JPH07194381A - スクアレンエポキシダーゼ産生遺伝情報を有するｄｎａ断片 - Google Patents
スクアレンエポキシダーゼ産生遺伝情報を有するｄｎａ断片Info
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- JPH07194381A JPH07194381A JP6117575A JP11757594A JPH07194381A JP H07194381 A JPH07194381 A JP H07194381A JP 6117575 A JP6117575 A JP 6117575A JP 11757594 A JP11757594 A JP 11757594A JP H07194381 A JPH07194381 A JP H07194381A
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- squalene epoxidase
- leu
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ラットスクアレンエポキシダーゼをコードす
るＤＮＡ断片及びこれを用いるラットスクアレンエポキ
シダーゼの製造法、スクアレンエポキシダーゼ阻害剤の
スクリーニング法を提供する。 【構成】 ラットスクアレンエポキシダーゼをコードす
るＤＮＡ断片、これを組み込んだベクター、これらで形
質転換した微生物及び該形質転換体を用いるラットスク
アレンエポキシダーゼの製造法並びにスクアレンエポキ
シダーゼ阻害剤のスクリーニング法。
るＤＮＡ断片及びこれを用いるラットスクアレンエポキ
シダーゼの製造法、スクアレンエポキシダーゼ阻害剤の
スクリーニング法を提供する。 【構成】 ラットスクアレンエポキシダーゼをコードす
るＤＮＡ断片、これを組み込んだベクター、これらで形
質転換した微生物及び該形質転換体を用いるラットスク
アレンエポキシダーゼの製造法並びにスクアレンエポキ
シダーゼ阻害剤のスクリーニング法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は哺乳類スクアレンエポキ
シダーゼをコードする遺伝子ＤＮＡ、該ＤＮＡ断片、該
ＤＮＡ断片を組み込んだベクター、該ベクターを導入し
た形質転換微生物、該形質転換微生物を用いたスクアレ
ンエポキシダーゼの製造法及び哺乳類スクアレンエポキ
シダーゼ遺伝子を組み込んだ微生物を利用したスクアレ
ンエポキシダーゼ阻害剤のスクリーニング方法に関する
ものであり、医薬の分野で有用である。
シダーゼをコードする遺伝子ＤＮＡ、該ＤＮＡ断片、該
ＤＮＡ断片を組み込んだベクター、該ベクターを導入し
た形質転換微生物、該形質転換微生物を用いたスクアレ
ンエポキシダーゼの製造法及び哺乳類スクアレンエポキ
シダーゼ遺伝子を組み込んだ微生物を利用したスクアレ
ンエポキシダーゼ阻害剤のスクリーニング方法に関する
ものであり、医薬の分野で有用である。
【０００２】
【従来の技術】スクアレンエポキシダーゼはコレステロ
ール合成系の中ほどに位置し、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクタ
ーゼに次ぐ第二の律速段階酵素と推測され、その重要性
から抗コレステロール薬開発の標的酵素としてＮＢ−５
９８［（Ｅ）−Ｎ−エチル−Ｎ−（６，６−ジメチル−
２−ヘプテン−４−イニル）−３−［（３，３’−ビチ
オフェン−５−イル）メトキシ］ベンゼンメタナミン］
等いくつかの阻害剤が開発されてきた（欧州特許公開３
９５７６８号等参照）。従来は試験薬剤の活性を測定す
るために、ラットの肝臓から直接スクアレンエポキシダ
ーゼを単離、精製して得る必要があった。
ール合成系の中ほどに位置し、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクタ
ーゼに次ぐ第二の律速段階酵素と推測され、その重要性
から抗コレステロール薬開発の標的酵素としてＮＢ−５
９８［（Ｅ）−Ｎ−エチル−Ｎ−（６，６−ジメチル−
２−ヘプテン−４−イニル）−３−［（３，３’−ビチ
オフェン−５−イル）メトキシ］ベンゼンメタナミン］
等いくつかの阻害剤が開発されてきた（欧州特許公開３
９５７６８号等参照）。従来は試験薬剤の活性を測定す
るために、ラットの肝臓から直接スクアレンエポキシダ
ーゼを単離、精製して得る必要があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ラット肝臓におけるス
クアレンエポキシダーゼの比活性は非常に低く、試験薬
剤の活性を測定する必要量のスクアレンエポキシダーゼ
を得るには、多数のラットにコレスチラミン又はＨＭＧ
−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤等を投与し、酵素活性を十
分に高くした後に殺処分して、その肝臓より多段階の精
製を行い単離する必要があった。このような操作は長時
間を要する上に非常に煩雑であり、多くの薬剤費また動
物費を必要とした。
クアレンエポキシダーゼの比活性は非常に低く、試験薬
剤の活性を測定する必要量のスクアレンエポキシダーゼ
を得るには、多数のラットにコレスチラミン又はＨＭＧ
−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤等を投与し、酵素活性を十
分に高くした後に殺処分して、その肝臓より多段階の精
製を行い単離する必要があった。このような操作は長時
間を要する上に非常に煩雑であり、多くの薬剤費また動
物費を必要とした。
【０００４】本発明の課題は、高価な薬剤および動物を
用いず、容易に哺乳類のスクアレンエポキシダーゼを得
る方法を開発すること、およびスクアレンエポキシダー
ゼを単離することなく、その産生遺伝子を組み込んだ微
生物を直接用いて、哺乳類又は真菌に対して選択性を有
するスクアレンエポキシダーゼ阻害剤をスクリーニング
する方法を提供することである。
用いず、容易に哺乳類のスクアレンエポキシダーゼを得
る方法を開発すること、およびスクアレンエポキシダー
ゼを単離することなく、その産生遺伝子を組み込んだ微
生物を直接用いて、哺乳類又は真菌に対して選択性を有
するスクアレンエポキシダーゼ阻害剤をスクリーニング
する方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、微生物に
