CN1163593C - 基因工程l-山梨糖还原酶缺陷型突变体 - Google Patents
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Abstract
一种衍生自属于葡糖杆菌属或醋杆菌属的微生物的基因工程微生物，其特征在于，通过对其基因的重组大体上消除了其还原L-山梨糖的生物活性。
Description
本发明涉及属于葡糖杆菌属(Gluconobacter)或醋杆菌属(Acetobacter)的微生物的新型基因工程L-山梨糖还原酶缺陷型突变体，它们在通过发酵生产L-山梨糖的应用中以及在改善维生素C生产方法中都是有利的。
维生素C的生产已通过Reichstein方法进行，该方法涉及利用一种属于葡糖杆菌属或醋杆菌属的微生物将D-山梨醇转化成L-山梨糖的发酵过程，作为唯一的生物学步骤。所述向L-山梨糖的转化是维生素C生产效率的关键步骤之一。然而，在用所述微生物进行氧化发酵的过程中，观察到底物D-山梨醇被消耗后，产物L-山梨糖也被消耗。这一现象被理解为L-山梨糖被细胞溶胶中存在的NADPH-联L-山梨糖还原酶(下文中有时称作SR)还原(参见：Sugisawa等，农业与生物化学(Agric.Biol.Chem.55：2043-2049，1991)。据报道，在葡糖杆菌属中，D-山梨醇被转化成D-果糖，D-果糖进入戊糖途径并进一步代谢成CO2(Shinjoh等，农业与生物化学54：2257-2263，1990)。这些消耗产物和底物的途径最终可以引起维生素C产量减少。
Nogami等在日本专利申请公开号51054/1995中报道了L-山梨糖生产方面的改进。它们对氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和弱氧化葡糖杆菌(Gluconobacter suboxydans)进行常规化学诱变，并分离出利用D-山梨醇作唯一可同化碳源的能力降低了的突变菌株。通过把这种突变体用于发酵生产L-山梨糖，他们观察到，与亲代菌株的生产能力相比，生产能力改善2～3％以上。
在常规诱变产生的突变菌株中经常观察到的缺点之一是回复突变，它在突变体发酵或传代培养过程中消除了突变菌株得到改善的特征，这最终导致维生素C生产能力的下降。所以，需要一种L-山梨糖还原酶的稳定阻断突变体。
一方面，本发明提供一种衍生自属于葡糖杆菌属或醋杆菌属的微生物的新型基因工程微生物，其特征在于，通过基因工程大体上消除了其还原L-山梨糖的生物活性。并且优选，所述生物活性低于原始微生物活性的10％；根据下述的活性定义(例如实施例1(iii)中)，所述活性为0.07～0.02单位/毫克蛋白质或更低。本发明的基因工程微生物的基因通过在该微生物细胞中形成活性L-山梨糖还原酶所需的区域内核苷酸的破坏、添加、插入、缺失和/或替代而携带至少一个突变。
在本发明的基因工程微生物的一个优选实施方案中，所述突变可以通过在形成活性L-山梨糖还原酶所需的区域内的基因破坏而引起。这种破坏可以包含至少一个选自下列的干扰性DNA片断：转座子、抗生素抗性基因盒和防止宿主微生物形成活性L-山梨糖还原酶的任何DNA序列。
在本发明的另一优选实施方案中，所述突变可以借助于定点诱变通过诱变法产生。这种突变可以在形成活性L-山梨糖还原酶所需的区域中完成，该区域可以包括L-山梨糖还原酶的结构基因以及表达控制序列，例如启动子、操纵基因、终止子、DNA编码阻抑物、激活物等。
本发明的另一方面提供了属于葡糖杆菌属或醋杆菌属的微生物的L-山梨糖还原酶基因在生产上述基因工程微生物方面的应用，其中所述基因的特征在于，它编码SEQ ID NO：2中所述的L-山梨糖还原酶氨基酸序列或它的在所述SEQ ID NO：2中包含一个或多个氨基酸的插入、缺失、添加和/或替代的功能等同物。
本发明的又一方面提供一种通过微生物在适当培养基中的发酵而生产L-山梨糖的有效方法，该方法包括应用上述的本发明的基因工程微生物。与这种L-山梨糖生产方法相关，本发明还提供一种有效的维生素C生产方法，它包括一个生产L-山梨糖的发酵步骤，其特征在于，所述发酵通过应用如上所述的本发明基因工程微生物来进行。
本发明提供了一种衍生自属于葡糖杆菌属或醋杆菌属的微生物的新型基因工程微生物，其特征在于，通过基因工程大体上消除了其还原L-山梨糖的生物活性。
所述基因工程微生物可以是属于葡糖杆菌属或醋杆菌属的微生物，它包括微白葡糖杆菌(Gluconobacter albidus)、Gluconobactercapsulatus、蜡状葡糖杆菌(Gluconobacter cerinus)、Gluconobacterdioxyacetonicus、Gluconobacter gluconicus、Gluconobacterindustrius、生黑葡糖杆菌(Gluconobacter melanogenus)(IFO 3293和FERM P-8386[日本国立生物科学和人体技术研究所])、非氧化萄萄糖葡糖杆菌(Gluconobacter nonoxygluconicus)、Gluconobacterroseus、Gluconobacter rubiginosus、弱氧化葡糖杆菌(IFO 3291)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)[可从日本大阪的发酵研究所(IFO)商购，IFO 3288]、巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)、酸化醋杆菌(Acetobacter aceti)、汉氏醋杆菌(Acetobacter hansenii)和液化醋杆菌(Acetobacter liquefaciens)(IFO 12388；ATCC 14835)。有关菌株信息也可参见欧洲专利申请公开号(EPA)213591和518136。弱氧化葡糖杆菌IFO 3291已被保藏，其形式为与氧化葡糖杆菌DSM 4025的混合物即FERM BP-3813和与生黑葡糖杆菌IFO 3293的混合物即FERM BP-8256。可从EP 518136获取进一步的细节。有关弱氧化葡糖杆菌(IFO 3291)和生黑葡糖杆菌(IFO 3293)还可参见EP728840(美国专利申请号08/606807)。
