: pyrD34, trp-45 his-68 thyA25 thi deoR33 galK35 xyl-7 mtl-2 malA1 rpsL118 λ^R(λ)-appA1 putA::Tn5 (Mu⁺)]를 35㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 LB 배지의 식균, 철야 배양하였다.

상기 배양액 100μl에 P1 파지액 10μl를 첨가·혼합하여 5분간 방치하였다.

상기 배양액을 10mMCaCl₂를 함유하는 3㎖ 의 LB 한천배지와 혼합, 10mM CaCl₂를 함유하는 LB 한천배지상에 중층 후, 37℃에서 7시간 배양하였다.

배양 후, 수득한 한천배지 표면의 라이제트를 10mMCaCl₂를 함유하는 2ml의 LB 배지 중에 회수하였다.

상기 회수액에 0.5㎖ 의 클로로포름을 첨가하고 볼텍스믹서를 사용하여 혼합한후, 3000rpm으로 15분간 원심, 수득한 상층액을 P1 퍼지라이제트로 사용하였다.

상기 P1 퍼지라이제트액 50μl과 10mMCaCl₂를 함유하는 LB 배지에서 배양한 E.coli ATCC12435 배양객 100μl을 혼합하여 37℃에서 20분간 정치하였다.

상기 정치액을 에프·톱·사이트레이트(F-top-citrate : NaCl 8.5 g/l, 시트르산2나트륨 100mM, 한천 0.7%) 3㎖와 혼합하여 35㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 LB 한천배시상에 도포후, 37℃에서 1일 배양하였다.

상기 배양에 의해 생육해 온 카나미이신 내성주를 0.85%의 NaCl에 현탁한 후, Pro-TTC 플레이트 (K₂HPO₄7 g/l, KH₂PO₄3 g/l, MgSO₄0.1 g/l, 프로테오스펩톤 2 g/l, 2,3,5-트리페닐테트라졸륨클로라이드 0.025 g/l, L-Pro 2g/l, 한천 15 g/l, pH 7.2)에 도포하고 37℃에서 1 ~ 2일간 배양하였다.

상기 배양에 의해 Pro-TTC 플레이트 상에 백색의 콜로니를 형성한 균주를 프롤린을 분해 자화하는 능력을 잃은 주로 선택하고, 프롤린 분해활성 결손주 E.coli WT1 주를 취득하였다. 그 균주는 1996년 8월 7일자로 공업기술원 생명공학 공업기술연구소, 일본국 이바라키현 쓰쿠바시 히가시 1쵸메 1방 3고(우편번호 305)에 FERM BP-5618로 기탁되어 있다.

실시예 3프롤린 생합성계 유전자 proB74 및 proA 발현 플라스미의 구축

대장균 유래의 γ-글루타밀 키나아제(glutamyl kinase)를 코드하는 proB 유전자를 프롤린에 의한 피드백 저해에 대하여 탈감작된 변이형 유전자로 변환한 proB74 유전자 및 대장균 유래의 γ-글루타밀 포스페이트 리덕타아제(glutamyl phosphate reductase)를 코드하는 proA 유전자의 발현 플라스미드 pPF 1을 이하의 방법에 의해 구축하였다.

대장균 유래의 proB 및 proA 유전자를 함유하는 플라스미드 pPRO-1 [대장균 K83 주(FERM BP-2807)로부터 취득]을 Ero RV에서 소화하고, 아가로스 겔 전기영동 후, Prep-A-gene DNA 정제 시스템 (BIO-RAD사제)에서 proB 유전자의 일부를 함유하는 약 1kb의 DNA 단편을 취득하였다.

상기 DNA 단편을 pUC 19(다카라 주조사제)의 SmaⅠ 소화물과 연결하고 플라스미드 pBAB 51을 수득하였다 (도 3).

상기 플라스미드 중의 proB 유전자를 이하의 방법에 의해 공지 [A. M. Dandekar and S. L. Uratsu, J. Bacteriol. 170, 5943 (1988)]의 프롤린에 의한 피드백 저해에 대하여 탈감작된 변이형 유전자 proB74로 변환하였다.

배열번호 4에 나타낸 올리고누클레오티드 A1 및 배열번호 5에 나타낸 올리고누클레오티드 A2를 어플라이드·바이오시스템즈(Applied Biosystems) 사제 380A·DNA 합성기를 사용하여 합성하였다.

