JP2003159075A - 蛋白質、それをコードするｄｎａ、及び宿主細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】耐熱性に優れた新規なω−アミノ酸アミノトラ
ンスフェラーゼを提供する。 【解決手段】モノマーとしての分子量が約５２，０００
であって、ホモテトラマーのサブユニット構造を有し、
至適ｐＨが７から９であり、９０℃以上の温度条件下に
おいてω−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有
する蛋白質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、耐熱性に優れる新
規なω−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有す
る蛋白質（その誘導体を含む）、該蛋白質をコードする
環状ＤＮＡおよびその利用法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ω−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ
は、末端にアミノ基を持つアミノ酸、例えばリジン、オ
ルニチンおよび４−アミノ酪酸等のω位のアミノ基をケ
ト酸やアルデヒドに転移し、またその逆反応を触媒する
酵素で、その反応は例えば以下のように表される。

【０００３】

【化１】 式中、Ｒ¹は水素又はアミノ基を、Ｒ²及びＲ³は水素又
はカルボキシル基を、Ｒ⁴は水素、カルボキシル基又は
アミノ基を、ｎは１以上の整数を、ｍは０以上の整数を
示す。

【０００４】この酵素は医薬、農薬の合成中間体等とし
て利用価値のある有用な酵素である。例えば降圧剤の中
間体の合成にリジンアミノトランスフェラーゼを用いた
例が報告されている（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔ
ｅｃｈｎｏｌ．，２７，６，３７６−３８９，２０００
年）。ω−アミノ酸アミノトランスフェラーゼにはリジ
ンアミノトランスフェラーゼ以外にも幾つか種類があ
り、様々な生物から単離されている。微生物由来の代表
的な報告例としてはフラボバクテリウム・ルテセンス由
来のリジンアミノトランスフェラーゼ（Ｓｏｄａ，Ｋ．
ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，４１０２−４１０
９，１９６８年）、バチラス・スフェリカス由来のオル
ニチンアミノトランスフェラーゼ（Ｙａｓｕｄａ，Ｍ．
ら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１０５，２０９−２１２，
１９７９年）、エッシェリヒア・コリ由来のアセチルオ
ルニチンアミノトランスフェラーゼ（Ｂｉｌｌｈｅｉｍ
ｅｒ．Ｊ．Ｔ．ら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．，１９５，４０１−４１３，１９７９年）、
シュードモーナス・エスピー（Ｆ−１２６）由来の４−
アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（Ｙｏｎａｈａ，
Ｋ．ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．，２００，１５６−１６４，１９８０年）等が知ら
れる。

【０００５】これらの酵素はいずれも常温にて生育する
生物由来であるために耐熱性は高くないが、バチラス・
エスピーＹＭ−２より単離されたオルニチンアミノトラ
ンスフェラーゼ（Ｊｈｅｅ，Ｋ−Ｈ ら、Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．１１８，１０１、１９９５年）は７０℃の温度
条件下まではほぼ安定と報告されている。しかしこの酵
素の基質特異性は比較的高く、アミノ基供与体はオルニ
チンにほぼ特異的で、アミノ基受容体は２−ケトグルタ
ル酸に対して突出して高い。また、８０℃以上において
活性は急激に低下し、安定性も低くなっている。我々は
更に耐熱性が高く、広い基質域を有するω−アミノ酸ア
ミノトランスフェラーゼを求めて超好熱菌に着目した。

【０００６】超好熱菌は安定性が高く、工業的に有用な
酵素を探索する上で貴重な生物資源である。実際にいく
つかの酵素については、同様の活性を有する中温菌由来
のものに比べて著しく高い耐熱性を有しており、温度ス
トレスはもとより、温度以外の種々の物理化学的なスト
レスにも耐性が高く、一般的には酵素が失活したり反応
が阻害されるような条件（例えば攪拌によって生じる強
い機械的衝撃や高濃度の基質などの存在下、有機溶媒中
による反応、酸やアルカリ条件下による反応、界面活性
剤存在下による反応）でも反応をし得るものと期待され
る。

【０００７】超好熱菌に由来するアミノ酸アミノトラン
スフェラーゼの報告として、例えばエアロパイラム・ペ
ルニクスの酵素（特願２０００−３５７６３０）、スル
フォロバス・ソルファタリカスの酵素（Ｍａｒｉｎｏ，
Ｇ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３、１２３０５
−１２３０９、１９８８年）、サーモコッカス・リトラ
リスの酵素（Ａｎｄｒｅｏｔｔｉ，Ｇ．ら，Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２０、５４３−５４９、１９９
４年）、パイロコッカス・フリオサスの酵素（Ａｎｄｒ
ｅｏｔｔｉ，Ｇ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂ
ｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １２４７、９０−９
６、１９９５年）、サーモコッカス・プロファンダスの
酵素（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．，Ｔｈｅ ５ｔｈ Ａ
ｎｎｉｖｅｒｓａｒｙ Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ｅ
ｎｚｙｍｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ 要旨集２１−２６、
１９９７年）、パイロコッカス・ホリコシイの酵素（Ｍ
ａｔｓｕｉ，Ｉ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
５、４８７１−４８７９、２０００年）等が知られる。
しかし、いずれの酵素もα‐アミノ酸アミノトランスフ
ェラーゼであるためにω−アミノ酸やアミン化合物には
作用せず、超好熱菌由来のω−アミノ酸アミノトランス
フェラーゼは今まで知られていない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、耐熱
性に優れた新規なω−アミノ酸アミノトランスフェラー
ゼ、および該蛋白質をコードするＤＮＡなどを提供する
ことにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、パイロコ
ッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉ
ｏｓｕｓ）の菌体抽出物を用いることにより、ω−アミ
ノ酸のリジン、オルニチンおよび４−アミノ酪酸をアミ
ノ基供与体にして２−ケトグルタル酸からグルタミン酸
が生成することを知見し、該知見に基づいて前記反応を
触媒する酵素遺伝子を探索した結果、パイロコッカス・
フリオサスに耐熱性ω−アミノ酸アミノトランスフェラ
ーゼ遺伝子を見出し、本発明を完成するに到った。