为了消除所述微生物在还原L-山梨糖方面的生物活性，本发明涉及基因工程来把微生物基因的形成活性L-山梨糖还原酶所需的区域作为目标。用于此目的的典型方法被称为用转座子或选择标记基因盒的基因破坏和定点诱突。如下文所述，基因破坏方法对于鉴定微生物的靶基因以及阻断基因功能来说是有用的。一旦鉴定出上述的基因靶区域，通过用例如化学诱变剂、紫外照射等处理靶DNA片断，常规诱变也同样可以是适用的。
基因破坏可以这样进行：借助于转座子诱变把干扰性DNA片断导入微生物的染色体DNA，把携带选择标记(如抗生素抗性基因)的基因盒、消除活性L-山梨糖还原酶的形成的DNA序列导入。
(a)转座子诱变：
转座子诱变被认为是用于遗传分析的有力工具(P.Gerhardt等，“普通和分子细菌学方法”，第17章，转座子诱变；美国微生物学学会)。该方法利用转座因子，它们是特殊的DNA区段，具有移动(转座)到宿主生物体基因组内新位点的特有能力。该转座过程与生物体的经典同源重组系统无关。把转座因子插入新的基因组位点并不需要该因子的末端与其靶位点之间的严格DNA同源性。已在各种原核和真核生物体中发现了转座因子，此时它们可引起无效突变、染色体重排、以及在编码区或者驻留基因和操纵子的调节序列中插入时基因表达的新模式。
原核转座因子可粗略地分成三个不同的类型。类型I由简单因子如插入序列(IS因子)组成，这些序列的长度大约为800-1,500bp。IS因子通常由一个编码转座所需的酶(即转座酶)的基因组成，该基因两侧有充当转座酶的底物的末端重复DNA序列。IS因子最初是在肠细菌的乳糖和半乳糖利用操纵子中鉴定的，这里发现这类因子经常引起插入时的不稳定的极性突变。
类型II由复合转座因子组成。这一类型的成员也称作转座子或Tn因子。已经将原核生物中的转座子鉴定为一类复合转座因子，在其末端经常含有同向或反向重复序列形式的简单IS因子(或其部分)，形式上具有IS因子一样的作用，但携带有与转座功能无关的其它基因，如抗生素抗性、重金属抗性或致病性决定基因。转座子插入特定遗传基因座或复制子(噬菌体)用双冒号来表示，例如lac Z::Tn5或λ::Tn5。
类型III包括“转座”噬菌体，如Mu及其相关物。噬菌体Mu既是一种病毒，又是一个转座子。已知它能在宿主染色体中多重位点处整合，由此时常引起突变。
已经知道，利用上述转座因子的转座子诱变具有下列特征：
(a)这种突变一般导致该基因的失活而且所得无效突变较少稳定。
(b)转座子将新的遗传和物理标记导入靶基因座，如抗生素抗性基因、新的限制酶切割位点、以及可通过基因手段、DNA-DNA杂交或电子显微镜异源双链分析来鉴定的独特DNA序列。该遗传标记可用于对突变基因座作图以及筛选突变体。
(c)转座子可产生多种基因组重排，例如缺失、倒位、转位或重复，而且可用于将特定基因导入靶细菌。
本领域中已知多种转座子，例如Tn3、Tn5、Tn7、Tn9、Tn10、噬菌体Mu等。其中，已知Tn5几乎没有插入特异性，而且其尺寸较小。Tn5也是最常用的转座因子之一，它容易从来源例如pfd-Tn5[美国典型培养物保藏中心，USA(ATCC)ATCC 77330)或pCHR81(ATCC 37535)]衍生。为了在本发明实施过程中在随机诱变中应用，Tn5是优选的。各种被称为Mini-Tn5s的Tn5衍生物同样可用于本发明，它们由转座所需的19bp的Tn5反向重复序列组成，这些序列与抗生素抗性或其它选择标记基因相连。除了Tn5转座酶(tnp)之外，这类Mini-Tn5s也被插入自杀载体，以构建有效的自杀Tn5诱变系统。关于如何利用Tn5转座子的更进一步信息可从下列文献获取：P.Gerhardt等，“普通和分子细菌学方法”，第17章，转座子诱变；美国微生物学学会，1994；K.N.Timmis等，用于革兰氏阴性真细菌中插入诱变、启动子探查和克隆化DNA的染色体插入的Mini-Tn5转座子衍生物，细菌学杂志(J.Bacteriology)，172：6568-6572，1990。
有关描述Tn5如何从pfd-Tn5[参见pfd-Tn5(ATCC 77330)]衍生的信息可从Internet上的ATCC Home Page上获取，http：//www.atcc.org/catalogy/recomb.html。因此，通过电穿孔(参见文献推荐的条件)可以将自杀质粒pfd-Tn5导入大肠杆菌(E.coli)以及其它革兰氏阴性细菌。该质粒自身可用作Tn5供体。此外，人们可以构建一个自杀Tn5载体，方法是：用人们想使用的任何质粒将pfd Tn5质粒导入受体大肠杆菌，选择那些显示Kmr和靶质粒抗性的转化体，从这些转化体中分离出质粒，用分离出的质粒转化大肠杆菌，并且选择Km和质粒-标记-抗性转化体，以获得携带含Tn5的靶质粒的大肠杆菌菌株。这一方法的概念还可从P.Gerhardt等(见上述)的“定区域Tn5诱变”中得到。
周转座子进行的随机诱变涉及通过使用自杀质粒或噬菌体载体、借助于转化、转导、接合交配或电穿孔术把转座子导入靶细菌细胞。所得突变体可借助于转座子所携带的标记来筛选。所用载体通过分离而丢失后，可检测到转座子转座到受体细菌的基因组中。
为了把转座子导入葡糖杆菌属或醋杆菌属微生物，通常采用包括噬菌体P1衍生物和窄宿主范围质粒在内的所谓自杀载体。噬菌体P1载体和质粒载体可分别通过感染和通过转化、接合交配或电穿孔法转入受体细胞，其中这些载体优选缺乏适当的受体起点。对要使用的自杀载体和转座子的选择取决于各种标准，包括噬菌体敏感性、受体细胞的独特抗生素抗性、包括转化、接合转移、电穿孔或感染在内的把携带转座子的载体导入大肠杆菌的基因转移系统的可获得性。