올리고누클레오티드 A1과 M13 프라이머 M3 (다카라 주조사제, 카탈로그 No.3831)를 일조의 프라이머로 하여 pBAB51을 주형으로 사용하여 PCR법에 의해 변이형 proB 유전자인 proB74 유전자의 부분배열을 증폭하였다.

PCR은, pBAB51을 0.1㎍, 올리고누클레오티드 A1과 M13 프라이머 M3을 각 2 μM, Taq DNA 폴리머라아제 (다카라 주조사제)를 1U, dNTP 믹스처 (다카라 주조사제, 카탈로그 No. 4030)를 1.6 μl, 첨부 버퍼 2 μl을 함유하는 반응액 20 μl를 사용, 94℃ -30초간, 52℃ - 30초간, 72℃ - 1분간의 인큐베이션 공정을 30회 반복, 최후에 72℃ - 5분간 인큐베이션함으로써 행하였다.

동일한 방법으로 올리고누클레오티드 A2과 M13 프라이머 RV (다카로 주조사제, 카탈로그 No. 3830A)를 일조의 프라이머로 하여 pBAB51을 주형으로 사용하고, PCR 법에 의해 변이형 proB 유전자의 부분배열을 증폭하였다.

PCR 법에 의해 증폭된 상기 2 종류의 DNA를 각각 아가로스 겔 전기영동한 후, Prep-A-gene DNA 정제 시스템(BIO-RAD사제)을 사용하여 정제하였다.

상기 2종의 정제 DNA 단편을 혼합한 것을 주형으로 하고, M13 프라이머 M3 및 M13 프라이머 RV를 프라이머를 사용, 상기와 동일한 방법에 의해 PCR 및 정제를 행하고, proB74 유전자의 염기배열을 함유하는 약 1 kb의 DNA 단편을 취득하였다.

상기 DNA 단편은 Eco 065Ⅰ 및 SacⅡ로 소화하고, Eco 065Ⅰ-SacⅡ 소화단편을 취득하였다.

상기 소화단편과 pPRO-1의 Eco 065Ⅰ-SacⅡ 소화 DNA 단편 (약 6.8 kbp)을 연결하여 pPRO-1의 proB 유전자를 탈감작형 proB74 유전자로 변환한 플라스미드 pPRO74를 제작하였다 (도 4).

배열번호 6에 나타낸 올리고누클레오티드 p1 및 배열번호 7에 나타낸 올리고누클레오티드 p2를 어플라이드·바이오시스템즈(Applied Biosystems) 사제 380A·DNA 합성기를 사용하여 합성하였다.

상기 p1, p2를 프라이머로 하고 플라스미드 pPRO74를 주형으로 사용하여 PCR 법에 의해 proB74 및 proA 유전자를 증폭하였다.

PCR은 pPRO74를 0.1 ㎍, p1, p2를 각 2μM, 다카라·이엑스·타크(TaKaRa Ex taq : 다카라 주조사제, 코드 RR001Q) 1U, dNTP 믹스처 (다카라 주조사제, 카탈로그 No. 4030)를 1.6 μl 함유하는 반응액 20 μl 를 사용하여 94℃ - 1분간, 42℃ - 2분간, 72℃ - 3분간의 인큐베이션 공정을 30회 반복함으로써 행하였다.

상기 반응액을 아가로스 겔 전기영동을 통하여 proB74 및 proA를 함유하는 2370 bp의 증폭 단편을 상법에 의해 추출하고, GENECLEAN Ⅱ KIT (BIO 101, INC.제)를 사용하여, DNA 단편을 회수하였다. 회수한 2370 bp의 DNA 단편을 HindⅢ 및 Bam HI으로 절단후, 에탄올 침전법에 의해 에탈올 침전을 수득하였다. 상기 에탄올 침전을 5μl 의 TE에 의해, proB74 및 proA 단편으로 사용하였다.

상기 proB74 및 proA 단편과 플라스미드 pSTV29 (다카라 주조사제)의 HindⅢ - Bam HI 소화 DNA 단편을 다카라 주조사제의 DNA 라이게이션 키트를 사용하여 연결하고 proB74 및 proA 단편이 삽입된 플라스미드를 구축하였다.

상기 플라스미드를 E.coli JM109 균주를 상법에 따라 형질변환후, 30㎍/㎖의 크로람페니콜, 0.1 mM IPTG, 40 ㎍/㎖의 X-Gal을 함유하는 LB 한천배지에 도포하여 37℃에서 하루 밤 배양하였다.

상기 배양에 의해 백색 콜로니를 형성한 균주로부터 상법에 따라 플라스미드를 추출하고, 그 플라스미드의 구조를 제한효소 소화에 의해 확인하였다.

