KR100710948B1

KR100710948B1 - 유전공학적으로 제조된 엘-소르보스 환원효소-결핍 변이주

Info

Publication number: KR100710948B1
Application number: KR1019990008359A
Authority: KR
Inventors: 호시노다쓰오; 곤다카히데; 신조마사코; 다조에마사아키
Original assignee: 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date: 1998-03-13
Filing date: 1999-03-12
Publication date: 2007-04-24
Also published as: DE69937086T2; NO991197D0; JP2000060576A; CN1229134A; AU2039099A; BR9902010A; ID23461A; US6664082B1; KR19990077840A; NO991197L; HK1021993A1; CN1163593C; CA2265239A1; DE69937086D1

Abstract

본 발명은 L-소르보스를 환원하는 유전자의 재조합에 의해 L-소르보스를 환원하는 생물학적 활성이 실질적으로 상실됨을 특징으로 하는, 글루코노박터(Gluconobacter) 속 또는 아세토박터(Acetobacter) 속에 속하는 미생물로부터 유래된 유전공학적으로 제조된 미생물에 관한 것이다.

Description

유전공학적으로 제조된 엘-소르보스 환원효소-결핍 변이주{Genetically engineered L-sorbose reductase-deficient mutants}

도 1은 글루코노박터 멜라노제누스(Gluconobacter melanogenus) IFO 3293에서 유래한 L-소르보스 환원효소-결핍 변이주, 26-9A의 염색체 DNA에서 Tn5-삽입된 영역의 업스트림(upstream) 및 다운스트림(downstream)의 뉴클레오타이드 서열을 도시한 것이다.

도 2는 글루코노박터 서브옥시단스(Gluconobacter suboxydans) IFO 3291에서 유래한 L-소르보스 환원효소(SR) 유전자를 중합효소 연쇄 반응(PCR) 클로닝(cloning)하는데 사용된 올리고뉴클레오타이드 프라이머(primer)를 도시한 것이다.

도 3은 글루코노박터 서브옥시단스 IFO 3291의 L-소르보스 환원효소 유전자를 함유한 8.0kb의 EcoRV 단편의 제한지도(상) 및 개방 판독틀(reading frame)이 발견되는 L-소르보스 환원효소 유전자 근처에서 EcoRV 단편의 확대된 영역의 제한지도(하)를 도시한 것이다.

도 4는 글루코노박터 서브옥시단스 IFO 3291에서 L-소르보스 환원효소 유전자의 파괴(disruption)를 위해 자살(suicide) 플라스미드를 제조하는 순서도이다.

도 5는 글루코노박터 서브옥시단스 IFO 3291의 L-소르보스 환원효소 유전자를 파괴하는 도식적인 메카니즘을 도시한 것이다.

도 6은 8% 소르비톨-5번 배지에서 균주 SR3 및 글루코노박터 서브옥시단스 IFO 3291의 발효 프로파일을 설명하는 그래프이다.

도 7은 2% 소르비톨-SCM 배지에서 균주 SR3 및 글루코노박터 서브옥시단스 IFO 3291의 발효 프로파일을 설명하는 그래프이다.

본 발명은 발효에 의해 L-소르보스를 생산하는데 사용되고, 비타민 C의 생산 공정을 개선시키는데 유용한, 글루코노박터(Gluconobacter) 속 또는 아세토박터(Acetobacter) 속에 속하는 미생물로부터 유래한 유전공학적으로 제조된 신규한 L-소르보스 환원효소-결핍 변이주에 관한 것이다.

비타민 C는 단일 생물학적 단계로서, 글루코노박터 속 또는 아세토박터 속에 속하는 미생물에 의해 D-소르비톨을 L-소르보스로 전환시키는 발효 공정을 포함하는 라이히슈타인(Reichstein) 방법에 의해 생산되어 왔다. L-소르보스로 전환시키는 단계는 비타민 C 생산의 효율에 있어서 핵심 단계 중 하나이다. 그러나, 이들 균주는 산화발효를 하는 동안 기질인 D-소르비톨을 다 소비한 후에 생성물인 L-소르보스를 소비한다는 사실이 관찰되었다. 이러한 현상은 L-소르보스가 사이토졸(cytosol)에 존재하는 NADPH-결합된 L-소르보스 환원효소(이하, 경우에 따라 SR이라 지칭한다)에 의해 환원되기 때문인 것으로 생각되었다(스기사와(Sugisawa) 등의 문헌[Agric. Biol. Chem., 1991, 55, 2043-2049] 참조). 글루코노박터는 D-소르비톨을 D-프럭토스로 전환시키고 D-프럭토스는 5탄당 경로를 통해 추가로 CO₂로 대사될 수 있다고 보고되었다(신조(Shinjoh) 등의 문헌[Agric. Biol. Chem., 1990, 54, 2257-2263] 참조). 기질 뿐만 아니라 생성물도 소비하는 이러한 경로는 궁극적으로 비타민 C의 생산성을 낮추는 원인이 된다.

L-소르보스 생산의 개선은 노가미(Nogami) 등의 일본 특허 공개공보 제 51054/1995 호에 보고되어 있다. 노가미 등은 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans) 및 글루코노박터 서브옥시단스의 미생물에 통상의 화학적 돌연변이를 유발시켜, 그 변이주 중에서 D-소르비톨을 유일한 동화성 탄소원으로 이용하는 능력이 감소된 변이주를 분리하였다. 이러한 변이주를 L-소르보스를 생산하는 발효에 적용하여 모균주에 비해 생산성을 2 내지 3% 이상 개선시켰다.

통상의 돌연변이 유발 방법으로 제조된 변이주에서 종종 관찰되는 문제점 중 하나는 발효 중이나 변이주의 2차 배양시 변이주의 개선된 특성을 상실시키는 복귀 돌연변이(back mutation)로서, 이 현상은 궁극적으로 비타민 C의 생산성을 감소시 킨다. 따라서 L-소르보스 환원효소가 안정하게 차단된 변이주가 바람직하다.

한 양상에서, 본 발명은 L-소르보스를 환원시키는 생물학적 활성이 유전공학적 방법에 의해 실질적으로 상실됨을 특징으로 하는, 글루코노박터 속 또는 아세토박터 속에 속하는 미생물에서 유래한, 유전공학적으로 제조된 신규한 미생물을 제공한다. 바람직하게는 변이된 미생물은 원래 미생물이 갖는 생물학적 활성의 10% 미만의 생물학적 활성을 갖고, 이 활성은 이하(예를 들어, 실시예 1(iii))에 기술한 활성의 정의에 따라 0.07 단위/㎎ 단백질 내지 0.02 단위/㎎ 단백질, 또는 그 미만이다. 본 발명의 유전공학적으로 제조된 미생물의 유전자는 미생물의 세포에서 활성 L-소르보스 환원효소를 형성하는데 필요한 유전자 영역내에서 뉴클레오타이드의 파괴, 첨가, 삽입, 결손 및/또는 치환에 의한 1종 이상의 돌연변이를 가질 수 있다.

본 발명의 유전공학적으로 제조된 미생물의 한 바람직한 실시형태에서, 상기 돌연변이는 활성 L-소르보스 환원효소를 형성하는데 필요한 영역내에서 유전자의 파괴에 의해 유발될 수 있다. 이러한 파괴는 트란스포존(transposon), 항생제 저항성 유전자 카세트(gene cassette), 및 숙주 미생물이 활성 L-소르보스 환원효소를 형성하지 못하도록 하는 임의의 DNA 서열로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 간섭 DNA 단편을 포함할 수 있다.

본 발명의 또다른 실시형태에서, 상기 돌연변이는 부위-지향성 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)에 의해 유발될 수 있다. 부위-지향성 돌연변이 유발은 활성 L-소르보스 환원효소를 형성하는데 필요한 영역에서 이루어질 수 있고, 이 영역에는 L-소르보스 환원효소의 구조 유전자 및 발현 조절 서열(예를 들어, 촉진유전자(promoter), 작동유전자(operator), 종결유전자(terminator), DNA 암호화 억제유전자(DNA encoding repressor), 활성화유전자(activator) 등)이 포함될 수 있다.

