JP2007143566A - タンパク質融合による切頭型耐熱性dnaポリメラーゼの過発現及び精製 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 DNA組み換え及びタンパク質融合技術を用いてBst DNAポリメラーゼから3′→5′エキソヌクレアーゼ活性を除去することによって、耐熱性の切頭型Bst DNAポリメラーゼを得る。
【選択図】なし
Description
1. Bst DNAポリメラーゼIをBacillus stearothermophilusから精製する。この生物は好熱菌であって、増殖温度範囲は45℃〜70℃である。細胞増殖後、以下のような複数ステッププロセスを用いてBst DNAポリメラーゼIを精製する。まず、細胞を緩衝液A(20mM KPO4緩衝液,pH6.5;1mM EDTA;10mM β−メルカプトエタノール)中に懸濁させ、超音波処理し、遠心分離にかける。KPO4濃度は上清中200mMに調整し、次いで上清を、DEAEセファロースカラムのような核酸に対して高い親和性を示すカラムに通す。上清溶液中に存在する核酸はDEAEに結合するため、核酸はKPO4塩濃度200mMでカラムを素通りするタンパク質と分離される。素通りしたタンパク質をヘパリンセファロースカラムに添加する。カラムを洗浄し、DNAポリメラーゼ酵素活性を緩衝液A中0→0.7M KClのような直線勾配で溶離する。緩衝液B(20mM トリス−HCl,pH7.4;0.5mM EDTA;10mM β−メルカプトエタノール)中でピークDNAポリメラーゼ活性を透析し、Q−セファロースカラムに添加する。酵素活性を緩衝液B中0.025→1M KClのような直線勾配で溶離する。再度、DNAポリメラーゼのピーク活性を透析し、ヘパリンTsk1カラム(Toso Haas)に添加する。酵素を、緩衝液B中0.025→1M KCl直線勾配で溶離する。この段階での酵素純度は約95%である(図1)。
2. ステップ1で得たBst Pol I酵素を、Matsudaira, J. Biol. Chem. 262:10035−10038(1987)の手順に従って電気泳動及びエレクトロブロッティングに付す。上記文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする。膜をクーマシーブルーR−250で染色し、90kDaの主タンパク質バンドを切り出し、Waite−Rees等, J. Bacteriol., 173:5207−5219(1991)の手順に従って連続的に分解させた。上記文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする。90kDaタンパク質の最初の21残基はMet−Lys−Lys−Lys−Leu−Val−Leu−Ile−Asp−Gly−Asn−Ser−Val−Ala−Tyr−Arg−Ala−Phe−Phe−Ala−Leu(配列番号3)である。Bst Pol I遺伝子のE.coli内へのクローニング及び発現を行うために、制限酵素(XbaI)クローニング部位及びリボソーム結合部位を含む縮重プライマー(プライマーA)をアミノ酸配列に基づいて作製する。
3. Bst Pol I遺伝子がPCRによって直接クローニングされ得るように3’末端ヌクレオチド配列を決定するために、NgoMI及びSau3AIで切断/自己連結したB. stearothermophilusゲノムDNA鋳型から逆PCR産物を増幅させる。NgoMIで消化、自己連結したBst DNAを鋳型として使用した反応では、寸法が約0.95kbの断片が得られる。Sau3AIで消化、自己連結したBst DNAを鋳型として使用した反応では、寸法が約1.5kbの断片が得られる。0.95kb及び1.5kbの2つの増幅DNAバンドをアガロースゲルから切り出し、直接DNAの配列決定に付す。終結コドン(TAA)がNgoMIで消化/自己連結した配列中180塩基対に見出され、これはBst DNAポリメラーゼI遺伝子の終結コドンであると考えられる。Bst Pol I遺伝子の3’末端にアニーリングする、NotIクローニング部位を含む他のプライマー(プライマーB)を作製する。