상기 방법에 의해 탈감작형 γ-글루타밀 키나아제(glutamyl kinase)의 N 말단에 β-갈락토시다제의 α 단편의 N 말단 8 아미노산 잔기 (lacZ.Nterm)가 결합한 융합단백을 코드하는 유전자 및 proA 유전자가 Plac 지배하에 존재하는 플라스미드 pPF1을 취득하였다 (도 5).

상기 융합단백의 구조 유전자 (lacZ. Nterm-proB74)의 염기배열과 아미노산

실시예 4프롤린 생합성계 유전자 발현 플라스미드를 함유하는 형질전환체에 의한 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 생산

실시예 3에서 구축한 플라스미드 pPF1을 사용해서 실시예 2에서 취득한 E.coli WT1 균주을 형질전환하여 형질전환주 E.coli WT1/pPF1을 취득하였다.

실시예 1에서 구축한 프롤린 4-수산화효소 발현 플라스미드 pWFH1로 실시예 2에서 취득한 WT1 균주를 형질전환하여 E.coli WT1/pWFH1을 수득하였다.

상기 형질전환주 E.coli WT1/pWFH1로부터 염화칼슘법으로 컨피턴트 셀을 제작, 실시예 3에서 제작한 플라스미드 pPF1을 도압하고 양 플라스미드를 보유하는 형질전환주 E.coli WT1/pWFH1/pPF1을 30㎍/㎖의 크로람페니콜과 50㎍/㎖의 암피시린을 함유하는 LB 배지에서 생육해 온 콜로니를 선택함으로써 취득하였다.

WT1, WT1/pPF1, WT1/pWFH1 및 WT1/pWFH1/pPH1을 각각 카나마이신 37.5 ㎍/㎖, 암피시린 100 ㎍/㎖, 크로람페니콜 30 ㎍/㎖, 그리고 암피시린 100 ㎍/㎖ 및 크로람페니콜 30 ㎍/㎖을 함유하는 LB 배지에서 37℃로 16시간 배양하였다.

상기 배양액 각각 100 μl을 2%(W/V)의 탄산칼슘을 함유하는 10㎖의 Med 7 배지 (글루코스 2%, 황산암모늄 1%, K₂HPO₄0.1%, NaCl 0.2%, MgSO₄0.05%, FeSO₄0.0278%, CaCl₂0.0015%, 펩톤 0.8%)를 넣은 큰 시험관 (ψ20×200mm)에 식균하여 30℃에서 24시간 배양하였다.

상기 배양 상층액 중의 L-프롤린 및 트랜스-4-히드록시-L-프롤린 함량을 표 2에 나타내었다.

[표 2]

프롤린 생합성계 유전자 발현 플라스미드 pPF1 보유균주에서는 L-프롤린의 생성이 현저하게 증가하고, L-프롤린 4-수산화효소 발현 플라스미드 pWFH1 및 프롤린 생합성계 유전자 발현 플라스미드 pPF1이 공존하는 형질전환체에서는 L-프롤린 4-수산화효소 발현 플라스미드를 단독으로 보유하는 형질전환체에 비히여 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 생성량이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5L-프롤린 4-수산화효소와 프롤린 생합성계 유전자 proB74 및 proA 발현 플라스미드의 구축

Dactylosporangium sp. RH1 유래의 L-프롤린 4-수산화효소 유전자, 프롤린 생합성계 유전자 proB74 및 proA의 모든 유전자를 단일 플라스미드 상에 보유하고, 이것을 발현시킬 발현 플라스미드 pWFP1을 이하의 방법에 의해 구축하였다.

실시예 1에서 작성한 pWFH1을 주형으로 하고, PCR 법으로 L-프롤린 4-수산화효소의 구조 유전자를 증폭하였다.

PCR 은 pWFH1 플라스미드 0.1㎍, Pfu DNA 폴리머라아제 (stratagene사제) 0.5 U, Pfu DNA 폴리머라아제용 × 10 완충액 (STRATAGENE 사제) 2μl, DMSO 2μl, 각 2.5 mMdNTP 액 1 μl, 배열번호 9 기재의 합성 DNA와 배열번호 10 기재의 합성 DNA 각 2μM을 함유하는 반응액 20μl을 사용하여 96℃, 5분간의 인큐베이션 후, 96℃ - 2분간, 58℃ - 1분간, 75℃ - 3분간의 인큐베이션 공정을 30회 반복하는 조건으로 행하였다.