본 발명의 또다른 양상은 전술한 바와 같이 유전공학적으로 제조된 미생물의 제조에서 글루코노박터 속 또는 아세토박터 속에 속하는 미생물의 L-소르보스 환원효소 유전자의 용도를 제공하고, 이때 L-소르보스 환원효소 유전자는 서열번호:2에 기술된 L-소르보스 환원효소의 아미노산 서열 또는 서열번호:2에서 하나 이상의 아미노산의 삽입, 결손, 첨가 및/또는 치환을 포함하는 기능적 동일 서열을 암호화하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 하나의 양상은 적당한 배지에서 미생물을 발효시켜 L-소르보스를 생산하는 효율적인 방법을 제공하며, 이 방법은 전술한 본 발명의 유전공학적으로 제조된 미생물의 사용을 포함한다. 이러한 L-소르보스 생산 방법과 관련하여, 본 발명은 또한 전술한 바와 같이 본 발명의 유전공학적으로 제조된 미생물을 사용하여 발효를 수행하는 것을 특징으로 하는 L-소르보스 생산의 발효 단계를 포함하는, 효율적인 비타민 C 생산 방법을 제공한다.

본 발명은 유전공학적 방법에 의해 L-소르보스를 환원시키는 생물학적 활성이 실질적으로 상실됨을 특징으로 하는, 글루코노박터 속 또는 아세토박터 속에 속 하는 미생물로부터 유래한 유전공학적으로 제조된 신규한 미생물을 제공한다.

상기 유전공학적으로 제조된 미생물은 글루코노박터 알비두스(Gluconobacter albidus), 글루코노박터 캡슐라투스(Gluconobacter capsulatus), 글루코노박터 세리누스(Gluconobacter cerinus), 글루코노박터 디옥시아세토니쿠스(Gluconobacter dioxyacetonicus), 글루코노박터 글루코니쿠스(Gluconobacter gluconicus), 글루코노박터 인더스트리우스(Gluconobacter industrius), 글루코노박터 멜라노제누스[IFO 3293 및 일본 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(National Institute of Bioscience and Human-Technology)에 기탁된 FERM P-8386], 글루코노박터 논옥시글루코니쿠스(Gluconobacter nonoxygluconicus), 글루코노박터 옥시단스, 글루코노박터 옥시단스 아종 스파에리쿠스(Gluconobacter oxydans subsp. sphaericus), 글루코노박터 로제우스(Gluconobacter roseus), 글루코노박터 루비지노수스(Gluconobacter rubiginosus), 글루코노박터 서브옥시단스(IFO 3291), 아세토박터 크실리눔(Acetobacoter xylinum)[일본 오사카 소재의 발효 연구소(Institute of Fermentation)에서 IFO 3288로서 입수가능함], 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus), 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti), 아세토박터 한세니(Acetobacter hansenii) 및 아세토박터 리퀘파시엔스(Acetobacter liquefaciens)(IFO 12388; ATCC 14835)를 포함하는 글루코노박터 속 또는 아세토박터 속에 속하는 미생물일 수 있다. 이들 균주에 대한 자료는 또한 유럽 특허 공개공보(EPA) 제 213591 호 및 제 518136 호를 참조한다. 글루코노박터 서브옥시단스 IFO 3291은 글루코노박터 옥시단스 DSM4025(FERM BP-3813)와 글루코노박터 멜라노제누스 IFO 3293(FERM BP-8256)의 혼합체 형태로 기탁되어 있다. 더 자세한 사항은 유럽 특허 공개공보 제 518136 호에 기술되어 있다. 글루코노박터 서브옥시단스(IFO 3291) 및 글루코노박터 멜라노제누스(IFO 3293)에 대해서는 유럽 특허 공개공보 제 728840 호(미국 특허 출원 제 08/606807 호에 대응)를 참조한다.

L-소르보스를 환원하는 상기 미생물의 생물학적 활성을 상실시키기 위해, 본 발명은 활성 L-소르보스 환원효소를 형성하는데 필요한 미생물의 유전자 영역을 표적으로 하는 유전공학적 방법을 필요로 한다. 이러한 목적을 위해 사용하는 전형적인 방법은 트란스포존이나 선택 표지(selection marker) 유전자 카세트에 의한 유전자 파괴, 및 부위-지향성 돌연변이로서 공지된 방법이다. 이하에 기술한 바와 같이, 유전자 파괴 방법은 미생물의 표적 유전자를 확인하고 그 유전자 기능을 차단하는데 유용하다. 유전자의 전술한 표적 영역이 확인되면, 표적 DNA 단편에, 예를 들어 화학적 돌연변이원, 자외선 조사 등을 처리하는 통상적인 돌연변이 유발 방법을 적용할 수 있다.

유전자 파괴는 트란스포존 돌연변이 유발, 선택 표지(예를 들어, 항생제 저항성 유전자)를 함유한 유전자 카세트의 도입, 활성 L-소르보스 환원효소가 형성되지 못하게 하는 DNA 서열과 같은 간섭 DNA 단편을 미생물의 염색체 DNA에 도입시켜 행할 수 있다.

(a) 트란스포존 돌연변이 유발

트란스포존 돌연변이 유발은 유전자 분석을 위한 유력한 방법으로 공지되어 있다(게르하르트(P. Gerhardt) 등의 문헌["Methods for General and Molecular Bacteriology", 17장, Transposon Mutagenesis; American Society for Microbiology] 참조). 이 방법은 숙주 유기체의 게놈(genome) 내에서 새 부위로 이동할 수 있는(전위할 수 있는) 고유한 능력을 갖는 독특한 DNA 단편인 전위인자(transposable element)를 사용한다. 전위 과정은 유기체의 고유한 상동 재조합 시스템과는 다르다. 전위인자 새 게놈 부위로 삽입할 때 전위인자와 그의 표적 부위의 말단부 사이에 광범위한 DNA 상동성이 필요하지 않다. 전위인자는 다양한 원핵 유기체 및 진핵 유기체에서 발견되어 왔고, 이들은 영 돌연변이(null mutation), 염색체 재배열(rearrangement), 및 기존의 유전자와 오페론(operon)의 암호화 영역 또는 조절 서열에 삽입되어 신규한 패턴의 유전자 발현을 일으킬 수 있다.

원핵 유기체의 전위인자는 3가지의 다른 종류로 대략 분류될 수 있다. I형은 약 800 내지 1,500bp의 길이를 갖는 단순인자(예를 들어, 삽입 서열(IS 인자))로 구성되어 있다. IS 인자는 일반적으로 전위에 필요한 효소(즉, 전위효소(transposase))의 기질로 작용하는 말단반복된 DNA 서열이 측면에 있는 전위효소를 암호화하는 유전자로 구성되어 있다. IS 인자는 초기에는 장내 세균의 락토스 및 갈락토스 사용 오페론으로 확인되었는데, IS 인자는 삽입시 종종 불안정한 극성 돌연변이를 일으키는 것으로 나타났다.

II형은 복합 전위인자로 구성되어 있다. 복합 전위인자의 구성요소를 또한 트란스포존 또는 Tn 인자로 지칭한다. 원핵생물에서 트란스포존은 종종 단순 IS 인자(또는 그의 일부)를 트란스포존의 말단에 배향된 또는 전향된 반복부로 포함하고, 형태는 IS 인자처럼 작용하지만 전위 기능과 관련되지 않은 추가의 유전자(예를 들어, 항생제 저항성, 중금속 저항성 또는 병원성 결정 유전자)를 포함하는 복합 전위인자의 한 종류로 확인되어 왔다. 트란스포존이 특정의 유전자 좌위(locus) 또는 복제단위(replicon)(파지)에 삽입된 것을, 예를 들어 lacZ::Tn5 또는 λ::Tn5에서와 같이 이중콜론으로 표기한다.

III형은 파지 뮤(Mu) 및 관련물과 같은 "전위성" 박테리오파지를 포함한다. 파지 뮤는 바이러스이고 동시에 트란스포존이다. 파지 뮤는 숙주 염색체의 다중 부위에 삽입되어 종종 돌연변이를 일으킬 수 있는 것으로 알려져 있다.

상기 전위인자들을 사용하는 트란스포존 돌연변이 유발 방법은 다음의 특성을 갖는 것으로 알려져 있다.

(1) 트란스포존 돌연변이는 일반적으로 유전자를 불활성화시키며, 생성된 영 돌연변이는 상대적으로 안정하다.