よるスクアレンエポキシダーゼの簡便な大量生産の方法
について検討した結果、ラット肝臓より得られたスクア
レンエポキシダーゼ産生遺伝情報を有するＤＮＡ断片
を、ベクターを介して微生物に導入することにより、当
該酵素を大量に産生する微生物を得ることができ又その
精製も容易であることを見出し、本発明を完成するに至
った。
よるスクアレンエポキシダーゼの簡便な大量生産の方法
について検討した結果、ラット肝臓より得られたスクア
レンエポキシダーゼ産生遺伝情報を有するＤＮＡ断片
を、ベクターを介して微生物に導入することにより、当
該酵素を大量に産生する微生物を得ることができ又その
精製も容易であることを見出し、本発明を完成するに至
った。
【０００６】また、本酵素を組み込んだ微生物を用い容
易に哺乳類又は真菌に選択的なスクアレンエポキシダー
ゼ阻害剤をスクリーニングする方法についても見出し、
本発明を完成するに至った。
易に哺乳類又は真菌に選択的なスクアレンエポキシダー
ゼ阻害剤をスクリーニングする方法についても見出し、
本発明を完成するに至った。
【０００７】かくして本発明によれば哺乳類スクアレン
エポキシダーゼをコードする遺伝子ＤＮＡ、該ＤＮＡ断
片、該ＤＮＡ断片を組み込んだベクター、該ベクターを
導入した形質転換微生物、該形質転換微生物を培養しス
クアレンエポキシダーゼを培養物中に蓄積させ採取する
ことを特徴とするスクアレンエポキシダーゼの製造法及
び哺乳類スクアレンエポキシダーゼ遺伝子を組み込んだ
微生物を利用した哺乳類又は真菌選択的スクアレンエポ
キシダーゼ阻害剤のスクリーニング方法が提供される。
エポキシダーゼをコードする遺伝子ＤＮＡ、該ＤＮＡ断
片、該ＤＮＡ断片を組み込んだベクター、該ベクターを
導入した形質転換微生物、該形質転換微生物を培養しス
クアレンエポキシダーゼを培養物中に蓄積させ採取する
ことを特徴とするスクアレンエポキシダーゼの製造法及
び哺乳類スクアレンエポキシダーゼ遺伝子を組み込んだ
微生物を利用した哺乳類又は真菌選択的スクアレンエポ
キシダーゼ阻害剤のスクリーニング方法が提供される。
【０００８】以下に本発明を更に詳しく説明する。
【０００９】本発明は下記のステップによって構成され
る。
る。
【００１０】１）ラット肝臓ｃＤＮＡをベクターｐＣＤ
２に挿入したライブラリーを作製する。
２に挿入したライブラリーを作製する。
【００１１】２）クローニングのための宿主は細菌、酵
母等を用いることができ特に限定されないが、例えば酵
母であるシゾサッカロマイセス ポンベ［Ｓｈｉｚｏｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（以下Ｓ．ｐｏ
ｍｂｅと表す）］等が好適である。具体的にはｃＤＮ
Ａ、および制限酵素ＰｓｔＩで切断したプラスミドｐＡ
Ｌ１７をＳ．ｐｏｍｂｅ中に共遺伝子導入させる。プラ
スミドｐＡＬ１７はＳ．ｐｏｍｂｅ固有の複製開始点お
よびＬｅｕ２遺伝子を持ち、Ｓ．ｐｏｍｂｅ内において
はｐＣＤ２とコンカテマー（鎖状体）を形成し安定に存
在する。
母等を用いることができ特に限定されないが、例えば酵
母であるシゾサッカロマイセス ポンベ［Ｓｈｉｚｏｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（以下Ｓ．ｐｏ
ｍｂｅと表す）］等が好適である。具体的にはｃＤＮ
Ａ、および制限酵素ＰｓｔＩで切断したプラスミドｐＡ
Ｌ１７をＳ．ｐｏｍｂｅ中に共遺伝子導入させる。プラ
スミドｐＡＬ１７はＳ．ｐｏｍｂｅ固有の複製開始点お
よびＬｅｕ２遺伝子を持ち、Ｓ．ｐｏｍｂｅ内において
はｐＣＤ２とコンカテマー（鎖状体）を形成し安定に存
在する。
【００１２】３）はじめＬｅｕ-でＳ．ｐｏｍｂｅを選
別した後、酵母スクアレンエポキシダーゼには阻害作用
を示すが、哺乳類スクアレンエポキシダーゼには弱い阻
害作用しか示さないテルビナフィン（Ｔｅｒｂｉｎａｆ
ｉｎｅ）を用いて選別しＳ．ｐｏｍｂｅのクローニング
を行なう。
別した後、酵母スクアレンエポキシダーゼには阻害作用
を示すが、哺乳類スクアレンエポキシダーゼには弱い阻
害作用しか示さないテルビナフィン（Ｔｅｒｂｉｎａｆ
ｉｎｅ）を用いて選別しＳ．ｐｏｍｂｅのクローニング
を行なう。
【００１３】４）選択されたＳ．ｐｏｍｂｅの菌株より
公知の方法でプラスミドＤＮＡを取り出し、制限酵素お
よびＤＮＡリガーゼあるいは他のベクターを用いた公知
の方法で改変し、ラットスクアレンエポキシダーゼ遺伝
子を発現させる組み換え体ＤＮＡを作成する。
公知の方法でプラスミドＤＮＡを取り出し、制限酵素お
よびＤＮＡリガーゼあるいは他のベクターを用いた公知
の方法で改変し、ラットスクアレンエポキシダーゼ遺伝
子を発現させる組み換え体ＤＮＡを作成する。
【００１４】５）改変された組換え体ＤＮＡを、公知の
方法で微生物、好ましくは細菌又は酵母等に、塩化カル
シウム法等の公知の方法で導入し、導入された菌株の中
からラットスクアレンエポキシダーゼ産生能を有する株
を選択分離する。宿主が細菌の場合、各種のものを用い
ることができるが、特にＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ
３）株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株等が
好適である。
方法で微生物、好ましくは細菌又は酵母等に、塩化カル
シウム法等の公知の方法で導入し、導入された菌株の中
からラットスクアレンエポキシダーゼ産生能を有する株
を選択分離する。宿主が細菌の場合、各種のものを用い
ることができるが、特にＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ
３）株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株等が
好適である。
【００１５】６）宿主が大腸菌の場合、発現系の構築に
は各種のベクターを用いることができるが、好適にはＴ
７プロモーターを用いた発現ベクターであるｐＥＴ３ａ
等が挙げられる。ｐＥＴ３ａのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断
片に、ラットのスクアレンエポキシダーゼのコーデイン
グ領域を挿入してラットスクアレンエポキシダーゼ発現
ベクターを作製する。
は各種のベクターを用いることができるが、好適にはＴ
７プロモーターを用いた発現ベクターであるｐＥＴ３ａ