4. PCR反応を実施すると、予測される2.6kbバンドがアガロースゲル上で観察される。ゲルから2.6kb断片を精製し、次いでNotI及びXbaIで消化し、NotI/XbaIで消化したpET−21aベクター(Novagen, Madison, Wisconsin)内にクローニングする。Bst Pol I遺伝子を含む組換えプラスミドをER2169コンピテント細胞(New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)内に形質転換する。65℃で耐熱性のDNAポリメラーゼ活性(約30,000u/g宿主細胞)が中温好性E. coli宿主で観察され、このことはBst Pol I遺伝子のクローニング及び発現に成功したことを示している。中断のない2631bpの読み取り枠(ORF)に相当する全Bst Pol I遺伝子のヌクレオチド配列を決定する(図2A、2B、2C)。2631bp遺伝子は分子量計算値99,007.67の876アミノ酸タンパク質をコードし、この分子量は10→20%ポリアクリルアミド勾配ゲル上で観察された約97kDaの分子量と一致する(図1)。
5. Bst DNAポリメラーゼIをプロテアーゼズブチリシンで消化すると、Bst大断片(Bst L.F.)が産生されることが観察された。Bst L.F.は5’→3’エキソヌクレアーゼドメインの欠如した切頭型ポリメラーゼであり、DNAの配列分析で非常に有用な酵素である(Ye及びHong, Scientia Sinica, 30:503−506(1987)、同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする)。ズブチリシンを使用してBst L.F.を産生することができるが、ズブチリシンによってBstポリメラーゼの非特異的分解が生じるために有効性は低い。本発明によれば、Bst L.F.を5’末端に欠失を有するBst Pol I遺伝子から直接産生する方がズブチリシン消化よりも効果的であり、これによりDNAの配列決定や鎖置換増幅法(Walker等、上掲)のような用途でのBst L.F.の実用性が高くなる。しかしながら、Bst L.F.のクローニング及び発現のための独創的な実験は失敗した。転写されるmRNA、又は切頭型遺伝子から翻訳されるタンパク質はin vivoで不安定であると考えられる。更には、Bst大断片はE. coli宿主に対して非常に致死的であり、ポリメラーゼ活性が低いか又はポリメラーゼ活性を持たない変異体だけが選択されたと考えられる。このような問題を克服するために、MBP−Bst L.F.融合タンパク質を産生することによって転写mRNAを安定化させるか又はより安定したもしくはほとんど致死的ではない翻訳タンパク質を製造することを期待して、5’末端切頭型Bst Pol I遺伝子をpMAL−c2ベクター内にクローニングした。
7. ステップ6の上清を(実施例VIで詳述する)アミロース親和性カラムに添加する。核酸及び他の全ての宿主細胞タンパク質(MBP−Bst融合タンパク質は除く)をカラムに通し、カラムをカラム容量の数倍の緩衝液C(200mM NaCl;20mMトリス−HCl,pH7.4;1mM EDTA;1mM DTT)で洗浄して除去する。MBP−Bst L.F.融合タンパク質を緩衝液C中の10mMマルトースで溶離する。溶離した融合タンパク質をS−100サイズ排除カラムで更に精製して、遊離MBPを排除する。
8. 精製したMBP−Bst融合タンパク質を因子Xaプロテアーゼ(New England Biolabs #800−10)で切断することができる。因子Xaの切断後、110kDaのMBP−Bst L.F.融合タンパク質が分解し、予想される67kDaのBst L.F.及び40kDaのMBPが得られた(図3)。MBP−Bst L.F.融合タンパク質及び因子Xaで切断したBst L.F.は共に活性を有するが、因子Xaで切断したBst L.F.(45,300u/mg)は融合タンパク質(6,300u/mg)の約7倍の比活性を有する。融合体の比活性が低いために、MBP−Bst融合タンパク質中の耐中温性MBPが65℃で熱変性を起こし得る。切断したBst L.F.は耐熱性があり比活性もより高いので、産生のための好ましい酵素となるはずである。
9. 因子Xa及び切断した遊離MBPを除去するために、65℃で20分間インキュベートして因子Xa消化体に熱負荷を加え、次いで緩衝液E(50mM NaCl;20mM トリス−HCl pH7.8;0.1mM EDTA;1mM DTT)に平衡化したSource−Q(Pharmacia Biotech)カラムに添加する。酵素を緩衝液D中50mM→600mM NaClの直線勾配で溶離する。Bst L.F.を7倍容量の緩衝液F(20mM KPO4,pH6.9;0.1mM EDTA;1mM DTT)で希釈し、緩衝液G(50mM NaCl, 20mM KPO4,pH6.9;0.1mM EDTA;1mM DTT)に平衡化した1cm×10cmのヘパリン−TSK 5PWガード樹脂カラムに添加する。酵素を緩衝液F中50mM→600mM NaClの直線勾配で溶離する。酵素含有画分をSDS−PAGEで調べると、予想分子量が67,000で純度が90%以上であることが判明した(図4)。この組換えBst L.F.の比活性は100,800u/mgである。