(2) 트란스포존은 항생제 저항성 유전자, 새로운 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease) 절단 부위, 및 유전학적 수단(예를 들어, DNA-DNA 혼성법 또는 전자 현미경 헤테로듀플렉스(heteroduplex) 분석법)으로 확인될 수 있는 고유한 DNA 서열과 같은 새로운 유전학적 및 물리적 표지를 목표 좌위에 도입시킨다. 유전자 표지는 돌연변이된 좌위를 맵핑(mapping)하거나 변이주를 스크리닝(screening)하는데 유용하다.

(3) 트란스포존은 결손, 역위(inversion), 전좌(translocation) 또는 복제와 같은 다양한 게놈 재배열을 일으킬 수 있고, 특정 유전자를 표적 세균에 도입하는데 사용될 수 있다.

Tn3, Tn5, Tn7, Tn9, Tn10, 파지 뮤 등과 같은 다양한 트란스포존이 당해 분야에 공지되어 있다. 이들 중에서, Tn5는 거의 삽입 특이성을 갖지 않는 것으로 알려져 있고, 그 크기도 상대적으로 작다. Tn5는 또한 pfd-Tn5[미국종균보존소(American Type Culture Collection, ATCC)에 ATCC 77330으로 기탁된 것)] 또는 pCHR81(ATCC 37535) 같은 Tn5원으로부터 쉽게 유래될 수 있는, 가장 자주 사용되는 전위인자 중의 하나이다. 본 발명의 실시에서 랜덤 돌연변이 유발 방법(random mutagenesis)을 사용할 때 Tn5가 바람직하다. 항생제 저항성 유전자 또는 다른 선택 표지 유전자에 결합된, 19bp의 전위에 필요한 Tn5 전향된 반복부로 구성된 다양한 Tn5 유도체(미니(Mini)-Tn5s로 표기된다)가 본 발명에 또한 유용하다. 이러한 미니-Tn5s는 Tn5 전위효소 유전자(tnp) 이외에, 자살 벡터에 삽입되어 효율적인 자살 Tn5 돌연변이 유발 시스템을 구성한다. Tn5 트란스포존을 사용하여 돌연변이 시키는 방법에 관한 추가의 내용은 하기 참고문헌에서 참조할 수 있다: 게르하르트 등의 문헌["Methods for General and Molecular Bacteriology", 17장, Transposon Mutagenesis; American Society for Microbiology, 1994]; 및 티미스(K.N. Timmis) 등의 문헌[Mini-Tn5 transposon derivatives for insertion mutagenesis, promoter probing, and chromosomal insertion of cloned DNA in Gram-negative Eubacteria, J. Bacteriology, 1990, 172, 6568-6572].

Tn5를 pfd-Tn5로부터 유도하는 방법을 기술한 내용은 ATCC 인터넷 홈페이지[http://www.atcc.org/catalogs/recomb.html]에서 수득할 수 있는 pfd-Tn5(ATCC 77330)의 설명을 참조한다. 이에 따라 자살 플라스미드 pfd-Tn5는 이 콜라이(E. coli) 및 다른 그람 음성(Gram negative) 세균에 전기천공법(electroporation)에 의해 도입될 수 있다(권장 조건에 대해서는 참조문헌을 참조한다). 플라스미드 자체를 Tn5 공여체로 사용할 수 있다. 또한, 사용하고자 하는 임의의 플라스미드를 함유하는 수용체 이 콜라이에 pfd-Tn5 플라스미드를 도입하고, Km^r 및 표적 플라스미드의 저항성을 나타내는 형질전환체(transformants)를 선택하고, 이 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하고, 분리된 플라스미드로 이 콜라이를 형질전환시키고, Km 저항성 및 플라스미드-표지 저항성 형질전환체를 선택하여, Tn5를 갖는 표적 플라스미드를 포함한 이 콜라이 균주를 수득하는 방법으로 자살 Tn5 벡터를 구성할 수 있다. 이러한 프로토콜의 내용은 또한 전술한 게르하르트 등의 문헌중에서["region-directed Tn5 mutagenesis"] 찾을 수 있다.

트란스포존에 의한 랜덤 돌연변이 유발 방법은 트란스포존을 자살 플라스미드 또는 파지 벡터를 사용하여 형질전환, 형질도입(transduction), 접합 교잡법(conjugal mating) 또는 전기천공법에 의해 표적 세균 세포 내에 도입시키는 것을 포함한다. 생성된 변이주는 트란스포존이 함유한 표지에 의해 스크리닝될 수 있다. 트란스포존이 수용체 세균의 게놈으로 전위되었는지의 여부는 사용된 벡터가 분리(segregation)에 의해 손실된 후에 검사될 수 있다.

트란스포존을 글루코노박터 속 또는 아세토박터 속의 미생물에 도입할 때, 파지 P1의 유도체 및 숙주 범위가 좁은(narrow-host-range) 플라스미드를 포함하는 소위 자살 벡터가 통상적으로 사용된다. 파지 P1 벡터는 감염에 의해, 플라스미드 벡터는 형질전환, 접합 교잡법 또는 전기천공법에 의해 각각 수용체 세포로 전달될 수 있고, 이때 이들 벡터는 바람직하게는 수용체 세포의 적당한 기원(origin)을 상실시킨다. 사용할 자살 벡터 및 트란스포존은 파지 민감성, 수용체 세포의 고유한 항생제 저항성, 이 콜라이에 트란스포존-함유 벡터를 도입하기 위한 형질전환, 접합적 전달, 전기천공법, 또는 감염을 포함하는 유전자 전달 시스템의 이용가능성 등의 기준에 따라 선택한다.

본 발명에 사용하는데 바람직한 벡터 중 하나는 글루코노박터 속 또는 아세토박터 속에 속하는 미생물에 자신의 DNA를 주입하는 파지 P1(ATCC 25404)이지만, 파지 P1의 DNA는 복제능력이 없어서 분리에 의해 손실될 수 있을 것이다. Tn5(P1::Tn5)를 함유한 이러한 P1 파지는 공지된 과정에 따라 P1::Tn5를 함유한 이 콜라이를 용균하여 제조할 수 있는 파지 용해물의 형태로 사용할 수 있다(문헌 ["Methods for General and Molecular Bacteriology", 17장, Tranposon Mutagenesis; American Society for Microbiology] 또는 미국 특허 제 5082785 호(1992) 참조).

본 발명에서 사용할 수 있는 다른 바람직한 자살 벡터는 플라스미드 자살 벡터인데, 이 벡터는 좁은 숙주 범위 복제 기원을 제외한 이동 기능부 및 부위의 동일한 넓은 숙주 범위(broad-host-range) 접합 전달성을 갖는, 플라스미드 RP4 또는 이의 동족체 RK2(ATCC 37125)에서 유래한 복제단위에 기초할 수 있다. 이러한 벡터는 높은 비율로 이 콜라이로부터 글루코노박터 속 또는 아세토박터 속에 속하는 미생물로 이동될 수 있지만, 수용체 세포에서 안정하게 유지될 수는 없다. 이들 벡터는 Tn5 이외에, IncP형 이동(mob; oriT) 부위를 포함하고, 통상적으로 사용되는 이 콜라이 클로닝 벡터(예를 들어, pACYC177(ATCC 37031), pACYC184(ATCC 37033) 및 pBR325(볼리바(Bolivar F.)의 문헌[Gene, 1978, 4, 121-136; pBR322(ATCC 31344)의 유도체] 참조))에 기초하고, 이들 벡터는 모두 비장내세균에서는 복제될 수 없다(pSUP 시리즈, 사이몬(Simon R.) 등의 문헌[Bio/Technology, 1983, 1, 784-791] 참조). pSUP형 플라스미드는, 양-친체(bi-parental) 교잡법 실험에서 공여체 균주 자체(예를 들어, 균주 S17-1)에서 염색체에 결합되어 존재하는 IncP 플라스미드 Rp4의 한 카피(copy)로부터 트란스(trans) 전달 기능을 제공함으로써 이동될 수 있거나, 또는 삼-친체(tri-parental) 교잡 실험에서 이 콜라이의 비공여체, 비수용체 헬퍼(helper) 균주가 제공하는 플라스미드 pRK2013(ATCC 37159)으로부터 전달 기능을 제공함으로써 이동될 수 있다.

