JP3192704B2 - デスチオビオチンからビオチンへの変換方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵素反応系でデスチオ
ビオチンをビオチンに変換する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ビオチンはビオチン酵素の補酵素として
脂肪代謝等の酵素反応に関与する動植物にとって必須の
ビタミンである。現在ビオチンは化学合成法によって製
造されているが複雑な工程を要するため、これを代替す
べく各種ビオチン生産菌を用いた醗酵法によるビオチン
の製造方法の開発が行われている。これらの製造方法に
用いられる微生物としては、エシェリヒア（Escherichi
a)属に属するものとして、α−デヒドロビオチン耐性株
（例えば、特開昭６１−１４９０９１号公報、参照）、
ビオチンによるフィードバック抑制が解除された株（例
えば、特開昭６１−２０２６８６号公報、参照）、酢酸
産生能の低減した株（例えば、ヨーロッパ特許出願公開
第０３１６２２９号明細書、参照）、ビオチン保持欠損
株（例えば、特公表昭６４−５０００８１号、参照）が
知られており、また、エシェリヒア属以外に属するもの
としては、バチルス（Bacillus) 属（例えば、特開昭６
２−２７５６８４号公報、参照）、セラチア（Serrati
a) 属（例えば、特開平２−２７９８０号公報、参照）
に属する微生物が知られており、これらの特許公報では
遺伝子工学的に改良した微生物を用いたビオチンの製造
方法を公表している。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】一般に、前記のような
微生物を用いた醗酵法によるビオチン製造方法において
は、菌体生産にも栄養源が消費されるためビオチンの対
糖収率が低く、また、目的物たるビオチンとともにその
直前の前駆体であるデスチオビオチンが多量に蓄積、残
存する傾向があるため、必ずしも満足できる生産性を達
成しているとは言えない。さらに、ビオチンの回収にあ
たっては、種々のきょう雑物を含む醗酵液からビオチン
を回収しなければならず、回収、精製工程が複雑になる
といった問題点もある。

【０００４】これらの醗酵法によるビオチン製造方法の
問題点の多くは、培養系に比べてより規定（定義）され
た反応系、すなわち休止菌体反応系や酵素反応系等を用
いるビオチン製造方法を開発することによって解決する
ことができる。この際、最も重要となるデスチオビオチ
ンからビオチンへの変換反応に関しては、例えば大腸菌
の休止菌体を用いた変換反応の研究（Eisenberg,M.A.
ら、Antimicrobial Agents and Chemotherapy 21,5,(19
82) 、参照) 等がなされてはいるが、硫黄原子の供与
体、補酵素の必要性など反応機構に関して多くの重要な
点が判っていない。さらに、酵素反応系を用いたデスチ
オビオチンからビオチンへの変換方法の開発にあたって
は、デスチオビオチンからビオチンへの変換活性を高く
維持したまま菌体から酵素抽出液（無細胞抽出液）を調
製する方法が未だ全く確立されていないなど解決すべき
問題が多く、休止菌体反応系や酵素反応系を用いてデス
チオビオチンからビオチンへの変換を高い変換効率で実
施することができなかった。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、効率のよ
いデスチオビオチンからビオチンへの変換方法の確立を
めざして研究を進めた結果、ビオチン生産菌体から無細
胞抽出液を調製する際に特定の物質を添加しておくとデ
スチオビオチンからビオチンへの変換活性を高く維持で
きることを見いだし、さらに、これらを用いた酵素変換
反応系に特定の物質を添加すると変換効率をより一層高
めることができることを見いだし本発明を完成した。

【０００６】従って、本発明によれば、酵素反応系でデ
スチオビオチンをビオチンへ変換する方法であって、酵
素反応系に用いる酵素活性物質が、ビオチンオペロン中
のｂｉｏＢ遺伝子を有する大腸菌より調製された無細胞
抽出液を含んでなるデスチオビオチンからビオチンへの
変換方法が提供される。

【０００７】以下、本発明を具体的に説明する。本発明
に言う無細胞抽出液とは、菌体を破砕した粗抽出液およ
びこれを一般に用いられる酵素蛋白質の分離精製方法に
よって種々の程度に精製した抽出液を含めた概念であ
る。