用于本发明的优选载体之一是噬菌体P1(ATCC 25404)，它把其DNA注入属于葡糖杆菌属或醋杆菌属的微生物，但该DNA将不能复制并且将通过分离而丢失。携带Tn5的这种P1噬菌体(P1::Tn5)可以噬菌体裂解液的形式使用，该裂解液可按照已知方法(参见：例如“普通和分子细菌学方法”，第17章，转座子诱变；美国微生物学学会或美国专利5082785，1992)裂解携带P1::Tn5的大肠杆菌而制备。
可用于本发明的其它优选自杀载体是质粒自杀载本，它可基于衍生自质粒RP4或其相关的RK2(ATCC 37125)的复制子，携带移动功能和位点的相同宽宿主范围接合转移但没有窄宿主范围复制起点。这些载体可高频率地从大肠杆菌移动到属于葡糖杆菌属或醋杆菌属的微生物中，但不能稳定地保持在受体细胞中。这些载体除了Tn5之外还含有IncP型移动(mob；oriT)位点，并且基于常用的大肠杆菌克隆载体，例如pACYC177(ATCC 37031)、pACYC 184(ATCC 37033)和pBR 325[Bolivar F.，1978，基因(Gene)4：121-136；pBR322的衍生物(ATCC 31344)，它们都不能在非肠细菌中复制(pSUPseries，Simon R.等，1983，生物/技术(Bio/Technology)1：784-791)。pSUP型质粒在双亲本交配试验中可通过提供从供体菌株自身(例如，菌株S17-1)中IncP质粒RP4的染色体整合拷贝反式(in trans)转移功能而移动；或者在三亲本交配试验中可通过提供从质粒pRK2013(ATCC37159)(由非供体、非受体的大肠杆菌的辅助菌株携带)中的转移功能而移动。
接受转座子的该受体细胞可通过由该因子携带的标记例如对特定抗生素的抗性来选择。当Tn5被用作转座子时，通常可使用Kmr或Nmr标记。除了Kmr或Nmr标记之外，Tcr、Gmr、Spr、Apr、Cmr等的遗传标记可用作替代性标记基因。同样可使用携带容易观察的基因产物(如那些由lacZ、luxAB或phoA编码的产物)的其它转座子。如果靶细菌菌株对常用于选择Tn5的抗生素(卡那霉素、新霉素、博来霉素和链霉素)具有独特的抗性，或者如果要进行已携带Tn5衍生物的菌株的次级诱变，这些Tn5衍生物是特别有用的(P.Gerhardt等，“普通和分子细菌学方法”，第17章，转座子诱变；美国微生物学学会)。
(b)定区域诱变
Tn5诱变方案的一个有力扩展是应用基因置换技术将原始细菌菌株中的野生型基因用大肠杆菌中其由质粒携带的鉴定好的Tn5-突变类似物替代。当野生型基因座已被克隆化时，可有效地应用Tn5或其衍生物或者携带选择标记的基因盒进行定区域诱变来使由克隆化区域携带的靶基因和操纵子失活。为此目的，可以使用上述Tn5本身或其衍生物或者带选择标记的任何基因盒，例如由pUC4K(Pharmacia，Uppsala，Sweden)携带的Kmr基因盒。当人们想使目的基因失活时，这一方法非常有效，所述目的基因例如是由亲代菌株(野生型基因曾从它克隆化)发育的突变菌株的基因。这些类型的置换试验的唯一局限性在于双交换重组事件所需的同源序列的长度；在两端0.5-5kb长的同源序列是优选需要的。
用于定区域诱变的优选载体与转座子诱变所用的那些相同；上述自杀噬菌体和质粒载体。
(c)定点诱变
当野生型基因被克隆化并且测定了其核苷酸序列时，同样可用定点诱变来使靶基因失活。把寡核苷酸引物用于感兴趣的基因的突变，所述引物包含用于移码的核苷酸添加和缺失或者用于引入终止密码子或不同密码子的核苷酸替代。通常可以在大肠杆菌中使用商用定点诱变盒用包含突变的引物进行诱变。如果Tn5-或定区域-盒式诱变导致影响下游或上游基因表达的极性效应的话，这类诱变是有用的。
用于把突变的基因导入靶微生物的优选载体与那些用于转座子诱变的相同。在这种情况下，通过生物学分析，例如酶学或免疫学筛选检测靶基因产物的缺陷，可以分离出目的突变体。而突变的基因可以在不影响下游或上游基因表达的位点处用上述选择标记基因进行标记，以便基因置换的选择。通过生物学分析与标记选择的组合，人们可更轻易地获得靶基因破坏。
通常可按下述选择L-山梨糖还原酶缺陷型突变体：以L-山梨糖为底物，对3000～10000个转座子突变体进行产物分析，以选择不能把L-山梨糖转化为D-山梨醇的突变体。第一种筛选可以优选在带有含L-山梨糖的反应混合物的微量滴定板中进行。产物D-山梨醇的形成首先是通过采用适当展开剂的TLC进行检测的；选择出形成不可发现量的D-山梨醇的候选物。
然后，如本发明实施例1所例举的，对候选突变体进行L-山梨糖还原酶活性分析，以证实L-山梨糖还原酶缺陷。
为了证实缺陷型突变体确实携带转座子，通常用标准方法(分子克隆，实验手册，第2版，Maniatis T.等，1989)进行菌落-或Southern-杂交，采用含转座子的标记DNA片断作为探针。
这样的突变体如本发明实施例1中所述进行分离。对于进一步鉴定靶L-山梨糖还原酶基因和测定其用转座子标记的区域的核苷酸序列来说，该转座子突变体是有用的。
通过选择表现出载体和转座子的选择标记的两种表型的转化体，可以把被转座子插入的DNA片断克隆入任何大肠杆菌克隆用载体，优选pUC18、pUC19、pBluescript II(Stratagene Cloning Systems，CA，USA)及其相关物。与转座子相邻的核苷酸序列可通过例如链终止法(Sanger F.S.，等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)74：5463-5467，1977)来测定。所得核苷酸序列可以是部分序列，其读框可能难于测定。
一旦测定了核苷酸序列，可以对它们进行同源性检索，这是采用遗传分析程序用核苷酸和/或蛋白质序列数据库进行的，例如，BLASTP检索(Lipman等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215：403-410，1990)。如果发现任何同源序列，就可将它们的氨基酸序列进行对比，以寻找在同源蛋白间保守的任何共有序列。根据这些共有序列，可以合成寡核苷酸引物并通过聚合酶链反应(PCR)扩增靶基因的部分DNA。除了共有序列之外，任何氨基酸序列(它们是通过同源蛋白质对比而调节读框后测定的)都可用于设计PCR引物。