【００１０】即ち本発明は、９０℃以上の温度条件下に
おいてω−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有
する蛋白質である。また本発明は、配列番号１の塩基配
列、又は配列番号１の塩基配列の一部からなるＤＮＡを
含む染色体外増殖性ＤＮＡであって、適切な宿主細胞に
導入することにより上述の蛋白質を生産し得る環状ＤＮ
Ａである。更に本発明は、上述のＤＮＡによって形質転
換された宿主細胞である。以下、本発明を詳細に説明す
る。

【００１１】本発明は９０℃以上の温度条件下において
ω−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋
白質であり、例えば配列番号１の塩基配列によってコー
ドされるパイロコッカス・フリオサスのω−アミノ酸ア
ミノトランスフェラーゼをあげることができる。このパ
イロコッカス・フリオサスのω−アミノ酸アミノトラン
スフェラーゼは、モノマーとしての分子量が約５２，０
００であって、ホモテトラマーのサブユニット構造を有
し、至適ｐＨが７から９であるという性質を有するもの
であり、より具体的には、後述するように配列番号５の
アミノ酸残基配列からなる蛋白質を含むものである。こ
の塩基配列、即ちパイロコッカス・フリオサスのω−ア
ミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ
は、パイロコッカス・フリオサス染色体ＤＮＡの特定の
領域を異種遺伝子発現系で発現しやすいよう、超好熱菌
エアロパイラム・ペルニクスの酵素を組換え大腸菌にて
発現させた例（特願２０００−３５７６３０）を参考
に、改変することにより得ることができる。より具体的
には、例えば配列番号２及び配列番号３のオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして用い、パイロコッカス・フリ
オサスの染色体ＤＮＡを材料にＰＣＲ法を実施して特定
領域のＤＮＡを増幅し、これを制限酵素ＳａｃＩとＰｓ
ｔＩで処理した後に配列番号４のオリゴヌクレオチドを
その５’末端側に付加することによって得ることができ
る。ここで、配列番号４よりなるオリゴヌクレオチドの
付加は、予めプラスミド上に該配列を配置することによ
って達成することもできる。またこの配列番号４よりな
るオリゴヌクレオチドは、その５’末端に位置するＡＴ
Ｇ配列が翻訳開始メチオニンとして認識されやすいよう
に上記プラスミドと連結されていることが望ましい。

【００１２】配列番号２及び３をプライマーＤＮＡとし
てＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｃＩとＰｓ
ｔＩで処理した後、配列番号４である人工的な配列をパ
イロコッカス・フリオサスのゲノムＤＮＡにある配列に
連結させることにより融合蛋白質として発現させるよう
に設計し、これらの配列を含む染色体外増殖性ＤＮＡを
宿主大腸菌に導入することが、ω−アミノ酸アミノトラ
ンスフェラーゼ活性のある蛋白質を大量に製造するうえ
で好ましいのである。

【００１３】上記ようにプラスミドベクターに組み込ん
だＤＮＡは、例えば、配列番号５で示したように４５６
アミノ酸残基からなる蛋白質をコードするＤＮＡであ
る。配列番号５の蛋白質においては、Ｎ末端から５アミ
ノ酸残基に渡って人工的な配列が付加されており、それ
よりＣ末端側に４５１アミノ酸残基に渡ってパイロコッ
カス・フリオサスのゲノムＤＮＡがコードする部分が続
いている。このように本発明の蛋白質は、具体的に配列
番号１の塩基配列によってコードされる蛋白質（具体的
には、例えば配列番号５のＮ末端６番目から４５６番目
までのアミノ酸残基からなる蛋白質）を含むものであ
る。また本発明の蛋白質は、これら具体的なアミノ酸残
基配列中の一部のアミノ酸残基が欠失した誘導体、一部
のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された誘導
体、そして他のアミノ酸残基がいずれかの部位に挿入又
は付加された蛋白質を含むものである。

【００１４】上記のＤＮＡを組み込んだプラスミドベク
ターで適切な宿主細胞を形質転換し、形質転換宿主を培
養することによって製造される本発明の蛋白質は、パイ
ロコッカス属微生物に由来する他の蛋白質を実質的に含
まない、という特徴を有するものである。プラスミドベ
クターの構築から形質転換宿主細胞の培養、そして蛋白
質の発現に至る操作は遺伝子工学の分野における常法を
採用することができ、プラスミドの種類や宿主細胞の選
択、蛋白質の発現等は適宜実施可能である。例えば、染
色体外増殖性であるプラスミドベクターとしては、ｐＵ
Ｃ１８／１９、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４等を例
示することができる。また宿主細胞としては、例えば大
腸菌Ｋ１２株や、その誘導体であるＨＢ１０１、ＪＭ１
０９、ＭＣ４１００、Ｗ３１１０、Ｃ６００等を例示で
きる。

