CZ87596A3

CZ87596A3 - CONTROLLABLE EXPRESSION SYSTEM, CONTROL PROTEIN, GENE, ENCODING PROTEIN, EXPRESSION CASSETTE, MICRO-ORGANISMS CONTAINING THE EXPRESSION SYSTEM, FERMENTATION AND PRODUCTION PROCESS OF PROTEINS AS WELL AS THE USE OF Fnr-NEGATIVE MICRO-ORGANISMS

Info

Publication number: CZ87596A3
Application number: CZ96875A
Authority: CZ
Inventors: August Prof Dr Bock; Dagmar Mayer; Verena Dr Schlensog; Anton Dr Candussio
Original assignee: Consortium Elektrochem Ind
Priority date: 1995-03-24
Filing date: 1996-03-22
Publication date: 1996-12-11
Also published as: JP2810016B2; FI961323A0; EP0733704A3; JPH08266291A; ATE159290T1; EP0733704B1; FI961323A; DE59600031D1; DK0733704T3; EP0733704A2; US5830692A; CA2171668A1

Description

Regulovatelný expresní systém, regulátorový protein, gen, kódující protein, expresní kazeta, mikroorganismy, obsahující expresní systém, způsob fermentace a výroby proteinů a použití Fnr-negativních mikroorganismů

Oblast techniky

Vynález se týká regulovatelného expresního systému, způsobu jeho výroby a použití.

Dosavadní stav techniky

Důležitou oblastí využití moderní genové technologie je produkce definovaných proteinů za použití rekombinantních produkčních systémů. Takové rekombinantní produkční systémy sestávají alespoň ze dvou složek, a to a) hostitele, který poskytuje buněčný nástroj pro produkci proteinu a b) rekombinantních DNK, které kódují produkovaný protein.

Známé hostitelské systémy jsou např. mikroorganismy, zvířata, rostliny nebo eukaryotické buněčné kultury. Pro produkci větších množství rekombinantních proteinů se jako hostitelské systémy používají výhodně mikroorganismy jako houby nebo bakterie, zejména E.coli.

Rekombinantní DNK, které obsahují genetickou informaci pro produkci definovaného proteinu, mohou být integrovány v chromosomu hostitele nebo episomálně, ve formě plasmidu, kosmidu nebo fágů popřípadě virů. Vedle genetické informace pro produkovaný protein obsahuje rekombinantní DNK regulační prvky, tak zvané promotory, které jsou nezbytné pro první stupeň exprese strukturního genu, transkripci DNK - sekvence do RNK. Promotory, definované krátké DNK -regiony, přitom slouží jako rozpoznávací místa pro RNK polymerásy, enzymy, které katalyzuj! transkripci DNK-sekvencí na RNK.

Promotory jsou často funkčně kombinovány s DNK-regiony, které slouží jako rozpoznávací nebo vazebná místa pro skupiny proteinů, které v závislosti na různých stimulech ovlivňují aktivitu promotorů a proto se označují jako regulátory. Vazbou takových regulátorů na jejich vazebná místa mohou být s nimi spojené promotory aktivovány (aktivátory) nebo reprimovány (represory). V genetických systémech pro produkci rekombinantních proteinů se používají takové interakce regulátor/promotor, aby produkce cílových proteinů byla regulovatelná.

Příklady takových technicky použitelných systémů jsou lac- a tac-promotor, kdy se jedná o promotory, které se inaktivují vazbou tzv. lac-represor proteinu. Při přídavku laktozy nebo analogu laktozy jako je IPTG, oddisociuje represor ze svého vazebného místa; dochází k indukci exprese genů položených za promotorem.

Další technicky použitelný regulační systém sestává z kombinace trp-promotoru a trp-represor proteinu. Jen za přítomnosti tryptofanu se váže receptor na promotor a tento inakt ivuj e.

Pro technickou produkci rekombinantních proteinů mají tyto systémy mnoho nevýhod. Pro indukci nebo represi tohoto systému používané substance jsou drahé a těžko dostupné, zejména když se jedná o metabolizované substance jako je laktoza nebo tryptofan. POlární poměr regulátorového proteinu a promotoru ovlivňuje silně reprimovatelnost expresního systému. Při přebytku promotoru nejsou takové systémy plně reprimovatelné, protože se represor vytitroval. Promotory závislé na lac-represoru nejsou při molárním přebytku represoru navíc plně indukovatelné.

V DE 3926076 Al (odpovídá CA-A-2015046) je popsáno použití pf1-promotoru pro produkci rekombinantních proteinů. Tento E.coli vlastní promotor se indukuje za přítomnosti regulátorového proteinu FNR za anaerobních podmínek a pyruvátem a reprimuje kyslíkem. Ve srovnání s lac-, tac- nebo trp-promotorem má pfl-promotor tu přednost, že je technicky jednoduše a levně indukovatelný. Regulace se provádí tak, že se na začátku fermentace aktivita promotoru potlačí přívodem kyslíku. V pozdější logaritmické fázi růstu dochází působením velké buněčné hmoty automaticky k omezení kyslíku, které může technicky posilovat fermentaco nebo ji regulovat. Navíc se v této růstové fázi z hostitelského organismu tvoří pyruvát, který posiluje expresi. Popřípadě může být přidán z zvějšku další pyruvát pro řízení indukce.

Přes své přednosti proti jiným promotorům je tento promotor z následujících důvodů vhodný jen k technické produkci rekombinantních proteinů. Při použití pf1-promotoru není možné indukovat expresi rekombinantního proteinu za přítomnosti kyslíku. Je však žádoucí vybudit maximální syntézní výkon hostitele, který u E.coli probíhá při aerobním růstu během exponenciální růstové fáze, pro produkci rekombinantních proteinů. I když pfl-promotor za aerobních podmínek není indukovatelný, má za přítomnosti kyslíku základní aktivitu, tj. pfl-promotor není plně reprimovatelný. Minimální reaktivita pf1-promotoru za aerobních podmínek činí 5 až 10 % aktivity promotoru za optimálních indukčních podmínek (anaerobně s pyruvátem). Reagulační systém sestává z FNR-regulátorového proteinu a pfl-promotor je proto systém, který je sice technicky jednoduchý a cenově přijatelný, který však není plně reprimovatelný a ne za všech růstových podmínek indukovatelný. Jako všechny ostatní známé technicky používané promotorové systémy, je také pfl-promotor vhodný jen k expresi strukturních genů nebo rekombinantních genů.

Blomquistem a spol. (J.Bact.(1933) sv.175(5), str. 1392-1404) byla popsána DNK-sekvence 2,3-butandiolového operonu (bud-operon) z Klebsiella terrigena. Je známo, že v Klebsiella terrigena se tvorba 2,3-butandiolu indukuje nižší hodnotou pH, přítomností acetátu a omezením kyslíku. Blomquist a spol ukazují, že geny, které kódují proteiny potřebné pro vazbu 2,3-butandiolu, tvoří operon, jehož transkripce se indukuje omezením kyslíku. Literatura neobsahuje žádné zmínky o indukci promotoru za přítomnosti kyslíku.

Úlohou vynálezu je nalézt expresní systém, který by umožňoval technicky jednoduše řiditelnou expresi za všech růstových podmínek hostitelského organismu.

Podstata vvnálezu

Podstatou vynálezu je acetátem, ρΗ-hodnotou a kyslíkem regulovatelný expresní systém, obsahující trans působící regulátorový protein a tímto proteinem aktivovatelný promotor, který se vyznačuje tím, že regulátorový protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je nejméně ze 75 % homologní s aminokyselinovou sekvencí Seq.ID-č.:l, a promotor, který obsahuje DNK sekvenci, která je alespoň z 95 % homologní s bázemi 315 až 397 DNK-sekvence Seq.ID-č;2.

Expresní systém podle vynálezu exprimuje libovolné strukturní geny pod kontrolou expresního systému při parciálním tlaku kyslíku pO2 0-5 %, hodnotě pH 6,0 až 6,5 a za přítomnosti acetátu v koncentraci maximálně 40 až 60 mM.

Expresní systém podle vynálezu umožňuje poprvé technicky také ve velkém měřítku jednoduše proveditelnou, levnou regulaci exprese rekombinantního genového produktu nezávisle na růstové fázi produkčních kmenů a obsahu O2 v kultivačním mediu.

Podstatou předloženého vynálezu je dále regulátorový protein, který se vyznačuje tím, že při omezení kyslíku a za přítomnosti acetátu a hodnotě pH kultivačního media 6,0 až 6,5 působí optimální aktivaci bud-promotoru z Klebsiella terrigena (DSM2687) .

Při omezení kyslíku ve výše uvedeném smyslu je parciální tlak pO2 0 až 5 %. Koncentrace acetátu činí za těchto podmínek výhodně 40 až 60 mM.

Výhodně obsahuje regulátorový protein podle vynálezu aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň ze 75 % hmologní s aminokyselinovou sekvencí Seq.ID-č:l.

Zvláště výhodná forma provedení zahrnuje aminokyselinovou sekvenci regulátorového proteinu podle vynálezu aminokyselinovou sekvenci Seq.ID-č:l. Takový regulátorový protein bude dále označován také jako BudR.

