CN116096919A - 确定人类样本中预定的核酸序列存在的等温实时pcr方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于确定样本中预定的核酸序列的存在的方法，所述方法包括以下步骤：向待分析是否存在预定的核酸序列的样本中添加一种或多种提供RNA‑和/或DNA‑依赖性DNA聚合酶活性与链置换活性的活性的酶；向待分析是否存在预定的核酸序列的样本中添加至少五种DNA引物，其中，至少一种DNA引物包含与核酸序列可杂交的序列并且至少一种DNA引物包含与与核酸序列反向互补的DNA序列可杂交的序列；在固定温度孵育得到的样本；确定样本中是否存在延长的DNA序列，其中，样本中延长的DNA序列的存在表示样本中预定的核酸序列的存在，其中，所述样本从人类受试者获得，并且其中未使用F3引物。

Description

确定人类样本中预定的核酸序列存在的等温实时PCR方法
本发明涉及一种用于确定样本中预定的核酸序列的存在的方法，所述方法包括以下步骤：向待分析是否存在预定的核酸序列的样本中添加一种或多种提供RNA-依赖性和/或DNA-依赖性DNA聚合酶活性与链置换活性的活性的酶；向待分析是否存在预定的核酸序列的样本中添加至少五种DNA引物，其中，至少一种DNA引物包含与核酸序列可杂交的序列并且至少一种DNA引物包含与与核酸序列反向互补的DNA序列可杂交的序列；在固定温度孵育得到的样本；确定样本中是否存在延长的DNA序列，其中，样本中延长的DNA序列的存在表示样本中预定的核酸序列的存在，其中，所述样本从人类受试者获得，并且其中未使用F3引物。
存在各种方法来确定从人类受试者获得的样本中是否存在核酸序列。大多数方法依赖于与预定的序列可杂交的核酸分子，例如预期存在于病原体中的序列。
然而，现有的测试是高度特异性的或者快速提供缺乏适当可靠性的结果。因此，本领域需要一种提供高度特异性的和快速的结果的方法。
上述技术问题由本文所提供的实施方案解决并且如权利要求中所表征。
因此，本发明尤其涉及以下实施方案。
1.一种用于确定样本中预定的核酸序列的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)向待分析是否存在预定的核酸序列的样本中添加一种或多种提供RNA-和/或DNA-依赖性DNA聚合酶活性与链置换活性的活性的酶；
(b)向待分析是否存在预定的核酸序列的所述样本中添加至少五种DNA引物，其中，至少一种DNA引物包含与所述核酸序列可杂交的序列并且至少一种DNA引物包含与与所述核酸序列反向互补的DNA序列可杂交的序列；
(c)在固定温度孵育步骤(a)和(b)得到的所述样本；
(d)确定所述样本中是否存在延长的DNA序列，
其中，所述样本中所述延长的DNA序列的存在表示所述样本中所述预定的核酸序列的存在，
其中，所述样本从人类受试者获得，并且其中未使用F3引物。
2.根据实施方案1所述的方法，其中，所述至少五种引物中的四种分别为正向内引物(forward inner primer，FIP)、反向内引物(backward inner primer，BIP)、正向环引物(loop primer forward，LPF)和反向环引物(loop primer backward，LPB)。
3.根据实施方案1和2所述的方法，其中，第五种引物为B3引物。
4.根据实施方案1至3中任一项所述的方法，其中，所述预定的核酸序列为RNA序列或DNA序列。
5.根据实施方案1至4中任一项所述的方法，其中，预定的RNA或DNA序列包含在病原体中。
6.根据实施方案5所述的方法，其中，所述病原体为病毒、细菌、真菌或寄生物(parasite)。
7.根据实施方案6所述的方法，其中，所述病原体为人类疱疹病毒或支原体属的细菌。
8.根据实施方案1至7中任一项所述的方法，其中，所述固定温度在50℃和75℃之间。
9.根据实施方案1至8中任一项所述的方法，其中，将步骤(c)中的所述样本孵育1分钟至120分钟。
10.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中，通过使用与所述双链延长的DNA序列可杂交的核酸分子，特别地，其中所述核酸分子被标记，使用嵌入所述双链延长的DNA序列的分子或使用浊度测量来确定所述样本中所述双链延长的DNA序列的存在。
11.一种用于治疗病原体的感染的抗感染组合物，其中，所述受试者先前已通过使用根据实施方案1至10中任一项所述的方法被确定为被所述病原体感染。
12.根据实施方案11使用的所述抗感染组合物，其中，所述病原体为病毒、细菌、真菌或寄生物。
13.根据实施方案11或12使用的所述抗感染组合物，其中，所述抗感染组合物分别包括抗病毒药、抗生素、抗真菌药或抗寄生物药。
14.根据实施方案12至13中任一项使用的所述抗感染组合物，其中，所述病原体为人类疱疹病毒或支原体属的细菌。