【００１５】この形質転換体を用いて該耐熱性酵素が生
産されるが、用いられる培地は菌株が増殖し得るもので
あればいずれを使用してもよく、このとき使用する培地
として、炭素源にはグルコース、ショ糖、デンプン、乳
糖、グリセロールなどが、窒素源には肉エキス、ペプト
ン、トリプトン、酢酸アンモニウムや硫酸アンモニウム
等のアンモニウム塩等などが、無機塩にはリン酸１ナト
リウム、リン酸２ナトリウム、リン酸１カリウム、リン
酸２カリウム等のリン酸塩やＮａＣｌなどが、金属イオ
ンには硫酸マグネシウム・７水和物、硫酸第一鉄・７水
和物、塩化カルシウム・２水和物などが使用できる。ま
た、培地には酵母エキス、ビタミン類などを添加するこ
ともできる。培養は通気撹拌、振とうによって好気的条
件で行なうことが好ましく、ｐＨは６〜８の範囲に調整
する。ｐＨの調整に使用するアルカリとしてはアンモニ
ア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アミン化合物
など任意のものが使用でき、酸としては塩酸、硫酸、リ
ン酸などが使用できる。培養時間は酵素の生成量が最大
になるまで行なえばよく、１２時間〜７２時間程度が好
ましい。培養温度としては２０〜４０℃付近が好まし
く、培地中の溶存酸素濃度は５〜５０％付近が好まし
い。また、必要に応じて酵素の誘導処理を行なうことも
できるが、その際使用する誘導剤としては糖類やその誘
導体のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（ＩＰＴＧ）などが使用できる。

【００１６】このようにして培養した培養液より菌体を
回収するが、回収方法としては遠心分離やろ過などを用
いることができる。回収した菌体を緩衝液に懸濁し破砕
するが、使用する緩衝液は酵素が安定に抽出されればい
ずれの緩衝液でもよく、例えばリン酸緩衝液、トリス−
塩酸緩衝液、酢酸緩衝液などがあげられる。濃度やｐＨ
についても同様に酵素が安定に抽出されればいずれの濃
度やｐＨでもよいが、好ましくは濃度は１０〜２００ｍ
Ｍ、ｐＨは５〜９である。また必要に応じてキレート剤
のＥＤＴＡや酸化防止剤の２−メルカプトエタノールや
ジチオスレイトールを添加できる。菌体の破砕は浸透圧
ショックや超音波処理、フレンチプレス処理、マントン
・ゴーリン・ホモジナイザー処理などの通常の方法によ
って処理できる。

【００１７】得られた酵素抽出液に対し１回目の加熱処
理を行なうが、それに先立ち酵素の安定化剤を添加する
ことが好ましく、アミノトランスフェラーゼにはピリド
キサールリン酸やピリドキサミンリン酸、２−ケトグル
タル酸などが挙げられる。熱処理条件は目的とする耐熱
性酵素がなるべく安定に回収される条件がよく、好まし
くは温度が６０〜１００℃、時間が１０〜１２０分であ
る。また必要に応じて酵素を沈殿法や膜を用いて濃縮、
あるいは透析によって低分子化合物を除去したりするこ
ともできるが、沈殿法による濃縮はアセトン、メタノー
ル、エタノール、イソプロパノール、ポリエチレングリ
コールなどの有機溶媒や硫酸アンモニウム、硫酸ナトリ
ウム、リン酸カリウムなどの無機塩による塩析が使用で
きる。膜を用いた濃縮は限外ろ過膜など用いることがで
き、膜を用いた透析は市販の透析膜が使用できる。その
際に使用する膜の分画分子量は目的の酵素が膜外に溶出
しなければいずれをも使用できる。

【００１８】沈殿法による濃縮を行なった場合は緩衝液
に再溶解し、不溶物がある場合は遠心分離あるいはろ過
により除去し、２回目の加熱処理を行なう。２回目の加
熱処理条件は１回目と同様に酵素が安定に保たれればい
ずれの条件でもよいが、１回目より高い温度もしくは長
い時間で処理すればより多く夾雑蛋白質を除くことがで
きる。

【００１９】得られた酵素溶液を透析や市販の脱塩カラ
ムにより脱塩を行ない、イオン交換クロマトグラフィ
ー、疎水クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィ
ー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の各種クロマトグラ
フィーを用いることにより更に高純度に精製することが
できる。

【００２０】以下、本願発明を実施例によりさらに詳細
に説明するが、本願発明はこれらに限定されるものでは
ない。

【００２１】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００２２】実施例１ パイロコッカス・フリオサスの
培養 市販の培地（商品名；マリンブロス２２１６、Ｄｉｆｃ
ｏ社製）を１リットル容のメジュームビンに３７．４ｇ
取り、純水１リットルを加えて溶解し、更に少量のリサ
ズリンを酸化還元指示薬として加えて１２０℃で２０分
間加圧滅菌した。滅菌後、薬サジ一杯分の元素硫黄粉末
を加え、窒素雰囲気下で密栓して９７℃に加熱した。こ
の溶液に２％の２−メルカプトエタノールをリサズリン
の赤色が消失するまで滴下し、さらにパイロコッカス・
フリオサスＤＳＭ３６３８株を植菌して９７℃で一晩培
養を行なった。

【００２３】培養終了後、室温まで培養液を冷却し、残
存する元素硫黄及び硫黄酸化物の沈殿を培養液を傾斜さ
せて分離、除去し、８０００回転、２０分の遠心分離に
より微生物菌体を回収した。