【０００８】無細胞抽出液の調製に用いられる大腸菌と
しては、ビオチンオペロン中のｂｉｏＢ遺伝子が染色体
もしくは組換えプラスミドまたはそれらの両方にふくま
れるものであり、特にｂｉｏＢ遺伝子の発現が増強され
たものが好ましく、例えば、本発明者らがビオチン高生
産株として作出したＤＲＫ３３２３〔ｐＸＢＡ３１２〕
株（微工研条寄第２１１７号）またはｂｉｏＢ遺伝子を
誘導型プロモーターの下流につなぎ、菌体増殖後に誘導
剤の添加により発現を行う誘導型プラスミドを有する組
換え菌などが挙げられる。このようなｂｉｏＢ誘導型プ
ラスミドは常法に従って市販の誘導型プロモーターを有
するプラスミドベクター（例えばｔａｑ系誘導型プロモ
ーターを有するプラスミドベクターとしてｐＫＫ２２３
−３、ファルマシア社、などが挙げられる）とビオチン
オペロンを有するプラスミド、例えば前記のＤＲＫ３３
２３〔ｐＸＢＡ３１２〕株からそれ自身既知のプラスミ
ド抽出方法を用いて得られるｐＸＢＡ３１２、から容易
に創製することができる。得られたプラスミドの宿主大
腸菌への導入は常法のカルシウム処理法(Mandel,M.ら、
Journal of Molecular Biology 53,109,(1970)、参照）
により容易に行うことができ、プラスミドベクターが有
する薬剤耐性を指標に該プラスミドを有する組換え菌を
選択取得することができる。こうして本発明に都合良く
もちいることのできる大腸菌を得ることができる。

【０００９】なお使用する誘導型プロモーターの種類に
応じて宿主菌に用いる大腸菌を適宜選択することで、よ
り効果的に誘導発現を行うことができる。例えばｔａｑ
系プロモーターを使用する場合は、宿主菌として例えば
大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ１０５（Yanisch-Perron,C. ら、
Gene 33,103,(1985)、参照）を用いることでより効果的
に誘導発現を行うことができる。このようにして得られ
た誘導型プロモーターによって発現が調節されるｂｉｏ
Ｂ遺伝子を担持するプラスミドを有する組換え大腸菌と
しては、例えば、後述する調製方法により得られるＪＭ
１０５〔ｐＴＴＢ１５〕などが挙げられる。

【００１０】無細胞抽出液の調製に用いられる大腸菌菌
体は、大腸菌の既知の培養方法によって得ることができ
る。培養に際して用いられる培地としては、炭素源、窒
素源、無機物を含有する合成培地、または天然培地のい
ずれも使用可能である。炭素源としては、グルコース、
グリセリン、フラクトース、シュークロース、マルトー
ス、澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜など炭水化物が使用で
きる。また窒素源としてはアンモニア、塩化アンモニウ
ム、燐酸アンモニウム、硫酸アンモニウムなどの各種の
無機および有機アンモニウム塩類、あるいはアミノ酸、
肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼ
イン加水分解物、脱脂大豆粕あるいはその消化物などの
天然有機窒素源が使用可能である。天然有機窒素源の多
くの場合は、窒素源であるとともに炭素源にもなりう
る。さらに無機物としては、燐酸第一水素カリウム、燐
酸第二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウ
ム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、塩化亜鉛、硫酸銅、
塩化マンガン、塩化コバルト、モリブデン酸アンモン、
ほう酸などが使用できる。また作出された微生物に抗菌
薬剤耐性が付与されている場合には、該当する抗菌剤を
培地に添加することによって汚染菌の混入を防ぐことが
できる。誘導型プロモーターによって発現が調節される
ｂｉｏＢ遺伝子を担持するプラスミドを有する組換え大
腸菌を用いる場合は、培養後菌体が対数増殖期に達した
ときに誘導剤、例えば誘導型プロモーターとしてｔａｑ
系プロモーターを使用した場合はＩＰＴＧ（イソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加し、ｂｉ
ｏＢ遺伝子の発現を誘導した後、培養をさらに数時間継
続して得られる菌体を無細胞抽出液の調製に用いるのが
よい。