반응종료 후, 그 반응액을 아가로스 겔 전기영동으로, L-프롤린 4-수산화효소 유전자를 함유하는 약 800 bp의 증촉 단편을 상법에 의해 추출하고, GENECLEAN Ⅱ KIT (BIO 101, INC. 제)를 사용하여 상기 DNA 단편을 회수하였다.

그 회수 DNA 단편은 HindⅢ 및 Eco RⅠ으로 절단후, 아가로스 겔 전기영동을 하고 GENECLEAN Ⅱ KIT (BIO 101, INC. 제)를 사용하여 L-프롤린 4-수산화효소 유전자를 가지는 HindⅢ - Eco RⅠ절단 DNA 단편을 회수하였다.

상기 L-프롤린 4-수산화효소 유전자 단편과, 플라스미드 pBluescript Ⅱ KS(+) (stratagene사제)의 HindⅢ - Eco RⅠ소화 DNA 단편을 다카라 주조사제의 DNA 라이게이션 키트를 사용하여 연결하고, L-프롤린 4-수산화효소 단편이 삽입된 플라스미드 pBⅡ - 4 OH를 구축하였다 (도 6).

실시예 3에서 작성한 pBRO74를 주형으로 하고 PCR 법으로 proB74 및 proA 유전자를 증폭하였다.

PCR은 pPRO74 플라스미드 0.1 ㎍, 타카라·엑스·타크 (Takara Ex Taq : 다카라 주조사제, 코드 RR001Q) 1U, 타카라·이엑스·타크 용 × 10완충액(다카라 주조사제) 2μl, 각 2.5 mMdNTP 액 1.6 μl, 배열번호 11 기재의 합성 DNA 94℃ - 1분간, 42℃ - 2분간, 75℃ - 3분간의 인큐베이션 공정을 30회 반복하는 조건에서 행하였다.

반응종료 후, 그 반응액을 아가로스 겔 전기영동을 통해, proB74 및 proA 유전자를 함유하는 약 2.3 kbp의 증폭 단편을 상법에 의해 추출하고, GENECLEAN Ⅱ KIT (BIO 101, INC. 제)를 사용하여, DNA 단편을 회수하였다. 회수한 DNA 단편을 BamHI 및 Eco R I 로 절단후, 페놀/클로로포름 처리, 에탄올 침전을 행하고 그 DNA 단편을 회수하였다. 이 proB74 및 proA 유전자를 함유하는 DNA 단편과 상기 플라스미드 pBII-40H의 HindⅢ - Eco R I 소화 DNA 단편을 다카라 주조사제의 DNA 라이게이션 키트를 사용하여 연결하고 L-프롤린 4-수산화효소 유전자, proB74 및 proA를 함유하는 플라스미드 pBII-40HBA를 구축하였다 (도 7).

플라스미드 pBII-40HBA를 HindⅢ 및 Bam HI로 소화, 아가로스 겔 전기영동을 하고, L-프롤린 4-수산화효소 유전자, proB74 및 proA를 함유하는 약 3.16 kbp의 DNA 단편을 취득하였다. 또한 실시예 1에서 작성한 pWFH1을 HindⅢ 및 Bam HI로 소화하고, 아가로스 겔 전기영동을 통해 L-프롤린 4-수산화효소 유전자를 함유하지 않고 복제 재시점을 함유하는 쪽의 약 2.6 kbp의 DNA 단편을 취득하였다. 취득한 2개의 DNA 단편을 다카라 주조사제의 DNA 라이게이션 키트를 사용하여 연결, 트립토판 탠덤 프로모터 하에서 L-프롤린 4-수산화효소, proB74 단백 및 proA 단백을 발현시키게 하는 플라스미드 pWFP1을 구축하였다 (도 8).

실시예 6형질전환체 E.coli WT1/pWFH1/pPF1 및 E.coli WT1/pWFP1을 사용한 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 생산

형질전환주 WT1/pWFH1/pPF1주를 암피시린 100 ㎍/㎖ 및 크로람페니콜 30 ㎍/㎖을 함유하는 50 ㎖ Med4G 배지 [글루코스 2%, 폴리펩톤 (일본제약사제) 1%, 이스트엑스트락트 (Difco 사제) 0.5%, NaCl 1%, 탄산칼슘 2%, pH 7.0]에, 형질전환주 WT1/pWFH1 주를 암피시린 100 ㎍/㎖ 을 함유하는 50 ㎖ Med4G 배지에 각각 균식한 후, 30℃에서 16시간 진탕 배양하였다.