【００２４】実施例２ パイロコッカス・フリオサスの
菌体抽出液からの酵素活性測定 実施例１で得られた菌体の一部を５０ｍＭトリス−塩酸
（ｐＨ７．６）に懸濁し、超音波で菌体の破砕を行な
い、遠心分離により沈殿を除去した。得られた上清を分
画分子量１２０００〜１４０００の膜にて一晩透析（２
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６））を行なった
のち、ピリドキサールリン酸を１ｍＭの濃度になるよう
加えた。酵素反応はアミノ基受容体に２−ケトグルタル
酸、アミノ基供与体にＬ−リジン塩酸塩、Ｌ−オルニチ
ン塩酸塩または４−アミノ酪酸をそれぞれ２０ｍＭの濃
度で用い、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
７）中、７０℃６０分間保温した。この溶液１０μｌを
取り、エタノール３５μｌ、トリエチルアミン５μｌ、
フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）５μｌを加
え、室温で２０分間反応させたのち、デシケーター内で
９０分間減圧乾固させ、一部を高速液体クロマトグラフ
ィー（Ｔｓｋ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ、商品名、東
ソー（株）製を使用）によって生成したグルタミン酸を
定量した。溶離液として０．１４Ｍ酢酸ナトリウム−
０．０５％トリエチルアミン（ｐＨ６．３５）を用い、
アセトニトリルの直線濃度勾配で溶出させ、２５４ｎｍ
での吸光度で検出を行ない、１分間に１μｍｏｌｅのグ
ルタミン酸を生成する活性を１Ｕとした。その結果、表
２に示すようにパイロコッカス・フリオサスの菌体抽出
液からＬ−リジン、Ｌ−オルニチン、４−アミノ酪酸を
アミノ基供与体に２−ケトグルタル酸からグルタミン酸
の生成が確認された。また酵素活性の高い順はＬ−オル
ニチン、Ｌ−リジン、４−アミノ酪酸だった。

【００２５】

【表１】 実施例３ パイロコッカス・フリオサス染色体ＤＮＡ
の調製 実施例１で得られた菌体の一部を１ｍｌのＴＮＥ緩衝液
（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、２００ｍＭＮ
ａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁した。これに１０％Ｓ
ＤＳを０．１ｍｌ加えて室温に１０分間静置し、溶菌さ
せた。

【００２６】これに水相と等容のフェノール−クロロフ
ォルム（１０ｍＭトリス−塩酸で飽和）を加えて穏やか
に攪拌し、遠心操作によって水相を回収した。この操作
を３回繰り返した後、水相と等容のクロロフォルムによ
る抽出を行なった。得られた水相に２．５容のエタノー
ルを加え、室温で１０分間静置した後、遠心によって核
酸を回収した。沈殿を７０％エタノールで洗浄した後、
再度遠心して核酸をペレットとして回収し、これを４０
０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．
５、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解した。

【００２７】この溶液に１０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ
（あらかじめＤＮａｓｅを熱処理により除去）を最終濃
度５０μｇ／ｍｌになるように２μｌ加え、３７℃で１
時間保温した。これに２０％ＰＥＧ６０００／２．５Ｍ
ＮａＣｌを２４０μｌ加えてから０℃で２時間静置し
た。これを４℃で遠心し、ペレットを７０％エタノール
で洗浄して再度遠心した。得られたペレットを乾固させ
た後４００μｌのＴＥ緩衝液に溶解してＤＮＡ標品とし
た。これにより１４０μｇのＤＮＡが回収された。

【００２８】実施例４ ＰＣＲによる特異的ＤＮＡ配
列の増幅 実施例３で得られた染色体ＤＮＡを鋳型として特定の配
列をもつＤＮＡを以下の手順により増幅した。まずプラ
イマーとしては、増幅させようとするＤＮＡ配列に相当
する配列を２０ないし２５塩基含み、かつその５’側に
適当な制限酵素認識配列と、さらにその５’側に１ない
し３塩基の余分な配列を持つように設計した。この余分
な配列は制限酵素が効率的に働くことを助けるものであ
り、その配列と長さは用いる制限酵素によって異なる。
ＳａｃＩについてはＡＴＣＣなる４塩基、ＰｓｔＩにつ
いてはＡＡよりなる２塩基が付加することにより制限酵
素が十分に切断活性をもつことが知られているので（Ｎ
ＥＢ社カタログ）、これを用いることにした。すなわち
下記のような配列番号２及び３よりなるＤＮＡ配列をプ
ライマーとすることに決定し、これらのオリゴヌクレオ
チドを常法により合成した。

【００２９】配列番号２ ５’ＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＡ
ＧＧＣＣＡＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣＡ３’
（下線部は、ＳａｃＩの認識部位を示す） 配列番号３ ５’ＡＡＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡＡＡ
ＧＡＡＣＡＧＧＣＣＧＡＡＴＴＴＡＴ３’（下線部は、
ＰｓｔＩの認識部位を示す）。

【００３０】ＰＣＲ反応はＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリ
メラーゼ（宝酒造製）を用い、以下の手順で行なった。
すなわち１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ緩衝液（宝酒造製）を
１０μｌ、各２．５ｍＭになるように調製されたｄＮＴ
Ｐ混合溶液を８μｌ、鋳型となる染色体ＤＮＡ標品を３
５０ｎｇ、上記プライマーＤＮＡを各々１００ｐｍｏ
ｌ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）
を０．５μｌ加えて、全量を１００μｌとした。Ｐｅｒ
ｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを
用いて、＜９４℃、２０秒−６０℃、６０秒−７２℃、
１２０秒＞のサイクルを３０回繰り返し、その後７２
℃、１０分の伸長反応を行なって終了させた。その一部
を１．０％アガロースで分析することにより、約１４０
０ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることが観察さ
れた。この反応によって得られたＤＮＡ量は約１０μｇ
であった。