PCR产生的该部分基因可以用作探针，以便通过Southern-或菌落-杂交来获得完整靶基因。Southern-杂交显示出含靶基因的DNA片断的大小，而且人们可以构建出含有目的大小的DNA片断的小基因文库。然后，可以通过菌落-杂交、以该部分基因为探针对小文库进行筛选，以获得完整靶基因。接着，可以测定靶基因的完整核苷酸序列以鉴定其开放读框。
被转座子插入的区域可以是控制L-山梨糖还原酶结构基因表达的调节基因；该调节基因也可以是用于破坏L-山梨糖还原酶基因的靶。
含有靶微生物的部分或完整L-山梨糖还原酶基因的克隆化DNA片断可用于破坏靶微生物L-山梨糖还原酶基因。这种破坏的示意性过程和机理分别示于图4和图5。先将该DNA片断克隆入大肠杆菌载体，如pBluescript II SK。再将携带选择标记的基因盒如Kmr基因插入靶L-山梨糖还原酶基因，以便不形成活性L-山梨糖还原酶。把所得DNA片断(带有破坏的L-山梨糖还原酶基因)再克隆于自杀载体如pSUP202上。通过上述包括接合交配在内的任何基因转移方法可以把携带破坏了的基因的自杀质粒导入受体微生物。可以选择由双交换重组事件产生的靶突变体，方法是分离出表达选择标记基因(例如Kmr)的菌落并且通过Sonthern印迹杂交来鉴定其染色体DNA。证实了候选突变体的L-山梨糖还原酶缺陷，不显示L-山梨糖还原酶的可检测酶活性。
如本发明实施例5中所述分离出这样一种突变体，作为菌株SR3。可以对含有1-500g/l的D-山梨醇的用于L-山梨糖发酵的培养基检查L-山梨糖的非同化，方法是探查发酵液中曾经由D-山梨醇转化的L-山梨糖浓度。而含L-山梨糖的培养基也可用于证实发酵条件下L-山梨糖的非同化。
本发明所提供的突变体可以在需氧条件下、在补充有适当营养物的含水培养基中培养。该培养可以在约3.0～9.0的pH下、优选在约5.0～8.0的pH下进行。尽管根据所用pH、温度和营养培养基，培养期可以变化，但通常1～6天将导致有利结果。进行培养的优选温度范围是约13℃～45℃，优选约18℃～42℃。
通常要求培养基含有这类营养物，例如可同化的碳源、可消化的氮源和无机物质、维生素、痕量元素和其它促生长因子。作为可同化的碳源，可以使用甘油、D-葡萄糖、D-甘露糖醇、D-果糖、D-阿糖醇、D-山梨醇、L-山梨糖等。
同样，可使用各种有机或无机物质作氮源，例如，酵母提取物、肉提取物、胨、酪蛋白、玉米浸液、尿素、氨基酸、硝酸盐、铵盐等。作为无机物质，可以使用硫酸镁、磷酸钾、氯化亚铁和氯化铁、碳酸钙等。
本发明的L-山梨糖还原酶缺陷型突变体可以用于D-山梨醇的发酵氧化，并且可预期改善维生素C的产率，方法是增加山梨糖(它可用于L-山梨糖缩合反应生成双丙酮-L-山梨糖的步骤)。对本领域技术人员而言显而易见的是，本发明的L-山梨糖还原酶缺陷型突变体可用于任何维生素C生产过程(它包括作为反应中间体的L-山梨糖)。
参照附图，通过下述实施例进一步阐释本发明，附图描述如下：
图1表示衍生自生黑葡糖杆菌IFO 3293的L-山梨糖还原酶缺陷型突变体26-9A的染色体DNA的Tn5-插入区域的上游和下游核苷酸序列。
图2表示用于从弱氧化葡糖杆菌IFO 3291 PCR克隆SR基因的寡核苷酸引物。
图3表示携带弱氧化葡糖杆菌IFO 3291的L-山梨糖还原酶基因的8.0kb EcoRV片断(上部)及其在L-山梨糖还原酶基因附近的表明发现的ORFs的放大区域(下部)的限制图。
图4示意性表示出构建用于破坏弱氧化葡糖杆菌IFO 3291中L-山梨糖还原酶基因的自杀质粒。
图5表示破坏弱氧化葡糖杆菌IFO 3291的L-山梨糖还原酶基因的示意性机制。
图6所示的图形表示8％山梨醇-No.5培养基中菌株SR3和弱氧化葡糖杆菌IFO 3291的发酵曲线。
图7所示的图形表示2％山梨醇-SCM培养基中菌株SR3和弱氧化葡糖杆菌IFO 3291的发酵曲线。
实施例1.从生黑葡糖杆菌IFO 3293衍生物分离L-山梨糖还原酶缺陷型Tn5突变体
(i)Tn5诱变
进行转座子诱变(Manning R.F.等，USP5082785)，由产生2-酮-L-古洛糖酸的L42-9菌株构建L-山梨糖还原酶缺陷型菌株。可以使用从D-山梨醇产生L-山梨糖并同化由L-山梨糖还原酶获得的L-山梨糖的任何本发明菌株，这些菌株借助于使用化学诱变剂(包括NTG和ICR170)、紫外照射等的多步诱变而得自生黑葡糖杆菌IFO 3293。把保持在含30μg/ml的卡那霉素的LB琼脂平板上、携带P1::Tn5的大肠杆菌W3110接种入5ml P1培养基(补充有0.01MMgSO4·7H2O和10μg/ml的胸腺嘧啶的LB)，并且在30℃下培养一夜。将1ml该培养物转入在500ml三角瓶中的100ml相同培养基中，在30℃下95分钟生长至OD550大约为0.09。在冰上冷却所得培养物10分钟，在3500rpm、4℃下离心20分钟。将细胞悬浮于25ml P1培养基中，将细胞悬浮液转入300ml瓶中，在42℃、无振荡下培养20分钟。通过在37℃下静置90分钟观察到细胞的裂解时，添加0.5ml氯仿来裂解细胞。然后对混合物进行彻底涡动，在室温下放置10分钟，在4℃下、10000rpm下离心15分钟。把上清液转入无菌的有螺旋盖的玻璃瓶中，再添加0.5ml的氯仿并且在4℃下贮存裂解液。
把生长在含0.5％甘油、0.5％酵母提取物(Difco)和0.5％MgSO4·7H2O的No.4琼脂平板上的受体细胞即L42-9接种入含5ml No.4培养基的管中，在30℃下、管振荡器上生长一夜。把1ml培养物转入500ml三角瓶中的30ml相同培养基中，在30℃下培养3小时。将培养物离心15分钟。把所得沉淀物悬浮于1.8ml的由100mMMgSO4·7H2O和100mM CaCl2组成的100mM MC缓冲剂中。将0.1ml的细胞悬浮液与0.1ml噬菌体溶液(在试管中用10mM MC缓冲剂稀释10倍)混合，在30℃下放置60分钟。添加0.8ml的No.4培养基后，在室温下保温试管2小时。然后把0.2ml体积的感染细胞悬浮液铺在含100μg/ml卡那霉素的No.4培养基琼脂平板上，在27℃下培养5天。