상기 배양액을 종 배양액으로 하여 2리터의 Med7 배지를 넣은 5리터 재퍼멘터에 각각 식균, WT1/pWFH1/pPF1주의 배양에서는, 암피시린 100 ㎍/㎖ 및 크로람페니콜 30 ㎍/㎖ 을 더 첨가하여, 배양온도 30℃, 교반수 400 회전/분, 통기량 1리터/배양객 1리터/분의 조건에서 배양하였다.

또 WT1/pWFH1/pPF1의 배양에서는, 배양 8시간째에 IPTG를 0.2 mM이 되도록 첨가하였다.

또 양 균주 모두, 배양 24시간째에 배양개시시와 동종, 동농도의 항생물질을 첨가하였다.

배양중, 글루코스를 거의 1%의 농도가 되도록 적시에 배양액에 첨가, NH₄OH를 사용하여 pH 6.5로 하한 컨트롤하였다. 또 배양 5시간 이후에 교반수를 250 ~ 700 rpm으로 변화시킴으로써 배양액의 용존산소 농도가 배양개시 시점의 1/15가 되도록 컨트롤하였다.

99시간 배양후, 상기 배양액을 원심분리하고 수득한 상층액 중의 트랜스-4-히드록시-L-프롤린 함량을 정량한 경과, WT1/pWFH1/pPF1주에서 156 mM (20.5 g/l), WT1/pWFH1 주에서 191 mM (25.0 g/l)의 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 생성축적이 확인되었다.

실시예 7L-프롤린 4-수산화효소 유전자 및 프롤린 생합성계 유전자 발현 플라스미드를 함유하는 형질전환체에 의한 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 생산

실시예 5에서 구축한 플라스미드 pWFP1을 사용하여 실시예 2에서 취득한 E.coli WT1 주를 형질전환하여, 형질전환주 E.coli WT1/pWFP1을 취득하였다.

WT1/pWFP1을 암피시린 100 ㎍/㎖ 을 함유하는 LB 배지에서 37℃로 16시간 배양하였다. 그 배양액 100 μl 을 2%(W/V)의 탄산칼슘을 함유하는 10 ㎖의 Med7 배지를 넣은 큰 시험관 (ψ 20 × 200mm)에 식균, 30℃에서 24시간 배양하였다.

상기 배양 상층액 중의 L-프롤린은 0.56 g/L 이고, 트랜스-4-히드록시-L-프롤린은 2.4 g/L 이었다.

실시예 8 형질전환체의 균체를 사용한 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 생산

형질전환체 E.coli ATT12435/pTr2-40H를 50 ㎍/㎖의 암피시린을 함유하는 3 ㎖ LB 배지에 식균하여 30℃, 하루 밤 진탕배양 후, 그 배양액을 원심분리하여 E.coli ATCC12435/pTr2-40H의 습균체를 취득하였다.

형질전환체 E.coli ATCC12435/pWFH1을 암피시린 100 ㎍/㎖ 을 함유하는 100 ㎖ Med4 배지 [폴리펩톤 (일본제약) 1%, 이스트엑스트락트 (Difco) 0.5%, NaCl 1%]에 식균하여 30℃에서 16시간 진탕 배양하였다.

그 배양액을 2리터의 Med7 배지 (글루코스 2%, 황산암모늄 1%, K₂HPO₄0.1%, NaCl 0.2%, MgSO₄0.05%, FeSO₄0.027%, CaCl₂0.0015%, 펩톤 0.4%)를 넣은 5리터 재퍼멘트에 식균 후, L-Pro를 200 mM 첨가하고 배양온도 33℃, 통기량 1리터/배양액 1리터/분이라는 조건에서 48시간 배양하였다.

용존산소 농도가 초기치의 1/15 에 달한 시점에서 교반수 400 회전/분을 기준으로 하여 700 회전/분을 상한으로 하여 교반수를 변화시킴으로써 용존산소 농도를 초기치의 1/15 이 되도록 컨트롤하였다.

배양중, 글루코스는 없어지지 않도록, L-프롤린은 약 50 mM 이 되도록 적시에 첨가하여 NH₄OH 를 사용하여 pH 6.5 로 하한 컨트롤하였다.

상기 배양에 의해 수득한 배양액을 원심분리하여 E.coli ATCC12435/pWFH1의 습균체를 취득하였다.