【００３１】実施例５ 組換え大腸菌の作製 実施例４で得られたＤＮＡを常法に従いフェノール−ク
ロロフォルム（１０ｍＭトリス−塩酸で飽和）抽出で除
蛋白し、次いでクロロフォルムによる抽出を行なった。
エタノール沈殿により回収したＤＮＡのうち５μｇに６
ＵのＳａｃＩと６ＵのＰｓｔＩによる酵素消化を各々３
７℃で９０分間行なった。一方、５μｇのプラスミドｐ
ＵＫ０２−Ａ３（特開平３−１５５７８８号参照）ＤＮ
Ａを用いて、これを同様に６ＵのＳａｃＩと６ＵのＰｓ
ｔＩで各々３７℃で２時間酵素消化を行なった。こうし
て得られた両方の酵素消化物を１．０％アガロースで電
気泳動させ、ゲルから常法により抽出して各ＤＮＡ断片
を精製した。

【００３２】次に前記ｐＵＫ０２−Ａ３由来の４ｋｂｐ
断片とＰＣＲ産物の１．４ｋｂｐ断片を等モル混合し、
ライゲーション反応に供した。これにより図１に示した
プラスミドｐＰＦＯＡＴ３が得られた。図中、Ａ３／ｌ
ａｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒは大腸菌Ｔ３ファージＡ３プロ
モーターと大腸菌ｌａｃオペレーターとの融合プロモー
ターを、ＳａｃＩは制限酵素ＳａｃＩの切断部位を、Ｅ
ｃｏＲＩは制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位を、ＰｓｔＩ
は制限酵素ＰｓｔＩの切断部位を、ω−ＡＴはパイロコ
ッカス・フリオサスのω−アミノ酸アミノトランスファ
ラーゼがコードされている領域を、ｒｒｎＢ Ｔ１Ｔ２
は大腸菌ｒｒｎＢオペロンの転写終結シグナルを、Ａｍ
ｐはアンピシリン耐性の遺伝子を、ｏｒｉはプラスミド
の複製開始部位を、そしてｌａｃＩｑは大腸菌のｌａｃ
リプレッサーバリアントの遺伝子をそれぞれ示す。

【００３３】反応物を常法に従って大腸菌ＭＣ４１００
に導入した。形質転換菌は５０μｇ／ｍｌのカルベニシ
リンを含む寒天培地で選択し、生じたコロニーからプラ
スミドを常法によって抽出、分析することにより、約
１．４ｋｂｐのＳａｃＩ−ＰｓｔＩ挿入断片を有するプ
ラスミドを保有する菌株を同定した。これをＭＣ４１０
０／ｐＰＦＯＡＴ３と呼び、以下の実験に供した。

【００３４】実施例６ 酵素の調製 実施例５で得られた組換え大腸菌ＭＣ４１００／ｐＰＦ
ＯＡＴ３を２００ｍｌ容のバッフル付き３角フラスコを
用い５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地
（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキ
ストラクト、０．５％ＮａＣｌ）４０ｍｌで３４℃で１
４時間振とう培養を行なった。この培養液３０ｍｌを５
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ４Ｙ培地（１％
バクトトリプトン、２％バクトイーストエキストラク
ト、０．５％ＮａＣｌ）３リットルに植菌し、５リット
ル容の発酵槽を用いて３０℃で２３時間好気的培養を行
なった。この培養物を常法に従って菌体を集めると４２
ｇであった。集めた菌体を２５０ｍｌの５０ｍＭのトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）で洗浄後、同じ緩衝液２
５０ｍｌで再度懸濁し、超音波で菌体の破砕をなった。
この菌体破砕物にピリドキサールリン酸を１ｍＭの濃度
になるよう加え、７０℃の湯浴にて３０分間浸し熱処理
を行なった。生じた沈殿物を遠心分離により除去し、上
清を回収した。

【００３５】得られた上清に硫酸アンモニウムを７０％
飽和濃度になるようゆっくり添加し、生じた沈殿を遠心
分離により回収した。この沈殿物を１８ｍｌの５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）に溶解し、８０℃の
湯浴にて２０分間浸し生じた沈殿を遠心分離により除去
し、上清を回収した。得られた上清を分画分子量１２０
００〜１４０００の膜にて一晩透析（２０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．６））を行ない、市販のゲル（Ｄ
ＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍ、商品名、東ソー
（株）製）により分画を行ない、ＳＤＳ−ポリクリルア
ミドゲル電気泳動による分析にてほぼ単一な成分の画分
を回収し、酵素化学的特性評価用の標品とした。ＳＤＳ
−ポリクリルアミドゲル電気泳動による分析結果より、
本酵素の分子量は約５２，０００と決定され、また高速
液体クロマトグラフィーによるゲルろ過分析（ＴＳｋ−
ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ、商品名、東ソー（株）製
を使用）の結果から、本酵素はホモテトラマーのサブユ
ニット構造を有することが明らかになった。

【００３６】実施例７ 組換え体の酵素活性測定 ２０ｍＭのＬ−オルニチン塩酸塩及び２０ｍＭの２−ケ
トグルタル酸を含む０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７．７）中７０℃３０分間保温し酵素反応を行な
い、等量の１Ｎ酢酸水溶液を加え反応を停止させた。こ
の溶液１０μｌを取り、エタノール３５μｌ、トリエチ
ルアミン５μｌ、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴ
Ｃ）５μｌを加え、室温で２０分間反応させたのち、デ
シケーター内で９０分間減圧乾固させ、一部を高速液体
クロマトグラフィー（ＴＳｋ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔ
Ｍ、商品名、東ソー（株）製を使用）によって生成した
グルタミン酸を定量した。溶離液として０．１４Ｍ酢酸
ナトリウム−０．０５％トリエチルアミン（ｐＨ６．３
５）を用い、アセトニトリルの直線濃度勾配で溶出さ
せ、２５４ｎｍでの吸光度で検出した。１分間に１μｍ
ｏｌｅのグルタミン酸を生成する活性を１Ｕとした場
合、実施例６の培養液１リットル当たりの酵素活性は１
８７Ｕであった。