(ii)通过产物分析来筛选L-山梨糖还原酶缺陷型突变体
把27℃下在No.4-Km琼脂平板上生长4天的带Tn5(Kmr)的菌株悬浮于50μl的0.15M柠檬酸盐-Na2HPO4缓冲(pH8.0)溶液中，96孔微量滴定板的每孔中的该缓冲溶液中含4％L-山梨糖，并且在30℃、无振荡下培养24小时。使用1μl的样品，通过薄层色谱法(TLC)分析从L-山梨糖转化的D-山梨醇。进行TLC分析，方法是使用：Kieselgel 60 F254，Merck的TLC板；溶剂为乙酸乙酯/异丙醇/乙酸/H2O＝10∶6∶3.5∶3；喷显剂为0.5％KIO4溶液和四甲基对苯二胺(tetrabase)试剂(通过把用四甲基对苯二胺饱和了的2N-乙酸盐和15％MnSO4·4-6H2O(1∶1体积)混合而制备)。
通过TLC分析获得了称为26-9A的一种突变体，作为L-山梨糖还原酶缺陷型突变体的一个候选物。菌株26-9A由L-山梨糖产生微量D-山梨醇，而其它Tn5-突变体和亲代L42-9产生大量D-山梨醇。
(iii)测定L-山梨糖还原酶活性
在30℃下、含8％D-山梨醇、1.5％酵母提取物(Oriental YeastCo.，Osaka，Japan)、0.25％MgSO4·7H2O、0.05％甘油和1.5％CaCO3(生产级)的8％山梨醇-No.5培养基上生长了2天的细胞被用离心法收集，用0.3％NaCl溶液洗涤两次。把细胞糊悬浮于10mMKH2PO4-K2HPO4缓冲剂(pH7.0)中，两次通过弗氏细胞压碎器。离心法除去完整细胞后，在100000xg下离心上清液60分钟。收集所得上清液作为L-山梨糖还原酶的来源。
在NADPH存在下通过光度分析法测定了L-山梨糖还原酶活性(T.Sugisawa等，农业与生物化学，55：2043-2049，1991)。反应混合物含有5mg/ml的L-山梨糖、在50mM KH2PO4-K2HPO4缓冲剂(pH7.0)中的0.4mg/ml的NADPH以及10μl的酶溶液。用Kontron分光光度计UVIKON 810在340nm处跟踪由NADPH的底物依赖性氧化造成的吸收度变化。1个单位的还原酶活性被定义为每分钟催化1μmolNADP形成所需的酶量。
如上所述，测得菌株26-9A及其亲代L42-9的L-山梨糖还原酶活性分别低于0.01和0.21U/mg蛋白质。
(iv)菌落杂交
以32P-标记的Col E1::Tn5 DNA为探针，通过菌落印迹杂交证实了菌株26-9A的染色体中引入了Tn5片段。
实施例2.Tn5-插入区域的克隆化和核苷酸测序
使用带有含Tn5的DNA片断的pSUP202(AprCmrTcr，；SimonR.等，生物/技术，1：784-791，1983)来重新构建新的Tn5-突变体，以证实26-9A的L-山梨糖还原酶缺陷是由Tn5插入引起的，而不是由同时发生在26-9A DNA距Tn5插入位置的不同位置上的不同突变引起的。菌株26-9A染色体的各种DNA片断的Southern-印迹杂交显示，在用于双交换重组的Tn5插入点的两侧，含完整Tn5的13kbEcoRV片断具有足够长(至少1kb以上)的DNA。把EcoRV片断克隆在pSUP202中以产生pSR02，再将其导入生黑葡糖杆菌IFO 3293得到KmrCms菌株即3293EV-1和3293 EV-9。菌株3293EV-1和3293EV-9的Southern-印迹杂交分析表明，两个菌株都含Tn5而没有象菌株26-9A那样含pSUP202载体部分(数据未示出)，这表明发生了通过双交换进行的同源重组。通过对菌株26-9A那样进行的产物分析和光度酶分析检查菌株3293EV-1和3293EV-9中L-山梨糖还原酶活性的缺陷；新的Tn5突变体还产生了不能检测到的L-山梨糖而且表现出低于0.01U/mg细胞溶胶蛋白的L-山梨糖还原酶活性，而生黑葡糖杆菌IFO 3293表现出0.20U/mg细胞溶胶蛋白的L-山梨糖还原酶活性。应得出的结论是：26-9A中Tn5的插入导致了L-山梨糖还原酶缺陷。
用双脱氧链终止法(Sanger F.等，美国国家科学院院报，74：5463-5467，1977)测定了pSR02上Tn5-插入区域的核苷酸序列(图1)。用BLASTP程序进行同源检索(Lipman D.J.等，分子生物学杂志，215：403-410，1990)对Tn5-插入区域的分析表明，该区域编码一种多肽，该多肽与那些属于甘露糖醇脱氢酶(MDH)家族的多肽具有同源性。成员之一，即类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)的甘露糖醇2-脱氢酶(EC 1.1.1.67)(Schneider K.-H.等，遗传微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)，1993)催化甘露糖醇NAD-依赖性地氧化成果糖。葡糖杆菌属的L-山梨糖还原酶不仅在NADPH的存在下催化L-山梨糖和D-果糖还原生成D-山梨醇和D-甘露糖醇，而且在NADP存在下催化D-山梨醇和D-甘露糖醇氧化生成L-山梨糖和D-果糖(Sugisawa T.等，同上文)。同源性分析表明，由菌株26-9A的Tn5-破坏的基因所编码的多肽是L-山梨糖还原酶基因本身，而不是其调节基因。
实施例3.PCR克隆化
采用一套图2所示的按氨基酸序列(SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4)合成的引物，通过PCR扩增法克隆弱氧化葡糖杆菌IFO 3291的部分L-山梨糖还原酶基因；考虑到葡糖杆菌属的密码子使用，合成了简并引物。PCR产生大约300bp的产物。采用该PCR扩增的片断作探针，通过Southern-和菌落-杂交分析法，获得了8.0kb EcoRV片断形式的弱氧化葡糖杆菌IFO 3291的完整L-山梨糖还原酶基因。