Promotor expresního systému může obsahovat libovolný DNK-region, který za BudR aktivujících podmínek vede k BudR-závislé iniciaci transkripce bezprostředně downstream k tomuto regionu ležícího genu. K fyziologickým podmínkám, při kterých se BudR maximálně aktivuje, patří parciální tlak kyslíku pO2 0 až 5 %, přítomnost acetátu v koncentraci 40 až 60 mM a hodnota pH 6,0 až 6,5.

Výhodně obsahuje promotor DNK-sekvenci, která je alespoň z 95 % homologní s bázemi 315 až 456 v DNK sekvenci ID-č:2.

Ve zvláště výodném provedení obsahuje promotor DNK-sekvenci ID-č:2 v oblasti bází 315 až 397. Takový DNK-region se dále také označuje jako bud-promotor.

Gen pro regulátorový protein podle vynálezu může být syntetizován bud plně chemicky nebo enzymaticky in vitro podle v Seq.ID-č.:l poskytnuté sekvence nebo může být izolován z mikroorganismu vytvářejícího 2,3-butandiol.

Regulátorový protein podle vynálezu se výhodně získá expresí dostupného genu takového typu. Vynález se proto také . popřípadě týká genů, které kódují regulátorový protein podle vynálezu.

Klonování genu, který kóduje regulátorový protein podle vynálezu, se výhodně provádí za použití takzvaného reporterového kmene. Konstrukce reportérových kmenů pro aktivátory transkripce se odborníkovi známá. Takový kmen obsahuje gen pro výhodně jednoduše prokazatelný protein pod transkripční kontrolou bud-promotoru. Příkladem reporterového kmenu je E.coli BL 142 (srov.příklSady 5 a 7) .

Jako reporterový gen se výhodně používá odborníkovi známý gen pro β-galaktosidásu na plasraidu pRS552 (Simons a spol.(1987), Gene, sv.53, str.85 až 96).

Pro klonování genu, který kóduje regulátorový protein podle vynálezu, se zavede do takového reporterového kmene genová banka z mikroorganismu, který tvoří regulátorový protein podle vynálezu. Konstrukce genové banky a její izolace je odborníkovi zřejmá.

Způsob klonováni pomocí reporterového kmene je odborníkovi také známý. Může být například proveden způsobem popsaným Casadanem a Cohenem (1979) Proč.Nati.Acad.Sci.USA, sv.76,č.9, str. 4530-4533.

K detekci klonů, které vytvářejí hledaný protein, se izolují z genové banky takové klony, u kterých se reportérové geny indukují při pH 6,5 a za přítomnosti acetátu. V případě použití β-galaktosidásy jako reporterového genu obsahují indikátorové plotny například barvivo X-Gal. Takové klony, které v případě použití β-galaktosidásy jako reporterového genu se na X-Gal-obsahujicích indikátorových plotnách zabarvují tmavomodře, obsahují regulátorový protein · podle vynálezu.

Ve výhodném provedení vynálezu se gen pro regulátorový protein izoluje z genové banky mikroorganismů rodů Enterobacter nebo Klebsiella, výhodně z Klebsiella terrigena (obchodně dostupný od DSM-Deutschen Sammlung fur Mikroorganisměn und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig pod označením DSM2687). Klebsiella terrigena je uložena na Mezinárodním ukládacím místě podle předpisů Budapešťské smlouvy pod přírůstkovým číslem DSM 9883.

V zásadě může být gen pro regulátorový protein izolován z mikroorganismu, například 2,3-butandiol tvořícího mikroorganismu, zejména ze 2,3-butandiol tvořícího mikroorganismu z čeledi Enterobacteriaceae.

Způsoby výroby pro expresní systém vhodného promotoru jsou odborníkům zřejmé a není proto nutno je podrobně vysvětlovat. Jedním takovým způsobem pro výrobu DNK-fragmentu, který zprostředkuje promotorovou aktivitu podle vynálezu, je chemická nebo enzymatická de novo syntéza za použití sekvenční informace uvedené v Seq.ID-č:2.

Další způsob výroby promotoru zahrnuje modifikaci jakéhokoliv DNK-fragmentu pomocí odborníkovi známých metod mutageneze za použití sekvenčních informací uvedených v Seq.ID.č.2.

Další způsob výroby promotoru zahrnuje izolaci promotoru z genové banky 2,3-butandiol tvořícího mikroorganismu.

2,3-Butandio 1 tvořící mikroorganismy jsou obecně známé a veřejnosti dostupné. Příklady jsou zástupci rodů Enterobacter, Serratia, Erwinia a Klebsiella. U těchto způsobů se alespoň upstream-regulátorový region bud-operonu, 5' před strukturním genem ležící DNK-oblast, která obsahuje funkci regulující expresi strukturního genu, izoluje z takového organismu o sobě známým způsobem. Současně izolované části, které neobsahují žádnou regulátorovou funkci, se popřípadě odstraní o sobě známými metodami (srov.příklad 14).

Výhodně se izoluje promotor, obsahující DNK-fragment bakterie rodu Enterobacter nebo Klebsiella, zvláště výhodně z genové banky Klebsiella terrigena (DMS2687).

Další podstatou vynálezu je expresní kazeta, která se vyznačuje tím, že je v ní spojen pro expresní systém vhodný promotor funkčně se strukturním genem exprimovaného, rekombinantního proteinu.

Ve výhodné formě provedení expresní kazety leží mezi promotorovým regionem a exprimovaným strukturním genem transkribovatelná ale netranslatovatelná oblast, která obsahuje ribosomové vazebné místo.

Expresní kazetu podle vynálezu je možno vyrobit například tak, že promotor se klonuje odborníkovi známým způsobem před 5'-konec exprimovaného strukturního genu.

Vynález se dále týká mikroorganismů, které obsahují expresní kazetu podle vynálezu.

Expresní kazeta může být přitom integrována v genomu mikroorganismu, může ale také být episomálně umístěna na alespoň jednom vektoru. Výhodně je expresní kazeta umístěna episomálně na alespoň jednom vektoru.

V první uvedené formě provedení se expresní kazeta podle* vynálezu známými způsoby integruje do genomu hostitelského mikroorganismu.

Ve výhodné formě provedení uvedené jako druhé, je expresní kazeta přítomna v hostitelském organismu episomálně na vektoru, takzvaném expresním vektoru. Integrace expresní kazety podle vynálezu do vektoru se provádí obvyklými, odborníkovi známými metodami. Vhodné vektorové molekuly jsou odborníkovi známé. Příklad takového vektoru je odborníkovi známý vektor pJF118 (Furste a spol.(1986), Gene, sv.48, 119-131) a jeho deriváty.

Vynález se rovněž týká způsobu výroby expresního systému podle vynálezu, který se vyznačuje tím, že se zavede do jakéhokoliv mikroorganismu popř. alespoň jeden gen pro regulátorový protein podle vynálezu a/nebo popřípadě alespoň jedna expresní kazeta podle vynálezu, tak že v příslušném mikroorganismu je potom přítomen alespoň jeden gen pro regulátorový protein podle vynálezu a jedna expresní kazeta podle vynálezu.

Vynález se také týká mikroorganismů, které obsahují expresní systém podle vynálezu.

Expresní systém podle vynálezu je možno například vyrobit tak, že se do jakéhokoliv mikroorganismu, který obsahuje alespoň jeden gen pro regulátorový protein podle vynálezu, zavede expresní kazeta podle vynálezu.

Výhodně se při tomto způsobu výroby expresního systému podle vynálezu používají takové mikroorganismy, které přirozeně obsahují gen pro regulátorový protein podle vynálezu.

Zvláště výhodně se při tomto způsobu používají mikroorganismy rodu Enterobacter nebo Klebsiella, které obsahují regulátorový protein podle vynálezu.

Zvláště výhodně se v tomto způsobu používá Klebsiella terrigena (DSM2687).

Dále se při tomto způsobu zvláště výhodně používají takové mikroorganismy jako hostitelské kmeny pro expresní kazetu podle vynálezu, do nichž byl gen pro regulátorový protein podle vynálezu zaveden pro odborníka známým způsobem. Zavedený gen, který kóduje regulátorový protein podle vynálezu se přitom může vyskytovat episomálně nebo být integrován do chromosomu hostitele.

Leží-li zavedený gen, který kóduje regulátorový protein, episomálně, lokalizuje se výhodně na stejné vektorové molekule, která také nese expresní kazetu. Vedle toho je ale také možné uspořádání, kdy jsou zavedený gen pro regulátorový protein a expresní kazeta podle vynálezu na dvou různých, ale komplementárních vektorových molekulách, jaké jsou odborníkovi známé,současně přítomny v jedné buňce hostitelského organismu.

V obecné formě provedení se použijí pro konstrukci expresního systému, při které se do hostitelského kmene zavádí přídavně gen, který kóduje regulátorový protein, jako hostitelské kmeny gram-pozitivní nebo gram-negativní bakterie.

Výhodně se jako hostitelské kmeny pro takový expresní systém použijí bakterie čeledi Enterobacieriaceae, zvláště výhodně rodů Escherichia a Salmonella. Zvláště je výhodné použití Escherichia coli jako hostitelského kmene pro takový expresní systém.