상기 양 균주의 습균체는 필요에 따라 -20℃에서 동결보존하는 것이 가능하고, 사용할 때에 해동하여 사용할 수 있다.

반응액 [240 mM 의 MES 완충액 (ph 6.5) 중에, 12 mM L-프롤린, 24 mM 2-케토글루타르산, 4 mM 황산제1철 및 8 mM L-아스코르빈산을 함유한다] 250 μl 에 습균체량으로 4% (W/V)가 되도록 가하여 35℃에서 10분간 반응하였다. 반응액을 100℃, 2분간 가열함으로써 반응을 정지하였다.

상기 반응 정지액을 원심분리하여 수득한 상층액 중의 트랜스-4-히드록시-L-프롤린 함량을 정량한 결과, E.coli ATCC12435/pTr2-4OH 균주에서 3 mmol/l, E.coli ATCC12435/pWFH1 균주에서 16 mmol/l 의 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 생산이 인정되었다. L-프롤린 4-수산화효소에 대한 균체 활성은 각각, 7.5 및 4 OU/mg·습윤 세포(wet cells)였다.

참고예 1L-프롤린 4-수산화효소 발현 플라스미드의 구축

배열번호 13 기재의 센스 사슬 DNA 프라이머와 배열번호 14에 기재된 안티센스 사슬 DNA 프라이머를 어플라이드·바이오시스템조 (Applied Biosystems) 사제 380A·DNA 합성기를 사용하여 합성하였다. 상기 합성 DNA를 프라이머로 하여 pRH71 [상기 플라스미드를 함유하는 Escherichia coli SOLR/pRH71 (FERM BP-5025)로부터 정법에 의해 취득]을 주형으로 하여 PCR 을행하였다.

PCR은 pRH71을 0.1 ㎍, 센스 사슬 및 안티센스 사슬 DNA 프라이머 각 2 μM, Pfu DNA 폴리머라아제 (STRATAGENE사제) 0.125 U/μl, DMSO 10%, Tris·HCl (pH 8.2) 20 mM, KC 110 mM, 황산암모늄 6 mM, 염화마그네슘 2 mM, TritonX-1000. 1%, 소 혈청 알부민 10 ng/μl 를 함유하는 반응액 20 μl 를 사용하여 96℃, 5분간의 인큐베이션 후, 96℃ - 2분간, 58℃ - 1분간, 75℃ - 1분간의 인큐베이션 공정을 30회 반복으로 조건으로 행하였다.

반응종료 후, 그 반응액을 아가로스 겔 전기영동을 하여 L-프롤린 4-수산화효소의 구조 유전자를 코드하여 844 bp의 증폭 단편이 생성되어 있는 것을 확인하였다.

상기 844 bp의 증폭 단편을 아가로스 겔로부터 상법에 의해 추출하고, 바이오래드사제의 Prep-A-gene을 사용하여 단편을 회수하였다. 회수한 844 bp의 DNA 단편의 양 말단을 HindⅢ 및 BamHI 로 절단후, 에탄올 침전법에 의해 에탄올 침전을 수득하였다. 상기 에탄올 침전을 5 μl 의 TE에 용해하였다.

pBR 322를 기본으로 하여 Ptrp를 2개 직렬시킨 프로모터 Ptrp×2 를 가진 플라스미드 pKYP200 [애그리컬처럴·바이올로지컬·케미스트리 (Agric, Biol. Chem), 48권, 669 ~ 675쪽 (1984년)]과 합성 링커를 조합시켜서 제작된 ATG 벡터 pTrS32 [E. coli JM109/pTrS32 (FERM BP-5408) 로부터 조제] 를 HindⅢ 및 Bam HI 로 절단하였다. 그 절단부위에 HindⅢ 및 Bam HI로 절단처리한 상기의 L-프롤린 4-수산화효소 구조 유전자 단편을 다카라 주조사제의 라이게이션 키트를 사용하여 삽입하였다.

수득한 플라스미드를 사용하여 E.coli XL1-Blue MRF' 균주를 상법에 따라서 형질전환하고, 그 형질전환체를 50 ㎍/㎖ 의 암피시린을 함유하는 LB 한천배지에 도포후, 37℃에서 하루 밤 배양하였다.

생육해 온 형질전환체의 콜로니로부터 상법에 따라 플라스미드를 추출하고, 그 구조를 제한 효소 소화에 의해 확인하였다. 구조 유전자 부분에 대해서는 어플라이드 바이오시스템즈사제의 염기배열 결정 키트 (Taq DyeDeoxy^TMTerminator Cycle Sequencing Kit)를 사용하여 염기배열을 결정하고, 배열번호 15에서 나타낸 염기배열인 것을 확인하였다.