因此，在第一方面，本发明涉及一种用于确定样本中预定的核酸序列的存在的方法，所述方法包括以下步骤：向待分析是否存在预定的核酸序列的样本中添加一种或多种提供RNA-和/或DNA-依赖性DNA聚合酶活性与链置换活性的活性的酶；向待分析是否存在预定的核酸序列的样本中添加至少五种DNA引物，其中，至少一种DNA引物包含与核酸序列可杂交的序列并且至少一种DNA引物包含与与该核酸序列反向互补的DNA序列可杂交的序列；在固定温度孵育得到的样本；确定样本中是否存在双链延长的DNA序列，其中，样本中双链延长的DNA序列的存在表示样本中预定的核酸序列的存在，其中，所述样本从人类受试者获得，并且其中未使用F3引物。
如本文所使用的术语“预定的核酸序列”是指核酸序列，优选RNA序列或DNA序列，其中，本领域技术人员知晓它可以包含在从人类受试者获得的样本(例如，组织样本、支气管肺泡灌洗液、支气管冲洗液、咽渗出物、气管抽吸物、血液、血清、血浆、骨、皮肤、软组织、肠道样品、生殖道样品、母乳、淋巴、脑脊液、胸膜液、痰、尿、鼻分泌物、眼泪、胆汁、腹水、脓液、滑液、玻璃体液、阴道分泌物、精液和/或尿道组织)中。特别地，本发明中预定的核酸序列为使用本发明的方法可检测的序列。换言之，如果本领域技术人员能够使用本文所提供的方法确定序列是否可能在从人类受试者获得的样本中被检测到，那么本领域技术人员可获得的核酸序列是预定的。在本发明中，该预定的核酸序列包含至少一个引物结合位点，该至少一个引物结合位点与本发明的方法中使用的至少一种引物至少部分相同。如果序列完全相同或如果它们的不同之处仅在于一个序列包含尿嘧啶而非胸腺嘧啶和/或如果它们的不同之处仅在于一个序列包含一个或多个修饰的核苷酸而非各自的非修饰的核苷酸，那么引物结合位点被认为与引物位点相同。
如本文所使用的术语“DNA引物”或“引物”是指包含3’端-羟基的核酸分子，其在与互补核酸序列杂交时，可以例如通过酶催化的核酸复制反应伸长。根据本发明的引物对用于核酸的扩增，即用于LAMP分析或RT-LAMP分析。引物的长度的上限和下限均根据经验确定。本文所描述的引物可以是正向引物或反向引物。如本文所使用的术语“反向引物”是指一种引物，其引发DNA序列的反义链以使得聚合酶沿DNA序列的互补链在一个方向上延伸。至少一条反向引物也可作为用于逆转录的RT引物。如本文所使用的术语“正向引物”是指一种引物，其引发DNA序列的有义链以使得聚合酶沿DNA序列的一条链在一个方向上延伸。
一种提供RNA-和/或DNA-依赖性DNA聚合酶活性的活性的酶可以基于由DNA链或RNA链组成的模板以5′→3′方向合成DNA。如本领域技术人员所知晓的，这种酶将连续向模板的游离3′-羟基添加核苷酸。在这方面，模板链基于Watson-Crick碱基配对确定添加的核苷酸的序列。DNA聚合酶的活性可以是RNA-和/或DNA-依赖性的。示例性的聚合酶包括但不限于Bst DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Vent(外部-)DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Deep Vent(外部-)DNA聚合酶、Bca(外部-)DNA聚合酶、DNA聚合酶I Klenow片段、Φ29噬菌体DNA聚合酶、Z-TaqTM DNA聚合酶、嗜热性(ThermoPhi)聚合酶、9°Nm DNA聚合酶和KOD DNA聚合酶。例如，参见U.S.专利号5,814,506、5,210,036、5,500,363、5,352,778和5,834,285；Nishioka,M.,et al.(2001)J.Biotechnol.88,141；Takagi,M.,et al.(1997)Appl.Environ.Microbiol.63,4504。
作为提供RNA-依赖性DNA聚合酶活性的活性的酶，可以采用任何合适的逆转录酶。在这方面，待使用的酶没有被特别限制，条件是它具有使用RNA作为模板以合成cDNA的活性。此外，可以添加提高核酸扩增酶的耐热性的物质，如海藻糖。
当在本说明书中简单地表述为“5'-端侧”或“3'-端侧”时，其表示在所有情况下都被视为模板的链中的方向。此外，当描述3'-端侧成为互补链合成的起点时，其表示3'-端侧-羟基为互补链合成的起点。
如本文所使用的术语“链置换”是指在引物引发的合成过程中，酶分离双链的DNA分子和/或双链的RNA分子中的DNA链和/或RNA链的能力。
如本文所使用的术语“杂交”是指互补的核酸分子的退火。当两个核酸彼此“杂交”时，或者当一个核酸与另一个核酸“杂交”时，这两个核酸分子表现出足够数量的互补核碱基，使得这两个核酸分子可以在用于特定的反应的特定条件(例如，温度、盐和其它缓冲条件)下彼此退火。最常见的杂交的机制涉及核酸分子的互补核碱基之间的氢键合(例如，Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键合)。杂交可以在不同条件下发生。严格条件是序列依赖性的并且由待杂交的核酸分子的性质和组成确定。核酸杂交技术和条件是本领域技术人员已知的并且已经被广泛描述。例如参见Sambrook et al,MolecularCloning:A Laboratory Manual 2nd ed.；Cold Spring Harbor Press,1989；Ausubel etal,1987,Current Protocols in Molecular Biology；Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York；Tijessen,1993,Hybridization with Nucleic Acid Probes,Elsevier Science Publishers,B.V.；以及Kricka,1992,Non-Isotopic DNA ProbeTechniques,Academic Press,San Diego,California。