Další podstatou vynálezu je použití Fnr-negativních mikroorganismů jako hostitelského kmene pro expresní systém podle vynálezu. Výhodně se používají přirozeně Fnr-negativní mikroorganismy. Zvláště výhodné je použití takových mikroorganismů jako hostitelských kmenů pro expresní systém podle vynálezu, ve kterých je fnr-gen inaktivován způsobem, který je odborníkům zřejmý. Příkladem takového zvláště vhodného mikroorganismu je E.coli RM101 (Sawers a Suppmann (1992), J.Bacteriol. sv. 174, str. 3473-3478) a všechny z něj odvozené deriváty.

Další podstatou vynálezu jsou fermentační způsoby pro produkci proteinů pomocí mikroorganismů, které se vyznačují tím, že používají mikroorganismy.které obsahují expresní systém podle vynálezu.

Má-li být dosaženo při fermentaci podle vynálezu maximálního indukčního účinku pěstuje se mikroorganismus, obsahující expresní systém podle vynálezu při hodnotách pH >

pH 7,0 za aerobních podmínek bez externího přídavku acetátu.

V jakémkoliv časovém bodě je pak možné maximálně indukovat expresi genu pro rekombinantní protein, který je částí expresní kazety podle vynálezu,tak, že se parciální tlak kyslíku p02 upraví na hodnoty 0 až 5 %, pH-hodnota media se reguluje na pH 6,0 až 6,5 aacetát se nastaví na konečnou koncentraci 40 mM až 60 mM.

Vhodnou kombinací různých regulovaných hodnot těchto tří stimulů je navíc jednoduše možné odstupňovaně indukovat expresi fuzního genu v mezistupních postupně od velmi slabé až do velmi silné. Možnost přesně odstupňované indukce je obvykle velmi žádaná, protože je možno nastavit například hladinu exprese tak,že se vytvoří množství cílového proteinu, při kterém se ještě protein nevylučuje jako tzv. uzavřená tělíska.

Indukční podmínka, která vede k velmi slabé indukci, je například kombinace pH-hodnoty > pH 6,5, vnější přídavek acetátu (na 40 mM) a přítomnost kyslíku s parciálním tlakem p02 větším než 10 %.

Předností expresního systému podle vynálezu je, že také za přítomnosti kyslíku (pC>2> 5 %) redukcí pH-hodnoty kultivačního media na pH 6,0 a přídavkem acetátu (40 až 60 mM) umožňuje silnou indukci exprese odpovídajícího fuzního genu.

Následující příklady dále osvětlují spolu s obrázky vynález.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1: Plasmidová mapa pBUl obr. 2: plasmidová mapa pBTL142 obr. 3: nukleotidová sekvence (SEq ID-č:3) a aminokyselinová sekvence (Seq ID-č: 4) budA'-lacZ'~ přechodového místa na PBTL142 a pRBL2 obr. 4: plasmidová mapa pBAKl obr. 5: plasmidová mapa pBAK14 obr. 6: plasmidová mapa pBAKló obr. 7A: velikost a relativní orientace genu bud-regulonu v genomu Klebsiella terrigena (DSM2687) obr. 7B: na pBAK14 a pBAKló obsahežý DNK-fragment obr. 7C: poloha k PCR-amplifikaci Klebsiella-DNK použitého oligonukleotidu (srov. příklady 1 a 10) obr. 8: plasmidová mapa pRBL2 obr. 9: konstrukce pBUDlOO )srov. příklad 17) obr. 10: nukleotidová sekvence na přechodové oblasti bud-DNK—CGTase-strukturního genu před (pBUDlOO; Seq ID-č:5) a po (pBUD200; Seq ID-č: 6) řízené mutageneze

Obecně ke konstrukci plasmidů, použitých v příkladech a expresním studiím:

1. Všechny anaerobní kultivace byly provedeny podle Balcha a Wolfe (1976), Appl.Environ.Microbiol. sv.32, str.781-791 v sérových lahvích. Aerobní kultivace byly prováděny v

Er1enmeyerových baňkách za silného třepání (baňky byly naplněny max. do 1/10 objemu). Kultury byly inkubovány při 37 «C.

2. Medium pro aerobní kultivaci: TGYEP (1 % trypton, 0,5 % kvasničný extrakt, 0,4 X glukóza, lOOmM K-fosfát, pH-hodnota s 0,lM pufrem fosfátu draselného nastavena na 6,0 až 8,0); medium pro aerobní kultivaci: TGYEP (pH nastaveno jak uvedeno výše); přídavek induktoru Na-acetátu na 40 mM z ÍM zásobního roztoku.

K práci s k-fágy byla použita media podle Klecknera a spol. ((1978), Genetics sv.90, str. 427-450).

3. Antibiotika byla přidána v následujících koncentracích: ampicilin 100 pg/ml, chloramfenikol 30 pg/ml, kanamycin 50 Pg/ml, tetracyklin 20 pg/ml popř. 15 pg/ml pro chromosomálně kódované rezistence.

4. Příprava chromosomální DNK se prováděla metodou podle Ausubela a spol. ((1987), Current protocols in molecular biology, sv.l, Greene Publishing Associates and

Wiley-Interscience, New York), příprava plasraidové DNK metodou podle Holmese a Quigley-e ((1981), Anal.Biochem.sv. 114, str.193 až 197).

5. Transformace použitých kmenů plasmidovou DNK se prováděly, pokud není uvedeno jinak, podle standarních postupů (Maniatis a spol. (1982), Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. str. 249-255) .

6. Stanovení β-galaktosidásové aktivity se provádělo podle Mlllera (1972) Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., str. 352-355. Enzymové aktivity jsou udávány v Millerových jednotkách.

7. Výroba lac“-mutantu Klebsiella terrigena DSM2687 se prováděla neřízenou UV-mutagenezí podle Millera (1972) Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. str. 121-124. Ozařování se provádělo 80 sekund s intenzitou 318 pW/cm². Stabilita mutace byla testována na reverzi inkubací s nitrosoguanidinem (Mi 11er(1972) Experiments in molecular genetics, Cold Spring

Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., str.125-129). Po kontrole pro Klebsiella typických reakcí látkové výměny byl pro další výzkum zvolen kmen KT14.

8. Interakce budA-lacZ-fuze v chromozomu E.coli se prováděly podle metody Simonse a spol. (1987), Gene sv.53, str.85-96. Jestliže se vycházelo z kmene E.coli MC4100 (F-, araD139,

D(argF-lac)U169, ptsF25, deoCl, relAl, flbB501, rpsLISO, 1-) (Casadaban a Cohen (1979), Proč.Nat.Acad Sci.USA, sv.76,str. 4530-4533) byly získány následující transduktanty: BL142 a BL1. Jestliže se vyšlo z kmene E.coli EM101 (fnr-) (Sawers a Suppmann (1992) J. of Bacteriology 174, 11 str. 3474-3478) byl po transdukci získán kmen BL12.

9. Enzymatické in vitro-reakce na DNK byly, pokud není uvedeno jinak, provedeny podle Maniatise a spol. (1982), Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. str.98-148.

Výchozí vektory:

1. pUC19 (Yanisch-Perron a spol.(1985), Gene sv.33, str.103-119)

2. pBR322 (Bolivar a spol.(1977), Gene sv.2, str. 95-113)

3. pRS552 (Simons a spol.(1987), Gene sv. 53, str. 85-96)

4. pJF118HE (Furste a spol. (1986), Gene sv.48, str. 119-131)

5. pCMIOO (Binder a spol. (1986), Gene sv.47, str. 269-277)

Fágy:

kRS45 (Sitnons a spol. (1987), Gene sv. 53, str. 85-96)

10. Syntetické oligonukleotidy byly získány od firmy Toplab (Martinsried, Německo). Nukleotidové sekvence v příkladech použitých o 1igonukleotidú jsou shrnuty v tabulce 1:

Nukleotidové sekvence použitých ol igonukleotidň «J

Λ «J

E

	n 1
					CJ			d
					CJ		d	1
					E		1	CJ
					CJ	X	a	E
					o	d	CJ	E	<x
					<	1	<	E	n
					E	<	E	CJ	i
			-*		<	<		E	E
			d		E	CJ		E	E
			1		CJ	<	E	CJ	E
			CJ		E	<£	E	CJ	E
			CJ		CJ	CJ	E	E	E
			CJ		CJ	E	E	E	O
					<	E	E		CJ
			<			CJ	E	CJ	CJ
	*»	*	<			CJ	E	CJ	<
	d	d	<		CJ	E	CJ	CJ
	1	1	CJ		CJ	CJ	CJ	<
	O	CJ	<		CJ	CJ	CJ	CJ	CJ
	CJ	<	CJ		CJ	E	<	CJ	<
u		CJ	CJ		CJ	E	<		<
o	O	CJ	E		CJ	CJ		<	<
3	El	CJ	CJ		CJ		CJ		<
OJ	E	CJ	E		<	CJ	<	<	CJ
>	<	CJ	<		<	CJ	<	E	E
X	CJ	CJ	CJ		CJ	E	*c	E
o	cj	CJ	<		CJ	CJ	CJ	CJ	E
ΙΛ	E	CJ	<		<	CJ	CJ	E	E
	CJ	CJ	<		CJ	E	E	E	<
<0	cj	CJ	<		CJ		<	*£	CJ
>	<	E	E	»	CJ	CJ	CJ	<	CJ
o	CJ	CJ	CJ	d	CJ	CJ	CJ	CJ	E
Ό	o	CJ	CJ	1	E	E	E	E	CJ
	cj	E	CJ	CJ	E	E	E	E	CJ
+»	E	<	CJ	CJ	CJ	CJ	CJ	CJ	CJ
o	CJ	CJ	u	CJ	CJ	CJ	CJ	CJ	CJ
OJ	CJ	CJ	CJ	E		<C	<		CJ
r—4	E	E	E	E		<	<	<
-X	<	<	<C	<	CJ	o	CJ	CJ	CJ
3	cj	CJ	CJ		<	<		<	CJ
C	CJ	CJ	CJ	CJ	E	E	E	E
	CJ	CJ	CJ	CJ	CJ	CJ	CJ	CJ	<
	CJ 1	CJ \|	CJ 1	CJ	E I	E i	E 1	E 1	CJ 1
	X»	X.	X.	X»	v	1 *»	1 X»	1
	tn	tn	tn	tn	in	LO	to	tn	tn