【００１１】菌体からの無細胞抽出液の調製には、一般
に用いられる菌体破砕法が適用できる。すなわち超音波
破砕、アルミナやガラスビーズによる磨砕、フレンチプ
レスやＸプレス装置を用いた破砕などが適用できる。す
なわち、例えば培養菌体を遠心分離機で集菌後、菌体を
生理食塩水などで洗浄し、適当な中性の緩衝液、例えば
トリス塩酸緩衝液、に再懸濁し、酵素の安定化剤として
例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）やフェニルメチ
ルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を添加した菌
体液を上述の菌体破砕方法で処理すればよい。この際、
デスチオビオチンからビオチンへの変換活性を高く維持
するためにフルクトース１，６−二リン酸（ＦＤＰ）を
５mM〜２０mM濃度となるように菌体液に添加してから菌
体破砕することが望ましい。菌体破砕後、遠心分離機で
菌体残さを除去し、上澄液を無細胞抽出液として用いる
ことができる。

【００１２】さらに、この無細胞抽出液を、一般に用い
られる酵素蛋白質の分離精製方法、例えば、硫安沈澱法
や、ゲルろ過等のクロマトグラフィーで処理し、デスチ
オビオチンからビオチンへの変換活性を高めたものを精
製無細胞抽出液として用いてもよい。これらの分離精製
処理に際しても５mM〜２０mMのＦＤＰを添加しておくこ
とで変換活性の低下を防ぐことができる。

【００１３】本発明でデスチオビオチンからビオチンへ
の変換を行わせる酵素変換反応系は、前記で調製した無
細胞抽出液をそのまま用いるか、適用な緩衝液に再溶解
して構成する。緩衝液にはトリス塩酸緩衝液をはじめと
する本発明の変換方法に悪影響を及ぼさない緩衝液を使
用する。緩衝液のpHは、通常６．８〜７．８に設定する
のが好ましい。

【００１４】本発明の変換反応は前記酵素変換反応系に
基質であるデスチオビオチンを添加して行う。デスチオ
ビオチンの添加量は構築した酵素変換反応系によってそ
の最適量が変動するので限定されないが、系に全量が溶
解される量で用いるのがよい。デスチオビオチンはＤ体
でもＤＬ体でもよい。Ｌ体は酵素反応を阻害しない。変
換反応は、温度３０℃〜４１℃で、３０分〜３時間かけ
て行うが、酵素活性が消失しない限りさらに長時間反応
を続けても良い。前記酵素変換反応系にグルコース、ま
たはグルコースからの代謝産物、例えばグルコース６−
リン酸、フルクトース６−リン酸、フルクトース１，６
−二リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸などのうち少
なくともひとつを、特に好ましくはフルクトース１，６
−二リン酸を、１mM〜１００mM程度添加することによ
り、より効率よく変換反応を行うことができ、本発明の
効果をより高めることができる。

【００１５】さらに、他の微量成分として、Ｆｅイオ
ン、ＫＣｌならびにＮＡＤ，ＮＡＤＨ，ＮＡＤＰおよび
ＮＡＤＰＨからなる群より選ばれる少なくとも１成分、
ならびにＳ−アデノシルメチオニンおよびＬ−メチオニ
ンからなる群より選ばれる少なくとも１成分のいずれか
１種、あるいはこれらの各成分を適宜組み合わせて変換
反応系に添加することによりさらに一層変換効率を高め
ることができる。これらの成分の添加量は構築した酵素
変換反応系によって最適量が異なるが、一般的にＦｅ²⁺
は１mM〜１０mM、ＫＣｌについては１mM以上、ＮＡＤ，
ＮＡＤＨ，ＮＡＤＰ，ＮＡＤＰＨについては１００μＭ
以上、Ｌ−メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニンにつ
いては５０μＭ〜５００μＭとなるように添加するのが
好ましい。

【００１６】こうしてデスチオビオチンから変換された
ビオチンの反応液からの回収は、例えば、反応終了後、
加熱処理等により蛋白質成分を変性沈澱させ、遠心分離
によって除去し、上澄液より常法にしたがってビオチン
を抽出精製することにより容易に達成することができ
る。上澄液を活性炭処理、イオン交換樹脂処理した後、
水またはアルコールより再結晶することにより精製ビオ
チンを得ることができる。これらの工程は、例えば醗酵
液中からビオチンを抽出精製する場合に比べ、きょう雑
物の種類と量が少なく、著しく容易に達成されるもので
ある。