实施例4.测定得自弱氧化葡糖杆菌IFO 3291的L-山梨糖还原酶基因的核苷酸序列
用含有弱氧化葡糖杆菌IFO 3291的L-山梨糖还原酶基因的8.0kb的EcoRV片断，测定了L-山梨糖还原酶基因的完整核苷酸序列。核苷酸序列和推定的氨基酸序列示于SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2。该8.0kb EcoRV的限制图示于图3。SR基因和两个开放读框位于相反方向，发现这两个开放读框在L-山梨糖还原酶基因的下游并且编码与DnaJ样蛋白和铁氧还蛋白具有同源性的多肽。在L-山梨糖还原酶基因的上游，没有发现可能产生带L-山梨糖还原酶基因的操纵子的相关ORFs。因此认为，L-山梨糖还原酶基因的破坏不影响其相邻基因的表达。
实施例5.由弱氧化葡糖杆菌IFO 3291构建L-山梨糖还原酶基因破坏体
如图4所示，质粒pUC4K、pSR03-1和pSUP202是起始原料质粒。pUC4K是Km抗性基因盒的一个来源，可从Pharmacia(Uppsala，Sweden；Code No.27-4958-01)商购。质粒pSR03-1是可商购载体pBluescript II SK(Stratagene CA，USA；Catalog No.212205和212206)的衍生物，携带实施例3中获得的EcoRV片断。载体pSUP202是pBR325的衍生物，携带含mob位点的片断；正如公知的那样，pBR325是pBR322的衍生物。尽管pBR325自身似乎不能商购，但认为本领域技术人员能轻易获得另一种材料，例如pBR322(ATCC 31344)、pACYC177(ATCC 37031)或pACYC184(ATCC 37033)，正如Simon R.等(1983，生物/技术1：784-791)所描述的pSUPseries。Simon R.等(同上)同样报道了构建含mob位点的质粒。
图4表示用于构建L-山梨糖还原酶基因导向载体pSUP202-SR::Km的图示。把8.0kb的Eco RV片断克隆在pBluescript II SK载体的Eco RI位点中(Alting-Mees M.A.等，酶学方法(Methods inenzymology 216：483-95，Academic Press，London，1992)以产生pSR03-1。将卡那霉素抗性基因盒(Km盒)插入克隆化L-山梨糖还原酶基因中的Eco RI位点以获得pSR04-1。把用Km盒破坏了的该L-山梨糖还原酶基因亚克隆在自杀载体pSUP202中。然后把所得pSR05-2即pSUP202-SR::Km(Kmr)导入弱氧化葡糖杆菌IFO 3291而获得L-山梨糖还原酶无效的突变体(Kmr)。最后，通过Southern-杂交分析证实了作为目标的基因破坏。用于这种破坏的示意性机制示于图5。于是获得L-山梨糖还原酶缺陷型突变体SR3。
L-山梨糖还原酶基因定向的突变体SR3和弱氧化葡糖杆菌IFO3291表现出的L-山梨糖还原酶活性分别为0.02以下和0.681U/mg蛋白质。
实施例6.菌株SR3在8％山梨醇-No.5培养基中的发酵曲线
用500ml三角瓶中的8％山梨醇-No.5培养基评估菌株SR3和弱氧化葡糖杆菌IFO 3291的生长和L-山梨糖同化曲线(图6)。菌株SR3和弱氧化葡糖杆菌IFO 3291能在24小时内把80g/L的D-山梨醇转化为L-山梨糖(数据未示出)。弱氧化葡糖杆菌IFO 3291在48小时内把大部分转化成的L-山梨糖同化。另一方面，菌株SR3几乎不利用L-山梨糖，直到第3天；残留的L-山梨糖大于70g/L。6天后，菌株SR3和弱氧化葡糖杆菌IFO 3291分别表现出6.4和24的OD600(细胞生长)。
实施例7.菌株SR3在2％山梨醇-SCM培养基中的发酵曲线
用500ml三角瓶中的2％山梨醇-SCM培养基评估菌株SR3和弱氧化葡糖杆菌IFO 3291的生长和L-山梨糖同化曲线(图7)。菌株SR3和弱氧化葡糖杆菌IFO 3291能在12小时内把20g/L的D-山梨醇转化成L-山梨糖。弱氧化葡糖杆菌IFO 3291在23小时内把转化成的L-山梨糖同化一半。另一方面，菌株SR3几乎不利用L-山梨糖。23小时后，菌株SR3和弱氧化葡糖杆菌IFO 3291分别表现出2.5和5.9的OD600(细胞生长)。
序列表
SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：1458个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)原始来源：
生物体：弱氧化葡糖杆菌
菌株：IFO 3291
(iv)特征：
特征键：CDS
位置：1..1458
测序方法：E
ATGATCACGC ACGAAACCCT CAAGTCTCTT CCCGCCGGTG TGCAGGCTCC GCCCTATGAC 60
ATCAATGGGA TCAAACCGGG GATCGTGCAT TTTGGCGTGG GAAACTTCTT CCGGGCCCAT 120
GAGGCTTTCT ACGTTGAACA GATCCTCAAG GACGATCCGA ACTGGGGAAT CATCGGCGTT 180
GGTCTGACGG GTAGCGACAG GTCAAAGAAG AAGGCCGAGG AATTCAAGAA GCAGGACTGC 240
CTCTTTTCCC TGACCGAAAC GGCTCCGTCC GGCAAGAGCA CGGTTCGTGT TATGGGCGCG 300
CTGAGGGATT ACCTTTTGGC TCCTGCCGAT CCGGAAGCCG TGCTGAAGCA TCTCGCTGAC 360
