DE69937086T2

DE69937086T2 - Genetisch veränderte, L-Sorbose Reduktase defiziente Mutanten

Info

Publication number: DE69937086T2
Application number: DE69937086T
Authority: DE
Inventors: Tatsuo Kamakura-shi Hoshino; Takahide Yokohama-shi Kon; Masako Kamakura-shi SHINJOH; Masaaki Yokohama-shi TAZOE
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1998-03-13
Filing date: 1999-03-08
Publication date: 2008-06-12
Anticipated expiration: 2019-03-09
Also published as: US6664082B1; NO991197L; KR19990077840A; AU2039099A; CN1163593C; ID23461A; HK1021993A1; NO991197D0; CA2265239A1; KR100710948B1; BR9902010A; JP2000060576A; DE69937086D1; CN1229134A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue genetisch veränderte L-sorbosereduktasedefiziente Mutanten eines Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter, die bei der fermentativen Produktion von L-Sorbose und bei der Verbesserung des Vitamin-C-Produktionsverfahrens vorteilhaft sind.
Die Produktion von Vitamin C wurde nach dem Reichstein-Verfahren durchgeführt, bei dem als einziger biologischer Schritt ein fermentatives Verfahren für die Umwandlung von D-Sorbitol in L-Sorbose durch einen Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter stattfindet. Diese Umwandlung in L-Sorbose ist einer der Schlüsselschritte für die Schlagkräftigkeit der Vitamin-C-Produktion. Es wurde jedoch beobachtet, daß das Produkt, nämlich L-Sorbose, nach dem Verbrauch des Substrats, nämlich D-Sorbitol, während der oxidativen Fermentation mit besagtem Mikroorganismus verbraucht wurde. Dieses Phänomen wurde dahingehend interpretiert, daß die L-Sorbose durch die NADPH-gebundene L-Sorbosereduktase (im folgenden gelegentlich SR genannt), die im Cytosol (siehe Sugisawa et al., Agric. Biol. Chem. 55: 2043-2049, 1991) vorliegt, reduziert wurde. Es wurde berichtet, daß D-Sorbitol bei Gluconobacter in D-Fructose umgewandelt wurde, welche in den Pentose-Stoffwechselweg eingebaut und weiter zu CO₂ verstoffwechselt werden konnte (Shinjoh et al., Agric. Biol. Chem. 54: 2257-2263, 1990). Diese Stoffwechselwege, bei denen nicht nur das Substrat, sondern auch das Produkt, verbraucht werden, haben möglicherweise letztendlich zu einer geringeren Vitamin-C-Produktivität geführt.
Über eine Verbesserung der L-Sorboseproduktion wurde von Nogami et al. in der japanischen Patentanmeldung Kokai Nr. 51054/1995 berichtet. Sie führten an den Mikroorganismen von Gluconobacter oxydans und Gluconobacter suboxydans eine traditionelle chemische Mutagenese durch und isolierten die Mutantenstämme, deren Fähigkeit, D-Sorbitol als einzige Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff zu verwerten, reduziert war. Beim Durchführen einer Fermentation auf L-Sorboseproduktion mit solch einer Mutante beobachteten sie eine Produktivitätsverbesserung von mehr als 2-3% im Vergleich zu der Produktivität des Elternstamms.
Einer der Nachteile, der häufig bei Mutantenstämmen, die mittels traditioneller Mutagenese erzeugt wurden, beobachtet wird, ist die Rückmutation, die die verbesserten Eigenschaften der Mutantenstämme während des Fermentationsverlaufs bzw. während der Subkultivierung der Mutante auf Null reduziert, was letztendlich zu einer verringerten Vitamin-C-Produktivität führen würde. Es ist daher eine stabil blockierte L-Sorbosereduktasemutante wünschenswert.
Gemäß einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen neuen genetisch veränderten Mikroorganismus bereit, der von einem Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter abstammt und der dadurch gekennzeichnet ist, daß seine biologische Aktivität, L-Sorbose zu reduzieren, mittels Gentechnik praktisch auf Null reduziert ist. Und erweist diese biologische Aktivität im Ausmaß von weniger als 10% von derjenigen des ursprünglichen Mikroorganismus auf; so beträgt gemäß der im folgenden beschriebenen Definition der Aktivität diese Aktivität z.B. 0,07 bis 0,02/Einheiten/mg Protein oder weniger (z.B. in Beispiel 1 (iii)). Das Gen des erfindungsgemäßen gentechnisch veränderten Mikroorganismus muß eine stabil integrierte Mutation tragen, vorzugsweise mindestens eine Mutation mittels Disruption, Addition, Insertion, Deletion und/oder Substitution eines Nukleotids bzw. von Nukleotiden innerhalb der Region, die für die Bildung von aktiver L-Sorbosereduktase erforderlich ist, in Zellen des Mikroorganismus.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen gentechnisch veränderten Mikroorganismus kann diese Mutation durch Gendisruption innerhalb der Region, die für die Bildung von aktiver L-Sorbosereduktase erforderlich ist, verursacht sein. Solch eine Disruption kann mindestens ein interferierendes DNA-Fragment aus der Gruppe Transposon, Antibiotikaresistenzgenkassette und beliebigen DNA-Sequenzen, die den Wirts-Mikroorganismus an der Bildung von aktiver L-Sorbosereduktase hindern, enthalten.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Mutation durch Mutagenese mittels ortsgerichteter Mutagenese erzeugt worden sein. Solch eine Mutagenese kann in der Region, die für die Bildung von aktiver L-Sorbosereduktase erforderlich ist, erfolgen, wobei diese Region ein Strukturgen der L-Sorbosereduktase und Expressionskontrollsequenzen wie Promoter, Operator, Terminator, DNA-codierenden Repressor, Aktivator und dergleichen beinhalten kann.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines L-Sorbosereduktasegens eines Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter bei der Erzeugung des wie oben beschriebenen gentechnisch veränderten Mikroorganismus bereitgestellt, wobei besagtes Gen dadurch gekennzeichnet ist, daß es für die Aminosäuresequenz der in SEQ ID NO: 2 beschriebenen L-Sorbosereduktase oder ihr funktionelles Äquivalent, das eine Insertion, Deletion, Addition und/oder Substitution von einer oder mehreren Aminosäure(n) in dieser SEQ ID NO: 2 enthält, codiert.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein schlagkräftiges Verfahren für die Herstellung von L-Sorbose durch Fermentation eines Mikroorganismus in einem entsprechenden Medium, umfassend die Verwendung des oben beschriebenen erfindungsgemäßen gentechnisch veränderten Mikroorganismus, bereitgestellt. Im Zusammenhang mit diesem Verfahren zur Herstellung von L-Sorbose stellt die vorliegende Erfindung auch ein schlagkräftiges Verfahren zur Herstellung von Vitamin C bereit, umfassend einen Fermentationsschritt für die Herstellung von L-Sorbose, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation durch Verwendung des wie oben beschriebenen erfindungsgemäßen gentechnisch veränderten Mikroorganismus durchgeführt wird.
Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen gentechnisch veränderten Mikroorganismus bereit, der von einem Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter abstammt, der dadurch gekennzeichnet ist, daß seine biologische Aktivität für die Reduktion von L-Sorbose mittels Gentechnik im wesentlichen auf Null reduziert ist.