【００１７】

【実施例】本発明を以下の例によりさらに具体的に説明
するが、本発明をこれらの例に限定することを意図する
ものではない。例１ ｂｉｏＢ高発現系プラスミドを有する組換え大腸
菌の創製 プラスミドｐＸＢＡ３１２（ヨーロッパ特許出願公開第
０３１６２２９号公報、参照）をプラスミドとして保有
する組換え大腸菌ＤＲＫ３３２３〔ｐＸＢＡ３１２〕
（微工研条寄第２１１７号）を、テトラサイクリン１
２．５mg／Ｌを添加したＬＢ培地（バクトトリプトン
（ディフコ社製）１％、バクト酵母エキス（ディフコ社
製）０．５％、塩化ナトリウム１％、水酸化ナトリウム
でpH７．２に調整）中で３７℃一昼夜振盪培養して菌体
を得、アルカリ抽出法(Biroboim,H.C.ら、Nucl.Acid.Re
s.,7,1513,(1979)、参照) を用いてプラスミドＤＮＡ
ｐＸＢＡ３１２を採取した。

【００１８】得られたプラスミドＤＮＡ ｐＸＢＡ３１
２ １μｇを制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで切断
し、６５℃１０分間の熱処理を行ない、エタノール沈澱
によりＤＮＡを回収した。ＤＮＡ断片を大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼ緩衝液（５００mMトリス塩酸pH７．５、６７
mM ＭｇＣｌ２、１０mMメルカプトエタノール）中それ
ぞれ５００μＭのｄＣＴＰ，ＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴ
Ｐ、および大腸菌ＤＮＡポリメラーゼクレノーフラグメ
ントを加え、３７℃３０分反応させた。次に６５℃１０
分間加熱することにより反応を停止し、エタノール沈澱
によりＤＮＡを回収した。得られたＤＮＡの末端に５′
−リン酸化ＥｃｏＲＩリンカー（宝酒造社）を宝酒造社
製ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結させ、その
後エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。次に制限エ
ンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切断し、低温ゲルアガロ
ース（シグマ社製タイプIV）を用いた１％アガロースゲ
ル電気泳動を行ないエチジウムブロミドで染色後約９kb
のＤＮＡ断片を前述の方法により分離採取した。次にこ
の断片を制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩで切断し、
１％の低温ゲルアガロースで電気泳動を行ない、エチジ
ウムブロミドで染色後、約１．７kbのＤＮＡ断片を切り
取り、７０℃で５分間加熱後にＴＥ緩衝液（１０mMトリ
ス塩酸緩衝液pH８．０、１mM ＥＤＴＡ）飽和フェノー
ルをほぼ同量加え、よく混合し、遠心分離により水相を
得た。この水相に２倍容のエタノールを加えて完全なｂ
ｉｏＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を沈澱採取した。

【００１９】一方、誘導型のｔａｑプロモーターを有す
るプラスミドベクターｐＫＫ２２３−３（ファルマシア
社）１μｇを２つの制限エンドヌクレアーゼ、Ｓｍａ
Ｉ，ＥｃｏＲＩで切断し、１％の低温ゲルアガロースで
電気泳動を行ない、エチジウムブロミドで染色後約４．
６kbのＤＮＡ断片を切り取り、７０℃で５分間加熱後に
ＴＥ緩衝液（１０mMトリス塩酸緩衝液pH８．０、１mM
ＥＤＴＡ）飽和フェノールをほぼ同量加え、よく混合
し、遠心分離により水相を得た。この水相に２倍容のエ
タノールを加えてｔａｑプロモーターを有するベクター
ＤＮＡ断片を沈澱採取した。

【００２０】これらの処理により得られた２つのＤＮＡ
断片を宝酒造社製ＤＮＡライゲーションキットを用いて
連結した。このライゲーション反応液を用いて、大腸菌
ＪＭ１０５株を形質転換した。形質転換は、カルシウム
法に準じて行った。アンピシリン５０mg／Ｌを含むＬＢ
固形培地上で生育した形質転換株ＪＭ１０５〔ｐＴＴＢ
１５〕を本発明で用いる菌株とした。