0* <u co

rH	<N	ΓΊ	rr	tn	Ό	cx	00
o	0	0	0	0	0	0	0
σ>	σ»		Cn	σ>	σ>	cn	σ>
•H	Ή	•H	•H	•H	•H	Ή	•H
(—i	pH	r4	r-i	•Η	rH	1—1
O	O	O	O	O	O	o	o

O H CM rí r“t r4

60&ΠΟ rr tn r“i

11. Enzymy pro restrikci, modifikaci a sekvenční analýzu DNK vyly získány od Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim), Pharmacia (Freiburg), New England Biolabs (Schwalbach) a Perkin Elmer Cetus (Langen).

Radioaktivní substance byly od Amersham Buchler (Braunschweig) nebo NEN Du Pont (Dreieich).

Jemné chemikálie byly získány od firem Merck (Darmstadt), Sigma (Mnichov), Serva (Heidelberg), Fluka (Neu-Ulm) a Biomol (Mnichov).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Translační kopulace budA-promotor-fragmentu s lacZ-genem

Za pomoci oligonukleotidů oligol a oligo2 (tabulka 1), jejichž nukleotidová sekvence byla odvozena z Blomquistem a spol. (J.Bact.(1993) sv.175(5), str. 1392-1404) zveřejněné sekvence bud-operonu z Klebsiella terrigena, byl 223 bp velký fragment z chromozomální DNK z Klebsiella terrigena (DSM2687) amplifikován symetrickou PCR (tepelné opracování: 30 s při 58 °C; prodlužování řetězce: 60 s při 72 °C; dělení řetězce: 30 s při 94 °C; 25 cyklů). Získaný fragment se rozkládá přes polohy 247 až 456 nukleotidové sekvence Seq ID-č:2 a obsahuje sekvenční informaci pro 10 N-terminální aminokyselinové zbytky BudA (srov. obr.7A), jakož i 178 proti směru od budA-startkodonu ležících nukleotidů, které obsahují funkčně aktivní promotor bud-operonu.

Za použití BamHI-restrikčních rozpoznávacích míst zavedených PCR startnukleotidy oligol a oligo2, se po štěpení PCR produktu pomocí BamHI izoluje 219 bp velký DNK fragment a klonuje do vektoru pUC19 štěpeného pomocí BamHI. Správná nukleotidová sekvence jakož i orientace inzertu byly ověřeny dvoj řetězcovou sekvenční analýzou (Sanger a spol. (1977)

Proč.Nat1.Acad.Sci.USA 74(12), str . 5463-5467). Vzniklý konstrukt byl nazván pBUl (obr.l).

Pro kombinaci bud-promotoru na pBUl s lacZ-genem jako reportérovým genem pro promotorovou aktivitu se překlonuje BamHI-fragment z pBUl do BamHI-místa štěpení protomortest-vektoru pRS552. Získaný konstrukt, plasraid PBTL142 (obr.2), kóduje fuzní protein, sestávající z 10 N-terminálních aminokyselinových zbytků BudA a na ně přes linker ze 2 aminokyselinových zbytků napojený LacZ od 9.arainokyselinového zbytku (obr.3, Seq-ID č: 3 a 4), jehož transkripce může být regulována jen regulačním elementem obsaženým ve 158 bp před budA.

Příklad 2

Exprese β-galaktosidázového proteinu bud-promotorovým fragmentem na pBTL142 v Klebsiella terrigena KT14

Pro funkční výzkum bud-promotoru na pBTL142 v Klebsiella terrigena (homologní systém) se Klebsiella terrigena KT14 (lacZ-) elektroporací (Fiedler a Wirth (1988) Analytical Biochemistry 170, str. 38-44) transformuje s pBTL142. Pro studie exprese se takto získaný transformant /Klebsiella terrigena KT14/pBTL142) za podmínek uvedených v tabulce 2. Takto vytvořené β-galaktosidásové aktivity (tabulka 2), které byly stanoveny podle Millera z buněčného lyzátu, jsou přímým měřítkem pro aktivitu bud-promotoru za příslušných podmínek.

Tabulka 2

Exprese budA'-lacZ' v Klebsiella terrigena KT14/pBTL142

PH	+O2	+O2+ acetát	-O2	-O2+ acetát
6,0	668	5688	2300	11515
6,5	800	2272	1057	4326
7,0	833	1280	760	1533
7,5	884	1123	784	754
8,0	875	1003	741	743

Příklad 3

Exprese β-galaktosidáza-proteinu v Klebsiella terrigena KTl4/pBTL142 při fermentaci za indukujících a neindukujících podmínek

Typ fermentoru: Biostat ED (B.Braun Biotech, Melsungen, Německo).

Objem plnění: 7 1

Medium: KH2PO4: 1,5 g/1; (NHaHSOa: 5,0 g/1; NaCl 0,5 g/1; FeSO* x 2H2O: 0,075 g/1; Najcitrát x 2 H2: 1,0 g/1; trypton (Oxoid): 5 g/1; kvasnicový extrakt (Oxoid): 2,5 g/1; glukóza: 12 g/1; kanamycin; 50 mg/1 pH media: konstantně 6,0 (úprava pomocí 6N NH4OH, popř. 4N H3PO4) teplota: 30 °C

Provzdušňování: Kultivace se během celého průběhu fermentace konstantně provzdušňují 4 1 vzduchu za minutu. Až po dosažení optické hustoty ODďoo= 20 se udržuje konstantní parciální tlak kyslíku pO2= 40 % mícháním rychlostí mezi 450 a 900 ot/min.

Při dosažení Οϋδοο= 20 se během hodiny p02 snížením rychlosti míchání nastaví na p02= 0 % a udržuje po 48 hodin.

Indukce: Při dosažení p02= 0 % se přidává při indukované fermentace 40 mM acetátu.

0-Galaktosidásová aktivita se stanoví 24 h a 48 h po indukci.

Tabulka 3:

Exprese budA’-lacZ' v Klebsiella terrigena KT14/pBTL142

0-galaktosidásová aktivita (Millerovy jedn.)

	24 h	48 h
bez indukce	460	700
s indukcí	10820	15325

Příklad 4

Exprese β-galaktosidása-proteinu budA-promotorfragmentem na PBTL142 v E.coli FM420

Po transformaci E.coli FM420 pomocí pBTL142 byly při následujících studiích exprese nalezeny hodnoty uvedené v tabulce 4.

Tabulka	4
Exprese	budA’-	lacZ¹ v	E.coli	FM420/pBTLl42
pH	+02	-02	-O2 +	acetát
6,0	424	408		737
7,0	613	466		722
8,0	655	607		794

V heterologním systému není zjistitelná žádná významná indukce bud-promotoru. E.coli neobsahuje pro plnou expresi a regulaci potřebné traskripční faktory, tj. na pBT142 přítomné, cis-působící faktory nejsou samy dostačující, aby zprostředkovaly v Klebsiella terrigena (př.2) pozorované expresní poměry v E.coli.

Příklad 5

Integrace budAlacZ-translační fuze na plasmidu pBTL142 do genomu E.coli MC4100

Integrace budA’lacZ-fuze do chromosomu se provede matodou podle Simonse a spol. ((1987), Gene sv.53, str.85 až 96). Transformací pBTL142 v E.coli MC4100 a potom infekcí s kRS45 se integruje translační fuze do chromosomu E.coli MC4100. Úspěšná integrace se přezkouší pomocí transdukované kanamycinové rezistence. Po UV-ozařování získané lyzáty kBTL142 (přečištěná fágová linie) se použijí k obnovené transdukci E.coli MC4100 a takto konstruovaný kmen se označí jako E.coli BL142.

Příklad 6

Exprese budA¹-lacZ’-proteinu chromosomálně integrovaným genem v E.coli BL142

Všechny kultivace byly provedeny při pH 6,5.

Tabulka 5

Exprese budA'-lacZ' v E.coli BL142

Růstové podmínky β-galaktosidásová aktivita +O₂ 35

-O₂ 40

-O₂ + acetát 70

Za uvedených růstových podmínek je malá základní exprese; ale není zjistitelná žádná významná indukce anaerobiosou a přídavkem acetátu.