Bei diesem gentechnisch veränderten Mikroorganismus kann es sich um einen Mikroorganismus handeln, der zu der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter zählt, darunter Gluconobacter albidus, Gluconobacter capsulatus, Gluconobacter cerinus, Gluconobacter dioxyacetonicus, Gluconobacter gluconicus, Gluconobacter industrius, Gluconobacter melanogenus (IFO 3293 und FERN P-8386 [Nationales Institut für Biowissenschaften und Humantechnologie, Japan]), Gluconobacter nonoxygluconicus, Gluconobacter oxydans, Gluconobacter oxydans subsp. sphaericus, Gluconobacter roseus, Gluconobacter rubiginosus, Gluconobacter suboxydans (IFO 3291), Acetobacter xylinum [im Handel vom Institut für Fermentation, Osaka, Japan (IFO) als IFO 3288 erhältlich], Acetobacter pasteurianus, Acetobacter aceti, Acetobacter hansenii und Acetobacter liquefaciens (IFO 12388; ATCC 14835). Bezüglich Einzelheiten zu den Stämmen siehe auch die europäischen Patentanmeldungen mit den Veröffentlichungsnummern (EPA) 213591 und 518136 . Gluconobacter suboxydans IFO 3291 wurde in Form einer Mischung mit Gluconobacter oxydans DSM4025 als FERM BP-3813 und Gluconobacter melanogenus IFO 3293 als FERM BP-8256 hinterlegt. Für weitere Einzelheiten siehe EP 518136 . Bezüglich Gluconobacter suboxydans (IFO 3291) und Gluconobacter melanogenus (IFO 3293) siehe auch EO 728 840 ( US-Patentanmeldung Nr. 08/606 807 ).
Zwecks Reduktion der biologischen Aktivität des besagten Mikroorganismus bei der Reduktion von L-Sorbose auf Null beinhaltet die vorliegende Erfindung eine gentechnische Veränderung, die auf die Region des Mikroorganismusgens, das für die Bildung der aktiven L-Sorbosereduktase erforderlich ist, abzielt. Die typischen Methoden für diesen Zweck sind unter der Bezeichnung Gendisruption mit Transposon oder Selektionsmarkergenkassette sowie ortsgerichtete Mutagenese bekannt. Wie im folgenden beschrieben eignet sich das Gendisruptionsverfahren zum Identifizieren des Zielgens des Mikroorganismus, jedoch auch für die Blockierung der Genfunktion. Sobald die obenerwähnte Zielregion des Gens identifiziert worden ist, kann auch eine traditionelle Mutagenese angewandt werden, und zwar durch Behandeln des Ziel-DNA-Fragments mit z.B. einem chemischen Mutagen, mit Ultraviolettbestrahlung und dergleichen.
Die Gendisruption kann durch Einführung eines interferierenden DNA-Fragments in die chromosomale DNA des Mikroorganismus mittels Transposonmutagenese, Einführung einer Genkassette mit einem Selektionsmarker wie einem Antibiotikaresistenzgen, DNA-Sequenzen, die die Bildung von aktiver L-Sorbosereduktase auf Null reduzieren, erfolgen.
(a) Transposonmutagenese
Die Transposonmutagenese ist als wirksames Mittel für die genetische Analyse bekannt (P. Gerhardt et al., „Methods for General and Molecular Bacteriology" [Verfahren der allgemeinen und molekularen Bakteriologie], Kapitel 17, Transposon Mutagenesis; American Society for Microbiology). Bei diesem Verfahren wird ein transponierbares Elemente eingesetzt, bei denen es sich um separate DNA-Segmente handelt, die über die einzigartige Fähigkeit verfügen, daß sie sich an neue Stellen innerhalb des Genoms des Wirtsorganismus versetzen (transponieren) können. Der Vorgang des Transponierens ist von dem klassischen homologen Rekombinationssystem des Organismus unabhängig. Bei der Insertion eines transponierbaren Elements an eine neue Stelle im Genom ist keine weitreichende DNA-Homologie zwischen den Enden des Elements und seiner Zielstelle erforderlich. Transponierbare Elemente wurden in verschiedensten prokaryontischen und eukaryontischen Organismen gefunden, wo sie Nullmutationen, Chromosomenumlagerungen und neue Muster der Genexpression verursachen können, wenn sie sich in die Codierregion oder in Regulationssequenzen von vorhandenen Genen und Operons insertieren.
Prokaryontische transponierbare Elemente lassen sich grob in drei verschiedene Gruppen einteilen. Die Gruppe I besteht aus einfachen Elementen wie Insertionssequenzen (IS-Elementen), die ungefähr 800 bis 1500 Bp lang sind. Die IS-Elemente bestehen üblicherweise aus einem Gen, das für ein für die Transposition erforderliches Enzym (d.h. eine Transposase) codiert und das von endständig wiederholten DNA-Sequenzen, die der Transposase als Substrat dienen, flankiert sind. IS-Elemente wurden zuerst in den Laktose- und Galaktoseverwertungs-Operons von Darmbakterien identifiziert, wobei gefunden wurde, daß die Elemente bei ihrer Insertion häufig zu unstabiler, polarer Mutation führen.
Die Gruppe II besteht aus zusammengesetzten transponierbaren Elementen. Die Mitglieder dieser Gruppe werden auch als Transposons oder Tn-Elemente bezeichnet. Es hat sich herausgestellt, daß die Transposons bei Prokaryonten eine Gruppe von komplexen transponierbaren Elementen darstellen, die häufig einfache IS-Elemente (oder Teile davon) als direkte oder umgekehrte Sequenzwiederholungen an ihren Enden enthalten, die sich formal wie IS-Elemente verhalten, jedoch zusätzliche Gene tragen, die mit Transpositionsfunktionen nichts zu tun haben, wie Gene für Antibiotikaresistenz, Schwermetallresistenz oder für Pathogenitätsdeterminanten. Die Insertion eines Transposons in einen bestimmten Genlocus oder ein bestimmtes Replicon (einen Phagen) wird durch einen doppelten Doppelpunkt gekennzeichnet, z.B. lacZ::Tn5 oder l::Tn5.
Zur Gruppe III zählen „transponierbare" Bacteriophagen wie My und seine Verwandten. Der Phage My ist Virus und gleichzeitig Transposon. Es ist bekannt, daß er an mehrfachen Stellen im Wirtschromosom integrieren kann, wodurch er häufig Mutationen erzeugt.
Es ist bekannt, daß die Transposonmutagenese unter Einsatz der oben genannten transponierbaren Elemente die folgenden Eigenschaften aufweist:

(i) Solch eine Mutation führt im allgemeinen zu einer Inaktivierung des Gens und die erzielte Nullmutation ist relativ stabil.
(ii) Transposons führen neue genetische und physikalische Marker an den Ziel-Locus ein, wie Antibiotikaresistenzgene, neue Spaltstellen für Restriktionsendonukleasen sowie unikäre DNA-Sequenzen, die durch genetische Mittel, DNA-DNA- Hybridisierung oder Heteroduplexanalyse mit dem Elektronenmikroskop identifiziert werden können. Die genetischen Marker eignen sich für die Kartierung der mutierten Loci sowie für die Durchmusterung der Mutanten.
(iii) Transposons können verschiedene Umlagerungen im Genom bewirken, wie Deletionen, Inversionen, Translokationen oder Duplikationen, und können zum Einführen von spezifischen Genen in die Zielbakterien eingesetzt werden.