【００３７】実施例８ 酵素活性の温度プロファイル 実施例７に記載した酵素反応を５０、６０、７０、８
０、９０、１００℃の各温度で行ない、温度による活性
の変化を図２に示した。図中、横軸は反応温度（℃）、
縦軸は相対活性（％）である。その結果本酵素は１００
℃の温度において最も高い活性を有していた。

【００３８】実施例９ 酵素活性のｐＨプロファイル 実施例７に記載した酵素反応を、酢酸緩衝液、リン酸カ
リウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、またはグリシン−
水酸化カリウム緩衝液を用いてｐＨ４．２〜１０．２の
間で行ない、ｐＨによる活性の変化を図３に示した。図
中、横軸はｐＨ、縦軸は相対活性（％）である。その結
果本酵素は７〜９の間で高い活性を有していた。

【００３９】実施例１０ 酵素の耐熱性 実施例６の精製酵素にピリドキサール−５−リン酸を１
ｍＭの濃度になるよう加え、９５℃の温度で２３時間処
理を行ない、実施例７に記載した酵素反応を行ない活性
の変化を求めた。その結果本酵素は５９％の残存活性を
示し、極めて高い耐熱性を有していた。

【００４０】実施例１１ アミノ基供与体に対する基質
特異性 アミノ基受容体を２−ケトグルタル酸に固定し、表２に
記載した化合物をアミノ基供与体に用いて実施例７に記
載した酵素反応を行なった。その結果、表２に示すよう
に本酵素は様々なＬ体およびＤ体のアミノ酸およびアミ
ノ化合物に作用した。

【００４１】

【表２】 実施例１２ アミノ基受容体に対する基質特異性 アミノ基供与体をＬ−オルニチンに固定し、表３に記載
した化合物をアミノ基受容体に用いて実施例７に記載し
た酵素反応を行なった。その結果、表３に示すように本
酵素はスクシニックセミアルデヒドに対して２−ケトグ
ルタル酸とほぼ同程度作用した。またピルビン酸にも作
用することも見出された。

【００４２】

【表３】

【発明の効果】本発明によって耐熱性が高くかつω−ア
ミノ酸やアミノ化合物を合成する活性を有するω−アミ
ノ酸アミノトランスフェラーゼおよびω−アミノ酸アミ
ノトランスファラーゼをコードするＤＮＡが新規に提供
される。このＤＮＡを使用することにより、安価かつ安
定的に、大量のω−アミノ酸アミノトランスファラーゼ
を製造することや、天然に存在するω−アミノ酸アミノ
トランスファラーゼのアミノ酸残基の一部を置換等した
変異型アミノトランスファラーゼを製造することが可能
となる。

【００４３】本発明は更に、前記ω−アミノ酸アミノト
ランスファラーゼを用いることにより、医薬品あるいは
農薬等の原料として重要なω−アミノ酸やアミノ化合物
を安価に製造することが可能となる。