Příklad 7

Klonování genu z Klebsiella terrigena, kódujícího protein, aktivující budA-promotor v E.coli

Izoluje se chromosomální DNK z Klebsiella terrigena DSM 2687 a částečně se štěpí pomocí Sau3A (0,02 jednotek/pg DNK, min při 37 °C). Fragmenty mezi 3 a 10 kb se izolují po elektroforetickém oddělení a ligují s BamHI 1inearizovaným vektorem pBR322. Plasmidový pool získaný po transformaci E.coli JM109 a následující preparaci se použije jako genová banka pro Klebsiella terrigena.

Pro idfentifikaci plasmidů, které kódují bud-promotor aktivovaný za přítomnosti acetátu v trans-působícím faktoru, se E.coli BL142 transformuje pomocí elektroporace s genovou bankou z Klebsiella terrigena (Fiedler a Wirth (1988( Analytical Biochemistry 170, str. 38-40). Transformační vsádky nanesou na takzvané indikátorové plotny (fosforečnanem draselným pufrovaný TGYEP-agar (pH 6,5) s 0,4 % glukózy, 40 mM acetátu, 1 mM X-Gal a ampicilin (100 pg/ml)) a inkubuji se při 37 °C. E.coli BL142 vytvoří na těchto indikátorových plotnách vzhledem ke své velmi slabé β-galaktosidásové aktivitě (tab.S) světlemodré kolonie. Klon naopak vytváří po transformaci tmavomodré kolonie. Obsahuje plasmid pBAKl (obr.4), který nese přibližně 1,8 kb velký Sau3A-fragment z Klebsiella terrigena. Pro další analýzy byly izolovány 1,8 kb velký HindlII-fragment z pBAKl (srov.obr.4) , který obsahuje 350 bp velký fragment vektoru pBR322 a 1,45 kb velký fragment z Klebsiella terrigena; přesahující konce fragmentů byly vyplněny Klenow-polymerásou. Potom se fragment v obou orientacích liguje do Smál 1inearizovaného plasmidu pUC19. Takto vzniklé plasmidy, které na indikátorových plotnách rovněž způsobují modré zabarvení kolonií E.coli BL142 byly označeny jako pBAK14 a pBAKló (obr. 5 a 6).

Příklad 8

Sekvenční analýza genu pro regulátorový protein, aktivující budA-promotor na pBAK14 a pBAKló

K sekvenční analýze inzertu na pBAK14 a pBAKló podle Sangera a spoi. ((1977), Proč.Nati.Acad.Sci. USA, sv.74, str. 5463-5467) se inzerty vždy zkrátí pomocí exonukleásy III. Jako vektorová ochrana slouží restrikce pomocí Sací, napadení exonukleásou probíhá na Asp718-místě štěpení vícenásobného klonovacího místa v pUC19 (Henikoff (1984), Gene sv.28, str. 351-359). Sekvenční reakce s T7-DNA polymerásou (Pharmacia, Freiburg) se provedou paralelně s dGTP a dITP, aby se potlačila silná komprese. Použije se pro pUC-vektory specifický, obchodně dostupný univerzální sekvenční startoligonukleotid. Pro DNK-inzert z Klebsiella terrigena na pBAK14 a pBAKló byla stanovena následující nukleotidová sekvence (Seq ID-č:2):

GGATCCGCCCGGGCTTTACGCGCGCTGCCGTCAGCGCGCAGCTGGTAGAC

CTCGCTGCTAAAGGCAATCAGTTCGCCATCGAGTTCGTTAAAGGTGCCGA

101 GACCGAAGTCGCCGTGGGTCAGCAGGTCGGCGATGGTGGTGCTACCCTCA

151 TAGACCCCGCTCAGCAGCGCGCTCATCAGAGAGGTCTGATAGATAACGCT

201 ATCAGGC-TGGTGGGCGGAGAAGCCGCGTACGGTTTCGCACAGGCTCTCCT

251 GGCAGGTGCATTCAGGATAATGATTCACAATCCACTTCCTCGTTCAACAA

301 ATATAAGAAAGATTAAATAAATATTGACCCGATTCAGCTCTCAGTTCCAA

351 TATAGAATCCATGCTGGTTTGAGACGTTTACGATATGGAACTTCGCTATT

401 TACGTTATTTTGTCGCCGTTGCCGAGGCGCGGAACTTCACCCGGGCGGCC

451 CACGATCTTGGCATTTCTCAACCGCCACTAAGTCAGCAAATTCAGCGACT

501 TGAGCGAGAAATAGGGACTCCGCTGCTGCGTCGTTTGACGCGGGGGGTTG

551 AGCTGACGGAGGCCGGAGAGTCGTTCTACGTCGACGCGTGTCAGATCCTC

601 GCCTTAAGCGATGGGGCGCTGGAAAAAACCAAGGGGATTGCGCGGGGCAT

651 GAACGGTAGCCTGGTGCCGGGGATCACCAGTTCAGCTGCTTTTCATTCGC

701 AGATTTTCTCTTTGCTGTACCAGTTTCAGCAGCGCTATCCGGCGGTGGCT

751 CTGCGCCAGGTCGAAGGCAATATGGCGACGCTGATGCATGCCCTGGGCGA

801 GGCGGAGCTGGATATCGCCTTTGTGCGCCTGCCGTGTGAAAGCAGCAAGG

851 CGTTTAATTTGCGCATTATTGCCGAGGAGCCGATGGTTATCGCGCTGCAT

901 CGCTCGCACCCGCTCTCCGGGGAAAGTGCGCTCTCTCTGGCGCAGCTGAG

951 CGACGCGGTGCCGGTTATTTTCCCGCCGGAGGTGGCGCCGGGCCTCTACG

1001 AGCAGGTTTATGATGGCTGTCGGCGTGCCGGGGTCGATATGAGCCGCGCC

1051 AGGCAATCTTCAC AGATCTCGTCTTCTATTAGC ATGGTGGACGCGC-GCTT

1101 CGGCTTTGCGCTGGTGCCTCAGTCGATGACCTGTATCTGCCTTCCCAACG

1151 TCACATGGCATCCCTTGCAGGACGCGTCGCTGAAGACGGAGATCGCCATC

1201 GCGTGGCGGCGTTTTGAACGTTCGCGGACGGTAAAGCGTTTTCTGGAGAT

1251 GTTTTAGGCGGGGCGCAGGGCTAGCAGGTATAGACGTTTGCCGCGGTTGG

1301 CCCGCGCAGGCCGTTAACCCGACGAAACTCAACGGAATACCGGGCGTCAT

1351 CGCCGTGGACTCGTTGGGGGATAATGCGGAAATATGAACCTGAACGTCTT

1401 TACGACCGTCGGAAGGGACGATAAGGCCTCTGCCGGTTTTATTATCAAAG

1451 CT

Ze stanovené nukleotidové sekvence (Seq ID-č:2) mohl být odvozen otevřený čtecí rámec (nukleotid 385 až 1254), který kóduje protein (Seq ID-č: 1), sestávající ze 290 aminokyselin Aminokyselinové sekvence odvozené z tohoto otevřeného čtecího rámce jsou následující:

1	MELRYLRYFV	AVAEARNFTR	AAHDLGISQP	PLSQQIQRLE	REIGTPLLRR
51	LTRGVELTEA	GESFYVDACQ	ILALSDAALE	KTKGIARGMN	GSLVPGITSS
101	AAFHSQIFSL	LYQFQQRYPA	VALRQVEGNM	ATLMHALGEA	ELDIAFVRLP
151	CESSKAFNLR	IIAEEPMVIA	LHRSHPLSGE	SALSLAQLSD	AVPVIFPPEV
201	APGLYEQVYD	GCRRAGVDMS	RARQSSQISS	SISMVDAGFG	FALVPQSMTC
251	ICLPNVTWHP	LQDASLKTEI	AIAWRRFERS	RTVKRFLEMF	*

Na základě své aktivity bud-promotor regulující aktivity se tento protein označí jako BudR (Bud-regulátor). Směr transkripce budR je protisměru k bud-operonu, ovšem nachází se mezi bud-operonem a budR jen jeden intergenový region o toliko 106 bp (nukleotid 279 až 384 v Seq ID-č:2). bud-Operon a budR tak tvoří divergentně orientovaný regulon pro syntézu enzymu (obr.7), který se podílí na tvorbě 2,3-butandiolu.

Příklad 9

Exprese β-galaktosidozového proteinu chromosomálně probíhající budA'lacZ-translatační fúzí v E.coli BL142/pBAKl

Indukovatelnost chromosomálně kódované budA'lacZ-fuze plasmidy genové banky, které vyvolávají lac+ fenotyp (modré zbarvení), je demonstrována následujícím příkladem. Všechny kultivace se provádějí při pH 6,5.