如本文所使用的术语“F3”是指引物对的外部正向引物。
在本发明中，令人意外地发现其中省略了F3引物的五引物系统在检测预定的核酸序列中是最有效的。如本文所使用的“最有效的”是指检测与通常使用的技术一样快速和灵敏，但保持了可靠性，这是用于检测核酸(如来源于人类疱疹病毒或支原体属的细菌的核酸)的测试的先决条件。此外，发现通过使用五种引物代替标准LAMP技术中的六种引物，可以检测到较短的靶序列。
本发明提供了包含预定的核酸序列的样本，以及用于扩增核酸的方法，该方法包括：在其中存在至少一种本发明的引物的反应系统中实施样本中的预定的核酸序列的扩增反应。在本发明的某些实施方案中，至少一类(species)引物用于本发明的核酸扩增反应。换言之，本文所描述的DNA引物可以与其它引物联合使用，或者可以使用本文所描述的两类DNA引物。
在本发明的方法中优选的是，使用五种DNA引物。
在一些实施方案中，本发明中采用的至少两种引物是环引物。
如本文所使用的术语“环引物”是指一种DNA引物，其包含与预定的RNA序列的扩增产物的至少一个环区可杂交的序列。该环区是通过扩增产物链退火至自身形成的。通常，环引物与生成的DNA序列杂交，并且为进一步DNA延伸过程的启动提供增加的数量的起点。环引物的使用可以加速扩增过程。
在本发明中优选的是，至少五种引物分别包括正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向环引物(LPF)和反向环引物(LPB)。
如本文所使用的术语“FIP”或“正向内引物”是指包含用于链引发的序列和与相同的FIP引发的链可杂交的序列的正向引物。
如本文所使用的术语“BIP”或“反向内引物”是指包含用于链引发的序列和与相同的BIP引发的链可杂交的序列的反向引物。
如本文所使用的术语“正向环引物”或“LPF”是指作为正向引物的环引物。
如本文所使用的术语“反向环引物”或“LPB”是指作为反向引物的环引物。
优选地，该至少五种引物还包括B3引物。
如本文所使用的术语“B3”是指引物对的外部反向引物。
本文所描述的特异性结合至靶核酸或其互补序列的DNA引物的长度可以是至少10、15或18个核苷酸，B3的长度是至少10、15、17或18个核苷酸，FIP和BIP的长度是至少25、30、33或36个核苷酸，以及LPF和LPB的长度是至少10、15、17或18个核苷酸。特异性结合至靶核酸序列的DNA引物可以具有与对应区域至少80％的互补性的核酸序列，特别是90％的互补性，更特别是95％、96％、97％、98％、99％或100％的互补性。
这些术语常用于与环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)方法相关的方法，如由Nagamine et al.2002.Molecular andCellular Probes 16.223-229所描述的那些。
在本发明的方法中，未使用F3引物，因此优选第五种引物为B3引物。这是因为发明人意外地发现，在存在B3引物但不存在F3引物的情况下，检测既快又灵敏。使用本发明的方法，观察到检测在10分钟内是可能的，并且对检测样本中少量的预定的RNA序列是灵敏的(图1)。换言之，如所附实施例中所示的，使用五种引物，特别是FIP、BIP、LPF、LPB和B3，在添加引物和酶之后10分钟内实现了支原体属的细菌的16S rRNA的预定的RNA序列的阳性检测(图1)。使用五种引物，特别是FIP、BIP、LPF、LPB和B3，在添加引物和酶之后10分钟内实现了人类疱疹病毒的预定的DNA序列的阳性检测(图2)。因此，本发明的方法第一次提供了检测感染的可靠和快速的方式，这对于例如控制感染的大规模流行爆发是重要的。
在本发明的方法中，使用了一种或多种提供RNA-和/或DNA-依赖性DNA聚合酶活性与链置换活性的活性的酶。换言之，在RNA序列的情况下，所有三种活性都要添加到待分析的RNA序列中。在DNA序列的情况下，不需要RNA-依赖性DNA聚合酶的活性。活性可以由一种具有全部两种/三种活性的酶提供，或者由若干种各自具有两种/三种活性中的一种或多种的酶提供。
优选地，预定的核酸序列为RNA序列或DNA序列。
在一些实施方案中，优选的是，所述预定的RNA序列或DNA序列包含在病原体中。换言之，本文所提供的方法用于检测从人类受试者获得的样本中病原体的核酸序列的存在。因此，本发明尤其涉及一种用于诊断人类受试者是否患有或可能患有由病原体引起的疾病的方法，其中，使用本文所提供的方法确定所述病原体的核酸序列的存在。