트란스포존을 수용하는 수용체 세포는 전위인자가 포함하는 표지(예를 들어, 특정 항생제에 대한 저항성)에 의해 선택될 수 있다. Tn5를 트란스포존으로 사용할 때, 일반적으로 Km^r 또는 Nm^r표지를 사용할 수 있다. Km^r 또는 Nm^r표지 이외에, Tc^r, Gm^r, Sp^r, Ap^r, Cm^r 등의 유전자 표지를 또 다른 표지 유전자로 사용할 수 있다. 쉽게 확인할 수 있는 유전자 산물(예를 들어, lacZ, luxAB 또는 phoA에 의해 발현되는 것)을 갖는 다른 트란스포존도 또한 사용할 수 있다. 표적 세균 균주가 Tn5의 선택에 일반적으로 사용되는 항생제(카나마이신(kanamycin), 네오마이신(neomycin), 블레오마이신(bleomycin) 및 스트렙토마이신(streptomycin))에 대해 고유한 저항성을 갖거나, Tn5 유도체를 이미 함유한 균주의 이차 돌연변이 유발을 행할 때, 이들 Tn5 유도체는 특히 유용하다(게르하르트 등의 문헌["Methods for General and Molecular Bacteriology", 17장, Transposon Mutagenesis; American Society for Microbiology] 참조).

(b) 영역지향성 돌연변이 유발(Region-directed mutagenesis)

Tn5 돌연변이 유발 프로토콜은 원래 세균 균주의 야생형(wild-type) 유전자를 이 콜라이의 플라스미드가 갖는 특성이 잘 알려진 Tn5-돌연변이된 유사 유전자로 치환시키는 유전자 치환 기술을 사용함으로써 확장된다. 야생형 좌위가 클로닝될 때, Tn5 또는 그의 유도체, 또는 선택표지를 함유한 유전자 카세트를 갖는 영역지향성 돌연변이를 효율적으로 유발시켜 클로닝된 영역에 포함된 표적 유전자 및 오페론을 불활성화시킬 수 있다. 이러한 목적을 위해서, 전술한 Tn5 또는 그의 유도체, 또는 선택표지를 갖는 임의의 유전자 카세트(예를 들어, pUC4K(스웨덴 웁살라 소재의 파마시아(Pharmacia) 제품)가 갖는 Km^r 유전자 카세트)를 사용할 수 있다. 이 방법은 일단 야생형 유전자가 클로닝된 모균주로부터 생성된 변이주의 유전자와 같은 중요 유전자를 불활성화시키고자 할 때 매우 효율적이다. 치환 실험의 이러한 유형이 갖는 유일한 제한점은 이중 유전자교환 재조합(double cross-over recombinant)에 필요한 상동 서열의 길이이다. 바람직하게는 양말단에서 0.5 내지 5kb 길의의 상동 서열이 요구된다.

영역지향성 돌연변이 유발 방법의 바람직한 벡터는 트란스포존 돌연변이 유발 방법에서 유용하게 사용된 것(전술한 자살 파지 및 플라스미드 벡터)과 동일하다.

(c) 부위-지향성 돌연변이 유발

야생형 유전자가 클로닝되고 그의 뉴클레오타이드 서열이 결정되면, 표적 유전자를 불활성시키기 위해 부위-지향성 돌연변이 유발 방법을 또한 사용할 수 있다. 프레임 쉬프트(frame-shift)를 위한 뉴클레오타이드의 첨가 및 결손, 또는 정지 코돈(codon)이나 다른 코돈의 도입을 위한 뉴클레오타이드의 치환을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 목표로 하는 유전자의 돌연변이에 사용할 수 있다. 돌연변이를 포함한 프라이머로 돌연변이시키는 것은 임의의 시판중인 부위-지향성 돌연변이 유발 키트(kit)를 사용하여 일반적으로 이 콜라이에서 행해질 수 있다. Tn5-돌연변이 유발 방법 또는 영역지향성-카세트-돌연변이 유발 방법이 다운스트림 또는 업스트림의 유전자 발현에 영향을 미치는 극성 효과를 일으킨다면, 부위-지향성 돌연변이 유발 방법이 유용하다.

변이된 유전자를 표적 미생물에 도입하는데 바람직한 벡터는 트란스포존 돌연변이 유발 방법에서 유용하게 사용된 것과 동일하다. 이 경우에, 목표로 하는 변이주는 생물학적 분석법(예를 들어, 효소학적 또는 면역학적 스크리닝)에 의해 분리되어 표적 유전자 산물이 결핍되었는지를 검사할 수 있다. 대신에, 변이된 유전자를 다운스트림 또는 업스트림의 유전자 발현에 영향을 미치지 않는 부위에서 전술한 선택표지 유전자를 태그(tag)시켜 치환 유전자의 선택을 용이하게 할 수 있다. 생물학적 분석법과 표지-선택법을 조합하여 더 쉽게 표적 유전자가 파괴된 균주를 수득할 수 있다.

L-소르보스 환원효소-결핍 변이주를 일반적으로 하기와 같이 선택할 수 있다. 3,000 내지 10,000개의 트란스포존 변이주를 L-소르보스를 기질로 하는 생성물 분석법을 행하여 L-소르보스를 D-소르비톨로 전환시키지 않는 변이주를 선택할 수 있다. 첫 번째 스크리닝은 바람직하게는 L-소르보스를 함유한 반응 혼합물로 마이크로타이터(microtiter) 평판에서 행해질 수 있다. 형성된 생성물인 D-소르비톨을 먼저 적당한 전개 용매로 TLC를 행하여 검출한다. D-소르비톨이 검출되지 않는 후보 균주를 선택한다.

이어서, 선택된 변이주를 본 발명의 실시예 1에서 예시한 바와 같이 L-소르보스 환원효소의 활성 시험을 행하여 L-소르보스 환원효소가 결핍되었는지의 여부를 확인한다.

결핍 변이주가 실제로 트란스포존을 함유하는지를 확인하기 위해, 프로브(probe)로서 사용되는 트란스포존을 함유하는 표지된 DNA 단편을 사용하여 표준의 방법에 의해 일반적으로 콜로니-혼성법(colony-hybridiation) 또는 서던-혼성법(southern-hybidization)을 행한다(마니아티스(Maniatis T.) 등의 문헌[Molecular cloning, a laboratory manual second edition, 1989] 참조).

트란스포존을 함유한 변이주를 본 발명의 실시예 1에서 기술한 바와 같이 분리하였다. 트란스포존 변이주는 추가로 표적 L-소르보스 환원효소 유전자를 확인하고 L-소르보스 환원효소 유전자에서 트란스포존이 태그된 영역의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는데 유용하다.

트란스포존에 의해 삽입된 DNA 단편은, 벡터의 선택표지 및 트란스포존의 선택표지에 의한 두 표현형(phenotype)을 보이는 형질전환체를 선택하여, 바람직하게는 pUC18, pUC19, pBluescript II(미국 캘리포니아주 소재의 스트라타진 클로닝 시스템(Stratagene Cloning System) 제품) 및 이들의 유도체와 같은 임의의 이 콜라이 클로닝 벡터에 클로닝될 수 있다. 트란스포존에 인접한 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어 사슬 종결 방법(chain termination method)(상거(Sanger F.S.) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74, 5463-5467] 참조)에 의해 결정될 수 있다. 결정된 뉴클레오타이드 서열은 그의 판독틀이 결정하기 어려울 수도 있는 부분 서열일 수 있다.

뉴클레오타이드 서열이 결정되면, 이 서열은 BLASTP 탐색(립만(Lipman) 등의 문헌[J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410] 참조)과 같은 유전자 분석 프로그램을 사용하여 뉴클레오타이드 서열 및/또는 단백질 서열 데이타 베이스에서 상동성 탐색을 수행할 수 있다. 임의의 상동 서열이 발견되면, 이들의 아미노산 서열을 배열하여 상동 단백질들 사이에 보존된 임의의 공통서열(consensus sequence)을 발견할 수 있다. 공통서열에 따라, 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 합성하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 표적 유전자의 부분 DNA를 증폭시키는데 사용한다. 공통서열 이외에, 상동 단백질의 배열에 의해 판독틀을 조정한 후에 결정된 임의의 아미노산 서열을 PCR 프라이머를 제조하는데 사용할 수 있다.

PCR로 제조된 부분 유전자를 프로브로 사용하여 서던-혼성법 및 콜로니-혼성법에 의해 전체 표적 유전자를 수득할 수 있다. 서던-혼성법은 표적 유전자를 포함한 DNA 단편의 크기를 나타내므로 목표로 하는 크기의 DNA 단편을 포함하는 미니-유전자 라이브러리(library)를 구축할 수 있다. 그다음 미니-라이브러리를 프로브로서 부분 유전자를 사용하여 콜로니-혼성법에 의해 스크리닝하여 전체 표적 유전자를 수득할 수 있다. 그 다음 표적 유전자의 완전한 뉴클레오타이드 서열을 결정하여 서열의 개방 판독틀을 확인할 수 있다.