等が挙げられる。ｐＥＴ３ａのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断
片に、ラットのスクアレンエポキシダーゼのコーデイン
グ領域を挿入してラットスクアレンエポキシダーゼ発現
ベクターを作製する。
【００１６】７）スクアレンエポキシダーゼ活性の測定
は４，８，１２，１３，１７，２１−［3Ｈ］−スクア
レン（ＮＥＮ社製）を基質として、酵素反応の結果、生
成した４，８，１２，１３，１７，２１−［3Ｈ］−
２，３−オキシドスクアレンを薄層クロマトグラフィー
上で分離定量することにより算出することができる。
は４，８，１２，１３，１７，２１−［3Ｈ］−スクア
レン（ＮＥＮ社製）を基質として、酵素反応の結果、生
成した４，８，１２，１３，１７，２１−［3Ｈ］−
２，３−オキシドスクアレンを薄層クロマトグラフィー
上で分離定量することにより算出することができる。
【００１７】８）ＤＮＡ塩基配列はｐＵＣ１８にサブク
ローニングし、『Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｖｅｒ．２』
［東洋紡（株）製］を用いたジデオキシ合成鎖停止法
［ Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，９巻３０９頁（１９８１年）］を用いて決定す
ることができる。
ローニングし、『Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｖｅｒ．２』
［東洋紡（株）製］を用いたジデオキシ合成鎖停止法
［ Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，９巻３０９頁（１９８１年）］を用いて決定す
ることができる。
【００１８】９）形質転換微生物からスクアレンエポキ
シダーゼを生産させる方法は、この分野で公知の微生物
による他の酵素の生産方法と同様である。培地組成物も
また通常のものと同様であり、典型的に炭素源、窒素源
および金属イオン類の他、必要に応じてアミノ酸、核
酸、ビタミン等の栄養源を含有する培地が用いられる。
炭素源としては、例えばグルコース、庶糖、澱粉加水分
解物、糖類またはコーン・スチープ・リカー等が、窒素
源としては例えばビーフエキス、バクトペプトン、バク
トイーストエキス、大豆粉、乾燥酵母又は尿素等の有機
窒素源の他に硫酸、硝酸、塩酸、炭酸等のアンモニウム
塩やアンモニアガス、アンモニア水等の無機窒素源をそ
れぞれ単独もしくは混合して用いることができる。
シダーゼを生産させる方法は、この分野で公知の微生物
による他の酵素の生産方法と同様である。培地組成物も
また通常のものと同様であり、典型的に炭素源、窒素源
および金属イオン類の他、必要に応じてアミノ酸、核
酸、ビタミン等の栄養源を含有する培地が用いられる。
炭素源としては、例えばグルコース、庶糖、澱粉加水分
解物、糖類またはコーン・スチープ・リカー等が、窒素
源としては例えばビーフエキス、バクトペプトン、バク
トイーストエキス、大豆粉、乾燥酵母又は尿素等の有機
窒素源の他に硫酸、硝酸、塩酸、炭酸等のアンモニウム
塩やアンモニアガス、アンモニア水等の無機窒素源をそ
れぞれ単独もしくは混合して用いることができる。
【００１９】また発酵工程中に、最終濃度として０．１
〜１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノ
シドを添加する必要がある。
〜１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノ
シドを添加する必要がある。
【００２０】培養は通常振盪あるいは通気撹拌深部培養
等の好気性条件下で、ｐＨ５〜９好ましくはｐＨ６〜
７、温度２０〜４５℃好ましくは３０〜４０℃で２４時
間ないし１４４時間行なうことができる。
等の好気性条件下で、ｐＨ５〜９好ましくはｐＨ６〜
７、温度２０〜４５℃好ましくは３０〜４０℃で２４時
間ないし１４４時間行なうことができる。
【００２１】培養物からスクアレンエポキシダーゼを分
離採取するには、公知の通常の精製手段、例えば沈澱
法、イオン交換樹脂や活性炭によるクロマトグラフィー
法等の分離精製法が用いられる。
離採取するには、公知の通常の精製手段、例えば沈澱
法、イオン交換樹脂や活性炭によるクロマトグラフィー
法等の分離精製法が用いられる。
【００２２】このようにして作成した哺乳類スクアレン
エポキシダーゼを組み込んだ微生物を用い、真菌又は哺
乳類に選択的なスクアレンエポキシダーゼ阻害剤をスク
リーニングする事が可能である。
エポキシダーゼを組み込んだ微生物を用い、真菌又は哺
乳類に選択的なスクアレンエポキシダーゼ阻害剤をスク
リーニングする事が可能である。
【００２３】
【実施例】 以下に本発明の実施例を記載するが、本発
明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ラットスクアレンエポキシダーゼｃＤＮＡのクローニン
グ ラット肝臓ｃＤＮＡをｐＣＤ２に挿入したライブラリー
およびＰｓｔＩで切断したプラスミドｐＡＬ１７をＳ．
ｐｏｍｂｅに共遺伝子導入する（図 １）。
明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ラットスクアレンエポキシダーゼｃＤＮＡのクローニン
グ ラット肝臓ｃＤＮＡをｐＣＤ２に挿入したライブラリー
およびＰｓｔＩで切断したプラスミドｐＡＬ１７をＳ．
ｐｏｍｂｅに共遺伝子導入する（図 １）。
【００２４】ｐＡＬ１７はＳ．ｐｏｍｂｅ固有の複製開
始点、およびＬｅｕ２遺伝子を持ち、Ｓ．ｐｏｍｂｅ内
においてはｐＣＤ２とコンカテマー（鎖状体）を形成し
安定に存在するためラット由来のｃＤＮＡは安定して
Ｓ．ｐｏｍｂｅ内で発現する。はじめＬｅｕ-で選別し
た後、酵母スクアレンエポキシダーゼは強く阻害する
が、哺乳類スクアレンエポキシダーゼはあまり強く阻害
しない阻害剤であるテルビナフィンを用いて、組み換え
体ＤＮＡの導入されたＳ．ｐｏｍｂｅのクローニングを
行なう。
始点、およびＬｅｕ２遺伝子を持ち、Ｓ．ｐｏｍｂｅ内
においてはｐＣＤ２とコンカテマー（鎖状体）を形成し
安定に存在するためラット由来のｃＤＮＡは安定して
Ｓ．ｐｏｍｂｅ内で発現する。はじめＬｅｕ-で選別し
た後、酵母スクアレンエポキシダーゼは強く阻害する
が、哺乳類スクアレンエポキシダーゼはあまり強く阻害
しない阻害剤であるテルビナフィンを用いて、組み換え