Tabulka 6

Exprese budA'-'lacZ- v E.coli BL142/pBAKl

Podmínky růstu +O2

-O2

-O2 + acetát β-galaktosidásová aktivita

1832

1147

5802

Příklad 10

Konstrukce budA'-'lacZ-fuze spolu s plnou sekvencí budR a intergenovým regionem mezi budR a budA

Za pomoci oligonukleotidů Oligol a 01igo3 (tab.l) se pomocí PCR z pBAK16 (pUCl9-derivát) amplifikuje 1027 bp velký fragment (obr.7). Za použití pomocí PCR-startnukleotid oligol a oligo3 zavedených BamHI-restrikčních míst se po štěpení PCR-produktu pomocí BamHI izoluje 1023 bp velký DNK-fragment a klonuje se do Vektoru pRS552 štěpeného pomocí BamHI. Správná orientace inzertu byla přezkoušena pomocí sekvenční analýzy podle Sangera a spol ((1977), Proč.Nati.Acad.Sci. USA, sv.74, str.5463-5467). Vzniklý konstrukt byl nazván pRBL2 (obr.8).

Plasmid pRBL2 obsahuje plný gen pro BudR, kompletní intergenový region mezi budR a budA jakož i gen, kódující fuzní protein, sestávající z 10 N-terminálních AK-zbytků BudA a na nich přes linker ze 2 aminokyselinových zbytků připojený LacZ od 9.aminokyselinového zbytku, který je také obsažen na PBTL142 (obr.3).

Příklad 11

Integrace budR do genomu E.coli MC4100

Integrace budA'lacZ-fuze s přídavnou sekvencí budR na plasmidu pBRL2 do chromosomu E.coli MC4100 se provádí metodou podle Simonse a spol.(1987), Gene, sv.53, str.85-96. Transformací pRBL2 do E.coli MC4100 a potom infekcí s lambdaRS45 E.coli MC4100(pRBL2 se fuze integruje do chomosomu E.coli MC4100. Úspěšná itegrace byla přezkoušena na základě kanamycinem transdukované rezistence. Po UV-ozařování získaný lyzát RBL2 (přečištěné fágové linie) se použijí k obnovené transdukci E.coli MC4100 a takto konstruovaný kmen byl nazván E.coli BL2.

Příklad 12

Exprese β-galaktosidása-proteinu chromosomálně přítomnou budA'-'lacZ-fuzí v E.coli BL2

Regulace dosažená exprese budA'-'lacZ-fuzního genu v chromosomu E.coli jednoduchou kopií budR je uvedena v tabulce 7. Všechny kultivace byly prováděny v TGYEP-mediu při pH 6,5.

Tabulka 7

Exprese budA’-'lacZ v E.coli BL2

Podmínky růstu β-galaktosidásová aktivita

-O 2 99

-O2 + acetát 1130

Příklad 13

Exprese β-galaktosidásového proteinu v E.coli BL2/pBTL142

Indukce plasmidové kódovaného budA'lacZ-fuzního genu chromosomálně kódovaným BudR je uvedena v tabulce 8.

Tabulka 8

Exprese	budA'-'	lacZ- v E.coli	BL2/pBTL142
PH	+O2	+O2+ acetát	-O2 -O2+	acetát
6,0	1435	10114	1520	14413
6,5	1410	6907	928	5381
7,0	1403	2257	980	1968
7,5	1281	1440	960	1339
8,0	1265	1665	1135	1243

Příklad 14

Postupná delece 5'-oblasti budA-promotorového regionu na plasmidu pBTL142

Pro stanovení minimální nukleotidové oblasti bud-promotoru, která ještě vykazuje budR aktivovatelnou promotorovou aktivitu, se zkracuje na plasmidu pBTL142 přítomný promotor postupně ze své 5'-strany. Proto se linearizuje pBUl restrikcí s EcoRI na 5'-konci inzertu a inkubuje se s Bal31-exonukleásou (Boehringer Mannheim) při 30 °C (0,3 jednotky/pg DNK)(Schaffner a spol., 1976). 5'-přesahující DNK-konce se vyplní Klenow-fragmentem DNA-polymerásy I a opatří EcoRI-1inkery (01igo4 (tab.l)). Po restrikci s EcoRI a BamHI se fragmenty elektroforeticky rozdělí, fragmenty vhodné délky se eluují a zavedou do vektoru pRS552 předem zpracovaného s EcoRI a BamHI. 5'-konce inzertů v delečních konstruktech se stanoví sekvenční analýzou. Zvolené klony (pBTL6 až pBTL124) jsou uvedeny v tabulce 9.

Tabulka 9:

Velikost bud-promotor- podílu na plasmidech pBT6 až pBTL142

Plasmid	velikost promotorového podílu (bp)	(bp)od polohy 315 do polohy xxx v Seq ID-č:10
PBTL6	6	320
PBTL22	22	336
pBTL34	34	348
PBTL51	51	365
pBTL	64	378
pBTL	83	397
pBTL103	103	407
PBTL124	124	438
PBTL142	142	456

Příklad 15

Exprese β-galaktosidása-proteinu zkrácenými budA-promotorfragmenty na plasmidech pBTL6 až pBTL142

Expresní studie byly provedeny se zkrácenými klony v Klebsiella terrigena KT14 jako hostitelským kmenem. Všechny kultivace byly provedeny při pH 6,5:

Plasmid	+O2	+O2+ acetát	-O2	-O2+ acetá
PBTL6	30	49	18	30
PBTL22	52	136	41	120
PBTL34	34	70	24	84
PBTL51	264	645	205	523
PBTL64	252	677	²¹⁴	624
PBTL83	398	2575	967	5563
PBTL103	211	1675	752	4703
PBTL124	238	1849	828	4444
PBTL142	449	2040	767	3145

Příklad 16

Exprese β-galaktosidása-proteinu v E.coli BL12 a E.coli BL12/pUFEl

Peo stanovení vlivu E.coli vlastního induktoru anaerobní látkové výměny, Fnr, na BudR-závislou aktivaci bud-promotoru, se budR jakož i budA'.-lacZ¹-translační fuze na plasmidu pRBL2 (obr.8) integruje přes transdukci s lambdaRS45 analogicky příkladu 11 do chromosomu fnr-negativní E.coli RM101. Takto získaný kmen se onačí jako E.coli BL12. Pro stanovení možných Fnr-efektú se E.coli BL12 navíc transformuje funkční fnr-gen nesoucím plasmidem pUPRl (Sawers a Suppmann (1992) J.of

Bacteriology 174, 11 str. 3474-3478).

Tabulka Exprese

Kmen/plasmid

BL12

BL12/pUFRl

BL12/pUFRl budA'-lacZ' v E.coli BL12 růstové podmínky

-0₂

-O2 + acetát

-0₂

-O2 + acetát a BL12/pUFRl

13-galaktos idásová akt ivi ta

371

3700

115

509

Příklad 17

Funkční kopulace bud-regulátor-systému s alfa-CGTasovým strukturním genem

Pro konstrukci CGTasového expresního plasmidů pBUD200 byly použity oligonukleotidy 01igo5 až 01igo9 uvedené v tabulce 1 .

A) Konstrukce pBUDlOO úplný budR-gen a budA-promotor obsahující DNK-fragment (nukleotidy 281 až 1300 v SEQ ID-č:2) se za pomoci o 1igonukleotidů Oligo5 a Oligoó (tab.l) za použití plasmidů pBAKló jako předloh-DNK amplifikuje a štěpí restrikčními endonukleásami Nrul a Ncol.

Pro amplifikaci strukturního genu alfa-CGTasy z

Klebsiella oxytoca M5al se použijí ol igonukleotidy 01igo7 a Oligo8 (tab.l) jako startoligonukleotidy, jakož i plasmid pCMIOO (Binder a spol. (1986), Gene, sv. 47, str.269-277) jako předloha DNK. Amplifikovaný DNK-fragment se štěpí restrikčními endonukleásami Ncol a EcoRI.

Oba PCR-fragmenty se společně ligují do pomocí Nrul a EcoRI štěpeného vektoru pJF118HE (obr.9). Takto vzniklý plasmid se označí jako pBUDlOO.

B) Konstrukce pBUD200 řízenou mutagenezí

Pro umožnění účinné translace alfa-CGTasového genu na pBUDlOO se tři bodové mutace, které byly vyrobeny při konstrukci pBUDlOO revertují, aby mohly být spojeny přes Ncol-rozpoznávací místo budA-promotoru a alfa-CGTasový strukturní gen (obr.10).

Řízenou mutagenezí podle Denga a Nickoloffa (1992),

Anal.Biochem.sv.200, str.81 ff se za použití oligo9 (tab.l) jako mutagenezového oligo upraví DNK-sekvence v oblasti přechodu podle originální sekvence budA popř. alfa-CGTasy. Polohy mutagenizovaných bází jsou zřejmé z obr. 10 (Seq ID-č:5 a 6). Mutagenizovaný plasmid byl označen jako pBUD200.

Příklad 18

Enzymový test pro stanovení alfa-CGTasové aktivity

Stanovení aktivity CGTasa se provádí podle Candussiem a spol. v Eur.J.Biochem. (1990) 191, str.177-185 popsané metody.