이 방법에 의해 Ptrp×2의 전사방향과 같은 방향으로 L-프롤린 4-수산화효소의 구조 유전자를 코드하는 DNA 단편이 삽입된 플라스미드 pTr2-4OH (도 9)를 수득하였다.

참고예 2닥틸로스포란디움·에스피의 균체를 사용한 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 생산

SR 3 배지 (글루코스 10.%, 가용성 전분 1.0%, 효모엑기스 0.5%, 트립톤 0.5%, 육엑기스 0.3% 및 인산마그네슘 0.05%를 함유하고, 6N NaOH에서 pH 7.2로 조정한 배지)를 시험관에 10㎖ 씩 나누어 주입하고 120℃, 20분간 살균하였다. 이 배지에, HT 한천평판배지에서 생육한 닥틸로스포란디움 에스피(Dactylosporangium sp.) RH1을 한 루프(loop)만큼 떠서 식균하여 28℃, 2일간 진탕 배양하고 종 배양액으로 사용하였다.

Df 1 배지(가용성 전분 5%, 소이빈밀 1.5%, 인산1칼륨 0.05%, 황산마그네슘 7수염 0.05% 및 탄산칼슘 0.5%를 함유, 6 N NaOH에서 pH 7.0으로 조정한 배지)를 시험관에 10㎖씩 나눠서 주입하여 120℃, 20분간 살균하였다. 이 배지에 상기 종 배양액 1㎖를 무균적으로 접종하여 28℃, 2일간 진탕 배양하였다.

수득한 배양액을 8000 rpm, 10분간, 4℃에서 원심분리하고 균체를 취득하였다.

상기 균체를 80 mMTES [N-트리스(히드록시메틸)메틸-2-아미노에탄술폰산] 완충액 (pH 7.5)으로 세정후, 원심분리하여 습균체를 취득하였다.

그 습균체 150mg을 1.5㎖의 반응액 [4 mM L-프롤린, 8 mM α-케토글루타르산, 4 mM L-아르코르빈산, 2 mM 황산제1철을 함유하는 80 mMTES 완충액 (pH 7.5)에 나이밍 용액 (나이밍 S-215 (일본유지주식회사제) 4g을 크실렌 10㎖에 용해)을 1.4% (v/v) 첨가] 에 현탁하여 30℃, 30분간 반응을 행하였다.

반응종료 후, 그 반응액을 원시분리하고 수득한 상층액 중의 트랜스-4-히드록시-L-프롤린 함량을 정량한 결과, 84 μmol/l 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 생산이 인정되었다. 그 균주에서의 L-프롤린 4-수산화효소에 대한 균체 활성은 0.028 U/mg·습윤 세포(wet cells)였다.

본 발명에 의하면 의학품의 합성원료 또는 식품첨가물로서 유용한 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 공업적으로 제조하는 방법, 그 방법에 유용한 L-프롤린 4-수산화효소 유전자를 함유하고, 또 프롤린 합성계의 활성이 강화된 형질전환체를 제공할 수 있다.

[배열표]

배열번호 : 1

배열의 길이 : 816

배열의 형태 : 핵산

사슬의 수 : 두 줄 사슬

토폴로지 : 직쇄상

배열의 종류 : 다른 핵산

[배열 1]

배열번호 : 2

배열의 길이 : 64

배열의 형태 : 핵산

토폴로지 : 한 줄 사슬

배열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[배열 2]

TGAGGAAAGC TTATGCTGAC CCCGACCGAA CTGAAACAGT 40

ATCGTGAAGC GGGCTATCTG CTGA 64

배열번호 : 3

배열의 길이 : 66

배열의 형태 : 핵산

토폴로지 : 한 줄 사슬

배열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[배열 3]

CCGGAATTCG TCGACTTCAC GCGGGCCCAG GCCATCTTCA 40

ATCAGCAGAT ACGATA 66

배열번호 : 4

배열의 길이 : 22

배열의 형태 : 핵산

토폴로지 : 한 줄 사슬

배열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[배열 4]

GACCCGTGCT AATATGGAAG AC 22

배열번호 : 5

배열의 길이 : 22

배열의 형태 : 핵산

토폴로지 : 한 줄 사슬

배열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[배열 5]

GTCTTCCATA TTAGCACGGG TC22

배열번호 : 6

배열의 길이 : 33

배열의 형태 : 핵산

토폴로지 : 한 줄 사슬

배열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[배열 6]