In der Fachwelt sind verschiedene Transposons bekannt, wie Tn3, Tn5, Tn7, Tn9, Tn10, der Phage My und dergleichen. Unter diesen Transposons ist von Tn5 bekannt, daß es über beinahe keine Insertionsspezifität verfügt und daß seine Größe relativ klein ist. Bei Tn5 handelt es sich auch um eines der am häufigsten verwendeten transponierbaren Elemente, das leicht von Quellen ableitbar ist, wie pfd-Tn5 [American Type Culture Collection, USA (ATCC) ATCC 77330] oder pCHR81 (ATCC 37535). Für die Verwendung bei der Zufallsmutagenese bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung wird Tn5 bevorzugt. Ebenfalls für die der vorliegende Erfindung eignen sich verschiedene Tn5-Derivate mit der Bezeichnung Mini-Tn5s, die aus 19Bp der für die Transposition erforderlichen invertierten Sequenzwiederholungen von Tn5 in Kopplung mit der Antibiotikaresistenz oder sonstigen selektierbaren Markergenen bestehen. Solche Mini-Tn5s werden zusätzlich zur Tn5-Transposase (tnp) in einen Suizidvektor insertiert, um ein effizientes Tn5-Suizid-Mutagenesesystem zu konstruieren. Weitere Informationen zum Arbeiten mit Tn5-Transposons finden sich in den folgenden Literaturstellen: P. Gerhardt et al., „Methods for General and Molecular Bacteriology", Kapitel 17, Transposon Mutagenesis; American Society for Microbiology, 1994; K.N. Timmis et al., Mini-Tn5 Transposon Derivatives for Insertion Mutagenesis, Promoter Probing, and Chromosomal Insertion of Cloned DNA in Gram-negative Eubacteria, J. Bacteriology, 172: 6568-6572, 1990.
Für Informationen darüber, wie man Tn5 von pfd-Tn5 ableiten kann, siehe die Erklärung zu pfd-Tn5 (ATCC 77330), die über das Internet von der ATCC-Home Page erhältlich ist
[http://www.atcc.org/catalogs/recomb.html]. Das Suizidplasmid pfd-Tn5 kann dementsprechend in E. coli sowie sonstige gramnegative Bakterien durch Elektroporation eingeführt werden (siehe Literaturstelle für die empfohlenen Bedingungen). Das Plasmid selbst kann als Tn5-Donor verwendet werden. Außerdem kann man einen Tn5-Suizidvektor dadurch konstruieren, daß man das Plasmid pfd-Tn5 in den Rezipienten E. coli mit einem beliebigen gewünschten Plasmid einführt, Transformanten, die Km^r und Resistenz auf dem Zielplasmid aufweisen, selektiert, Plasmide aus den Transformanten isoliert, E. coli mit den isolierten Plasmiden transformiert und auf Km- und plasmidmarkerresistente Transformanten selektiert, um so zu einem E. coli-Stamm zu gelangen, der das Zielplasmid mit Tn5 trägt. Das Konzept dieser Vorschrift findet sich auch bei „Regiondirected Tn5 mutagenesis" in P. Gerhardt et al. (siehe oben).
Die Zufallsmutagenese mit Transposons beinhaltet das Einbringen eines Transposons in eine bakterielle Zielzelle mittels Transformation, Transduktion, Konjugation oder Elektroporation unter Verwendung von Suizidplasmid- oder -phagenvektoren. Die erhaltenen Mutanten können mit Hilfe des vom Transposon getragenen Markers durchmustert werden. Die Transposition des Transposons in das Genom des Rezipientbakteriums kann nachgewiesen werden, nachdem der verwendete Vektor aufgrund von Aufspaltung verloren gegangen ist.
Für die Einführung von Transposons in einen Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter verwendet man gewöhnlich sogenannte Suizidvektoren, darunter auch ein Derivat des Phagen P1, und Plasmide mit einem engen Wirtsbereich. Die Phage-P1-Vektoren und die Plasmidvektoren können jeweils durch Infektion und durch Transformation, Konjugation oder Elektroporation in die Rezipientenzellen gebracht werden, wobei diesen Vektoren vorzugsweise die jeweiligen Startpunkte der Rezipienten fehlen. Die Wahl des zu verwendenden Suizidvektors und -transposons hängt von verschiedenen Kriterien ab, darunter Empfindlichkeit des Phagen, intrinsische Antibiotikaresistenz der Rezeptorzelle, Verfügbarkeit eines Gentransfersystems, darunter Transformation, Konjugation, Elektroporation oder Infektion, zum Einbringen des transposontragenden Vektors in E. coli.
Einer der bevorzugten Vektoren für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist der Phage P1 (ATCC25404), der seine DNA in einen Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter injiziert; diese DNA wird jedoch nicht replikationsfähig sein und wird aufgrund von Aufspaltung verloren gehen. Solch ein P1-Phage, der Tn5 trägt (P1::Tn5), kann in Form eines Phagenlysats eingesetzt werden, das dadurch hergestellt werden kann, daß man E. coli, der P1::Tn5 trägt, nach bekannten Vorgehensweisen lysiert (siehe: z.B. Methods for General and Molecular Bacteriology" Kapitel 17, Transposon Mutagenesis; American Society for Microbiology oder US-Patent Nr. 5082785 , 1992).
Bei den anderen bevorzugten Suizidvektoren, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, handelt es sich um Plasmidsuizidvektoren, die auf einem von dem Plasmid RP4 oder seinem Verwandten RK2 (ATCC37125) abgeleiteten Replikon basieren können, wobei sie denselben Konjugationstransfer von Mobilisierungsfunktionen und -stämmen für einen weiten Wirtsbereich, jedoch einen Replikationsursprung von einem engen Wirtsbereich tragen. Diese Vektoren können mit hoher Frequenz von E. coli in einen Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter mobilisiert werden, können jedoch in den Rezipientenzellen nicht stabil erhalten werden. Zusätzlich zu Tn5 enthalten diese Vektoren die Mobilisierungsstelle des IncP-Typs (mob; oriT), und sie basieren auf gewöhnlich verwendeten E. coli-Kloniervektoren wie pACYC177 (ATCC37031), pACYC184 (ATCC37033) und pBR325 [Bolivar F., 1978, Gene 4: 121-136; einem Derivat von pBR322 (ATCC31344)], die allesamt nicht in Nicht-Darm-Bakterien replizieren können (pSUP-Reihe, Simon R. et al., 1983, Bio/Technology 1: 784-791). Plasmide des pSUP-Typs können in Kreuzungsversuchen mit zwei Kreuzungspartnern dadurch mobilisiert werden, daß man die Transferfunktion in trans von einer chromosomal integrierten Kopie des IncP-Plasmids RP4 im Donorstamm selbst bereitstellt (z.B. Stamm S17-1), oder in Kreuzungsexperimenten mit drei Kreuzungspartnern dadurch, daß man die Transferfunktionen vom Plasmid pRK2013 (ATCC37159), das von einem Nicht-Donor, Nicht-Rezipient-Helferstamm von E. coli geborgen wird, bereitstellt.
Die Rezipientenzelle, die das Transposon erhalten hat, kann aufgrund des Markers, der von dem Element getragen wird, z.B. Resistenz gegenüber gewissen Antibiotika, selektiert werden. Wird Tn5 als Transposon verwendet, so kann üblicherweise der Marker von Km^r oder Nm^r verwendet werden. Außer den Km^r- oder Nm^r-Markern können genetische Marker von Tc^r, Gm^r, Sp^r, Ap^r, Cm^r und dergleichen als alternative Markergene verwendet werden. Es können auch andere Transposons, die leicht sichtbar gemachte Genprodukte tragen, wie diejenigen, die vom lacZ, luxAB oder phoA codiert werden, verwendet werden. Diese Tn5-Derivate sind besonders dann nützlich, wenn der Zielbakterienstamm eine intrinsische Resistenz gegenüber den Antibiotika, die normalerweise für die Selektion von Tn5 verwendet werden (Kanamycin, Neomycin, Bleomycin und Streptomycin), aufweist oder wenn eine Zweitmutagenese eines Stamms, der bereits ein Tn5-Derivat birgt, durchgeführt werden soll (P. Gerhardt et al., „Methods for General and Molecular Bacteriology" Kapitel 17, Transposon Mutagenesis; American Society for Microbiology).