Vždy 2 jednotky na gram škrobu testované CGTasy se inkubují s 5% (hmotn./obj,) roztokem rozpustného škrobu (Merch, Darmstadt) v pufru sestávajícím ze 20 mM Tris/HCl pH 7,2 a 5 mM CaCl2 po definovanou dobu při 45 °C. Potom se reakce ukončí přídavkem 1,5 objemových dílů methanolu. Nezreagovaný zbytkový škrob se vyloučí jednohodinovou inkubací při 4 °C a odstředováním (10 min, 12000 x g). Vzniklé produkty se stanovípomocí HPLC na Nucleosil 10-NH2-koloné (Macherey a Nagel, Duřen), přičemž jako definované cylodextriny (Wacker-Chemie, Mnichov) slouží jako standard.

Příklad 19

Exprese alfa-CGTasy bud-regulátor/promotor-systémem na plasmidu pBUD200 v E.coli WCN105

Pro kyslíkem, pH-hodnotou a/nebo acetátem regulovatelnou produkci alfa-CGTasy se v příkladu 16 popsaný expresní plasmid pBUD200 transformuje do E.coli sekrečního kmene. Jako E.coli sekreční kmen se použije E.coli WCM105. Tento kmen se vyrobí z E.coli DS410 jak je popsáno v EP 338410.

Pro prokázání regulovatelné alfa-CGTasové produkce se pěstuje E.coli WCM105/pBUD200 při 37 °C v pufrem z fosforečnanu draselného pufrovaném plném mediu (TGYEP s pH 6,5 popř. pH 8,0; Begg a spol.(1977), FEMS Microbio1.Lett.sv.2, str.47-50) za přídavku 0,4 % glukózy (hmotn./obj.) a popř. 40 mM octanu sodného. Anaerobní kultivace se provádí v sérových lahvích technikou podle Balche a Wolfa (1976). Při ODeoo mezi 0,8 a 1,0 se buňky oddělí odstředováním při 5000 x g. Buněk prostý kultivační supernatant se použije, jak je popsáno v příkladu 15, pro stanovení v něm obsažené alfa-CGTasové aktivity. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 12.

Tabulka 12 alfa-CGTasová aktivita v supernatantu E.coli WCM105/pBUD200 (U stanovených hodnot se vždy jedná o průměrnou hodnotu ze dvou paralelních pokusných kultivací)

po 2	PH	acetát(mM)	CGTasová-akt ivi ta (mj/10^-1.ml^-1)
aerob	6,5	0	2,5
anaerob	6,5	0	30,0
anaerob	6,5	40	64,0
aerob	8,0	0	< 1,0
anaerob	8,0	0	24,0
anaerob	8,0	40	46,5

- I ητ-?(

Sekvenční protokol (1) Obecné údaje:

(i) Přihlašovatel:

(A) Jméno: Consortium filr e 1 ektrochemische industrie GmbH (B) Ulice: Zielstattstr.20 (C) Místo: Mnichov (D) Spolková země: Bavorsko (E) Země: Německo (F) Směr.pošt.číslo: 81379 (G) Telefon: 089/74844-0 (H) Telefax: 089/74844-350 (I) Telex: 5215553 cons d (ii) Název vynálezu: Regulovatelný expresní systém (iii) Počet sekvencí: 15 (iv) Počítačově čitelná forma:

(A) Nosič dat: floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Pracovní systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patntln Release #1,0,verze #l,30(EPA) (2) Údaje o SEQ ID-č:l:

(i) Údaje o sekvenci:

(A) Délka: 290 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Forma řetězce:

(D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (vi) původní zdroj:

(A) Organismus: KLebsiella terrigena (B) Kmen: DSM2867

II (xi) Popis sekvence: SEQ ID-č:l:

Mec Glu Leu Arg Tyr Leu Arg Tyr Phe Val Ala Val Ala Glu Ala Arg

5 10 15

Asn Phe Thr Arg Ala Ala His As? Leu Gly Ha Ser Gin Pro Pro Leu

2S 30

Ser Gin Gin Zla Gin Arg Leu Glu Arg Glu lis Gly Thr Pro Leu Leu 35 40 45

Arg Arg Leu Thr Arg Gly Val Glu Leu Thr Glu Ala Gly Glu Ser Phe 50 55 SO

Tyr Val As? Ala Cys Gin Zle Leu Ala Leu Ser As? Ala Ala Leu Glu

70 75 80

Lys Thr Lys Gly Zle Ala Arg Gly Met Asn Gly Ser Leu Val Pro Gly

90 95

Zla Thr Ser Ser Ala Ala Phe His Ser Gin Zle Phe Ser Leu Leu Tyr 100 105 110 /

Gin Phe Gin Gin Arg Tyr Pro Ala Val .Ala Leu Arg Gin Val Glu Gly 115 ' 120 125

Asn Met Ala Thr Leu Met His Ala Leu Gly Glu Ala Glu Leu As? Zle 130 135 140

Ala Phe Val Arg Leu Pro Cys Glu Ser Ser Lys Ala Phe Asn Leu Arg

145 150 155 ISO

Zla Zle Ala Glu Glu Pro Met Val lie Ala Leu His Arg Ser Kis Pro

165 170 175

III

Leu	Ser	Gly	Giu Ser Ala Lee Ser Leu Ala Gir. Leu Ser Asp Ala Val
130	135	190
Pra	Val	Ile	?he Pro Pro Giu Val	Ala Pro Gly Leu	Tyr Glu Gin Val
		195	200		205
Tyr	Asp	Gly	Cys Arg Arg Ala Gly	Val Asp Mec Ser	Arg Ala Arg Gin
	210		215	220
Ser	Ser	Gin	Ile Ser Ser Ser Ile	Ser Met Val Asp	Ala Gly Phe Gly
225			230	235	240
Pbe	Ala	Leu	Val Pro Gin Ser Met	Thr Cys Ile Cys	Leu Pro Asn Val
			245	250	255
Thr	Trp	His	Pro Leu Gin Asp Ala	Ser Leu Lys Thr	Glu Ile Ala Ile
			250	255	270
Ala	Trp	Arg	Arg Phe Giu Arg Ser	Arg Thr Val Lys	Arg Phe Leu Giu
		275	230		235

Met Phe

290 (2) údaje o SEQ ID-č:2:

(i) údaje o sekvenci:

(A) Délka: 1453 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Forma řetězce: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: genom-DNK (vi) původní zdroj:

(A) Organismus: KLebsiella terrigena (B) Kmen: DSM2867 (vii) bezprostřední zdroj:

IV (B) Klon(y): ρΒΑΚί4/16 (vii i):poloha v genomu:

(C) jednotky: bp (xi) Popis sekvence: SEQ-ID-č:2:

GGAGCCGCCG GGGCTTTACG CGCGCTGCCG TCAGCGCGCA GCTGGTAGAC CTCGCTGCTA SO

AAGGCAATCA GTTCGCCATC GAGTTCGTTA AAGGTGCCGA GACCGAAC-TC GCCGTGGGTC 120

AGCAGGTCGG CGATGGTGGT GCTACCCTCA TAGACCCCGC TCAGCAGCGC GCTCATCAGA 180

GAGGTCTGAT AGATAACGCT ATCAGGGTGG TGGGCGGAGA AGCCGCGTAC GGTTTCGCAC 240

AGGCTCTCCT GGCAGGTGCA TTCAGGATAA TGATTCACAA TCCACTTCCT CGTTCAACAA 3 00

ATATAAGAAA GATTAAATAA ATATTGACCC GATTCAGCTC TCAGTTCCAA TATAGAATCC 3 60

ATGCTGGTTT GAGACGTTTA CGATATGGAA CTTCGCTATT TACGTTATTT TGTCGCCGTT 420

GCCGAGGCGC GGAACTTCAC CCGGGCGGCC CACGATCTTG GCATTTCTCA ACCGCCACTA 430

AGTCAGCAAA TTCAGCGACT TGAGCGAGAA ATAGGGACTC CGCTGCTGCG TCGTTTGACG S40 i

CGGGGGGTTG AGCTGACGGA GGCCGGAGAG TCGTTCTACG TCGACGCGTG TCAGATCCTC 500

GCCTTAAGCG ATGCGGCGCT GGAAAAAACC AAGGGGATTG CGCGC-GGCAT GAACGGTAGC 660

CTGGTGCCGG GGATCACCAG TTCAGCTGCT TTTCATTCGC AGATTTTCTC TTTGCTGTAC 720

CAGTTTCAGC AGCGCTATCC GGCGGTGGCT CTGCGCCAGG TCGAAC-GCAA TATGGCGACG 780

CTGATGCATG CCCTGGGCGA GGCGGAGCTG GATATCGCCT TTGTGCGCCT GCCGTGTGAA 840

AGCAGCAAGG CGTTTAATTT GCGCATTATT GCCGAGGAGC CGATGGTTAT CGCGCTGCAT 900 v

CGCTCGCACC CGC*TC*7CC3w /yimm ****·««» ,*««»«· *

- * - is.s.^^.k.sAlA ^<JA- «J i sj\» >— »J AJV7V7 · s. sJΛ — Λ A f* *“· Λ « —»^j***z**w*«wn