体ＤＮＡの導入されたＳ．ｐｏｍｂｅのクローニングを
行なう。
【００２５】このクローニングの方法を図１に示す。
【００２６】なお、プラスミドｐＡＬ１７を組み込んだ
Ｓ．ｐｏｍｂｅは、平成５年１０月２７日付けで工業技
術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３９２
７号として寄託されている。
Ｓ．ｐｏｍｂｅは、平成５年１０月２７日付けで工業技
術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３９２
７号として寄託されている。
【００２７】酵母からのプラスミドの取り出しは以下の
ように行う。
ように行う。
【００２８】まず形質転換株を、選択培地としてロイシ
ンを欠如したＭＭＡプレート上で２５℃で２日から３日
間にわたって培養し、次いで選択培地としてロイシンを
欠如し、選択薬剤としてテルビナフィンを加えたＭＭＡ
プレート上で２５℃で２日から３日間にわたって培養
後、１．５ｍｌのＴＥＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌｐ
Ｈ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｎａ2ＳＯ3）
を加えた後遠心分離用チューブに移す。
ンを欠如したＭＭＡプレート上で２５℃で２日から３日
間にわたって培養し、次いで選択培地としてロイシンを
欠如し、選択薬剤としてテルビナフィンを加えたＭＭＡ
プレート上で２５℃で２日から３日間にわたって培養
後、１．５ｍｌのＴＥＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌｐ
Ｈ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｎａ2ＳＯ3）
を加えた後遠心分離用チューブに移す。
【００２９】８，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し沈澱
を１ｍｌのソルビトール溶液（１Ｍソルビトール、０．
１Ｍ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｎａ2ＳＯ3、０．１Ｍ 酢
酸リチウム）に懸濁した後、２０単位のＺｙｍｏｌｉａ
ｓｅ［生化学工業（株）製］を加え３０℃で１時間撹拌
し酵母の細胞壁を溶解する。
を１ｍｌのソルビトール溶液（１Ｍソルビトール、０．
１Ｍ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｎａ2ＳＯ3、０．１Ｍ 酢
酸リチウム）に懸濁した後、２０単位のＺｙｍｏｌｉａ
ｓｅ［生化学工業（株）製］を加え３０℃で１時間撹拌
し酵母の細胞壁を溶解する。
【００３０】８，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し沈澱
を３００μｌの溶菌緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ
ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ
）に懸濁して６５℃で１時間静置する。
を３００μｌの溶菌緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ
ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ
）に懸濁して６５℃で１時間静置する。
【００３１】３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ４．８）
１５０μｌを加えて０℃で１時間静置した後１５，００
０ｒｐｍで５分間遠心分離する。
１５０μｌを加えて０℃で１時間静置した後１５，００
０ｒｐｍで５分間遠心分離する。
【００３２】上清にフェノール−クロロホルム（１：１
ｖ／ｖ）混合溶液４５０μｌを加えて撹拌し室温、１
０，０００ｒｐｍで遠心分離後、上清を採取する。この
操作を３回繰り返し、得られた上清に２倍容のエタノー
ルを加え、−２０℃で４時間静置する。
ｖ／ｖ）混合溶液４５０μｌを加えて撹拌し室温、１
０，０００ｒｐｍで遠心分離後、上清を採取する。この
操作を３回繰り返し、得られた上清に２倍容のエタノー
ルを加え、−２０℃で４時間静置する。
【００３３】室温、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分
離した後沈澱（核酸画分）を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ
緩衝液に懸濁する。
離した後沈澱（核酸画分）を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ
緩衝液に懸濁する。
【００３４】 ＤＮＡ塩基配列はｐＵＣ１８にサブクロー
ニングし、『Ｓｅｑｕｅｎａｓｅｖｅｒ．２』を用いた
ジデオキシ合成鎖停止法［ Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇら、Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９巻３０９頁（１９８
１年）等参照］を用いて決定した。
ニングし、『Ｓｅｑｕｅｎａｓｅｖｅｒ．２』を用いた
ジデオキシ合成鎖停止法［ Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇら、Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９巻３０９頁（１９８
１年）等参照］を用いて決定した。
【００３５】ラットスクアレンエポキシダーゼは５７３
個のアミノ酸よりなると推測され、予想される分子量は
６３，９５０ダルトンで配列中にはフラビン補酵素を結
合すると考えられる配列が存在する。
個のアミノ酸よりなると推測され、予想される分子量は
６３，９５０ダルトンで配列中にはフラビン補酵素を結
合すると考えられる配列が存在する。
【００３６】このプラスミドから、スクアレンエポキシ
ダーゼのコーディング領域をＭｓｃＩ又はＢａｌＩとＳ
ｓｐＩを用いて切り出し、合成リンカーを用いてＤＮＡ
リガーゼによりｐＥＴ３ａのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩに挿