(b) Regionsgerichtete Mutagenese
Eine schlagkräftige Weiterentwicklung des Tn5-Mutageneseprotokolls ist die Verwendung von Genersatztechniken, um das Wildtypgen in dem ursprünglichen Bakterienstamm durch sein gut charakterisiertes Tn5-mutiertes Analog, das von einem Plasmid in E. coli getragen wird, zu ersetzen. Wenn ein Wildtyp-Locus kloniert worden ist, so kann die regionsgerichtete Mutagenese mit Tn5 oder seinen Derivaten oder Genkassetten, die Selektionsmarker tragen, dazu verwendet werden, um die Zielgene und -operons, die von der klonierten Region getragen werden, wirksam zu inaktivieren. Zu diesem Zweck können Tn5 selbst oder seine obenerwähnten Derivate oder beliebige Genkassetten mit Selektionsmarkern, z.B. der von pUC4K getragenen Km^r-Genkassette (Pharmacia, Uppsala, Schweden) eingesetzt werden. Dieser Ansatz ist dann sehr schlagkräftig, wenn man das Gen von Interesse, z.B. das Gen eines mutierten Stamms, der von dem Elternstamm, von dem das Wildtypgen früher kloniert wurde, entwickelt wurde, inaktivieren möchte. Die einzige Einschränkung bei dieser Art von Ersatzexperimenten ist die Länge der homologen Sequenzen, die für das doppelte Crossover-Rekombinationsevent erforderlich sind; vorzugsweise sind homologe Sequenzen mit einer Länge von 0,5-5 kB an beiden Enden erforderlich. Die bevorzugten Vektoren für die regionsgerichtete Mutagenese sind dieselben wie diejenigen, die sich auch für die Transposonmutagenese eignen, nämlich die obengenannten Suizidphagen- und -plasmidvektoren.
(c) Ortsgerichtete Mutagenese
Wird ein Wildtyp-Gen kloniert und seine Nukleotidsequenz bestimmt, so kann man auch mittels ortsgerichteter Mutagenese die Zielgene inaktivieren. Für das Mutieren von interessierenden Genen werden Oligonukleotid-Primer, die eine Addition und Deletion von Nukleotiden zwecks Leserasterverschiebung oder eine Substitution von Nukleotiden für die Einführung von Stop-Codons oder anderen Codons beinhalten, verwendet. Die Mutagenese mit Primern, die (eine) Mutation(en) beinhalten, können üblicherweise in E. coli mit einem beliebigen im Handel erhältlichen Kit für die ortsgerichtete Mutagenese durchgeführt werden. Diese Art von Mutagenese eignet sich dann, wenn die Mutagenese mit einer Kassette, die auf Tn5 oder eine Region gerichtet ist, einen polaren Effekt verursacht, der die Genexpression stromabwärts oder stromaufwärts beeinflußt.
Bei den bevorzugten Vektoren für die Einführung des mutierten Gens in den Zielmikroorganismus handelt es sich um die gleichen wie diejenigen, die sich für die Transposonmutagenese eignen. Im vorliegenden Fall kann die gewünschte Mutante mittels eines Bioassays, z.B. Enzym- oder Immun-Screening zum Nachweisen der Defizienz des Zielgenprodukts isoliert werden. Statt dessen kann das mutierte Gen mit dem oben beschriebenen Selektionsmarkergen an der Stelle, die nicht die Genexpression stromabwärts oder stromaufwärts beeinflußt, markiert werden, um die Selektion des Genersatzes zu erleichtern. Man kann leichter zu einer Zielgenstörung gelangen, wenn man den Bioassay mit einer Markerselektion kombiniert.
Die für L-Sorbosereduktase defiziente Mutante kann allgemein folgendermaßen selektiert werden: Mit 3 000 bis 10 000 Transposonmutanten wird ein Produktassay mit L-Sorbose als Substrat durchgeführt, um die Mutante zu selektieren, die nicht L-Sorbose in D-Sorbitol umwandelt. Das erste Screening kann vorzugsweise in Mikrotiterplatten erfolgen, wobei der Ansatz L-Sorbose enthält. Die Bildung des Produkts, nämlich D-Sorbitol, wird erstens mittels DC mit einem geeigneten Elutionsmittel nachgewiesen; Kandidaten, die nicht nachweisbare D-Sorbitolmenten bilden, werden selektiert.
Dann wird mit den Kandidatenmutanten ein Assay auf L-Sorbosereduktaseaktivität wie in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung durchgeführt, um die Defizienz für L-Sorbosereduktase zu bestätigen.
Zur Bestätigung, daß die defiziente Mutante tatsächlich das Transposon trägt, wird üblicherweise eine Kolonie- oder Southern-Hybridisierung nach Standardmethoden durchgeführt, wobei das markierte DNA-Fragment, das das Transposon trägt, als Sonde verwendet wird (Molecular cloning, a laboratory manual, second edition, Maniatis T., et al., 1989).
Solche eine Mutante wurde wie in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung beschrieben isoliert. Die Transposonmutante eignet sich für die weitere Identifizierung des als Ziel dienenden L-Sorbosereduktasegens und für die Bestimmung seiner Nukleotidsequenz der mit dem Transposon markierten Region.
Das von einem Transposon insertierte DNA-Fragment kann in beliebige E. coli-Kloniervektoren eingeführt werden, vorzugsweise pUC18, pUC19, pBluescript II (Stratagene Cloning Systems, CA, USA) und ihre Verwandten, und zwar dadurch, daß man Transformanten selektiert, die beide Phänotypen von Selektionsmarkern des Vektors und des Transposons, aufweisen. Die Nukleotidsequenzen neben dem Transposon können auch z.B. mittels eines Kettenabbruchverfahrens (Sanger F.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, 1977) bestimmt werden. Bei den erhaltenen Nukleotidsequenzen kann es sich um Partialsequenzen handeln, deren Leseraster schwer zu bestimmen sein kann.
Sobald die Nukleotidsequenzen bestimmt wurden, kann man mit ihnen eine Homologiesuche durchführen, die mit Nukleotid- und/oder Proteinsequenzdateien erfolgt, und zwar dadurch, daß man ein genetisches Analyseprogramm, z.B. BLASTP-Abfrage, einsetzt (Lipman et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). Findet man irgendwelche homologen Sequenzen, so kann mit mit ihren Aminosäuresequenzen ein Alignment durchführen, um irgendwelche Konsensus-Sequenzen, die zwischen den homologen Proteinen konserviert sind, aufzufinden. Gemäß den Konsensussequenzen können Oligonukleotid-Primer synthetisiert und für die Amplifikation der Partial-DNA des Zielgens mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden. Neben den Konsensussequenzen können auch beliebige Aminosäuresequenzen, die nach Einstellung des Leserasters durch Alignment von homologen Proteinen bestimmt werden, für die Entwicklung der PCR-Primer verwendet werden.