트란스포존에 의해 삽입된 영역은 L-소르보스 환원효소의 구조 유전자의 발현을 조절하는 조절 유전자일 수 있고, 이 조절 유전자는 또한 L-소르보스 환원효소 유전자를 파괴하기 위한 표적 유전자가 될 수 있다.

표적 미생물의 L-소르보스 환원효소 유전자의 부분 또는 전체를 포함한 클로닝된 DNA 단편을, 표적 미생물의 L-소르보스 환원효소 유전자를 파괴하기 위해 사용할 수 있다. 이러한 파괴에 대한 도식적 과정 및 메카니즘을 각각 도 4 및 도 5에 도시하였다. DNA 단편을 먼저 pBluescript II SK와 같은 이 콜라이 벡터에 클로닝한다. 그 다음 Km^r 유전자와 같은 선택표지를 함유한 유전자 카세트를 표적 L-소르보스 환원효소 유전자 내로 삽입하여 활성 L-소르보스 환원효소를 형성하지 않도록 한다. L-소르보스 환원효소 유전자가 파괴된 DNA 단편을 pSUP202와 같은 자살 벡터 상에서 재클로닝한다. 파괴된 유전자를 함유한 자살 플라스미드를 전술한 바와 같은 접합 교잡법을 포함하는 임의의 유전자 전달 방법에 의해 수용체 미생물에 도입시킬 수 있다. 이중 유전자교환 재조합에 의해 생성된 표적 변이주를, 선택표지 유전자(예를 들어, Km^r)를 발현하는 콜로니를 분리하고, 변이주의 염색체 DNA를 서던-블롯 혼성법(Southern-blot hybridization)에 의해 특징화하여 선택할 수 있다. 선택된 변이주의 L-소르보스 환원효소 결핍성 여부는 L-소르보스 환원효소가 검출가능한 효소 활성을 보이지 않는지로 확인한다.

이러한 변이주는 본 발명의 실시예 5에서 기술한 바와 같이 균주 SR3으로서 분리되었다. L-소르보스의 비동화는 1 내지 500g/L의 D-소르비톨을 함유한 임의의 L-소르보스 발효용 배지를 사용하여 발효액내에서 D-소르비톨로부터 전환된 L-소르보스의 농도를 추적하여 조사할 수 있다. D-소르비톨 대신, L-소르보스 함유 배지를 또한 발효 조건하에서 L-소르보스 비동화를 확인하기 위해 사용할 수 있다.

본 발명에서 제공된 변이주를 호기 조건하에 적당한 영양소가 첨가된 수성 배지에서 배양할 수 있다. 배양은 약 3.0 내지 9.0, 바람직하게는 약 5.0 내지 8.0의 pH에서 행해질 수 있다. 배양 기간은 사용되는 pH, 온도 및 영양성 배지에 따라 다양하지만, 일반적으로 1 내지 6일에 바람직한 결과가 나타난다. 배양할 때 바람직한 온도 범위는 약 13℃ 내지 45℃, 바람직하게는 약 18℃ 내지 42℃이다.

일반적으로 배양 배지는 동화성 탄소원, 소화성 질소원, 무기물질, 비타민, 미량원소 및 다른 성장 촉진 인자와 같은 영양소를 함유하여야 한다. 동화성 탄소원으로서 글리세롤, D-포도당, D-만니톨, D-프럭토스, D-아라비톨, D-소르비톨, L-소르보스 등을 사용할 수 있다.

효모 추출물, 육즙(meat extract), 펩톤, 카세인, 옥수수 침출액(corn steep liquor), 우레아, 아미노산, 질산염, 암모늄 염 등과 같은 다양한 유기물질 또는 무기물질을 질소원으로서 사용할 수 있다. 무기물질로서, 황산마그네슘, 인산칼륨, 염화철(II), 염화철(III), 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 L-소르보스 환원효소-결핍 변이주는 D-소르비톨의 발효적 산화에 적용할 수 있고, 디아세톤-L-소르보스를 생산하는 L-소르보스의 축합 반응에 사용될 수 있는 L-소르보스를 증가시켜 비타민 C의 수율을 개선시킬 것으로 기대된다. 당해 분야의 숙련가에게 자명한 바와 같이, 본 발명의 L-소르보스 환원효소-결핍 변이주를, 반응 중간산물로서 L-소르보스를 포함하는 임의의 비타민 C 생산 공정에 적용할 수 있다.

첨부된 도면을 참고로 하여, 하기 실시예에서 본 발명을 추가로 설명한다.

실시예

실시예 1. 글루코노박터 멜라노제누스 IFO 3293 유도체로부터 L-소르보스 환원효소-결핍 Tn5 변이주의 분리

(1) Tn5 돌연변이 유발

2-케토-L-굴론산-생산균주 L42-9에 트란스포존 돌연변이를 유발시켜(매닝(Manning R. F.) 등에게 허여된 미국 특허 제 5082785 호) L-소르보스 환원효소 결핍 균주를 제조하였다. 글루코노박터 멜라노제누스 IFO 3293으로부터 NTG 및 ICR170을 포함한 화학적 돌연변이원, 자외선 조사 등의 다단계 돌연변이에 의해 수득된, D-소르비톨로부터 L-소르보스를 생산하고 L-소르보스 환원효소에 의해 생성된 L-소르보스를 동화하는 임의의 균주를 본 발명에 사용할 수 있다. 30㎍/㎖의 카나마이신을 함유한 LB 한천 평판에 보존된, P1::Tn5를 함유한 이 콜라이 W3110을 5㎖의 P1 배지(0.01M MgSO₄·7H₂O 및 10㎍/㎖의 티민이 첨가된 LB)에 접종하고 30℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이 배양액 1㎖를 500㎖들이 에를렌마이어(Erlenmyer) 플라스크내 100㎖의 동일 배지에 옮기고 95분간 30℃에서 배양하여 550㎚에서 광학 밀도가 약 0.09가 될 때까지 배양시켰다. 이 배양액을 10분간 얼음에서 냉각시키고 4℃에서 20분간 3500rpm으로 원심분리하였다. 침전된 세포를 25㎖의 P1 배지에 현탁하고 이 세포 현탁액을 300㎖들이 플라스크에 옮겨 42℃에서 20분간 진탕하지 않고 배양하였다. 37℃에서 90분간 놓아두어 세포의 용균현상을 관찰하는데, 0.5㎖의 클로로포름을 첨가하여 세포를 용균시켰다. 그다음 혼합물을 심하게 흔들고, 실온에서 10분간 놓아둔 후, 4℃에서 15분간 10,000rpm으로 원심분리하였다. 상징액을 멸균 나사마개(screw-top) 유리병에 옮긴 후 0.5㎖의 클로로포름을 다시 첨가하고 그 용균액을 4℃에 보존하였다.

0.5% 글리세롤, 0.5% 효모 추출물(디프코(Difco) 제품) 및 0.5% MgSO₄·7H₂O로 구성된 4번 한천 평판에서 생육한 수용체 세포, L42-9를 5㎖의 4번 배지를 포함한 시험관에 접종하고 30℃에서 하룻밤 동안 시험관 진탕기에서 생육시켰다. 이 배양액 1㎖를 500㎖들이 에를렌마이어 플라스크내 30㎖의 동일 배지에 옮기고 3시간 동안 30℃에서 배양하였다. 배양액을 15분간 원심분리하였다. 침전된 펠렛(pellet)을 100mM MgSO₄·7H₂O 및 100mM CaCl₂로 구성된 1.8㎖의 100mM MC 완충액에 현탁시켰다. 0.1㎖의 세포 현탁액을 시험관에서 10mM MC 완충액으로 10배 희석된 파지 용액 0.1㎖와 혼합하고 30℃에서 60분간 놓아두었다. 0.8㎖의 4번 배지를 첨가한 후에, 시험관의 혼합액을 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 그 다음 0.2㎖ 체적의 감염된 세포 현탁액을 100㎍/㎖의 카나마이신이 함유된 4번 배지의 한천 평판에 확산도말하고 27℃에서 5일간 배양하였다.