10. エキソヌクレアーゼ活性アッセイを実施して、本発明のBst DNAポリメラーゼIと関連するエキソヌクレアーゼ活性の方向性を決定する。5’−32P及び3’−3H末端ラベルを用いて線状PUC19 DNA基質を調製し、BstポリメラーゼIと共に、また対照としてVent、E. coli Pol I及びTaq DNAポリメラーゼを用いてインキュベートする間の2つのラベルの可溶化を監視する。Ventは3’→5’エキソヌクレアーゼを有し、結果として3Hラベルを可溶化する。Taqは5’→3’エキソヌクレアーゼを有し、従って32Pラベルを可溶化する。E. coli Pol Iは5’→3’及び3’→5’の両方のエキソヌクレアーゼを有し、従ってE. coli Pol Iと共にインキュベートする間に32P及び3Hの両方のラベルが可溶化する。Bst Pol Iと共にインキュベートすると、Taqと同様に32Pラベルだけが可溶化し、このことはBst Pol Iが5’→3’エキソヌクレアーゼを有するが、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性は欠如していることを示している(図5)。配列データは、Bst Pol Iが3’→5’エキソヌクレアーゼドメイン中に「DXE」exoIモチーフを持たないことを示しており、これは本発明のエキソヌクレアーゼアッセイデータと一致していた。
B.stearothermophilus DNAポリメラーゼI遺伝子のクローニング
1.逆(inverse)PCRを用いてのBst Pol I遺伝子の3′末端の決定
1反応当たり1.2μgのB. stearothermophilusゲノムDNAを用いて、複数の個別管内で制限消化を行なった。前記DNAを45μlのNEBuffer Sau3AI(New England Biolabs NEBuffer Sau3AI=100mM NaCl、10mMビストリスプロパン−HCl、10mM MgCl2、1mMジチオトレイトール;pH7.0@25℃)に加えた混合物に、50UのSau3AI(New England Biolabs, #169)を添加した。前記DNAを45μlのNEBuffer 4(New England Biolabs NEBuffer 4=50mM酢酸カリウム、20mMトリス−酢酸塩、10mM酢酸マグネシウム、1mMジチオトレイトール;pH7.9@25℃)に加えた混合物には、50UのNgoMI(New England Biolabs, #564)を添加した。Sau3AI反応混合物には100μg/mlのBSAを含有させた。いずれの反応混合物も最終体積を50μlとした。両消化物を37℃で1時間インキュベートした。消化物から制限酵素を、フェノール(1回)及びクロロホルム(2回)での抽出によって除去した。各消化物に5μlの3M酢酸ナトリウム及び100μlの95%エタノール/5%イソプロパノールを添加することによってDNAを沈澱させ、これを遠心によって回収した。DNAを個別管内で500μlのT4 DNAリガーゼ緩衝液(New England Biolabs T4 DNAリガーゼ緩衝液=50mMトリス−HCl pH7.8、10mM MgCl2、10mMジチオトレイトール、1mM ATP、25μg/μl BSA)中に再懸濁させ、3,000UのT4 DNAリガーゼ(New England Biolabs, #202)を添加した。両連結反応混合物を16℃で一晩、次いで72℃で20分間インキュベートした。
2μgのBst DNAポリメラーゼIをトリス−トリシン10→20%勾配ポリアクリルアミドゲル(Novex, San Diego, California)上での電気泳動に掛け、電気ブロット(electroblot)した(Matsudaira, J. Biol. Chem. 262, pp.10035−10038, 1987; この開示は本明細書中に参考として含まれる)。膜をクーマシーブルーR−250で染色し、約97kDaのタンパク質のバンドを切り取り、連続的に分解(sequential degradation)した(Waite−Rees等, J. Bacteriol. 173, pp.5207−5219, 1992; この開示は本明細書中に参考として含まれる)。97kDaタンパク質の最初の7残基はMet−Lys−Lys−Lys−Leu−Val−Leu(配列番号7)に対応した。プライマーは、Bst DNAポリメラーゼIのN末端アミノ酸配列[5′WTGAARAARAARCTNGTNYT3′(配列番号8)]と、逆PCRから得られた遺伝子の3′末端の配列[5′TCTTATTTNGCATCATACCATGT3′(配列番号9)]とに基づき設計した。150ngのBstゲノムDNAと、100pmolの各プライマーと、200μM dNTPとを98μlのThermoPol緩衝液に添加した。