Das erhaltene, mittels PCR hergestellte Partialgen kann als Sonde verwendet werden, um das vollständige Zielgen mittels Southern- und Kolonie-Hybridisierung zu erhalten. Mittels Southern-Hybridisierung gelangt man zur Größe des DNA-Fragments, das das Zielgen enthält, und man kann eine Mini-Genbibliothek, die die DNA-Fragmente mit der gewünschten Größe enthält, konstruieren. Die Minibibliothek kann anschließend mit dem Partialgen als Sonde mittels Kolonie-Hybridisierung durchmustert werden, um zu dem vollständigen Zielgen zu gelangen. Anschließend kann die vollständige Nukleotidsequenz des Zielgens bestimmt werden, um sein offenes Leseraster zu identifizieren.
Bei der von einem Transposon insertierten Region kann es sich um ein Regulationsgen handeln, das die Expression des Strukturgens der L-Sorbosereduktase kontrolliert; bei dem Regulationsgen kann es sich auch um den Angriffspunkt für die Disruption des L-Sorbosereduktasegens handeln.
Mit dem klonierten DNA-Fragment, das das partielle oder ganze L-Sorbosereduktasegen des Zielmikroorganismus enthält, läßt sich das L-Sorbosereduktasegen des Zielmikroorganismus disrumpieren. Eine schematische Vorgehensweise und ein schematischer Mechanismus für die Disruption sind in 4 bzw. 5 dargestellt. Das DNA-Fragment wird erst in einen E. coli-Vektor wie pBluescript II SK kloniert. Anschließend wird eine Genkassette, die einen Selektionsmarker wie das Km^r-Gen enthält, in das als Angriffspunkt dienende L-Sorbosereduktasegen insertiert, so daß keine aktive L-Sorbosereduktase gebildet wird. Das erhaltene DNA-Fragment mit dem disrumpierten L-Sorbosereduktasegen wird auf einen Suizidvektor wie pSUP202 umkloniert. Das Suizidplasmid, das das disrumpierte Gen trägt, kann in den Rezipientenmikroorganismus nach beliebigem Gentransferverfahren, darunter auch Konjugation, wie oben beschrieben eingeführt werden. Die Selektion der durch ein Doppel-Crossover-Rekombinationsevent erzeugten Zielmutante kann dadurch erfolgen, daß man Kolonien, die das Selektionsmarkergen (z.B. Km^r) exprimieren, isoliert und seine chromosomale DNA mittels Southern-Blot-Hybridisierung charakterisiert. Die L-Sorbosereduktasedefizienz der mutmaßlichen Mutante wird auf Fehlen einer nachweisbaren Enzymaktivität von L-Sorbosereduktase verifiziert.
Solch eine Mutante wurde wie in Beispiel 5 der vorliegenden Erfindung beschrieben als Stamm SR3 isoliert. Die Nichtverwertung von L-Sorbose kann mit einem beliebigen Medium, das 1-500 g/l D-Sorbit enthält auf L-Sorbosefermentation untersucht werden, und zwar dadurch, daß man die Konzentration der L-Sorbose, sobald sie aus dem D-Sorbit in der Fermentationsbrühe umgewandelt ist, verfolgt. Statt dessen kann man mit L-sorbose-haltigem Medium auch die Nichtverwertung von L-Sorbose unter Fermentationsbedingungen bestätigen.
Die in der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Mutanten können in einem wäßrigen Medium mit einem Zusatz von entsprechenden Nährstoffen unter aeroben Bedingungen kultiviert werden. Die Kultur kann bei einem pH-Wert zwischen ungefähr 3,0 und 9,0, vorzugsweise zwischen ungefähr 5,0 und 8,0, erfolgen. Obwohl die Kulturzeit je nach dem pH-Wert, der Temperatur und dem verwendeten Nährmedium schwankt, gelangt man üblicherweise in 1 bis 6 Tagen zu günstigen Ergebnissen. Ein bevorzugter Temperaturbereich für die Kultivierung liegt von ungefähr 13°C bis 45°C, vorzugsweise von ungefähr 18°C bis 42°C.
Üblicherweise muß das Kulturmedium Nährstoffe wie verwertbare Kohlenstoffquellen, verdauliche Stickstoffquellen und anorganische Substanzen, Vitamine, Spurenelemente und sonstige wachstumsfördernde Faktoren enthalten. Als verwertbare Kohlenstoffquellen können Glycerin, D-Glucose, D-Mannit, D-Fructose, D-Arabit, D-Sorbit, L-Sorbose und dergleichen eingesetzt werden.
Als Stickstoffquellen können auch verschiedene organische oder anorganische Substanzen eingesetzt werden, wie zum Beispiel Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Casein, Maisquellwasser, Harnstoff, Aminosäuren, Nitrate, Ammoniumsalze und dergleichen. Als anorganische Substanzen können Magnesiumsulfat, Kaliumphosphat, Eisen(II)- und Eisen(III)-chlorid, Calciumcarbonat und dergleichen eingesetzt werden.
Die L-sorbosereduktasedefiziente Mutante der vorliegenden Erfindung kann bei der fermentativen Oxidation von D-Sorbit eingesetzt werden, und es wird erwartetet, daß sie durch Erhöhen der L-Sorbose, die für den Schritt der Kondensationsreaktion von L-Sorbose zu Diaceton-L-Sorbose verwertbar ist, die Vitamin-C-Ausbeute verbessert. Wie dem Fachmann klar ist, kann die L-sorbosereduktasedefiziente Mutante der vorliegenden Erfindung bei beliebigen Verfahren der Vitamin-C- Produktion eingesetzt werden, bei denen L-Sorbose als Reaktionszwischenprodukt vorkommt.
Die vorliegende Erfindung wird durch die unten beschriebenen Beispiele, die sich auf die beigelegten Zeichnungen beziehen, genauer beschrieben; in denen folgendes dargestellt ist:
1 zeigt die Nukleotidsequenzen stromaufwärts und stromabwärts der Tn5-Insertionsregion der chromosomalen DNA der von G. melanogenus IFO 3293 abstammenden L-sorbosereduktasedefizienten Mutante 26-9A.
2 zeigt die Oligonukleotidprimer, die für die PCR-Klonierung des SR-Gens aus G. suboxydans IFO 3291 eingesetzt wurden.
3 zeigt die Restriktionskarte des 8,0 kB großen EcoRV-Fragments, das das L-Sorbosereduktasegen von G. suboxydans IFO 3291 (oben) und seine vergrößerte Region in der Nähe des L-Sorbosereduktasegens (unten) trägt, wobei die gefundenen offenen Leseraster (ORFs) angegeben sind.
4 ist ein Schema für die Konstruktion eines Suizidplasmids für die Disruption des L-Sorbosereduktasegens in G. suboxydans IFO 3291.
5 zeigt einen schematischen Mechanismus für die Disruption des L-Sorbosereduktasegens von G. suboxydans IFO 3291.
6 zeigt die Graphen der Fermentationsprofile vom Stamm SR3 und G. suboxydans IFO 3291 in Nr. 5-Medium mit 8% Sorbit.
7 zeigt die Graphen der Fermentationsprofile vom Stamm SR3 und G. suboxydans IFO 3291 in SCM-Medium mit 2% Sorbit.
Beispiel 1. Isolation einer L-sorbosereduktasedefizienten Tn5-Mutante aus einem G. melanogenus IFO 3293 Abkömmling
(i) Tn5-Mutagenese
Es wurde eine Transposon-Mutagenese durchgeführt (Manning R.F. et al., USP5082785 ), um den L-sorbosereduktasedefizienten Stamm aus dem 2-keto-L-gulonsäureproduzierenden Stamm L42-9, der von G. melanogenus IFO 3293 erhalten wurde, mittels mehrstufiger Mutationen mit chemischen Mutagenen, darunter NTG und ICR170, Ultraviolett-Bestrahlung usw. zu konstruieren. Der Stamm E. coli W3110, der P1::Tn5 trägt, und auf LB-Agarplatte mit 30 μg/ml Kanamycin erhalten wurde, wurde in 5 ml P1-Medium (LB mit Zusatz von 0,01 M MgSO₄·7H₂O und 10 μg/ml Thymin) überimpft und bei 30°C über Nacht gezüchtet. Ein ml dieser Kultur wurde in 100 ml desselben Mediums in einem 500-ml-Erlenmeyer-Kolben überimpft und 95 min bei 30°C bis zum Erreichen einer OD550 von ungefähr 0,09 gezüchtet. Die erhaltene Kultur wurde 10 min auf Eis gekühlt und dann bei 3500 U/min bei 4°C 20 min lang zentrifugiert. Die Zellen wurden in 25 ml P1-Medium suspendiert, und die Zellsuspension wurde in einen 300-ml-Kolben übertragen und 20 min ohne Schütteln bei 42°C inkubiert. Wenn durch 90minütiges Stehenlassen bei 37°C ein Lysieren der Zelle beobachtet wurde, wurden die Zellen durch Versetzen mit 0,5 ml Chloroform lysiert. Anschließend wurde der Ansatz gründlich mit dem Vortex-Mixer gemischt, 10 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und 15 min lang bei 4°C bei 10 000 U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand in eine sterile Glasflasche mit Schraubverschluß übertragen wurde, wurde nochmals mit 0,5 ml Chloroform versetzt, und das Lysat wurde bei 4°C aufbewahrt.
Die Rezipientenzelle, L42-9, die auf einer Nr. 4-Agarplatte bestehend aus 0,5% Glycerin, 0,5% Hefeextrakt (Difco) und 0,5% MgSO₄·7H₂O gezüchtet wurde, wurde in ein Röhrchen mit 5 ml Nr. 4-Medium überimpft und auf einem Röhrchenschüttler bei 30°C über Nacht gezüchtet. Ein ml der Kultur wurde in 30 ml desselben Mediums in einem 500-ml-Erlenmeyer-Kolben übertragen und 3 h bei 30°C gezüchtet. Die Kultur wurde 15 min lang zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde in 1,8 ml 100 mM MC-Puffer bestehend aus 100 mM MgSO₄·7H₂O und 100 mM CaCl₂ suspendiert. 0,1 ml der Zellsuspension wurde mit 0,1 ml 10fach mit 10 mM MC-Puffer verdünnter Phagenlösung in dem Röhrchen gemischt und 60 min bei 30°C belassen. Nach Versetzen mit 0,8 ml Nr. 4-Medium wurde das Röhrchen 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die infizierte Zellsuspension mit einem Volumen von 0,2 ml wurde dann auf Nr. 4-Medium-Agarplatten, die 100 μg/ml Kanamycin enthielten, ausplattiert und 5 Tage lang bei 27°C inkubiert.
(ii) Durchmustern von L-sorbosereduktasedefizienten Mutanten mittels Produktassay
Stämme mit Tn5 (Km^r), die 4 Tage lang bei 27°C auf einer Nr. 4-Km-Agarplatte gezüchtet worden waren, wurden in 50 μl 0,15 M Citrat-Na₂HPO₄-Puffer (pH 8,0)-Lösung, die 4% L-Sorbose pro Näpfchen einer 96-Well-Mikrotiterplatte enthielt, suspendiert und 24 h lang bei 30°C ohne Schütteln inkubiert. Das aus L-Sorbose umgesetzte D-Sorbit wurde mittels Dünnschichtchromatographie (DC) anhand von 1 μl der Probe analysiert. Die DC-Analyse erfolgte mittels einer Kieselgel 60 F₂₅₄ DC-Platte von Merck; Lösungsmittel Essigester/Isopropylalkohol/Essigsäure/H₂O = 10:6:3,5:3; und Sprühreagentien von 0,5% KIO₄-Lösung und einem Tetrabase-Reagens, das dadurch hergestellt wurde, daß man 2N gesättigtes Acetat mit Tetrabase und 15% MnSO₄·4-6 H₂O (1:1 v/v) vermischte.
Gemäß DC-Analyse wurde eine Mutante mit der Bezeichnung 26-9A als mutmaßliche L-sorbosereduktasedefiziente Mutante erhalten. Der Stamm 26-9A produzierte aus L-Sorbose eine schwache Menge D-Sorbit, während die anderen Tn5-Mutanten und der Elternstamm L42-9 beträchtliche D-Sorbitmengen produzierten.
(iii) Bestimmung der L-Sorbosereduktaseaktivität
Zellen, die 2 Tage lang bei 30°C auf 8%-Sorbit-Nr.5-Medium, das aus 8% D-Sorbit, 1,5% Hefeextrakt (Oriental Yeast Co., Osaka, Japan), 0,25% MgSO₄·7H₂O, 0,05% Glycerin und 1,5% CaCO₃ (in Produktionsqualität) bestand, gezüchtet worden waren, wurden mittels Zentrifugation geerntet und zweimal mit 0,3% NaCl-Lösung gewaschen. Der Zellenbrei wurde in 10 mM KH₂PO₄-K₂HPO₄-Puffer (pH 7,0) suspendiert und zweimal durch eine French-Druckzellenpresse gegeben. Nach Zentrifugation zum Entfernen von ganzen Zellen wurde der Überstand 60 min bei 100 000 × g zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde als L-Sorbosereduktasequelle gewonnen.
Die L-Sorbosereduktaseaktivität wurde mittels eines photometrischen Assays in Gegenwart von NADPH bestimmt (T. Sugisawa et al., Agric. Biol. Chem., 55: 2043-2049, 1991). Der Ansatz enthielt 5 mg/ml L-Sorbose, 0,4 mg/ml NADPH in 50 mM KH₂PO₄-KH₂HPO₄-Puffer (pH 7,0) und 10 μl Enzymlösung. Die Absorptionsänderung aufgrund der substratabhängigen Oxidation von NADPH wurde bei 340 nm mit einem UVIKON 810 Spektrophotometer von Kontron verfolgt. Eine Einheit Reduktaseaktivität wurde als diejenige Menge Enzym definiert, die die Bildung von 1 μmol NADP pro min katalysiert.
Die L-Sorbosereduktaseaktivitäten von Stamm 26-9A und seinem Elternstamm L42-9 wurden wie oben beschrieben als weniger als 0,01 bzw. 0,21 Einheiten/mg Protein bestimmt.
(iv) Koloniehybridisierung
Die Einführung des Tn5-Fragments auf das Chromosom vom Stamm 26-9A wurde mittels einer Kolonie-Blot-Hybridisierung mit ³²P-markierter Col E1::Tn5 DNA als Sonde bestätigt.