入する。またＳｓｐＩの代わりにＡｖｒＩＩを用いてｂ
ｌｕｎｔ ｅｎｄ（平滑末端）にし、ｂｌｕｎｔ ｅｎ
ｄ化したＢａｍＨＩに挿入してもよい。 またＮｄｅＩ
のサイトを持ちラットスクアレンエポキシダーゼのコー
ディング領域のＮ端を持つプライマーと、ＢａｍＨＩの
サイトとコーディング領域のＣ端を持つプライマーによ
りＰＣＲ法を用いて増殖し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで
切断しベクターｐＥＴ３ａのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩに挿
入してもよい。 実施例２形質転換した大腸菌によるラットスクアレンエポキシダ
ーゼの製造法 ラットスクアレンエポキシダーゼ遺伝子を組み込んだプ
ラスミドを有する大腸菌［Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）］を、バクト・トリプトン１０ｇ、酵母抽出物５
ｇ及び食塩１０ｇを含むｐＨ７．５の培養液１Ｌを１２
１℃、１５分間高圧滅菌後、濾過滅菌した２０ｍｇ／ｍ
ｌのアンピシリン水溶液２．５ｍｌを加えた培地に播種
し、３７℃で３時間培養する。
ダーゼのコーディング領域をＭｓｃＩ又はＢａｌＩとＳ
ｓｐＩを用いて切り出し、合成リンカーを用いてＤＮＡ
リガーゼによりｐＥＴ３ａのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩに挿
入する。またＳｓｐＩの代わりにＡｖｒＩＩを用いてｂ
ｌｕｎｔ ｅｎｄ（平滑末端）にし、ｂｌｕｎｔ ｅｎ
ｄ化したＢａｍＨＩに挿入してもよい。 またＮｄｅＩ
のサイトを持ちラットスクアレンエポキシダーゼのコー
ディング領域のＮ端を持つプライマーと、ＢａｍＨＩの
サイトとコーディング領域のＣ端を持つプライマーによ
りＰＣＲ法を用いて増殖し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで
切断しベクターｐＥＴ３ａのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩに挿
入してもよい。 実施例２形質転換した大腸菌によるラットスクアレンエポキシダ
ーゼの製造法 ラットスクアレンエポキシダーゼ遺伝子を組み込んだプ
ラスミドを有する大腸菌［Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）］を、バクト・トリプトン１０ｇ、酵母抽出物５
ｇ及び食塩１０ｇを含むｐＨ７．５の培養液１Ｌを１２
１℃、１５分間高圧滅菌後、濾過滅菌した２０ｍｇ／ｍ
ｌのアンピシリン水溶液２．５ｍｌを加えた培地に播種
し、３７℃で３時間培養する。
【００３７】この培養液に最終濃度０．４ｍＭになるよ
うにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを
添加し、更に３７℃で４時間培養後、５，０００ｒｐｍ
で１０分間遠心分離し菌体を集める。
うにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを
添加し、更に３７℃で４時間培養後、５，０００ｒｐｍ
で１０分間遠心分離し菌体を集める。
【００３８】菌体１７ｇに対し５０ｍＭのトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ食塩、
０．２ｍＭ ＰＭＳＦ及び１ｍＭジチオスレイトールよ
りなる溶菌緩衝液４６ｍｌを加え、更に１０ｍｇ／ｍｌ
のリゾチーム水溶液５ｍｌを加える。試料をよく混合し
１時間室温に放置後、凍結融解を２度繰り返し、１Ｍ塩
化マグネシウム水溶液３４０μｌ、１００ｍＭ塩化マン
ガン水溶液３４０μｌ及びＤＮアーゼＩ １０μｇ／ｍ
ｌ水溶液１７０μｌを加え、超音波処理を行ない、室温
で３０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行なう。
衝液（ｐＨ８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ食塩、
０．２ｍＭ ＰＭＳＦ及び１ｍＭジチオスレイトールよ
りなる溶菌緩衝液４６ｍｌを加え、更に１０ｍｇ／ｍｌ
のリゾチーム水溶液５ｍｌを加える。試料をよく混合し
１時間室温に放置後、凍結融解を２度繰り返し、１Ｍ塩
化マグネシウム水溶液３４０μｌ、１００ｍＭ塩化マン
ガン水溶液３４０μｌ及びＤＮアーゼＩ １０μｇ／ｍ
ｌ水溶液１７０μｌを加え、超音波処理を行ない、室温
で３０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行なう。
【００３９】上清 ５７ｍｌを透析し、小野らの方法
［バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス・
リサーチ・コミュニケーション、（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，）９６巻、５
２２ページ、１９８０年］に従いスクアレンエポキシダ
ーゼの精製を行ない１０ｍｇ〜２０ｍｇ／ｌのラットス
クアレンエポキシダーゼを得ることができる。
［バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス・
リサーチ・コミュニケーション、（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，）９６巻、５
２２ページ、１９８０年］に従いスクアレンエポキシダ
ーゼの精製を行ない１０ｍｇ〜２０ｍｇ／ｌのラットス
クアレンエポキシダーゼを得ることができる。
【００４０】なお、プラスミドｐＥＴ３ａを組み込んだ
大腸菌は、平成５年１０月２７日付けで工業技術院生命
工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３９２８号とし
て寄託されている。 実施例３スクアレンエポキシダーゼ阻害剤のスクリーニング方法 哺乳類スクアレンエポキシダーゼ阻害剤のスクリーニン
グは次のようにして行う。
大腸菌は、平成５年１０月２７日付けで工業技術院生命
工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３９２８号とし
て寄託されている。 実施例３スクアレンエポキシダーゼ阻害剤のスクリーニング方法 哺乳類スクアレンエポキシダーゼ阻害剤のスクリーニン