1μl(5U)のTaq DNAポリメラーゼ及び1μl(0.05U)のDeep Vent DNAポリメラーゼ(New England Biolabs, #258)を添加してPCR反応(94℃で0.5分間、45℃で1分間及び72℃で3分間のサイクル35回)を開始させた。15μlを取り分け、エチジウムブロミド存在下でのアガロースゲル電気泳動に掛けた。Bst DNAポリメラーゼI遺伝子の予測される大きさに対応する2.6kbの断片が増幅された。残りの85μlを、エチジウムブロミド存在下にTAE緩衝液中の1%低温融解アガロースゲル上で行なうゲル電気泳動に掛け、2.6kb断片を切り取った。DNAを含有する切片をβ−アガロースIで処理し、フェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール及び酢酸ナトリウムで沈澱させ、これらの操作はいずれも先に述べたように行なった。DNAペレットをTE緩衝液中に再懸濁させた。2.6kb断片の制限マッピングを行なって、完全な断片のベクター中へのクローニングを可能にするプライマーの設計がそれによって可能となる単一の制限部位の存在を確認した。NcoI、NotI及びXbaIがDNA断片を切断しなかったので、断片の3′末端にアニールする、NcoI及びNotI部位を有する第一のプライマー[5′TCCATGGCGGCCGCTCTTATTTNGCATCATACCATGT3′(配列番号10)]と、断片の5′末端にアニールする、XbaI部位を有する第二のプライマー[5′ATTCTAGAGGAAACAGACCWTGAARAARAARCTNGTNYT3′(配列番号11)]との二つのプライマーを設計した。2.6kb断片の増幅に用いたのとまさに同じ条件下に、ただし本来のプライマーを上記制限酵素部位を有するプライマーに置き換えてPCR反応を生起させた。総量600μlのPCR反応混合物を収容した同等の管を6本用いた。
Bst大断片をコードする5′末端切頭型Bst Pol I遺伝子のクローニング
1.Bst L. F.のN末端境界(border)のズブチリシンでの解明
50μgのBst DNAポリメラーゼIを、140mM K2PO4、3mM β−メルカプトエタノール、30mM硫酸アンモニウム、及び125μgの仔ウシ胸腺DNAの存在下に室温で5分間ズブチリシン(最終濃度75ng/μl)で消化した。フェニルメチルスルホニルフルオリドを2.4mg/mlの最終濃度で添加することによって消化を停止した。得られたズブチリシン消化Bst L. F.を4→20%勾配SDS−PAGEゲル(Daiichi Integrated Separation Systems, Natick, Massachusetts)上での電気泳動によって定量した。2μgのズブチリシン消化BstポリメラーゼIを、トリス−トリシン10→20%勾配ポリアクリルアミドゲル(Novex, San Diego, California)上での電気泳動に掛け、電気ブロットした(Matsudaira, J. Biol. Chem. 262, pp.10035−10038, 1987; この開示は本明細書中に参考として含まれる)。この67kDa大断片のN末端アミノ酸配列を先に述べたように決定した。67kDaタンパク質の最初の7残基はAla−Glu−Gly−Glu−Lys−Pro−Leu(配列番号12)に対応し、このことはBst L. F.のN末端境界がAla289とAla290との間であることを示している(図2)。この情報に基づき、Bst L. F.の境界の下流にアニールするプライマー[5′AATTTGCGCAGAAGGGGAGAAACCGCTTGA3′(配列番号13)]を設計した。このプライマーはFspI切断部位を有するように設計したので、FspIで消化してpMAL−c2ベクターのXmnI部位に連結させることができた。Bst Pol I遺伝子の3′末端にアニールする、XbaI切断部位を有する別のプライマー[5′TATTCTAGATCTTATTTGGCATCATACCATGT3′(配列番号14)]も設計した。
Bst DNAポリメラーゼ大断片の精製
ステップ5以外、いずれのステップも4℃で実施した。
ステップ1: 粗抽出物の調製
64gの酵素保持(bearing)細胞(NEB #956)を解凍し、緩衝液C(200mM NaCl、20mMトリス−HCl pH7.4、1mM EDTA、1mM DTT)中に再懸濁させた。細胞を8分間の音波処理によって破壊した。抽出物を4℃において、Beckman J2−21遠心機で12,000rpmで30分間遠心した。デカンテーションによって上清を分離した。
ステップ2:アミロースアフィニティークロマトグラフィー