【００２１】例２ 菌体の調製 培地−Ａ リン酸二ナトリウム（１２水和物） １７．６ ｇ／Ｌ リン酸−カリウム ２．４ ｇ／Ｌ 硫酸アンモニウム ４．０ ｇ／Ｌ 酵母エキス １０．０ ｇ／Ｌ ペプトン １０．０ ｇ／Ｌ 硫酸第一鉄（７水和物） ０．１ ｇ／Ｌ 塩化カルシウム（２水和物） ０．０５ｇ／Ｌ 塩化マンガン（４水和物） ０．０５ｇ／Ｌ 硫酸マグネシウム（７水和物） ０．１ ｇ／Ｌ グルコース ５．０ ｇ／Ｌ

【００２２】−８０℃で凍結保存していたい組換え大腸
菌ＪＭ１０５〔ｐＴＴＢ１５〕株を５００ml容量坂口フ
ラスコ（柴田ハリオ社）中２０mlの培地−Ａに接種し、
３７℃、１２５ストロークス／分で１２〜１４時間振と
う培養したものを前培養とした。この前培養２０mlを５
Ｌ容量ミニジャーファメンター（丸菱バイオエンジ社）
中２Ｌの培地−Ａに植菌し、本培養を開始した。培養条
件は温度３７℃、通気量２vvm 、攪拌速度５００rpm と
した。本培養開始後１〜２時間経過し菌体濃度（ＯＤ６
６０）が２．０程度まで菌体が増殖した時点でＩＰＴＧ
２mMを添加しｔａｑプロモーターの誘導を行った。ＩＰ
ＴＧ添加後３〜４時間経過し菌体濃度（ＯＤ６６０）が
１２．０程度まで達した時点で培養を終了し、得られた
培養液を無細胞抽出液の調製材料として用いた。乾燥菌
体量は菌体濃度（ＯＤ６６０）より算出した。本菌株の
場合、日本分光社の分光光度計ＵＶＩＤＥＣ−２２０Ｂ
で測定すると、１．０ ＯＤ６６０＝０．４８ ｇ乾燥
菌体／Ｌの換算式が成立した。

【００２３】例３ 無細胞抽出液の調製 以下の操作は全て氷水中あるいは４℃で行った。例２で
調製した培養液２Ｌを６０００rpm で１０分間遠心分離
して集菌後、培地と等量の０．７５％ＮａＣｌ溶液で２
回洗浄し、２００mL（培養液の１／１０容量）の０．１
Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．５、２mM ＤＴＴ、０．２
mM ＰＭＳＦを含む）に再懸濁した。

【００２４】この菌体懸濁液１２０mLを３００mL容量の
ビーカーに移し、氷浴中で懸濁液の温度が１０℃以上に
上昇しないよう注意しながら、超音波破砕装置（ブラン
ソン社、ＳＯＮＩＦＩＥＲモデル４５０）を用いて菌体
を超音波破砕した。得られた菌体破砕液を遠心チューブ
に移し、１４０００rpm、４℃で３０分間遠心分離し、
上澄液を無細胞抽出液とした。菌体破砕液の粘度が高く
１回の遠心分離で完全に細胞残さが除去できない場合は
上澄液について遠心分離操作を繰り返した。無細胞抽出
液は遠心チューブ等に小分けして−８０℃で凍結保存し
た。凍結保存した無細胞抽出液は６カ月間以上変換活性
を保持していた。無細胞抽出液の蛋白質濃度は蛋白質定
量キット（ピアス社、製品コード２３２２５）を用い、
アルブミン（ＢＳＡ）で検量線を作成して求めた。調製
した無細胞抽出液の蛋白質濃度は約１５〜２５mg／mLで
一定していた。

【００２５】例４ 精製無細胞抽出液の調製 ａ）ゲルろ過による無細胞抽出液の精製 セファデックスＧ−２５充填カラム（ファルマシア社、
ＰＤ−１０）を０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液（pH７．
５）緩衝液で十分洗浄後、例３で調製した無細胞抽出液
２．５mLをカラムに添加し、３．５mLの同緩衝液で溶出
させて精製画分を得た。