Beispiel 2. Klonierung und Nukleotidsequenzierung der Tn5-Insertionsregion
Neue Tn5-Mutanten wurden dadurch rekonstruiert, daß man pSUP202 (Ap^rCm^rTc^r ^'; Simon R. et al., BIO/TECHNOL., 1: 784-791, 1983) mit dem Tn5-haltigen DNA-Fragment einsetzte, um zu bestätigen, daß die L-Sorbosereduktasedefizienz von 26-9A durch die Tn5-Insertion und nicht durch eine andere Mutation, die gleichzeitig an der von der Position der Tn5-Insertion verschiedenen Position von der 26-9A-DNA stattgefunden hat. Aus einer Southern-Blot-Hybridisierung von verschiedenen DNA-Fragmenten von Chromosomen des Stamms 26-9A ging hervor, daß ein 13 kB großes EcoRV-Fragment, das ein ganzes Tn5 enthielt, genug DNA (mehr als mindestens 1 kB) an beiden Seiten der Tn5-Insertionsstelle für eine doppelte Crossover-Rekombination aufwies. Das EcoRV-Fragment wurde in pSUP202 kloniert, wodurch man pSR02 erhielt, das anschließend in G. melanogenus IFO 3293 eingeführt wurde, wodurch man die Km^rCm^s-Stämme 3293EV-1 und 3293EV-9 erhielt. Eine Southern-Blot-Hybridisierungsanalyse der Stämme 3293EV-1 und 3293EV-9 zeigte, daß beide Stämme Tn5 ohne den pSUP202-Vektorabschnitt wie Stamm 26-9A (Werte nicht gezeigt) enthielten, was anzeigt, daß eine homologe Rekombination durch doppeltes Crossover stattgefunden hatte. Eine Defizienz für L-Sorbosereduktaseaktivität in den Stämmen 3293EV-1 und 3293EV-9 wurde mittels eines Produkt-Assays und eines photometrischen Enzymassays, wie er für den Stamm 26-9A durchgeführt wurde, geprüft; neue Tn5-Mutanten produzierten ebenfalls nicht nachweisbare L-Sorbose und wiesen eine L-Sorbosereduktaseaktivität unter 0,01 Unit/mg Cytosolprotein auf, während G. melanogenus IFO 3293 eine L-Sorbosereduktaseaktivität von 0,20 Units/mg Cytosolprotein aufwies. Daraus konnte geschlossen werden, daß die Tn5-Insertion in 26-9A eine L-Sorbosereduktasedefizienz verursacht hat.
Die Nukleotidsequenz der Tn5-Insertionsregion auf pSR02 wurde nach der Didesoxy-Kettenabbruchmethode bestimmt (Sanger F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467, 1977) (1). Eine Analyse der Tn5-Insertionsregion mittels Homologiesuche mit dem BLASTP-Programm (Lipman D. J. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990) ergab, daß die Region für ein Polypeptid mit Homologie mit Polypeptiden, die zur Familie der Mannitdehydrogenasen (MDH) gehören, aufweist. Eines der Mitglieder, nämlich die Mannit-2-Dehydrogenase (EC 1.1.1.67) von Rhodobacter sphaeroides (Schneider K.-H. et al., J. Gen. Microbiol., 1993), katalysiert die NAD-abhängige Oxidation von Mannit zu Fructose. Die L-Sorbosereduktase von Gluconobacter katalysiert nicht nur die Reduktion von L-Sorbose und D-Fructose zu D-Sorbit und D-Mannit in Gegenwart von NADPH, sondern auch die Oxidation von D-Sorbit und D-Mannit zu L-Sorbose und D-Fructose in Gegenwart von NADP (Sugisawa T. et al., ibid). Aus der Homologieanalyse ging hervor, daß das von dem Tn5-disrumpierten Gen von Stamm 26-9A codierte Polypeptid das L-Sorbosereduktasegen selbst und nicht sein Regulationsgen ist.
Beispiel 3. PCR-Klonierung
Das partielle L-Sorbosereduktasegen von G. suboxydans IFO 3291 wurde mittels PCR-Amplifikation kloniert, und zwar mit einem Satz Primer, die gemäß den in 2 gezeigten Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4) synthetisiert wurden; die degenerierten Primer wurden unter Berücksichtigung des „Codon Usage" von Gluconobacter synthetisiert. Die PCR ergab ein Produkt von ungefähr 300 Bp. Durch Southern- und Kolonie-Hybrydisierungsanalysen, bei denen dieses mittels PCR amplifizierte Fragment als Sonde eingesetzt wurde, erhielt man das vollständige L-Sorbosereduktasegen von G. suboxydans IFO 3291 in einem 8,0 kB großen EcoRV-Fragment.
Beispiel 4. Bestimmung der Nukleotidsequenz des L-Sorbosereduktasegens von G. suboxydans IFO 3291.
Die vollständige Nukleotidsequenz des L-Sorbosereduktasegens wurde mit dem 8,0 kB großen EcoRV-Fragment, das das L-Sorbosereduktasegen von G. suboxydans IFO 3291 enthielt, bestimmt. Die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz sind in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 dargestellt. Die Restriktionskarte des 8,0 kB großen EcoRV ist in 3 dargestellt. Das SR-Gen und zwei offene Leseraster, die stromabwärts des L-Sorbosereduktasegens gefunden wurden, und die für Polypeptide mit Homologien mit DnaJ-artigem Protein und Ferredoxin codieren, liegen in der entgegengesetzten Richtung. Stromaufwärts des L-Sorbosereduktasegens wurden keine relevanten ORFs gefunden, die eventuell gemeinsam mit dem L-Sorbosereduktasegen ein Operon bilden könnten. Man ist daher der Meinung, daß die Disruption des L-Sorbosereduktasegens nicht die Expression seiner benachbarten Gene beeinflußt.
Beispiel 5. Konstruktion der L-Sorbosereduktasegen-Disruptante von G. suboxydans IFO 3291.
Wie aus 4 ersichtlich handelt es sich bei den Ausgangsmaterialplasmiden um das Plasmid pUC4K, pSR03-1 und pSUP202. pUC4K ist ein Ausgangsmaterial für Kurresistente Genkassette und von Pharmacia (Uppsala, Schweden; Code Nr. 27-4958-01) verfügbar. Das Plasmid pSR03-1 ist ein Abkömmling des im Handel erhältlichen Vektors pBluescript II SK (Stratagene CA, USA; Katalog-Nr 212205 und 212206), mit dem in Beispiel 3 erhaltenen EcoRV-Fragment. Der Vektor pSUP202 ist ein Abkömmling von pBR325 mit einem Fragment, das eine mob-Stelle enthält, und pBR325 ist bekanntermaßen ein Abkömmling von pBR322. Obwohl es den Anschein hat, daß pBR selbst nicht im Handel erhältlich ist, ist man der Meinung, daß ein Alternativmaterial, z.B. pBR322 (ATCC 31344), pACYC177 (ATCC 37031) oder pACYC184 (ATCC 37033), leicht für den Fachmann anwendbar ist, wie dies als pSUP-Serie von Simon R. et al. (1983, Bio/Technology 1: 784-791) beschrieben wird. Über die Konstruktion eines Plasmids mit einer mob-Stelle wird ebenfalls von Simon R. et al. (ibid) berichtet.