ステップ1で得た上清を、緩衝液Cで平衡させた200ml容アミロース(NEB #800−21)カラムに添加した。カラムを2,200mlの緩衝液Cで洗浄し、10mMのマルトースを含有する緩衝液C 800mlで酵素を溶離した。タンパク質ピーク画分をプールし、緩衝液D(500mM NaCl、20mMトリス−HCl pH7.4、0.1mM EDTA、1mM DTT、50%グリセロール)中への透析で濃縮した。
ステップ3: S−100サイズ排除クロマトグラフィー
前ステップで得られた貯溜物を、緩衝液Dで平衡させた5cm×90cm S−100(Pharmacia Biotech., Piscataway, New Jersey)カラムに添加した。2,000mlのS緩衝液の添加によって酵素を溶離した。酵素含有画分をSDS−PAGEによって確認し、プールし、緩衝液E(50mM NaCl、20mMトリス−HCl pH7.8、0.1mM EDTA、1mM DTT)中へ透析した。
ステップ4: Xa因子プロテアーゼによる融合タンパク質の切断
前ステップで得られた酵素200mg(150ml中)を2mgのXa因子(New England Biolabs #800−10)と共に4℃で22時間インキュベートした。
ステップ5: Xa因子への熱負荷付与(heat−stressing)
ステップ4で得られた切断生成物150mlに、65℃で20分間のインキュベーションと、続く4℃への冷却とによって熱負荷を付与した。
ステップ6: Source−Qイオン交換クロマトグラフィー
前ステップで得られた貯溜物を、緩衝液Eで平衡させた1.6cm×10cm Source−Q(Pharmacia Biotech., Piscataway, New Jersey)カラムに添加した。上記と同じ緩衝液中で、150mlの50→600mM直線勾配NaClで酵素を溶離した。酵素含有画分をSDS−PAGEで確認し、プールした。
ステップ7:ヘパリン−TSK 5PWガードレジンカラムクロマトグラフィー
前ステップで得られた貯溜物を7倍容量の20mM KPO4(pH6.9)、0.1mM EDTA、1mM DTTで稀釈し、緩衝液G(50mM NaCl、20mM KPO4 pH6.9、0.1mM EDTA、1mM DTT)で平衡させた1cm×10cmヘパリン−TSK 5PWガードレジンカラムに添加した。H緩衝液中で、100mlの50→600mM直線勾配NaClで酵素を溶離した。酵素含有画分をSDS−PAGE(図4)で確認し、プールし、20倍容量の貯蔵緩衝液(50mM KCl、10mMトリス−HCl pH7.5、0.1mM EDTA、1mM DTT)に対して透析した。50μlの反応混合物中の1,000単位を最適反応条件下に4時間インキュベートして確認したところ、酵素調製物は実質的に純粋で、他の汚染酵素/タンパク質を含有せず、かつ検出可能なエキソヌクレアーゼ活性を有しなかった。
Claims (3)
- (a)(i)10%−20%のポリアクリルアミドゲル上で観察される97kDの分子量に対応する完全なBstI DNA ポリメラーゼをコードする単離されたDNAであって、当該単離されたDNAの発現産物が3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しており5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離されたDNA、および
(ii)ゲル電気泳動で測定される67kDの大きさを有する精製されたBstI DNAポリメラーゼ大断片に対応する発現産物をコードする単離されたDNAであって、当該発現産物が完全なBstIポリメラーゼに存在する5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しており、当該発現産物が鎖置換活性を有することを特徴とする単離されたDNAから成る群より選択されるDNAと融合DNAを形成する工程、
(b)工程(a)のDNAをクローニングベクターに挿入する工程、
(c)工程(b)のベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
(d)工程(c)の宿主細胞を発現に適した条件下で培養する工程、および
(e)BstIポリメラーゼを回収する工程
を含む、ゲル電気泳動で測定された67kDの大きさを有する組換えBstI DNA ポリメラーゼ大断片を製造する方法。 - 工程(e)が、組換えBstIポリメラーゼおよび融合パートナーを含む融合タンパク質を単離する工程を更に含む請求項1に記載の方法。
- 融合パートナーがマルトース結合タンパク質を含む請求項2に記載の方法。
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