【００２６】ｂ）硫安沈澱法による無細胞抽出液の精製 無細胞抽出液１０mLをビーカーに移し、マグネットスタ
ーラーで攪拌しながら等量の飽和硫酸アンモニウム溶液
を除々に加えた。さらに１Ｌ当り３００ｇの固形硫酸ア
ンモニウム（乳鉢中で細粉化したもの）を徐々に加え硫
安濃度を９０％にした後、４℃で３０分間低速攪拌して
平衡化した。これを１２０００rpm 、４℃で１５分間遠
心分離し、上澄を除去して硫安沈澱画分を得た。沈澱画
分を２mLのトリス塩酸緩衝液（pH７．５）に懸濁し、セ
ルロース製透析チューブ（ユニオンカーバイド社）に移
して２Ｌの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．５）を用
いて２時間づつ、２回緩衝液を交換して透析を行った
後、透析チューブ内の溶液を回収して精製画分を得た。

【００２７】例５ デスチオビオチンからビオチンへの
変換反応 例３あるいは例４によって調製された無細胞抽出液を酵
素活性物質として用いてデスチオビオチンからビオチン
への変換反応を行った。変換反応は１．５mL容量のマイ
クロ遠心チューブ内で行い、０．１mMトリス塩酸緩衝液
（pH７．５）を基本組成として、最終反応液量が１００
〜２００μＬとなるように無細胞抽出液や基質溶液等を
添加し、３５℃に設定した恒温槽中で３０分〜５時間静
置して行った。反応系にデスチオビオチンを５０μＭと
なるように添加することで反応を開始させた。反応終了
後、直ちに１００℃で５分間加熱して酵素を失活させ
た。１２０００rpm で５分間遠心分離後、上澄液５０μ
Ｌをラクトバシラス プランタラムを用いたバイオアッ
セイの試料として供し、生成したビオチン量を算出し
た。変換活性は１分間に無細胞抽出液の蛋白質１mg当た
りに生成するビオチン量として表した。

【００２８】例６ グルコース、またはグルコース代謝
産物の添加効果 例５に従ってデスチオビオチンからビオチンへの変換反
応を行う際、反応系にグルコースを添加するとビオチン
変換活性が増加する現象を見いだした。用いた無細胞抽
出液は例３に従って調製したが、この無細胞抽出液には
デスチオビオチンからビオチンへの変換に関与する酵素
以外に解糖系などのグルコース代謝に関与する酵素も含
まれており、添加したグルコースがこれらの酵素により
代謝されてビオチン変換活性を増加させることが考えら
れたので、各種グルコースの代謝産物を変換反応系に添
加してビオチン変換活性への影響を調べた。結果を表１
に示した。

【００２９】

【表１】

【００３０】表１から明らかなように、グルコース、お
よびグルコース６リン酸、フルクトース６リン酸、フル
クトース１，６二リン酸（ＦＤＰ）、ジヒドロキシアセ
トンリン酸、Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸などの
グルコースの代謝産物を変換反応系に添加すると、無添
加時に比べてビオチン変換活性が増加することがわか
り、特にＦＤＰの添加効果が著しいことがわかる。

【００３１】例７ ＦＤＰによる変換活性の安定化 例３に従って無細胞抽出液を調製する際に、ＦＤＰを５
mM濃度となるように添加して調製した無細胞抽出液と、
対照として添加しないで調製したものを、それぞれ４℃
で１８時間放置し、例５に準じて変換活性を測定した。
いずれの場合も、変換活性測定時に変換反応系にＦＤＰ
を５mM濃度となるように添加した。結果を表２に示し
た。

【００３２】

【表２】

【００３３】表２から明らかなように、調製の際にＦＤ
Ｐを添加しなかった無細胞抽出液のビオチン変換活性は
ＦＤＰを添加して調製した場合の１／４以下であった。
また、例４ｂ）において硫安沈澱を行う際に、最終濃度
２０mMとなるようにＦＤＰを添加してから硫安沈澱処理
をして調製した精製無細胞抽出液と、ＦＤＰを無添加で
調製した精製無細胞抽出液のビオチン変換活性を比較し
た。いずれの場合も、変換活性測定時に変換反応系にＦ
ＤＰを５mM濃度となるように添加した。結果を表３に示
した。