Ak?\« A i <yw - <5*j AUU\-'-j\jxj\- - CTTCCCAACG TCACATGGCA

GCGTGGCGGC GTTTTGAACG

C-GGCGCAGGG CCAGCAC-GTA

GACGAAACTC AACGGAATAC

AATATGAACC TGAACGTCTT

GGAAAGTGCG CTCTCTCTGG

GGTGGCGCCG GGCCTCTACG

GAGCCGCGCC AGGCAATCTT

CGGCTTTGCG CTGGTGCCTC

TCCCTTGCAG GACGCGTCGG

TTCGCGGACG GTAAAGCGTT

TAGACGTTTG CCGCC-GTTGG

CGGGCGTCAT CGCCGTGGAC

TACGACCGTC GGAAGGGACG

CGCAGCTGAG CGACGCGGTG

AGCAGGTTTA TGATGGCTGT

CACAGATCTC GTCTTCTATT

AGTCGATGAC CTGTATCTGC

TGAAGACGGA GATCGCCATC

TTCTGGAGAT GTTTTAGC-CG

CCCGCGCAGG CCGTTAACCC

TCGTTGGGGG ATAATGCGGA

ATAAGGCCTC TGCCGGTTTT

ATTATCAAAG CTT

950

1020

S0

1140

1200

1250

1320

1330

1440

1453

Údaje o SEQ ID-č:3:

(i) Údaje o sekvenci:

(A) Délka: 39 párů bází

(B) Typ: nukleotid

(C) Forma řetězce: dvojitý

(D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: genom-DNK (vii) bezprostřední zdroj:

(B) Klon(y): pBAK142 a pRBL2 (vii i):poloha v genomu:

(C) jednotky: bp

VI (xi) Popis sekvence: SEQ-ID-č:3 TATCCTGAAT GCACCTGCGA GGATCGCGTG GTATTACAA (2) údaje o SEQ ID-č:4:

(i) Údaje o sekvenci:

(A) Délka: 13 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Forma řetězce:

(D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (v) Typ fragmentu: vnitřní fragment (vii) bezprostřední zdroj:

(B) Klon(y): pBAK142 a pRBL2 (xi) Popis sekvence: SEQ-ID-č:4

Tyr Pro Giu Cys Thr Cys Gin. Asp Pro Val Val Leu Gin 15 10 (2) Údaje o SEQ ID-č:5:

(i) údaje o sekvenci:

(A) Délka: 29 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Forma řetězce: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: genom-DNK (vii) bezprostřední zdroj:

(B) Klon(y): pBUDlOO (viii):poloha v genomu:

(C) jednotky: bp (xi) Popis sekvence: SEQ-ID-č:S:

CGAGGAAGTG GACCATGGAA AGAAACCGT

VII (2) údaje o SEQ ID—č:6:

(i) údaje o sekvenci:

(A) Délka: 29 páru bází (B) Typ: nukleotid (C) Forma řetězce: dvojitý (D) Topologie: lineární (i i) Typ molekuly: genom-DNK (vii) bezprostřední zdroj:

(B) Klon(y): pBUD200 (vii i):poloha v genomu:

(C) jednotky: bp (xi) Popis sekvence: SEQ-ID-č:6:

CGAGGAAGTG GATTATGAAA AC-AAACCGT (2) Údaje o SEQ ID-č:7:

(i) Údaje o sekvenci:

(A) Délka: 25 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Forma řetězce: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc= syntetická DNK (vii) bezprostřední zdroj:

(B) Klon(y): 01igo 1 (viii):poloha v genomu:

(C) jednotky: bp (xi) Popis sekvence: SEQ-ID-č:7:

GGGGATCCTG GCAGGTGCAT TCAGG

VIII (2) údaje o SEQ ID-č:8:

(i) údaje o sekvenci:

(B) Klon(y): 01igo2 (vii i):poloha v genomu:

(C) jednotky: bp (xi) Popis sekvence: SEQ-ID-č:8:

GGGGATCCAT CGTGGGCCGC CCGAG 25 (2) údaje o SEQ ID-č:9:

(i) údaje o sekvenci:

(A) Délka: 33 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Forma řetězce: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc= syntetická DNK (vii) bezprostřední zdroj:

(B) Klon(y): Oligo3 (xi) Popis sekvence: SEQ-ID-č:9:

GGGGATCCCG CCTAAAACAT CTCCAGAAAA CGC

IX (2) Údaje o SEQ ID-č:10:

(i) Údaje o sekvenci:

(A) Délka: 10 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Forma řetězce: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc= syntetická DNK (vii) bezprostřední zdroj:

(B) Klon(y): Oligo4 (viii):poloha v genomu:

(C) jednotky: bp (xi) Popis sekvence: SEQ-ID-č:10:

CGGAATTCCG (2) údaje o SEQ ID—č:11:

(i) Údaje o sekvenci:

(A) Délka: 43 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Forma řetězce: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc= syntetická DNK (vii) bezprostřední zdroj:

(B) Klon(y): Oligo5 (viii):poloha v genomu:

(C) jednotky: bp (xi) Popis sekvence: SEQ-ID-č:ll: :tagaagct tcgcgaccaa ccggggcaaa cgtctatacc tg_

X (2) údaj e o SEQ ID-č (i) údaje (A) (B) (C) (D) : 12:

o sekvenci:

Délka: 37 párů bázi Typ: nukleotid Forma řetězce: jediný Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc= syntetická DNK (vii) bezprostřední zdroj:

(B) Klon(y): 01igoó (viii):poloha v genomu:

(C) jednotky: bp (xi) Popis sekvence: SEQ-ID-č:12:

TCTAGAAGC7 TCCATGGTCC ACTTCCTCGT TCAACAA (2) Údaje o SEQ ID-č:13:

(i) údaje o sekvenci:

(A) Délka: 40 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Forma řetězce: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc= syntetická DNK (vii) bezprostřední zdroj:

(B) Klon(y): 01igo7 (vii i):poloha v genomu:

(C) jednotky: bp (xi) Popis sekvence: SEQ-ID-č:13: TCTAGAAGCT TCCATGGAAA GAAACCGTTT TTTTAATACC

XI (2) Údaje o SEQ ID-č:14:

(i) údaje o sekvenci:

(A) Délka: 41 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Forma řetězce: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc= syntetická DNK (vii) bezprostřední zdroj:

(B) Klon(y): 01igo8 (vii i):poloha v genomu:

(C) jednotky: bp (xi) Popis sekvence: SEQ-ID-č:l4:

TCTAGAAGCT TGAATTCTTA AAACGAGCCA TTCGTTGTTT G / (2) Údaje o SEQ ID-č:15:

(i) Údaje o sekvenci:

(A) Délka: 36 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Forma řetězce: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc= syntetická DNK (vii) bezprostřední zdroj:

(B) Klon(y): 01igo9 (vii i):poloha v genomu:

(C) jednotky: bp (xi) Popis sekvence: SEQ-ID-č:15:

GAACuAGGCG gtggattatg aaaagaaacc gttttt

JUDr. MHoá VéčTEČKA advokát

120 00 PRAHA & Háfcova 3

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Regulovatelný expresní systém, obsahující trans-působící regulátorový protein a tímto proteinem aktivovatelný promotor a který může být regulován acetátem, hodnotou pH a kyslíkem, vyznačující se tím, že regulátorový protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň ze 75 % hmologní k aminokyselinové sekvenci Seq.ID-č:1 a který obsahuje promotor DNK-sekvence, která je alespoň z 95 % hmologní k bázím 315 až 397 DNK-sekvence Seq.ID-č.:2.
2. Expresní systém podle nároku 1, vyznačující se tím, že exprimuje jakýkoliv strukturní gen pod kontrolou expresního systému při parciálním tlaku kyslíku pO₂ 0 až 5 %, hodnotě pH 6,0 až

6,5 a za přítomnosti acetátu v koncentraci 40 až 60 mM maximálně.
3. Regulátorový protein, vyznačující se t í m , že při omezení kyslíku a za přítomnosti acetátu a hodnotě pH kultivačního media pH 6,0 až pH 6,5 působí optimální aktivaci bud-promotoru z Klebsiella terrigena (DSM2687).
4. Regulátorový protein podle nároku 3, vyznačující se tím,že obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je alesoň ze 75 % homologní k aminokyselinové sekvenci Seq.ID-č:l.
5. Gen, kódující protein podle nároku 3 nebo 4.
6. Expresní kazeta, vyznačující se tí m,že promotor, který obsahuje DNK-sekvenci, která je nejméně z 95 % homologní k bázím 315 až 397 DNK-sekvence sekvence ID-č:2, je funkčně spojen se strukturním genem exprimovaného, heterologního proteinu.
7. Mikroorganismy, obsahující alespoň jednu expresní kazetu podle nároku 6.
8. Mikroorganismy, obsahující alespoň jeden expresní systém podle nároku 1.
9. Způsob fermentace pro produkci proteinů pomocí mikroorganismů, vyznačující se tí m,že se použijí mikroorganismy podle nároku 7 nebo 8.
10. Způsob výroby mikroorganismů podle nároku 8, vyznačující se tí m,že se do libovolného mikroorganismu zavede popřípadě alespoň jeden gen pro regulátorový protein podle nároku 4 nebo 5 a/nebo popřípadě alespoň jedna expresní kazeta podle nároku 7.
11. Použití Fnr-negativních mikroorganismů jako hostitelského kmene pro expresní systém podle nároku 1.