【００４４】前記した本発明の蛋白質は、１００℃の温
度条件下でもω−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活
性を発現し得るものである。例えば配列番号１の塩基配
列によってコードされる蛋白質では、９５℃で２３時間
の処理でも５９％と極めて高い残存活性を示した。この
ように高い好熱性と耐熱性を有するω−アミノ酸アミノ
トランスフェラーゼは知られていない。こうした物性を
有する酵素は、一般的な酵素が失活したり反応が阻害さ
れるような温度以外の条件、例えば攪拌によって生じる
強い機械的衝撃や高濃度の基質などの存在下等において
も高い耐性が期待できることから、産業的な有用性が高
い。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110>TOSOH Corporation <120>蛋白質、それをコードするＤＮＡ、及び宿主細胞 <130>PA211-0636 <160>7 <210>1 <211>1371 <212>DNA <213>Pyrococcus furiosus <400>1 atg agc aac gag ctc agg cca aat gtt aaa gaa atc cca ggt cca aag 48 Met Ser Asn Glu Leu Arg Pro Asn Val Lys Glu Ile Pro Gly Pro Lys 5 10 15 gcg aga gaa ata ata gag aaa cac cac aaa tac atg gca act acc acc 96 Ala Arg Glu Ile Ile Glu Lys His His Lys Tyr Met Ala Thr Thr Thr 20 25 30 aat gat ccc aat gag tac ttc tta gtt att gag aga gcg gag gga gtt 144 Asn Asp Pro Asn Glu Tyr Phe Leu Val Ile Glu Arg Ala Glu Gly Val 35 40 45 tac tgg att gat gtg gat gga aat gta atc ctc gac ttc tct tca gga 192 Tyr Trp Ile Asp Val Asp Gly Asn Val Ile Leu Asp Phe Ser Ser Gly 50 55 60 att ggt gtt ctc aat gtt gga tta agg aat cct agg gtt gtt gag gcc 240 Ile Gly Val Leu Asn Val Gly Leu Arg Asn Pro Arg Val Val Glu Ala 65 70 75 80 ata aag aag cag ttg gac tta gtt ctt cat gct gct gga aca gac tac 288 Ile Lys Lys Gln Leu Asp Leu Val Leu His Ala Ala Gly Thr Asp Tyr 85 90 95 tat aat cca tat caa gtt gcc ttg gca gaa aag ctt gtt caa ata aca 336 Tyr Asn Pro Tyr Gln Val Ala Leu Ala Glu Lys Leu Val Gln Ile Thr 100 105 110 cct gga gat ttc gag aag aaa gta ttc ttg agc aac agt gga act gag 384 Pro Gly Asp Phe Glu Lys Lys Val Phe Leu Ser Asn Ser Gly Thr Glu 115 120 125 gcc aac gag gca gca cta aag ata gca aag tgg tcc aca aac aga aag 432 Ala Asn Glu Ala Ala Leu Lys Ile Ala Lys Trp Ser Thr Asn Arg Lys 130 135 140 atg ttc att gca ttt ata ggg gca ttc cac gga aga act cat gga aca 480 Met Phe Ile Ala Phe Ile Gly Ala Phe His Gly Arg Thr His Gly Thr 145 150 155 160 atg agc ctc acc gct agt aag ccc gtt cag agg agc agg atg ttc cca 528 Met Ser Leu Thr Ala Ser Lys Pro Val Gln Arg Ser Arg Met Phe Pro 165 170 175 aca atg cct ggt gtt gag cac gtt cct tat cca aac cca tac aga aat 576 Thr Met Pro Gly Val Glu His Val Pro Tyr Pro Asn Pro Tyr Arg Asn 180 185 190 ccc tgg cac att gat ggt tat gag aac cca gac gaa ctc ata aat aga 624 Pro Trp His Ile Asp Gly Tyr Glu Asn Pro Asp Glu Leu Ile Asn Arg 195 200 205 gtt ctg gag tac ata gag gaa tat ctc ttt agt cac tat gtt cca gca 672 Val Leu Glu Tyr Ile Glu Glu Tyr Leu Phe Ser His Tyr Val Pro Ala 210 215 220 gaa gag gtt gca gga ata gtc ttt gag cca att cag gga gag ggt ggt 720 Glu Glu Val Ala Gly Ile Val Phe Glu Pro Ile Gln Gly Glu Gly Gly 225 230 235 240 tac gtc gtt ccc cca agg aac ttc ttc aag gaa cta aag aag ctg gct 768 Tyr Val Val Pro Pro Arg Asn Phe Phe Lys Glu Leu Lys Lys Leu Ala 245 250 255 gac aag tac ggc ata ctc tta att gat gac gag gtt caa atg gga att 816 Asp Lys Tyr Gly Ile Leu Leu Ile Asp Asp Glu Val Gln Met Gly Ile 260 265 270 ggt aga act gga aag atg tgg gca att gag cac ttt gga ata gcc cca 864 Gly Arg Thr Gly Lys Met Trp Ala Ile Glu His Phe Gly Ile Ala Pro 275 280 285 gat atc atc act aca gca aag gct ctt ggt gga ggc att cca att gga 912 Asp Ile Ile Thr Thr Ala Lys Ala Leu Gly Gly Gly Ile Pro Ile Gly 290 295 300 gct aca atc ttc aga aag gat ttg gac ttt gga gtt agt gga gtg cac 960 Ala Thr Ile Phe Arg Lys Asp Leu Asp Phe Gly Val Ser Gly Val His 305 310 315 320 agc aat acc ttt gga gga aat gcc gta gcc gca gca gct gca ctt gca 1008 Ser Asn Thr Phe Gly Gly Asn Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ala 325 330 335 gta atg gag gag ttg gag aat gga ttg tta gag aat gtc cag aaa tta 1056 Val Met Glu Glu Leu Glu Asn Gly Leu Leu Glu Asn Val Gln Lys Le 340 345 350 gag ccc ctg ttc agg gag aga ctt gaa gaa atg aag gag aag tat gag 1104 Glu Pro Leu Phe Arg Glu Arg Leu Glu Glu Met Lys Glu Lys Tyr Glu 355 360 365 atc ata gga gat gtc aga ggt ata ggc ctt gca tgg ggt gta gaa ttc 1152 Ile Ile Gly Asp Val Arg Gly Ile Gly Leu Ala Trp Gly Val Glu Phe 370 375 380 gta aag gac aga aag acc aag gaa tat gca act aag gag aga aat gaa 1200 Val Lys Asp Arg Lys Thr Lys Glu Tyr Ala Thr Lys Glu Arg Asn Glu 385 390 395 400 gta gta gtt gag gct ctt aag aga ggt cta gca ttg cta ggg tgt gga 1248 Val Val Val Glu Ala Leu Lys Arg Gly Leu Ala Leu Leu Gly Cys Gly 405 410 415 aag agt gcc ata aga cta att cca cca cta ata atc agc gaa gag gag 1296 Lys Ser Ala Ile Arg Leu Ile Pro Pro Leu Ile Ile Ser Glu Glu Glu 420 425 430 gcc aag ata gga ctt gac ata ttt gag gaa gca ata agg gta gtc agt 1344 Ala Lys Ile Gly Leu Asp Ile Phe Glu Glu Ala Ile Arg Val Val Ser 435 440 445 gag agg tat gga tat aag atc cac tag 1371 Glu Arg Tyr Gly Tyr Lys Ile His 450 455 <210>2 <211>34 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>2 atcc gag ctc agg cca aat gtt aaa gaa atc caa 34 <210>3 <211>34 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>3 aactgcagtg gagcaaagaa caggccgaat ttat 34 <210>4 <211>14 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>4 atg agc aac gag ct 14 <210>5 <211>456 <212>PRT <213>Pyrococcus furiosus <400>5 Met Ser Asn Glu Leu Arg Pro Asn Val Lys Glu Ile Pro Gly Pro Lys 1 5 10 15 Ala Arg Glu Ile Ile Glu Lys His His Lys Tyr Met Ala Thr Thr Thr 20 25 30 Asn Asp Pro Asn Glu Tyr Phe Leu Val Ile Glu Arg Ala Glu Gly Val 35 40 45 Tyr Trp Ile Asp Val Asp Gly Asn Val Ile Leu Asp Phe Ser Ser Gly 50 55 60 Ile Gly Val Leu Asn Val Gly Leu Arg Asn Pro Arg Val Val Glu Ala 65 70 75 80 Ile Lys Lys Gln Leu Asp Leu Val Leu His Ala Ala Gly Thr Asp Tyr 85 90 95 Tyr Asn Pro Tyr Gln Val Ala Leu Ala Glu Lys Leu Val Gln Ile Thr 100 105 110 Pro Gly Asp Phe Glu Lys Lys Val Phe Leu Ser Asn Ser Gly Thr Glu 115 120 125 Ala Asn Glu Ala Ala Leu Lys Ile Ala Lys Trp Ser Thr Asn Arg Lys 130 135 140 Met Phe Ile Ala Phe Ile Gly Ala Phe His Gly Arg Thr His Gly Thr 145 150 155 160 Met Ser Leu Thr Ala Ser Lys Pro Val Gln Arg Ser Arg Met Phe Pro 165 170 175 Thr Met Pro Gly Val Glu His Val Pro Tyr Pro Asn Pro Tyr Arg Asn 180 185 190 Pro Trp His Ile Asp Gly Tyr Glu Asn Pro Asp Glu Leu Ile Asn Arg 195 200 205 Val Leu Glu Tyr Ile Glu Glu Tyr Leu Phe Ser His Tyr Val Pro Ala 210 215 220 Glu Glu Val Ala Gly Ile Val Phe Glu Pro Ile Gln Gly Glu Gly Gly 225 230 235 240 Tyr Val Val Pro Pro Arg Asn Phe Phe Lys Glu Leu Lys Lys Leu Ala 245 250 255 Asp Lys Tyr Gly Ile Leu Leu Ile Asp Asp Glu Val Gln Met Gly Ile 260 265 270 Gly Arg Thr Gly Lys Met Trp Ala Ile Glu His Phe Gly Ile Ala Pro 275 280 285 Asp Ile Ile Thr Thr Ala Lys Ala Leu Gly Gly Gly Ile Pro Ile Gly 290 295 300 Ala Thr Ile Phe Arg Lys Asp Leu Asp Phe Gly Val Ser Gly Val His 305 310 315 320 Ser Asn Thr Phe Gly Gly Asn Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ala 325 330 335 Val Met Glu Glu Leu Glu Asn Gly Leu Leu Glu Asn Val Gln Lys Leu 340 345 350 Glu Pro Leu Phe Arg Glu Arg Leu Glu Glu Met Lys Glu Lys Tyr Glu 355 360 365 Ile Ile Gly Asp Val Arg Gly Ile Gly Leu Ala Trp Gly Val Glu Phe 370 375 380 Val Lys Asp Arg Lys Thr Lys Glu Tyr Ala Thr Lys Glu Arg Asn Glu 385 390 395 400 Val Val Val Glu Ala Leu Lys Arg Gly Leu Ala Leu Leu Gly Cys Gly 405 410 415 Lys Ser Ala Ile Arg Leu Ile Pro Pro Leu Ile Ile Ser Glu Glu Glu 420 425 430 Ala Lys Ile Gly Leu Asp Ile Phe Glu Glu Ala Ile Arg Val Val Ser 435 440 445 Glu Arg Tyr Gly Tyr Lys Ile His 450 455 <210>6 <211>35 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>6 atccgagctc caggccaaat gttaaagaaa tccca 35 <210>7 <211>34 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>7 aactgcagtg gagcaaagaa caggccgaat ttat 34