4 zeigt das Schema für die Konstruktion eines Vektors, der das L-Sorbosereduktasegen ansteuert, nämlich pSUP202-SR::Km. Ein EcoRV-Fragment mit einer Größe von 8,0 kB wurde in die EcoRI-Stelle des Vektors pBluescript II SK kloniert (Alting-Mees M. A. et al., Methods in Enzymology 216: 483-95, Academic Press, London, 1992), wodurch man pSR03-1 erhielt. Eine Kanamycinresistenzgenkassette (Km-Kassette) wurde in eine EcoRI-Stelle in dem klonierten L-Sorbosereduktasegen insertiert, wodurch man pSR04-1 erhielt. Dieses mit Km-Kassette disrumpierte L-Sorbosereduktasegen wurde in einem pSUP202-Suiziduektor subkloniert. Das erhaltene pSR05-2, nämlich pSUP202-SR::Km (Km^r), wurde anschließend in G. suboxydans IFO3291 eingeführt, wodurch man die L-Sorbosereduktase-Nullmutante (Km^r) erhielt. Die gewünschte Gendisruption wurde schlußendlich mittels Southern-Hybridisierungsanalyse bestätigt. Ein schematischer Mechanismus für die Disruption ist in 5 dargestellt. Auf diese Weise erhielt man eine L- sorbosereduktasedefiziente Mutante SR3. Die Mutante SR3, deren L-Sorbosereduktasegen als Angriffspunkt diente, sowie G. suboxydans IFO 3291 wiesen eine L-Sorbosereduktaseaktivität von unter 0,02 bzw. 0,681 Units/mg Protein auf.
Beispiel 6. Fermentationsprofil des Stamms SR3 in Nr. 5-Medium mit 8% Sorbit
Die Wachstums- und L-Sorboseassimilationsprofile von Stamm SR3 und G. suboxydans IFO 3291 wurden mit Nr. 5-Medium mit 8% Sorbit in 500-ml-Erlenmeyerkolben ausgewertet (6). Der Stamm SR3 und G. suboxydans IFO 3291 konnten innerhalb von 24 h 80 g/l D-Sorbit in L-Sorbose umwandeln (Werte nicht dargestellt). G. suboxydans IFO 3291 assimilierte den größten Teil der umgewandelten L-Sorbose innerhalb von 48 h. Im Gegensatz dazu verwertete der, Stamm SR3 L-Sorbose bis zum dritten Tag kaum; die verbleibende L-Sorbose machte mehr als 70 g/l aus. Der Stamm SR3 und G. suboxydans IFO 3291 zeigten nach 6 Tagen eine OD600 (Zellwachstum) von 6,4 bzw. 24.
Beispiel 7. Fermentationsprofil des Stamms SR3 in SCM-Medium mit 2% Sorbit
Die Wachstums- und L-Sorboseassimilationsprofile von Stamm SR3 und G. suboxydans IFO 3291 wurden mit SCM-Medium mit 2% Sorbit in 500-ml-Erlenmeyerkolben ausgewertet (7). Der Stamm SR3 und G. suboxydans IFO 3291 konnten innerhalb von 12 h 20 g/l D-Sorbit in L-Sorbose umwandeln. G. suboxydans IFO 3291 assimilierte die Hälfte der umgewandelten L-Sorbose innerhalb von 23 h. Im Gegensatz dazu verwertete der Stamm SR3 L-Sorbose kaum. Der Stamm SR3 und G. suboxydans IFO 3291 zeigten nach 23 h eine OD600 (Zellwachstum) von 2,5 bzw. 5,9. Sequenzbeschreibung

Claims

Genetisch veränderter Mikroorganismus, der von einem Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter abstammt, und der ein Gen enthält, das für ein Protein mit L-Sorbosereduktaseaktivität codiert, wobei dieses Gen eine stabil integrierte Mutation aufweist, wobei besagter genetisch veränderte Mikroorganismus bezüglich der Umwandlung von L-Sorbose in D-Sorbitol defizient ist und wobei die L-Sorbosereduktaseaktivität in diesem genetisch veränderten Mikroorganismus weniger als 10% der Menge der Aktivität des Wildtyp-Mikroorganismus beträgt.
Der genetisch veränderte Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei dessen Gen mindestens eine Mutation mittels Disruption, Addition, Insertion, Deletion und/oder Substitution innerhalb einer Region, die für die Bildung einer aktiven L-Sorbosereduktase erforderlich ist, trägt.
Der genetisch veränderte Mikroorganismus nach Anspruch 2, wobei die Disruption mindestens ein interferierendes DNA-Fragment ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Transposon, einer Antibiotikaresistenz-Genkassette und DNA-Sequenzen, die den Wirtsorganismus an der Bildung einer aktiven L-Sorbosereduktase hindern, enthält.
Der genetisch veränderte Mikroorganismus nach Anspruch 2 oder 3, wobei besagte für die Bildung einer aktiven L-Sorbosereduktase erforderliche Region in der DNA-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Strukturgen, das für L-Sorbosereduktase codiert, und seinen Expressionskontrollsequenzen, liegt.
Der genetisch veränderte Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Gen, das für ein Protein mit L-Sorbosereduktaseaktivität codiert, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, einem Fragment von SEQ ID NO: 1, das für ein Polypeptid mit L-Sorbosereduktaseaktivität codiert, und einem Polynukleotid, das für SEQ ID NO: 2 codiert.
Verwendung eines L-Sorbosereduktasegens für die Erzeugung eines genetisch veränderten Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei besagtes Gen dadurch gekennzeichnet ist, daß es für die Aminosäuresequenz der in SEQ ID NO: 2 beschriebenen L-Sorbosereduktase oder ihr funktionelles Äquivalent, das eine Insertion, Deletion, Addition und/oder Substitution von einer oder mehreren Aminosäure(n) in dieser SEQ ID NO: 2 enthält, codiert.
Verfahren zur Herstellung von L-Sorbose durch Fermentation eines Mikroorganismus in einem entsprechenden Medium, umfassend die Verwendung von besagtem, in Ansprüchen 1 bis 5 definierten, genetisch verändertem Mikroorganismus.
Verfahren zur Herstellung von Vitamin C, umfassend einen Fermentationsschritt für die Herstellung von L-Sorbose, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren die Verwendung eines, in ein in einem der Ansprüche 1 bis 5 definierten, genetisch veränderten Mikroorganismus umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines genetisch veränderten Mikroorganismus nach Anspruch 1, umfassend: (a) Bereitstellen eines Miroorganismus der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter, der ein Gen enthält, das für ein Protein mit L-Sorbose reduktaseaktivität codiert, und (b) Einführen einer Mutation in dieses Polynukleotid, die zu einer biologischen Aktivität zur Reduktion von L-Sorbose führt, die weniger als 10% der Aktivitätsmenge des Wildtyp-Mikroorganismus beträgt.
Verfahren zur Herstellung eines genetisch veränderten Mikroorganismus, umfassend die folgenden Schritte: (a) Bereitstellen eines Miroorganismus der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter, der ein Gen enthält, das für ein Protein mit L-Sorbosereduktaseaktivität codiert, (b) genetisches Verändern dieses Mikroorganismus durch Einführen einer stabilen Mutation in dieses Gen, (c) Bestimmen der L-Sorbosereduktaseaktivität des Mikroorganismus, der das in Schritt (b) erhaltene mutierte Gen enthält, (d) Selektieren eines Mikroorganismus basierend auf Schritt (c), in dem die L-Sorbosereduktaseaktivität weniger als 10% des Wildtyp-Organismus beträgt.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei der Mikroorganismus durch Gendisruption, -addition, -insertion, -deletion und/oder -substitution innerhalb einer Region, die für die Bildung einer aktiven L-Sorbosereduktase erforderlich ist, genetisch verändert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei das Gen, das für die L-Sorbosereduktase codiert, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, einem Fragment von SEQ ID NO: 1, das für ein Polypeptid mit L-Sorbosereduktaseaktivität codiert, und einem Polynukleotid, das für SEQ ID NO: 2 codiert.
Verfahren zur Herstellung von L-Sorbose oder Vitamin C, umfassend einen Fermentationsschritt für die Herstellung von L-Sorbose in einem entsprechenden Medium mit einem Mikroorganismus, der mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12 hergestellt wird.