CCGGGAATCC GTATCGTTTC CATGACAATC ACGGAAGGCG GTTACAACAT TAACGAGACG 420
ACAGGTGAGT TCGATCTTGA GAACAAGGCG GTTCAGCAGG ATCTGAAGAC ACCCGAAACG 480
CCGTCCACAA TCTTTGGATA TGTTGTGGAA GGACTGCGCC GCCGCCGTGA CGCAGGTGGC 540
AAGGCCTTCA CGATCATGTC CTGCGATAAT CTGCGGCATA ACGGTAATGT CGCCCGCAAG 600
GCATTTCTGG GATACGCGAA GGCCCGTGAT CCGGAACTGG CCAAGTGGAT TGAAGAGAAC 660
GCGACGTTCC CAAATGGCAT GGTTGATCGC ATCACGCCGA CCGTTTCTGC TGACATTGCG 720
AAGAAGCTCA ACGAAGCCAG TGGCCTGCAC GACGACCTGC CGCTCGTTGC AGAAGACTTT 780
CATCAGTGGG TGCTGGAAGA CAGCTTTGCT GATGGCCGGC CTGCGCTGGA AAAGGCCGGA 840
GTGCAGTTCG TTGGGGATGT GACGGACTAC GAGCATGTAA AAATCCGCAT GCTGAATGCT 900
GGTCACATCA TGCTCTGCTT CCCGGCTGTT CTGGCAGGAT TTGAAAATGT CGATCATGCC 960
CTTGCTGATC CCGATCTACG GCGTATCCTC GAGAACTTCC TGAACAAAGA CGTCATCCCG 1020
ACCCTGAAGG CACCGCCGGG CATGACGCTG GAAGGCTATC GGGACAGCGT GATCAGCCGT 1080
TTCTCGAATC CGGCCATGGC GGATCAGACA TTGCGTATTT CCGGGGACGG GAGCTCGAAG 1140
ATCCAGGTCT TCTGGACGGA AACGGTCCGC AAGGCTTTTG AGGGCAAGCG CGATCTGTCC 1200
CGCATTGCTT TTGGTATGGC ATCCTACCTG GAAATGCTGC GCGGTAAGGA TGAAACGGGT 1260
GGCACCTACG AGCCATTCGA GCCGACTTTT GGTGACAACC ATAAGACTCT GGCCAAGGCT 1320
GATGATTTTG AGAGCGCGCT CAAGCTGCCA GCGTTCGATG CCTGGCGCGA TCTGGAGACG 1380
TCCGGGCTGA ACAACAAGGT TGTGGAGCTT CGCAAGATTA TCCGCGAGAA GGGCGTCAAG 1440
GCTGCCCTTC CGGCCTGA 1458
SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：485个残基
(B)类型：氨基酸
(C)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(iii)原始来源：
生物体：弱氧化葡糖杆菌
菌株：IFO 3291
(iv)特征：
特征键：mat肽
位置：1..485
测序方法：E
Met Ile Thr His Glu Thr Leu Lys Ser Leu Pro Ala Gly Val Gln
1 5 10 15
Ala Pro Pro Tyr Asp Ile Asn Gly Ile Lys Pro Gly Ile Val His
20 25 30
Phe Gly Val Gly Asn Phe Phe Arg Ala His Glu Ala Phe Tyr Val
35 40 45
Glu Gln Ile Leu Lys Asp Asp Pro Asn Trp Gly Ile Ile Gly Val
50 55 60
Gly Leu Thr Gly Ser Asp Arg Ser Lys Lys Lys Ala Glu Glu Phe
65 70 75
Lys Lys Gln Asp Cys Leu Phe Ser Leu Thr Glu Thr Ala Pro Ser
80 85 90
Gly Lys Ser Thr Val Arg Val Met Gly Ala Leu Arg Asp Tyr Leu
95 100 105
Leu Ala Pro Ala Asp Pro Glu Ala Val Leu Lys His Leu Ala Asp
110 115 120
Pro Gly Ile Arg Ile Val Ser Met Thr Ile Thr Glu Gly Gly Tyr
125 130 135
Asn Ile Asn Glu Thr Thr Gly Glu Phe Asp Leu Glu Asn Lys Ala
140 145 150
Val Gln Gln Asp Leu Lys Thr Pro Glu Thr Pro Ser Thr Ile Phe
155 160 165
Gly Tyr Val Val Glu Gly Leu Arg Arg Arg Arg Asp Ala Gly Gly
170 175 180
Lys Ala Phe Thr Ile Met Ser Cys Asp Asn Leu Arg His Asn Gly
185 190 195
Asn Val Ala Arg Lys Ala Phe Leu Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Asp
200 205 210