GGCAAAGCTT CATGAGTGAC AGCCAGACGC TGG33

배열번호 : 7

배열의 길이 : 33

배열의 형태 : 핵산

토폴로지 : 한 줄 사슬

배열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[배열 7]

TTTGCAGGAT CCGGTTTTAT TTACGCACGA ATG33

배열번호 : 8

배열의 길이 : 1125

배열의 형태 : 핵산

사슬의 수 : 두 줄 사슬

토폴로지 : 직쇄상

배열의 종류 : 다른 핵산

[배열 8]

배열번호 : 9

배열의 길이 : 37

배열의 형태 : 핵산

토폴로지 : 한 줄 사슬

배열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[배열 9]

TATCGATAAG CTTATGCTGA CCCCGACCGA ACTGAAA37

배열번호 : 10

배열의 길이 : 33

배열의 형태 : 핵산

토폴로지 : 한 줄 사슬

배열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[배열 10]

GGCAGAATTC TAGACGGGCT GGGCCAGCGC GAA33

배열번호 : 11

배열의 길이 : 38

배열의 형태 : 핵산

토폴로지 : 한 줄 사슬

배열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[배열 11]

AAAATTGAAT TCCAGACAAT CATGAGTGAC AGCCAGAC38

배열번호 : 12

배열의 길이 : 36

배열의 형태 : 핵산

토폴로지 : 한 줄 사슬

배열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[배열 12]

ACCCGGATCC ATTTACGCAC GAATGGTGTA ATCACC36

배열번호 : 13

배열의 길이 : 37

배열의 형태 : 핵산

토폴로지 : 한 줄 사슬

배열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[배열 13]

GTGAGGAAAG CTTATGCTGA CCCCGACGGA GCTCAAG37

배열번호 : 14

배열의 길이 : 36

배열의 형태 : 핵산

토폴로지 : 한 줄 사슬

배열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[배열 14]

GCCTGCGGGA TCCTAGACGG GCTGGGCCAG CGCGAA36

배열번호 : 15

배열의 길이 : 816

배열의 형태 : 핵산

사슬의 수 : 두 줄 사슬

배열의 종류 : Genomic DNA

기원

생물명 : Dactylosporangium sp.

주명 : RH1

특징을 결정한 방법 : E

[배열 15]

Claims

2-케토글루타르산 및 2가 철이온의 존재하, 유리 L-프롤린에 작용하여 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 생성하는, L-프롤린 4-수산화효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자를 함유하는 DNA 단편을 벡터에 삽입하여 수득하여 재조합체 DNA을 보유하고, 또 L-프롤린의 생합성계의 활성이 강화된 형질 전환체.
제 1 항에 있어서, L-프롤린 생합성계의 활성의 강화가 숙주 중의 프롤린 합성계 유전자의 카피수를 증가시키는, 프롤린에 의해 피드백 저해를 받는 프롤린 합성계 효소 유전자에 변이를 낳게 하고, 프롤린에 의한 피드백 저해가 현저하게 감소한 효소를 코드하는 유전자를 숙주에 도입하는, 프롤린의 분해활성을 결여시키는, 또는 이들을 조합시킴으로써 달성되는 것을 특징으로 하는 형질 전환체.
제 1 항에 있어서, L-프롤린 생합성계의 활성의 강화가, L-프롤린의 생합성에 관한 효소를 코드하는 유전자의 도입에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는 형질 전환체.
제 3 항에 있어서, 유전자가 대장균 유래의 proB 및 proA 유전자인 것을 특징으로 하는 형질 전환체.
제 3 항에 있어서, 유전자는 L-프롤린에 의한 피드백 저해가 저감한 프롤린 생합성에 관한 효소를 코드하는 유전자인 것을 특징으로 하는 형질 전환체.
제 5 항에 있어서, 유전자가 대장균 유래의 proB74 유전자인 것을 특징으로 하는 형질 전환체.
제 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 항의 형질 전환체를 배지가 배양하여 수득한 배양물, 균체 또는 그들의 처리물을 효소원으로 하여 2-케토글루타르산 및 2가 철이온의 존재하, 수성 매체 중에서 L-프롤린을 트랜스-4-히드록시-L-프롤린으로 변환시키고, 생성된 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 그 수성 매체로부터 채취하는 것을 특징으로 하는 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 제조법.
제 7 항에 있어서, 수성 매체가 배양액인 것을 특징으로 하는 제조법.