(2) 생성물 분석에 의한 L-소르보스 환원효소-결핍 변이주의 스크리닝

27℃에서 4일간 카나마이신을 함유한 4번 배지의 한천 평판에서 배양한 Tn5(Km^r)를 함유한 균주를 96개의 웰(well)을 가진 미량역가 평판의 각 웰에 4% L-소르보스를 함유한 0.15M 시트레이트-Na₂HPO₄ 완충액(pH 8.0) 50㎕에 현탁하고 진탕하지 않고 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 1㎕의 시료를 사용하여 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 L-소르보스로부터 전환된 D-소르비톨을 분석하였다. TLC 분석은 키젤겔(Kieselgel) 60 F₂₅₄(메르크(Merck) 제품)의 TLC판; 에틸 아세테이트/이소프로필 알콜/아세트산/H₂O의 비가 10/6/3.5/3인 용매; 및 0.5% KIO₄ 용액과 테트라베이스(tetrabase) 시약(테트라베이스로 포화된 2N-아세트산과 15% MnSO₄·4∼6 H₂O를 1:1 체적비로 혼합하여 제조된 것)의 분무제를 사용하여 행하였다.

TLC 분석에 의해서, 26-9A로 표기된 하나의 변이주가 L-소르보스 환원효소-결핍 변이주의 후보로 수득되었다. 균주 26-9A는 L-소르보스로부터 극소량의 D-소르비톨을 생산하였지만, 다른 Tn5-변이주 및 모균주 L42-9는 상당한 양의 D-소르비톨을 생산하였다.

(3) L-소르보스 환원효소 활성의 측정

8% D-소르비톨, 1.5% 효모 추출물(일본 오사카 소재의 오리엔탈 이스트 컴파니(Oriental Yeast Co.) 제품), 0.25% MgSO₄·7H₂O, 0.05% 글리세롤 및 1.5% CaCO₃(제품 등급)으로 구성된 8% 소르비톨-5번 배지에서 2일간 30℃에서 배양한 세포를 원심분리에 의해 수확하고 침전된 균체를 0.3% NaCl 용액으로 2회 세척하였다. 이 세포 페이스트를 10mM KH₂PO₄-K₂HPO₄ 완충액(pH 7.0)에 현탁하고 프렌치(French) 압력 세포 파쇄기를 2회 통과시켰다. 원심분리하여 파쇄되지 않은 세포를 제거한 후에, 상징액을 60분간 100,000×g로 원심분리하였다. 생성된 상징액을 L-소르보스 환원효소원으로 수거하였다.

L-소르보스 환원효소 활성를 NADPH의 존재하에 광도 측정 분석법으로 측정하였다(스기사와 등의 문헌[Agric. Biol. Chem., 1991, 55, 2043-2049] 참조). 반응 혼합물은 5㎎/㎖의 L-소르보스, 50mM KH₂PO₄-K₂HPO₄ 완충액(pH 7.0)내 0.4㎎/㎖의 NADPH 및 10㎕의 효소 용액을 포함하였다. NADPH의 기질-의존성 산화에 의한 흡광도의 변화를 콘트론(Kontron) 분광광도계 UVIKON 810으로 340㎚에서 측정하였다. 환원효소 활성의 1 단위는 1분당 1μmol의 NADP 생성을 촉매화하는 효소의 양으로 정의하였다.

균주 26-9A 및 그의 모균주 L42-9의 L-소르보스 환원효소 활성을 전술한 바와 같이 측정하였을 때, 활성은 각각 0.01 단위/㎎ 단백질 미만 및 0.21 단위/㎎ 단백질이었다.

(4) 콜로니 혼성법

균주 26-9A의 염색체에 Tn5 단편이 도입된 것은 ³²P-표지된 Col E1::Tn5 DNA를 프로브로서 사용하여 콜로니 블롯(colony blot) 혼성법으로 확인하였다.

실시예 2. Tn5-삽입된 영역의 클로닝 및 뉴클레오타이드 서열 결정

26-9A의 L-소르보스 환원효소 결핍이 26-9A DNA에서 Tn5 삽입 위치와는 다른 위치에서 동시에 발생한 다른 돌연변이에 의한 것이 아니라, Tn5 삽입에 의한 것임을 확인하기 위해, 새로운 Tn5-변이주를 Tn5를 함유한 DNA 단편을 갖는 pSUP202(Ap^rCM^rTc^r; 사이몬(Simon R.) 등의 문헌[BIO/TECHNOL., 1983, 1, 784-791] 참조)를 사용하여 재구성하였다. 균주 26-9A 염색체의 다양한 DNA 단편에 행한 서던-블롯 혼성법에서 전체 Tn5를 포함한 13kb의 EcoRV 단편이 이중 유전자교환 재조합에서 Tn5 삽입 지점의 양쪽에 충분한 길이(적어도 1kb보다 긴)의 DNA를 갖는 것으로 나타났다. EcoRV 단편을 pSUP202에 클로닝하여 pSR02를 형성한 다음, pSR02를 글루코노박터 멜라노제누스 IFO 3293에 도입시켜 Km^rCm^s 균주인 3293EV-1 및 3293EV-9를 수득하였다. 균주 3293EV-1 및 3293EV-9의 서던-블롯 혼성법 분석에서 두 균주는 균주 26-9A에서와 같이(자료는 제시하지 않음) pSUP202 벡터 부분 없이 Tn5를 포함하는 것으로 나타났고, 이러한 결과는 이중 유전자교환에 의해 상동 재조합이 발생하였음을 시사하였다. 균주 3293EV-1 및 3293EV-9에서 L-소르보스 환원효소의 활성 결핍성 여부를 균주 26-9A에서와 같이 생성물 분석법 및 광도 측정 효소 분석법에 의해 조사하였을 때, 새로운 Tn5 변이주는 또한 L-소르보스를 검출할 수 없는 수준으로 생산하였고 0.01 단위/㎎ 사이토졸 단백질 미만의 L-소르보스 환원효소 활성을 나타내었지만, 글루코노박터 멜라노제누스 IFO 3293은 0.20 단위/㎎ 사이토졸 단백질의 L-소르보스 환원효소 활성을 나타내었다. 26-9A에서 Tn5 삽입이 L-소르보스 환원효소를 결핍시키는 것으로 결론지었다.

pSR02에서 Tn5-삽입된 영역의 뉴클레오타이드 서열을 디데옥시 사슬 종결법(상거 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1977, 74, 5463-5467] 참조)에 의해 결정하였다(도 1). BLASTP 프로그램(립만 등의 문헌[J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410] 참조)으로 상동성 탐색을 수행하여 Tn5-삽입된 영역을 분석하였을 때, 이 영역이 만니톨 탈수소효소(MDH) 계열에 속하는 폴리펩타이드의 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 것으로 나타났다. 그 계열의 일원인 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides)의 만니톨 2-탈수소효소(EC 1.1.1.67)(슈나이더(Schneider K. -H.) 등의 문헌[J. Gen. Microbiol., 1993] 참조)는 만니톨의 프럭토스로의 NAD-의존성 산화를 촉매화한다. 글루코노박터의 L-소르보스 환원효소는 NADPH의 존재하에 L-소르보스 및 D-프럭토스를 환원시켜 D-소르비톨 및 D-만니톨을 생산하는 것을 촉매화할 뿐만 아니라, 또한 NADP의 존재하에 D-소르비톨 및 D-만니톨을 산화시켜 L-소르보스 및 D-프럭토스를 생산하는 것을 촉매화한다(스기사와 등의 문헌[Agric. Biol. Chem., 1991] 참조). 상동성 분석의 결과는 균주 26-9A의 Tn5-파괴된 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드가 L-소르보스 환원효소 유전자 자체이지 그의 조절 유전자가 아님을 나타내었다.

실시예 3. PCR 클로닝

글루코노박터 서브옥시단스 IFO 3291의 부분 L-소르보스 환원효소 유전자를, 도 2에 도시한 아미노산 서열(서열번호:3 및 서열번호:4)에 따라 합성된 한 세트(set)의 프라이머로 PCR 증폭시켜 클로닝하였고, 퇴화 프라이머(degenerate primer)는 글루코노박터의 코돈 용도를 고려하여 합성하였다. PCR에 의해 약 300bp의 생성물을 수득하였다. 이 PCR-증폭된 단편을 프로브로서 사용하여 서던-혼성법 및 콜로니-혼성법에 의해, 글루코노박터 서브옥시단스 IFO 3291의 완전한 L-소르보스 환원효소 유전자를 8.0kb EcoRV 단편으로 수득하였다.