グは次のようにして行う。
【００４１】哺乳類スクアレンエポキシダーゼを組み込
んだＳ．ｐｏｍｂｅをテルビナフィン１０μｇ／ｍｌを
含むＹＭ寒天培地で２７℃、３日間培養する。滅菌生理
食塩水で１０8菌／ｍｌになるよう上記の菌の懸濁液を
準備する。
んだＳ．ｐｏｍｂｅをテルビナフィン１０μｇ／ｍｌを
含むＹＭ寒天培地で２７℃、３日間培養する。滅菌生理
食塩水で１０8菌／ｍｌになるよう上記の菌の懸濁液を
準備する。
【００４２】Ａプレートの作製：加熱滅菌したＹＭ寒天
を４５℃に冷却し、上記菌液を１％、テルビナフィンを
１０μｇ／ｍｌになるよう添加し、撹拌後、シャ−レに
１０ｍｌづつまき冷却固化させる。
を４５℃に冷却し、上記菌液を１％、テルビナフィンを
１０μｇ／ｍｌになるよう添加し、撹拌後、シャ−レに
１０ｍｌづつまき冷却固化させる。
【００４３】Ｂプレートの作製：Ａプレートの作製と同
様に作製するが、テルビナフィンの代わりにＮＢ−５９
８ １０μｇ／ｍｌを使用する。
様に作製するが、テルビナフィンの代わりにＮＢ−５９
８ １０μｇ／ｍｌを使用する。
【００４４】ＡプレートではＳ．ｐｏｍｂｅ本来のスク
アレンエポキシダーゼはテルビナフィンにより阻害され
ているため、菌はクローニングされた哺乳類のスクアレ
ンエポキシダーゼを利用して成育することになり、Ｂプ
レートではＮＢ−５９８によりクローニングされた哺乳
類のスクアレンエポキシダーゼは阻害されているため
Ｓ．ｐｏｍｂｅ本来のスクアレンエポキシダーゼを利用
して菌は生育する。
アレンエポキシダーゼはテルビナフィンにより阻害され
ているため、菌はクローニングされた哺乳類のスクアレ
ンエポキシダーゼを利用して成育することになり、Ｂプ
レートではＮＢ−５９８によりクローニングされた哺乳
類のスクアレンエポキシダーゼは阻害されているため
Ｓ．ｐｏｍｂｅ本来のスクアレンエポキシダーゼを利用
して菌は生育する。
【００４５】阻害剤のスクリーニングと判定：微生物培
養液もしくは化学合成品を等量づつ２枚のペーパーディ
スクにしみ込ませ、ＡプレートとＢプレートの上に置
き、２７℃で３日間インキュベートする。Ａプレート、
Ｂプレートでの阻止円の各々の直径より以下のように推
定することができる。
養液もしくは化学合成品を等量づつ２枚のペーパーディ
スクにしみ込ませ、ＡプレートとＢプレートの上に置
き、２７℃で３日間インキュベートする。Ａプレート、
Ｂプレートでの阻止円の各々の直径より以下のように推
定することができる。
【００４６】Ａプレートのみで阻止円が出るか、または
Ａプレートでの阻止円がＢプレートでの阻止円より大き
いものは、哺乳類スクアレンエポキシダーゼに選択的阻
害剤の可能性が強い。
Ａプレートでの阻止円がＢプレートでの阻止円より大き
いものは、哺乳類スクアレンエポキシダーゼに選択的阻
害剤の可能性が強い。
【００４７】Ｂプレートでのみ阻止円が出るか、または
Ｂプレートでの阻止円がＡプレートでの阻止円より大き
いものは、真菌類スクアレンエポキシダーゼに選択的阻
害剤の可能性が強い。
Ｂプレートでの阻止円がＡプレートでの阻止円より大き
いものは、真菌類スクアレンエポキシダーゼに選択的阻
害剤の可能性が強い。
【００４８】ＡプレートでもＢプレートでも阻止円の大
きさが同じものは、スクアレンエポキシダーゼ阻害とは
無関係の抗真菌剤または哺乳類、真菌両方のスクアレン
エポキシダーゼを阻害する物質である可能性が強い。
きさが同じものは、スクアレンエポキシダーゼ阻害とは
無関係の抗真菌剤または哺乳類、真菌両方のスクアレン
エポキシダーゼを阻害する物質である可能性が強い。
【００４９】例えば、哺乳類特異的スクアレンエポキシ
ダーゼ阻害剤、ＮＢ−５９８の１０μｇ／ｍｌ溶液５０
μｌを直径８ｍｍのペーパーディスクにしみ込ませ寒天
培地上に３日間置くと、Ａプレートでは直径１５ｍｍの
阻止円が出るが、Ｂプレートでは阻止円は出ない。同様
に、真菌特異的スクアレンエポキシダーゼ阻害剤、テル
ビナフィンの１０μｇ／ｍｌ溶液５０μｌを直径８ｍｍ
のペーパーディスクにしみ込ませ寒天培地上に３日間置
くと、Ａプレートでは阻止円は出ないが、Ｂプレートで
は直径２０ｍｍの阻止円が出る。また、スクアレンエポ
キシダーゼ阻害剤ではない抗真菌剤、ミコナゾールの１
０μｇ／ｍｌ溶液５０μｌを直径８ｍｍのペーパーディ
スクにしみ込ませ寒天培地上に置くと、いずれの培地で
も直径３０ｍｍの阻止円が出きる。
ダーゼ阻害剤、ＮＢ−５９８の１０μｇ／ｍｌ溶液５０
μｌを直径８ｍｍのペーパーディスクにしみ込ませ寒天
培地上に３日間置くと、Ａプレートでは直径１５ｍｍの
阻止円が出るが、Ｂプレートでは阻止円は出ない。同様
に、真菌特異的スクアレンエポキシダーゼ阻害剤、テル
ビナフィンの１０μｇ／ｍｌ溶液５０μｌを直径８ｍｍ
のペーパーディスクにしみ込ませ寒天培地上に３日間置
くと、Ａプレートでは阻止円は出ないが、Ｂプレートで
は直径２０ｍｍの阻止円が出る。また、スクアレンエポ
キシダーゼ阻害剤ではない抗真菌剤、ミコナゾールの１
０μｇ／ｍｌ溶液５０μｌを直径８ｍｍのペーパーディ
スクにしみ込ませ寒天培地上に置くと、いずれの培地で
も直径３０ｍｍの阻止円が出きる。
【００５０】
【発明の効果】本発明はラット肝臓スクアレンエポキシ
ダーゼをコードするＤＮＡ断片を組み込んだ微生物を作
成することにより、スクアレンエポキシダーゼを容易か
つ大量に供給する手段及び当該酵素阻害剤のスクリーニ
ング法を提供するものであり、医薬の分野で有用であ
る。
ダーゼをコードするＤＮＡ断片を組み込んだ微生物を作
成することにより、スクアレンエポキシダーゼを容易か
つ大量に供給する手段及び当該酵素阻害剤のスクリーニ
ング法を提供するものであり、医薬の分野で有用であ
る。
【図１】 図１は実施例１でのラットスクアレンエポキ
シダーゼｃＤＮＡのクローニング法を示す。
シダーゼｃＤＮＡのクローニング法を示す。