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例５で得られたプラスミドｐＰＦＯＡＴ３
の概要を示す図である。

【図２】実施例８で行った温度による活性の変化を示す
図である。

【図３】実施例９で行ったｐＨによる活性の変化を示す
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA07 BA10 CA04 DA05 DA06 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 4B050 CC01 CC03 DD02 FF10 FF12 LL01 LL05 4B065 AA01Y AA26X AB01 BA01 CA16 CA27 CA44 CA47

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】９０℃以上の温度条件下においてω−アミ
   ノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
2. 【請求項２】モノマーとしての分子量が約５２，０００
   であって、ホモテトラマーのサブユニット構造を有し、
   至適ｐＨが７から９であることを特徴とする、請求項１
   記載の蛋白質。
3. 【請求項３】配列番号１の塩基配列によってコードされ
   る蛋白質、又はその一部のアミノ酸配列が欠失し、一部
   のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換され、他のア
   ミノ酸残基が挿入され、若しくは他のアミノ酸残基が付
   加された蛋白質であることを特徴とする請求項１又は２
   に記載の蛋白質。
4. 【請求項４】パイロコッカス属微生物に由来する他の蛋
   白質を実質的に含まないことを特徴とする、請求項１〜
   ３いずれかに記載の蛋白質。
5. 【請求項５】配列番号１の塩基配列、又は配列番号１の
   塩基配列の一部からなるＤＮＡを含む染色体外増殖性Ｄ
   ＮＡであって、適切な宿主細胞に導入することにより請
   求項１〜４いずれかに記載の蛋白質を生産し得る環状Ｄ
   ＮＡ。
6. 【請求項６】請求項５に記載のＤＮＡによって形質転換
   された宿主細胞。
7. 【請求項７】大腸菌Ｋ１２株又はその誘導体であること
   を特徴とする、請求項６に記載の宿主細胞。