실시예 4. 글루코노박터 서브옥시단스 IFO 3291로부터 L-소르보스 환원효소 유전자의 뉴클레오타이드 서열 결정

L-소르보스 환원효소 유전자의 완전한 뉴클레오타이드 서열을, 글루코노박터 서브옥시단스 IFO 3291의 L-소르보스 환원효소 유전자를 포함한 8.0kb의 EcoRV 단편을 사용하여 결정하였다. 이 뉴클레오타이드 서열 및 추론된 아미노산 서열을 서열번호:1 및 서열번호:2에 도시하였다. 8.0kb EcoRV의 제한지도는 도 3에 도시하였다. SR 유전자와, L-소르보스 환원효소 유전자의 다운스트림에서 발견되고 DnaJ 형 단백질 및 페로독신(ferrodoxin)과 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 두 개의 개방 판독틀은 반대 방향으로 위치한다. L-소르보스 환원효소 유전자의 업스트림에서, L-소르보스 환원효소 유전자가 포함된 오페론을 만들 수 있는 적절한 개방 판독틀이 발견되지 않았다. 따라서, L-소르보스 환원효소 유전자의 파괴는 그의 이웃한 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 것으로 생각되었다.

실시예 5. 글루코노박터 서브옥시단스 IFO 3291로부터 L-소르보스 환원효소 유전자가 파괴된 균주의 제조

도 4에 개시한 바와 같이, 플라스미드 pUC4K, pSR03-1 및 pSUP202가 출발 물질 플라스미드이다. pUC4K는 Km 저항성 유전자 카세트원으로서 파마시아(스웨덴 웁살라 소재; 제품 번호 27-4958-01)로부터 입수하였다. 플라스미드 pSR03-1은 상업적으로 시판중인 벡터의 유도체로서, 실시예 3에서 수득한 EcoRV 단편을 함유한 pBluescript II SK(미국 캘리포니아주 소재의 스트라타진 제품; 제품 번호 212205 및 212206)이다. 벡터 pSUP202는 이동 부위(mob site)를 포함한 단편을 함유한 pBR325의 유도체이고 잘 알려진 바와 같이, pBR325는 pBR322의 유도체이다. pBR325 자체는 상업적으로 시판되지 않는 것 같지만, pBR322(ATCC 31344), pACYC177(ATCC 37031) 또는 pACYC184(ATCC 37033)와 같은 선택적인 플라스미드는 사이먼 등(문헌[Bio/Technology, 1983, 1, 784-791])이 pSUP 시리즈로서 기술한 바와 같이 당해 분야의 숙련가가 용이하게 사용할 수 있을 것으로 생각된다. 이동 부위-함유 플라스미드의 제조도 사이먼 등(상기 문헌)에 의해 보고되어 있다.

도 4는 L-소르보스 환원효소 유전자를 표적으로 하는 벡터, pSUP202-SR::Km을 제조하는 순서도를 도시한다. 8.0kb의 EcoRV 단편을 pBluescript II SK 벡터의 EcoRI 부위에서 클로닝하여(알팅-미스(Alting-Mees M. A.) 등의 문헌[Methods in enzymology, Academic Press, London, 1992, 216, 483-495] 참조) pSR03-1을 제조하였다. 카나마이신-저항성-유전자 카세트(Km 카세트)를 클로닝된 L-소르보스 환원효소 유전자의 EcoRI 부위에 삽입하여 pSR04-1을 수득하였다. Km 카세트로 파괴된 이 L-소르보스 환원효소 유전자를 자살 벡터 pSUP202에 아클로닝(subcloning)하였다. 그 다음 제조된 pSR05-2, pSUP202-SR::Km(Km^r)을 글루코노박터 서브옥시단스 IFO 3291에 도입하여 L-소르보스 환원효소를 상실한 변이주(Km^r)를 수득하였다. 목표로 하는 유전자 파괴를 최종적으로 서던-혼성 분석법으로 확인하였다. 유전자 파괴의 도식적인 메카니즘을 도 5에 도시하였다. 이렇게 하여 L-소르보스 환원효소 결핍 변이주 SR3을 수득하였다.

L-소르보스 환원효소-유전자-표적화 변이주, SR3 및 글루코노박터 서브옥시단스 IFO 3291은 각각 0.02 단위/㎎ 단백질 미만 및 0.681 단위/㎎ 단백질 미만의 L-소르보스 환원효소 활성을 나타내었다.

실시예 6. 8% 소르비톨-5번 배지에서 균주 SR3의 발효 프로파일

균주 SR3 및 글루코노박터 서브옥시단스 IFO 3291의 생육 및 L-소르보스-동화 프로파일을 500㎖들이 에를렌마이어 플라스크내 8% 소르비톨-5번 배지에서 평가하였다(도 6). 균주 SR3 및 글루코노박터 서브옥시단스 IFO 3291은 24시간 내에 80g/L의 D-소르비톨을 L-소르보스로 전환시킬 수 있었다(자료는 제시하지 않음). 글루코노박터 서브옥시단스 IFO 3291은 대부분의 전환된 L-소르보스를 48시간 내에 동화하였다. 다른 한편으로, 균주 SR3은 3일째까지 L-소르보스를 거의 사용하지 않아서 남아있는 L-소르보스의 양이 70g/L 이상이었다. 균주 SR3 및 글루코노박터 서브옥시단스 IFO 3291을 6일간 배양한 후에, 600㎚에서 광학 밀도(세포 성장)를 측정한 결과 각각 6.4 및 24를 나타내었다.

실시예 7. 2% 소르비톨-SCM 배지에서 균주 SR3의 발효 프로파일

균주 SR3 및 글루코노박터 서브옥시단스 IFO 3291의 생육 및 L-소르보스-동화 프로파일을 500㎖들이 에를렌마이어 플라스크내 2% 소르비톨-SCM 배지에서 평가하였다(도 7). 균주 SR3 및 글루코노박터 서브옥시단스 IFO 3291은 12시간 내에 20g/L의 D-소르비톨을 L-소르보스로 전환시킬 수 있었다. 글루코노박터 서브옥시단스 IFO 3291은 전환된 L-소르보스의 절반을 23시간 내에 동화하였다. 다른 한편으로, 균주 SR3은 L-소르보스를 거의 사용하지 않았다. 균주 SR3 및 글루코노박터 서브옥시단스 IFO 3291을 23시간 동안 배양한 후에, 600㎚에서 광학 밀도(세포 성장)를 측정한 결과 각각 2.5 및 5.9를 나타내었다.

본 발명의 L-소르보스 환원효소-결핍 변이주는, D-소르비톨의 발효적 산화에 적용할 수 있고, 디아세톤-L-소르보스를 생산하는 L-소르보스의 축합 반응에 사용될 수 있는 L-소르보스를 증가시켜 비타민 C의 수율을 개선시킬 것으로 기대된다. 당해 분야의 숙련가에게 자명한 바와 같이, 본 발명의 L-소르보스 환원효소-결핍 변이주를, 반응 중간산물로서 L-소르보스를 포함하는 임의의 비타민 C 생산 공정에 적용할 수 있다.