Pro Glu Leu Ala Lys Trp Ile Glu Glu Asn Ala Thr Phe Pro Asn
215 220 225
Gly Met Val Asp Arg Ile Thr Pro Thr Val Ser Ala Asp Ile Ala
230 235 240
Lys Lys Leu Asn Glu Ala Ser Gly Leu His Asp Asp Leu Pro Leu
245 250 255
Val Ala Glu Asp Phe His Gln Trp Val Leu Glu Asp Ser Phe Ala
260 265 270
Asp Gly Arg Pro Ala Leu Glu Lys Ala Gly Val Gln Phe Val Gly
275 280 285
Asp Val Thr Asp Tyr Glu His Val Lys Ile Arg Met Leu Asn Ala
290 295 300
Gly His Ile Met Leu Cys Phe Pro Ala Val Leu Ala Gly Phe Glu
305 310 315
Asn Val Asp His Ala Leu Ala Asp Pro Asp Leu Arg Arg Ile Leu
320 325 330
Glu Asn Phe Leu Asn Lys Asp Val Ile Pro Thr Leu Lys Ala Pro
335 340 345
Pro Gly Met Thr Leu Glu Gly Tyr Arg Asp Ser Val Ile Ser Arg
350 355 360
Phe Ser Asn Pro Ala Met Ala Asp Gln Thr Leu Arg Ile Ser Gly
365 370 375
Asp Gly Ser Ser Lys Ile Gln Val Phe Trp Thr Glu Thr Val Arg
380 385 390
Lys Ala Phe Glu Gly Lys Arg Asp Leu Ser Arg Ile Ala Phe Gly
395 400 405
Met Ala Ser Tyr Leu Glu Met Leu Arg Gly Lys Asp Glu Thr Gly
410 415 420
Gly Thr Tyr Glu Pro Phe Glu Pro Thr Phe Gly Asp Asn His Lys
425 430 435
Thr Leu Ala Lys Ala Asp Asp Phe Glu Ser Ala Leu Lys Leu Pro
440 445 450
Ala Phe Asp Ala Trp Arg Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Asn Asn
455 460 465
Lys Val Val Glu Leu Arg Lys Ile Ile Arg Glu Lys Gly Val Lys
470 475 480
Ala Ala Leu Pro Ala
485
SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：8个残基
(B)类型：氨基酸
(C)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)原始来源：
生物体：生黑葡糖杆菌
菌株：IFO 3293
(iv)特征：
特征键：肽
测序方法：E
Met Thr Ile Thr Glu Gly Gly Tyr
l 5 8
SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：8个残基
(B)类型：氨基酸
(C)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)原始来源：
生物体：生黑葡糖杆菌
菌株：IFO 3293
(iv)特征：
特征键：肽
测序方法：E
Phe Pro Asn Gly Met Val Asp Arg
1 5 8
Claims (9)
1.一种衍生自属于葡糖杆菌属的微生物的基因工程微生物，所述基因工程微生物包括在选自下列的多核苷酸中具有突变的突变多核苷酸：SEQ ID NO：1、编码具有L-山梨糖还原酶活性的多肽的SEQ ID NO：1的片段和编码SEQ ID NO：2的多核苷酸，其中所述突变使得还原L-山梨糖的生物活性低于未突变的葡糖杆菌微生物的活性的10％。
2.根据权利要求1的基因工程微生物，其中所述微生物选自弱氧化葡糖杆菌IFO3291和生黑葡糖杆菌IFO3293。
3.根据权利要求1的基因工程微生物，其中所述突变位于形成活性L-山梨糖还原酶所需的区域内。
4.根据权利要求3的基因工程微生物，其中所述突变是通过插入至少一个选自下组的干扰性DNA片段而产生的：转座子和抗生素抗性基因盒。
5.根据权利要求3的基因工程微生物，其中所述突变是用基因工程技术通过定点诱变而诱发的。
6.根据权利要求3的基因工程微生物，其中所述形成活性L-山梨糖还原酶所需的区域位于选自下组的DNA序列：L-山梨糖还原酶基因的编码区及其表达控制序列。
7.一种生产权利要求1的基因工程微生物的方法，该方法包括：
(a)提供包含选自SEQ ID NO：1和编码具有L-山梨糖还原酶活性多肽的SEQ ID NO：1片段的葡糖杆菌微生物，和
(b)在所述多肽中引入一个突变，使该多肽还原L-山梨糖的生物活性低于未突变的葡糖杆菌微生物活性的10％。
8.生产L-山梨糖的方法，该方法包括：
(a)在适当的培养基中发酵权利要求1或2的基因工程微生物，和
(b)由所述培养基中获得L-山梨糖。
9.一种包括生产L-山梨糖的发酵步骤的生产维生素C的方法，其特征在于，该方法包括应用权利要求1中定义的一种基因工程微生物。
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