【００３４】

【表３】

【００３５】表３から明らかなように、ＦＤＰを添加し
ておくことで精製工程中の変換活性の低下を顕著に防止
することができる。以上の結果から、以降の実施例に用
いた無細胞抽出液の調製時にはＦＤＰを添加した。

【００３６】例８ Ｆｅ²⁺イオンの添加効果 金属イオンのビオチン変換活性に対する影響を調べるた
め、ＦＤＰを添加して例３に従って調製した無細胞抽出
液を用い、各種金属イオンを変換反応系に添加して、例
５に示した方法に準じてデスチオビオチンからビオチン
への変換反応を行った。変換活性測定時には変換反応系
にＦＤＰを５mM濃度となるように添加した。結果を表４
に示した。

【００３７】

【表４】

【００３８】表４から明らかなようにＦｅイオンの添加
は顕著にビオチン変換活性を増加させた。

【００３９】例９ ＫＣｌ，ＮＡＤ，ＮＡＤＰ，Ｓ−ア
デノシルメチオニン、Ｌ−メチオニンの添加効果 さらに塩類、補酵素、アミノ酸など各種微量成分のビオ
チン変換活性に対する影響を調べるため、ＦＤＰを添加
して例４ｂ）に従って精製した精製無細胞抽出液を用
い、各種微量成分を変換反応系に添加して、例５に示し
た方法に準じてデスチオビオチンからビオチンへの変換
反応を行った。塩類、補酵素、アミノ酸の添加効果をそ
れぞれ表５、表６、表７に示した。

【００４０】

【表５】

【００４１】

【表６】

【００４２】

【表７】

【００４３】いずれの場合も変換活性測定時に変換反応
系にＦＤＰおよびＦｅ²⁺イオンをそれぞれ５mM濃度とな
るように添加した。またビオチン変換活性を顕著に増加
させた添加物について相乗効果を調べた結果を表８に示
した。

【００４４】

【表８】

【００４５】表４、表５、表６、表７、表８から明らか
なようにＦｅ²⁺イオン，ＫＣｌ，ＮＡＤ，ＮＡＤＨ，Ｎ
ＡＤＰ，ＮＡＤＰＨ，Ｓ−アデノシルメチオニン，Ｌ−
メチオニンを添加するとビオチン変換活性が著しく増加
することがわかる。

【００４６】

【発明の効果】デスチオビオチンからビオチンへの効果
的な変換方法が提供される。無細胞抽出液を用い、さら
に変換反応系にフルクトース１，６−二リン酸、鉄イオ
ン等を添加することでさらに前記変換の効率を高めた変
換方法が提供される。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特表 昭64−500081（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 17/18 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酵素反応系でデスチオビオチンをビオチ
   ンへ変換する方法であって、酵素反応系に用いる酵素活
   性物質が、ビオチンオペロン中のｂｉｏＢ遺伝子を含む
   がビオチンオペロン中の他の活性な遺伝子を含まないＤ
   ＮＡ断片を挿入したベクターにより形質転換した大腸菌
   より調製された無細胞抽出液を含んでなる、デスチオビ
   オチンからビオチンへの変換方法。
2. 【請求項２】 酵素反応系にグルコース、またはグルコ
   ースからの代謝産物のうち少なくとも一つを添加するこ
   とを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 グルコースからの代謝産物がグルコース
   ６−リン酸、フルクトース６−リン酸、フルクトース
   １，６−二リン酸およびジヒドロキシアセトンリン酸で
   ある請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 酵素反応系にＦｅイオン、ＫＣｌならび
   にＮＡＤ，ＮＡＤＨ，ＮＡＤＰおよびＮＡＤＰＨからな
   る群より選ばれる少なくとも１成分、ならびにＳ−アデ
   ノシルメチオニンおよびＬ−メチオニンからなる群より
   選ばれる少なくとも１成分のいずれか１種、あるいはこ
   れらの各成分を適宜組み合わせて添加することを特徴と
   する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 【請求項５】 無細胞抽出液の調製に際してフルクトー
   ス１，６−二リン酸を添加しておくことを特徴とする請
   求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 【請求項６】 大腸菌が高発現ｂｉｏＢ遺伝子を担持す
   るプラスミドを含有する請求項１〜５のいずれかに記載
   の方法。