<110> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG <120> Genetically engineered L-sorbose reductase-deficient mutants <130> 8 <150> EP 98104546.1 <151> 1998-03-13 <160> 4 <170> KOPATIN 1.0 <210> 1 <211> 1458 <212> DNA <213> Gluconobacter suboxydans IFO 3291 <400> 1 atgatcacgc acgaaaccct caagtctctt cccgccggtg tgcaggctcc gccctatgac 60 atcaatggga tcaaaccggg gatcgtgcat tttggcgtgg gaaacttctt ccgggcccat 120 gaggctttct acgttgaaca gatcctcaag gacgatccga actggggaat catcggcgtt 180 ggtctgacgg gtagcgacag gtcaaagaag aaggccgagg aattcaagaa gcaggactgc 240 ctcttttccc tgaccgaaac ggctccgtcc ggcaagagca cggttcgtgt tatgggcgcg 300 ctgagggatt accttttggc tcctgccgat ccggaagccg tgctgaagca tctcgctgac 360 ccgggaatcc gtatcgtttc catgacaatc acggaaggcg gttacaacat taacgagacg 420 acaggtgagt tcgatcttga gaacaaggcg gttcagcagg atctgaagac acccgaaacg 480 ccgtccacaa tctttggata tgttgtggaa ggactgcgcc gccgccgtga cgcaggtggc 540 aaggccttca cgatcatgtc ctgcgataat ctgcggcata acggtaatgt cgcccgcaag 600 gcatttctgg gatacgcgaa ggcccgtgat ccggaactgg ccaagtggat tgaagagaac 660 gcgacgttcc caaatggcat ggttgatcgc atcacgccga ccgtttctgc tgacattgcg 720 aagaagctca acgaagccag tggcctgcac gacgacctgc cgctcgttgc agaagacttt 780 catcagtggg tgctggaaga cagctttgct gatggccggc ctgcgctgga aaaggccgga 840 gtgcagttcg ttggggatgt gacggactac gagcatgtaa aaatccgcat gctgaatgct 900 ggtcacatca tgctctgctt cccggctgtt ctggcaggat ttgaaaatgt cgatcatgcc 960 cttgctgatc ccgatctacg gcgtatcctc gagaacttcc tgaacaaaga cgtcatcccg 1020 accctgaagg caccgccggg catgacgctg gaaggctatc gggacagcgt gatcagccgt 1080 ttctcgaatc cggccatggc ggatcagaca ttgcgtattt ccggggacgg gagctcgaag 1140 atccaggtct tctggacgga aacggtccgc aaggcttttg agggcaagcg cgatctgtcc 1200 cgcattgctt ttggtatggc atcctacctg gaaatgctgc gcggtaagga tgaaacgggt 1260 ggcacctacg agccattcga gccgactttt ggtgacaacc ataagactct ggccaaggct 1320 gatgattttg agagcgcgct caagctgcca gcgttcgatg cctggcgcga tctggagacg 1380 tccgggctga acaacaaggt tgtggagctt cgcaagatta tccgcgagaa gggcgtcaag 1440 gctgcccttc cggcctga 1458 <210> 2 <211> 485 <212> PRT <213> Gluconobacter suboxydans IFO 3291 <400> 2 Met Ile Thr His Glu Thr Leu Lys Ser Leu Pro Ala Gly Val Gln Ala 1 5 10 15 Pro Pro Tyr Asp Ile Asn Gly Ile Lys Pro Gly Ile Val His Phe Gly 20 25 30 Val Gly Asn Phe Phe Arg Ala His Glu Ala Phe Tyr Val Glu Gln Ile 35 40 45 Leu Lys Asp Asp Pro Asn Trp Gly Ile Ile Gly Val Gly Leu Thr Gly 50 55 60 Ser Asp Arg Ser Lys Lys Lys Ala Glu Glu Phe Lys Lys Gln Asp Cys 65 70 75 80 Leu Phe Ser Leu Thr Glu Thr Ala Pro Ser Gly Lys Ser Thr Val Arg 85 90 95 Val Met Gly Ala Leu Arg Asp Tyr Leu Leu Ala Pro Ala Asp Pro Glu 100 105 110 Ala Val Leu Lys His Leu Ala Asp Pro Gly Ile Arg Ile Val Ser Met 115 120 125 Thr Ile Thr Glu Gly Gly Tyr Asn Ile Asn Glu Thr Thr Gly Glu Phe 130 135 140 Asp Leu Glu Asn Lys Ala Val Gln Gln Asp Leu Lys Thr Pro Glu Thr 145 150 155 160 Pro Ser Thr Ile Phe Gly Tyr Val Val Glu Gly Leu Arg Arg Arg Arg 165 170 175 Asp Ala Gly Gly Lys Ala Phe Thr Ile Met Ser Cys Asp Asn Leu Arg 180 185 190 His Asn Gly Asn Val Ala Arg Lys Ala Phe Leu Gly Tyr Ala Lys Ala 195 200 205 Arg Asp Pro Glu Leu Ala Lys Trp Ile Glu Glu Asn Ala Thr Phe Pro 210 215 220 Asn Gly Met Val Asp Arg Ile Thr Pro Thr Val Ser Ala Asp Ile Ala 225 230 235 240 Lys Lys Leu Asn Glu Ala Ser Gly Leu His Asp Asp Leu Pro Leu Val 245 250 255 Ala Glu Asp Phe His Gln Trp Val Leu Glu Asp Ser Phe Ala Asp Gly 260 265 270 Arg Pro Ala Leu Glu Lys Ala Gly Val Gln Phe Val Gly Asp Val Thr 275 280 285 Asp Tyr Glu His Val Lys Ile Arg Met Leu Asn Ala Gly His Ile Met 290 295 300 Leu Cys Phe Pro Ala Val Leu Ala Gly Phe Glu Asn Val Asp His Ala 305 310 315 320 Leu Ala Asp Pro Asp Leu Arg Arg Ile Leu Glu Asn Phe Leu Asn Lys 325 330 335 Asp Val Ile Pro Thr Leu Lys Ala Pro Pro Gly Met Thr Leu Glu Gly 340 345 350 Tyr Arg Asp Ser Val Ile Ser Arg Phe Ser Asn Pro Ala Met Ala Asp 355 360 365 Gln Thr Leu Arg Ile Ser Gly Asp Gly Ser Ser Lys Ile Gln Val Phe 370 375 380 Trp Thr Glu Thr Val Arg Lys Ala Phe Glu Gly Lys Arg Asp Leu Ser 385 390 395 400 Arg Ile Ala Phe Gly Met Ala Ser Tyr Leu Glu Met Leu Arg Gly Lys 405 410 415 Asp Glu Thr Gly Gly Thr Tyr Glu Pro Phe Glu Pro Thr Phe Gly Asp 420 425 430 Asn His Lys Thr Leu Ala Lys Ala Asp Asp Phe Glu Ser Ala Leu Lys 435 440 445 Leu Pro Ala Phe Asp Ala Trp Arg Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Asn 450 455 460 Asn Lys Val Val Glu Leu Arg Lys Ile Ile Arg Glu Lys Gly Val Lys 465 470 475 480 Ala Ala Leu Pro Ala 485 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Gluconobacter melanogenus IFO 3293 <400> 3 Met Thr Ile Thr Glu Gly Gly Tyr 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Gluconobacter melanogenus IFO 3293 <400> 4 Phe Pro Asn Gly Met Val Asp Arg 1 5

Claims

서열번호:1의 폴리뉴클레오타이드, L-소르보스 환원효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열번호:1의 단편 및 서열번호:2의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드에 트란스포존(transposon) 및 항생제 저항성 유전자 카세트로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 간섭 DNA 단편이 삽입됨으로써 L-소르보스를 환원시키는 생물학적 활성이 돌연변이되지 않은 글루코노박터 미생물의 활성의 10% 미만으로 감소된 돌연변이를 포함하는, 유전공학적으로 제조된 글루코노박터 멜라노제누스(Gluconobacter melanogenus) 또는 글루코노박터 서브옥시단스(Gluconobacter suboxydans).
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(a) 서열번호:1의 폴리뉴클레오타이드, L-소르보스 환원효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열번호:1의 단편 및 서열번호:2의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 글루코노박터 멜라노제누스 또는 글루코노박터 서브옥시단스를 제공하는 단계, 및

(b) 상기 서열번호:1의 폴리뉴클레오타이드, L-소르보스 환원효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열번호:1의 단편 및 서열번호:2의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오타이드에 트란스포존 및 항생제 저항성 유전자 카세트로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 간섭 DNA 단편을 삽입시켜 L-소르보스를 환원시키는 생물학적 활성을 돌연변이되지 않은 글루코노박터 미생물의 활성의 10% 미만으로 감소시키는 돌연변이를 도입하는 단계를 포함하는,

제 1 항에 따른 유전공학적으로 제조된 글루코노박터 멜라노제누스 또는 글루코노박터 서브옥시단스를 제조하는 방법.
제 1 항에 따른 유전공학적으로 제조된 글루코노박터 멜라노제누스 또는 글루코노박터 서브옥시단스의 사용을 포함하는, 적당한 배지에서 상기 미생물을 발효시킴으로써 L-소르보스를 생산하는 방법.
제 1 항에 따른 유전공학적으로 제조된 글루코노박터 멜라노제누스 또는 글루코노박터 서브옥시단스의 사용을 포함함을 특징으로 하는, L-소르보스를 생산하는 발효 단계를 포함하는 비타민 C의 생산 방법.
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