【配列表】配列番号 ：１ 配列の長さ：１７２２ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ＡＴＧ ＴＧＧ ＡＣＴ ＴＴＴ ＣＴＴ ＧＧＡ ＡＴＴ ＧＣＴ ＡＣＴ ＴＴＣ ＡＣＣ ＴＡＴ ＴＴＴ ＴＡＴ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＧＣ ＧＧＧ ＧＡＴ ＧＴＣ ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＣＣ ＡＡＣ ＡＡＧ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＴＧＣ ＧＴＡ ＣＴＧ ＧＴＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＴＣＧ ＣＴＧ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＴＧ ＣＴＣ ＴＣＣ ＴＡＣ ＣＧＣ ＴＧＴ ＣＧＣ ＣＡＴ ＣＧＡ ＡＡＣ ＧＧＧ ＧＧＣ ＣＴＣ ＣＴＴ ＧＧＣ ＣＧＣ ＣＡＴ ＣＡＧ ＡＧＣ ＧＧＣ ＴＣＣ ＣＡＧ ＴＴＣ ＧＣＴ ＧＣＣ ＴＴＣ ＴＣＡ ＧＡＴ ＡＴＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＧＣＴ ＴＴＧ ＣＣＴ ＣＴＴ ＡＴＴ ＧＧＣ ＴＴＣ ＴＴＣ ＴＧＧ ＧＣＣ ＡＡＡ ＴＣＡ ＣＣＣ ＣＣＴ ＧＡＡ ＴＣＡ ＧＡＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＧＡＡ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＴＣＣ ＡＡＧ ＡＧＧ ＣＧＣ ＡＧＡ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＴＣ ＡＡＴ ＣＴＧ ＴＣＡ ＧＡＧ ＡＣＧ ＡＣＧ ＴＴＡ ＡＣＧ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＣＴ ＡＣＣ ＴＣＡ ＧＴＡ ＴＣＧ ＡＣＡ ＴＣＡ ＴＣＴ ＧＴＧ ＡＣＧ ＧＡＣ ＣＣＡ ＧＡＡ ＧＴＧ ＡＴＣ ＡＴＣ ＡＴＡ ＧＧＧ ＴＣＴ ＧＧＴ ＧＴＡ ＣＴＴ ＧＧＣ ＴＣＴ ＧＣＴ ＴＴＧ ＧＣＡ ＡＣＡ ＧＴＡ ＣＴＣ ＴＣＴ ＡＧＡ ＧＡＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＡＣＧ ＧＴＧ ＡＣＡ ＧＴＡ ＡＴＣ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＴ ＴＴＡ ＡＡＡ ＧＡＧ ＣＣＴ ＧＡＣ ＡＧＡ ＡＴＡ ＣＴＴ ＧＧＡ ＧＡＧ ＴＧＴ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＣＣ ＧＧＴ ＧＧＣ ＴＡＴ ＣＧＡ ＧＴＴ ＣＴＴ ＣＧＡ ＧＡＧ ＣＴＧ ＧＧＣ ＣＴＴ ＧＧＡ ＧＡＴ ＡＣＡ ＧＴＡ ＧＡＡ ＡＧＴ ＣＴＴ ＡＡＴ ＧＣＣ ＣＡＴ ＣＡＴ ＡＴＡ ＣＡＣ ＧＧＣ ＴＡＣ ＧＴＡ ＡＴＴ ＣＡＴ ＧＡＣ ＴＧＴ ＧＡＡ ＡＧＣ ＡＧＧ ＴＣＴ ＧＡＡ ＧＴＴ ＣＡＡ ＡＴＴ ＣＣＡ ＴＡＣ ＣＣＧ ＧＴＧ ＴＣＡ ＧＡＡ ＡＡＣ ＡＡＣ ＣＡＡ ＧＴＡ ＣＡＧ ＡＧＴ ＧＧＧ ＧＴＴ ＧＣＴ ＴＴＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＧＣ ＡＡＧ ＴＴＣ ＡＴＣ ＡＴＧ ＡＧＴ ＣＴＣ ＣＧＧ ＡＡＡ ＧＣＡ ＧＣＴ ＡＴＧ ＧＣＡ ＧＡＧ ＣＣＣ ＡＡＴ ＧＴＡ ＡＡＧ ＴＴＴ ＡＴＡ ＧＡＡ ＧＧＴ ＧＴＴ ＧＴＧ ＣＴＴ ＣＧＧ ＴＴＡ ＣＴＡ ＧＡＧ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＡＴ ＧＣＴ ＧＴＧ ＡＴＴ ＧＧＴ ＧＴＧ ＣＡＡ ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＡＣ ＡＡＧ ＧＡＧ ＡＣＴ ＧＧＧ ＧＡＣ ＡＣＣ ＡＡＧ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＡＴ ＧＣＣ ＣＣＧ ＣＴＣ ＡＣＴ ＧＴＴ ＧＴＴ ＧＣＣ ＧＡＣ ＧＧＧ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＣＣ ＡＡＧ ＴＴＣ ＡＧＧ ＡＡＧ ＡＡＣ ＣＴＣ ＡＴＣ ＴＣＣ ＡＡＴ ＡＡＡ ＧＴＣ ＴＣＴ ＧＴＴ ＴＣＣ ＴＣＣ ＣＡＣ ＴＴＣ ＧＴＴ ＧＧＣ ＴＴＣ ＡＴＴ ＡＴＧ ＡＡＧ ＧＡＴ ＧＣＡ ＣＣＡ ＣＡＧ ＴＴＴ ＡＡＡ ＧＣＣ ＡＡＴ ＴＴＣ ＧＣＧ ＧＡＧ ＣＴＴ ＧＴＴ ＣＴＧ ＧＴＣ ＧＡＴ ＣＣＣ ＡＧＴ ＣＣＡ ＧＴＴ ＣＴＣ ＡＴＣ ＴＡＣ ＣＡＧ ＡＴＴ ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＧＣ ＧＡＡ ＡＣＴ ＡＧＧ ＧＴＧ ＣＴＴ ＧＴＣ ＧＡＴ ＡＴＴ ＣＧＡ ＧＧＡ ＧＡＡ ＴＴＧ ＣＣＡ ＡＧＡ ＡＡＣ ＴＴＡ ＡＧＡ ＧＡＡ ＴＡＣ ＡＴＧ ＡＣＡ ＧＡＡ ＣＡＡ ＡＴＴ ＴＡＣ ＣＣＡ ＣＡＧ ＡＴＡ ＣＣＴ ＧＡＴ ＣＡＣ ＴＴＧ ＡＡＧ ＧＡＡ ＴＣＡ ＴＴＴ ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＣＣ ＴＧＴ ＣＡＧ ＡＡＴ ＧＣＴ ＣＧＴ ＣＴＧ ＣＧＧ ＡＣＣ ＡＴＧ ＣＣＡ ＧＣＡ ＡＧＣ ＴＴＣ ＣＴＴ ＣＣＴ ＣＣＴ ＴＣＣ ＴＣＡ ＧＴＧ ＡＡＣ ＡＡＡ ＣＧＡ ＧＧＣ ＧＴＣ ＣＴＡ ＣＴＴ ＣＴＧ ＧＧＡ ＧＡＴ ＧＣＧ ＴＡＴ ＡＡＣ ＣＴＧ ＡＧＧ ＣＡＴ ＣＣＴ ＣＴＴ ＡＣＴ ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＡ ＡＴＧ ＡＣＡ ＧＴＣ ＧＣＴ ＴＴＡ ＡＡＡ ＧＡＴ ＡＴＡ ＡＡＡ ＡＴＡ ＴＧＧ ＡＧＡ ＣＡＡ ＣＴＧ ＴＴＡ ＡＡＡ ＧＡＴ ＡＴＴ ＣＣＴ ＧＡＣ ＣＴＴ ＴＡＴ ＧＡＴ ＧＡＴ ＧＣＣ ＧＣＴ ＡＴＴ ＴＴＣ ＣＡＧ ＧＣＣ ＡＡＡ ＡＡＧ ＴＣＡ ＴＴＣ ＴＴＴ ＴＧＧ ＴＣＡ ＡＧＡ ＡＡＡ ＡＧＧ ＡＧＣ ＣＡＴ ＴＣＣ ＴＴＴ ＧＴＴ ＧＴＧ ＡＡＣ ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＴ ＣＡＧ ＧＣＧ ＴＴＧ ＴＡＴ ＧＡＡ ＣＴＡ ＴＴＴ ＴＣＴ ＧＣＴ ＡＣＡ ＧＡＴ ＧＡＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＣＧＴ ＣＡＧ ＣＴＣ ＣＧＡ ＡＡＡ ＧＣＴ ＴＧＣ ＴＴＴ ＣＴＴ ＴＡＴ ＴＴＴ ＡＡＡ ＣＴＴ ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＡＡ ＴＧＴ ＴＴＧ ＡＣＴ ＧＧＴ ＣＣＴ ＧＴＴ ＧＧＧ ＴＴＧ ＣＴＴ ＴＣＴ ＡＴＡ ＴＴＧ ＴＣＴ ＣＣＴ ＧＡＣ ＣＣＴ ＣＴＣ ＣＴＡ ＴＴＧ ＡＴＴ ＣＧＡ ＣＡＣ ＴＴＣ ＴＴＣ ＴＣＣ ＧＴＴ ＧＣＡ ＧＴＣ ＴＡＴ ＧＣＣ ＡＣＧ ＴＡＴ ＴＴＣ ＴＧＣ ＴＴＣ ＡＡＧ ＴＣＡ ＧＡＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＧＣＴ ＡＣＡ ＡＡＡ ＣＣＴ ＣＧＧ ＧＣＴ ＣＴＴ ＴＴＣ ＡＧＴ ＡＧＴ ＧＧＴ ＧＣＴ ＡＴＡ ＣＴＧ ＴＡＣ ＡＡＡ ＧＣＧ ＴＧＣ ＴＣＴ ＡＴＡ ＡＴＡ ＴＴＴ ＣＣＴ ＣＴＣ ＡＴＣ ＴＡＴ ＴＣＡ ＧＡＡ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＡＴ ＣＴＧ ＧＴＴ ＣＡＣ ＴＧＡ 配列番号 ：２ 配列の長さ：５７３ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド Ｍｅｔ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ ＊＊＊
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｑ 1/18 6807−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (13)
- 【請求項１】哺乳類ｃＤＮＡよりクローニングしたスク
アレンエポキシダーゼの産生遺伝情報を有するＤＮＡ断
片。 - 【請求項２】哺乳類がラットである請求項１記載のＤＮ
Ａ断片。 - 【請求項３】ＤＮＡ断片の塩基配列が配列表の配列番号
１で示される請求項１又は２記載のＤＮＡ断片。 - 【請求項４】配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配
列をコードするスクアレンエポキシダーゼ遺伝子ＤＮ
Ａ。 - 【請求項５】請求項１ないし４記載のＤＮＡ断片をベク
ターに組み込んだ組み換え体ＤＮＡ。 - 【請求項６】ベクターが大腸菌用ベクター又は酵母用ベ
クターである請求項５記載の組み換え体ＤＮＡ。 - 【請求項７】ベクターが大腸菌用ベクターｐＥＴ３ａ又
は酵母用ベクターｐＡＬ１７である請求項５記載の組み
換え体ＤＮＡ。 - 【請求項８】請求項５記載の組み換え体ＤＮＡを導入し
た微生物。 - 【請求項９】微生物が大腸菌または酵母である請求項８
記載の微生物。 - 【請求項１０】請求項５記載の組み換え体ＤＮＡを改変
することにより得られた改変組み換え体ＤＮＡ。 - 【請求項１１】請求項１０記載の改変組み換え体ＤＮＡ
を導入した微生物。 - 【請求項１２】請求項８又は請求項９記載の形質転換微
生物を培養し、スクアレンエポキシダーゼを培養物中に
蓄積させ、それを採取することを特徴とするスクアレン
エポキシダーゼの製造法。 - 【請求項１３】請求項８又は請求項９記載の組み換え体
ＤＮＡを導入した微生物を用いたスクアレンエポキシダ
ーゼ阻害剤のスクリーニング方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6117575A JPH07194381A (ja) | 1993-11-25 | 1994-05-06 | スクアレンエポキシダーゼ産生遺伝情報を有するｄｎａ断片 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5-319017 | 1993-11-25 | ||
| JP31901793 | 1993-11-25 | ||
| JP6117575A JPH07194381A (ja) | 1993-11-25 | 1994-05-06 | スクアレンエポキシダーゼ産生遺伝情報を有するｄｎａ断片 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07194381A true JPH07194381A (ja) | 1995-08-01 |
Family
ID=26455669
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6117575A Pending JPH07194381A (ja) | 1993-11-25 | 1994-05-06 | スクアレンエポキシダーゼ産生遺伝情報を有するｄｎａ断片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07194381A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998020137A1 (en) * | 1996-11-07 | 1998-05-14 | Inctye Pharmaceuticals, Inc. | Human squalene epoxidase |
| EP2216405A1 (en) | 2002-05-03 | 2010-08-11 | Monsanto Technology LLC | Speed specific USP promoters for expressing genes in plants |
-
1994
- 1994-05-06 JP JP6117575A patent/JPH07194381A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998020137A1 (en) * | 1996-11-07 | 1998-05-14 | Inctye Pharmaceuticals, Inc. | Human squalene epoxidase |
| US5861496A (en) * | 1996-11-07 | 1999-01-19 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human squalene epoxidase |
| EP2216405A1 (en) | 2002-05-03 | 2010-08-11 | Monsanto Technology LLC | Speed specific USP promoters for expressing genes in plants |
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