在一些实施方案中，所述病原体为病毒、细菌、真菌或寄生物。
如本文所使用的术语“病毒”是指一种只在生物体的活细胞内复制的传染物(infectious agent)。任何包含龄期(stadium)(例如在细胞内或在病毒包膜内)的核酸均可以通过本发明测定。在一些实施方案中，本发明的方法用于确定属的至少一种病毒的预定的核酸序列的存在，所述属选自由以下组成的组：腺病毒科(Adenoviridae)、指环病毒科(Anelloviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、星状病毒科(Astroviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、布尼亚病毒(Bunyavirus)、杯状病毒科(Caliciviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、小RNA病毒科(Picornaviridae)、肺泡病毒科(Pneumoviridae)、多瘤病毒科(Polyomaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、弹状病毒(Rhabdovirus)以及披膜病毒科(Togaviridae)。
在一些实施方案中，本发明的方法用于确定来自属的至少一种细菌的预定的核酸序列的存在，所述属选自由以下组成的组：营养缺陷菌属(Abiotrophia)、无色杆菌属(Achromobacter)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、食酸菌属(Acidovorax)、不动杆菌属(Acinetobacter)、放线杆菌属(Actinobacillus)、放线棒菌属(Actinobaculum)、马杜拉放线菌属(Actinomadura)、放线菌属(Actinomyces)、气球菌属(Aerococcus)、气单胞菌属(Aeromonas)、阿菲波菌属(Afipia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、差异球菌属(Alloiococcus)、交替单胞菌属(Alteromonas)、无枝酸菌属(Amycolata)、拟无枝菌酸菌属(Amycolatopsis)、厌氧螺菌属(Anaerobospirillum)、棍状厌氧菌(Anaerorhabdus)、“Anguillina”、蛛网菌属(Arachnia)、隐秘杆菌属(Arcanobacterium)、弓形杆菌属(Arcobacter)、节杆菌属(Arthrobacter)、奇异菌属(Atopobium)、金杆菌属(Aureobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、拟杆菌属(Bacteroides)、巴氏丝菌属(Balneatrix)、巴尔通氏体属(Bartonella)、伯杰菌属(Bergeyella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、嗜胆菌属(Bilophila)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、博德特菌属(Bordetella)、短螺旋体属(Brachyspira)、短芽胞杆菌属(Brevibacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、布鲁氏菌属(Brucella)、伯克氏菌属(Burkholderia)、布丘氏菌属(Buttiauxella)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、鞘杆菌属(Calymmatobacterium)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、二氧化碳噬纤维菌属(Capnocytophaga)、心杆菌属(Cardiobacterium)、卡托氏菌属(Catonella)、西地西菌属(Cedecea)、纤维菌属(Cellulomonas)、石胡荽菌属(Centipeda)、衣原体属(Chlamydia)、嗜衣原体属(Chlamydophila)、色杆菌属(Chromobacterium)、金黄杆菌属(Chyseobacterium)、金色单胞菌属(Chryseomonas)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、梭菌属(Clostridium)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、柯克斯氏体属(Coxiella)、短小杆菌属(Cryptobacterium)、代尔夫特菌属(Delftia)、皮杆菌属(Dermabacter)、嗜皮菌属(Dermatophilus)、脱硫单胞菌属(Desulfomonas)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、小类杆菌属(Dialister)、腐蹄杆菌属(Dichelobacter)、狡诈球菌属(Dolosicoccus)、狡诈菌属(Dolosigranulum)、爱德华菌属(Edwardsiella)、迟缓埃格特菌(Eggerthella)、埃里希氏体属(Ehrlichia)、艾肯菌属(Eikenella)、稳杆菌属(Empedobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、欧文氏菌属(Erwinia)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、真杆菌属(Eubacterium)、爱文氏菌属(Ewingella)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、费克蓝姆氏菌属(Facklamia)、产线菌属(Filifactor)、黄色单胞菌属(Flavimonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、Flexispira、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、加德纳菌属(Gardnerella)、孪生球菌属(Gemella)、球链菌属(Globicatella)、戈登氏菌属(Gordona)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、哈夫尼菌属(Hafnia)、螺杆菌属(Helicobacter)、盐球菌属(Helococcus)、霍德曼菌属(Holdemania)、不活动粒菌属(Ignavigranum)、约翰森氏菌属(Johnsonella)、金氏菌属(Kingella)、克雷伯菌属(Klebsiella)、考克氏菌属(Kocuria)、科泽氏菌属(Koserella)、库特氏菌属(Kurthia)、盖球菌属(Kytococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、口动菌属(Lautropia)、勒克氏菌属(Leclercia)、军团菌属(Legionella)、勒米诺菌属(Leminorella)、钩端螺旋体属(Leptospira)、纤毛菌属(Leptotrichia)、明串珠菌属(Leuconostoc)、李斯特菌属(Listeria)、利斯顿氏菌属(Listonella)、巨球形菌属(Megasphaera)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、微球菌属(Micrococcus)、光岗菌属(Mitsuokella)、动弯杆菌属(Mobiluncus)、米勒氏菌属(Moellerella)、摩拉克氏菌属(Moraxella)、摩根氏菌属(Morganella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、支原体(Mycoplasma)、类香味菌属(Myroides)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、诺卡氏菌属(Nocardia)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、卵黄杆菌属(Oeskovia)、寡源杆菌属(Oligella)、东方体属(Orientia)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、泛菌属(Pantoea)、副衣原体属(Parachlamydia)、巴氏杆菌属(Pasteurella)、片球菌属(Pediococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、发光杆菌属(Photobacterium)、光杆状菌属(Photorhabdus)、邻单胞菌属(Plesiomonas)、卟啉单胞菌属(Porphyrimonas)、普氏菌属(Prevotella)、丙酸菌属(Propionibacterium)、变形杆菌属(Proteus)、普罗维登斯菌属(Providencia)、假单孢菌属(Pseudomonas)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、假支杆菌属(Pseudoramibacter)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、拉恩氏菌属(Rahnella)、劳尔氏菌属(Ralstonia)、红球菌属(Rhodococcus)、立克次氏体属(Rickettsia)、罗卡利马氏体属(Rochalimaea)、玫瑰单胞菌属(Roseomonas)、罗氏菌属(Rothia)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、沙门氏菌属(Salmonella)、月形单胞菌属(Selenomonas)、小蛇菌属(Serpulina)、沙雷氏菌属(Serratia)、舍维内拉菌属(Shewenella)、志贺氏菌属(Shigella)、西门坎氏菌属(Simkania)、斯莱克氏菌属(Slackia)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、螺旋状菌属(Spirillum)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、口腔球菌属(Stomatococcus)、链杆菌属(Streptobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、萨特氏菌属(Sutterella)、萨顿氏菌属(Suttonella)、塔特姆氏菌属(Tatumella)、泰氏菌属(Tissierella)、特拉布斯氏菌属(Trabulsiella)、密螺旋体属(Treponema)、养障体属(Tropheryma)、卡氏镰刀菌属(Tsakamurella)、苏黎士菌属(Turicella)、脲原体属(Ureaplasma)、漫游球菌属(Vagococcus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、弧菌属(Vibrio)、威克氏菌属(Weeksella)、沃廉菌属(Wolinella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、致病杆菌属(Xenorhabdus)、耶尔森氏菌属(Yersinia)以及约克氏菌属(Yokenella)。
在一些实施方案中，本发明的方法用于确定属的至少一种真菌的预定的核酸序列的存在，所述属选自由以下组成的组：念珠菌属(Candida)、曲霉属(Aspergillus)、隐球菌属(Cryptococcus)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、肺囊虫属(Pneumocystis)和/或葡萄穗霉属(Stachybotrys)。
如本文所使用的术语“寄生物”是指在第二种生物体中或第二种生物体上存活的生物体。在一些实施方案中，本发明的方法用于确定来自属的至少一种寄生物的预定的核酸序列的存在，所述属选自由以下组成的组：体表寄生虫(Ectoparasite)、原生动物生物体和/或蠕虫(Helminth)，如绦虫(Tapeworm)、吸虫(Fluke)和/或蛔虫(Roundworm)。
优选地，在一个实施方案中，本发明的方法中使用的引物，特别是用于肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)的引物，是以下一些或优选全部：
1.FIP引物包含TGC GGG TCC CCG TCA ATT GCC TGG GTA GTA CAT TCG(SEQ IDNO:1)的序列；和/或
2.BIP引物包含CAA GTG GTG GAG CAT GTT TGT CAA GTC TAG GTA AGG(SEQ IDNO:2)的序列；和/或
3.LPF引物包含GTT TGA GTT TCA TTC TTG(SEQ ID NO:3)的序列；和/或
4.LPB引物包含CTT AAT TCG ACG GTA CAC(SEQ ID NO:4)的序列；和/或
5.B3引物包含TGT TTC CAT AAC TTT GCC(SEQ ID NO:5)的序列。
上述引物序列靶向肺炎支原体的序列。特别地，上述引物靶向以下序列。
#AF132740.1_支原体_肺炎链球菌_菌株_ATCC_15531_16S_核糖体_RNA_基因_和_16S-23S_rRNA_基因间_间隔区_完整_序列(#AF132740.1_Mycoplasma_pneumoniae_strain_ATCC_15531_16S_ribosomal_RNA_gene_and_16S-23S_rRNA_intergenic_spacer_complete_sequence)TTAACGCTGGCGGCATGCCTAATACATGCAAGTCGATCGAAAGTAGTAATACTTTAGAGGCGAACGGGTGAGTAACACGTATCCAATCTACCTTATAATGGGGGATAACTAGTTGAAAGACTAGCTAATACCGCATAAGAACTTTGGTTCGCATGAATCAAAGTTGAAAGGACCTGCAAGGGTTCGTTATTTGATGAGGGTGCGCCATATCAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCAATGACGTGTAGCTATGCTGAGAAGTAGAATAGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTTCACAATGAGCGAAAGCTTGATGGAGCAATGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTTAAGATTGTAAAGTTCTTTTATTTGGGAAGAATGACTTTAGCAGGTAATGGCTAGAGTTTGACTGTACCATTTTGAATAAGTGACGACTAACTATGTGCCAGCAGTCGCGGTAATACATAGGTCGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCAAGCGCAGGCGGATTGAAAAGTCTGGTGTTAAAGGCAGCTGCTTAACAGTTGTATGCATTGGAAACTATTAATCTAGAGTGTGGTAGGGAGTTTTGGAATTTCATGTGGAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGAAAACTTAGGCCATTACTGACGCTTAGGCTTGAAAGTGTGGGGAGCAAATAGGATTAGATACCCTAGTAGTCCACACCGTAAACGATAGATACTAGCTGTCGGGGCGATCCCCTCGGTAGTGAAGTTAACACATTAAGTATCTCGCCTGGGTAGTACATTCGC AAGAATGAAACTCAAACGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGTGGTGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGGTACACGAAAAACCTTACCTAGACTTGACATCCTTGGCAAAGTTATGGAAACATAATGGAGGTTAACCGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCGTTAGTTACATTGTCTAGCGAGACTGCTAATGCAAATTGGAGGAAGGAAGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTAGGGCTGCAAACGTGCTACAATGGCCAATACAAACAGTCGCCAGCTTGTAAAAGTGAGCAAATCTGTAAAGTTGGTCTCAGTTCGGATTGAGGGCTGCAATTCGTCCTCATGAAGTCGGAATCACTAGTAATCGCGAATCAGCTATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCAAACTATGAAAGCTGGTAATATTTAAAAACGTGTTGCTAACCATTAGGAAGCGCATGTCAAGGATAGCACCGGTGATTGGAGTTAAGTCGTAACAAGGTACCCCTACGAGAACGTGGGGGTGGATCACCTCCTTTCTAATGGAGTTTTTTACTTTTTCTTTTCATCTTTAATAAAGATAAATACTAAACAAAACATCAAAATCCATTTATTTATCGGTGGTAAATTAAACCCAAATCCCTGTTTGGTCTCACAACTAACATATTTGGTCAGATTGTATCCAGTTCTGAAAGAACATTTCCGCTTCTTTCAAAACTGAAAACGACAATCTTTCTAGTTCCAAATAAATACCAAAGGATCAATACAATAAGTTACTAAGGGCTTATGGTG(SEQ ID NO:13)
在一些实施方案中，本发明的方法中使用的引物，特别是用于肺炎支原体的引物，包含至少一种选自以下的引物：
a)FIP引物，其包含与序列：TGC GGG TCC CCG TCA ATT GCC TGG GTA GTA CATTCG(SEQ ID NO:1)具有至少88％、91％、94％、97％或100％序列同一性的序列，该序列仍然提供引物功能性，
b)BIP引物，其包含与序列：CAA GTG GTG GAG CAT GTT TGT CAA GTC TAG GTAAGG(SEQ ID NO:2)具有至少88％、91％、94％、97％或100％序列同一性的序列，该序列仍然提供引物功能性，
c)LPF引物，其包含与序列：GTT TGA GTT TCA TTC TTG(SEQ ID NO:3)具有至少88％、94％或100％序列同一性的序列，该序列仍然提供引物功能性，
d)LPB引物，其包含与序列：CTT AAT TCG ACG GTA CAC(SEQ ID NO:4)具有至少88％、94％或100％序列同一性的序列，该序列仍然提供引物功能性，以及
e)B3引物，其包含与序列TGT TTC CAT AAC TTT GCC(SEQ ID NO:5)具有至少88％、94％或100％序列同一性的序列，该序列仍然提供引物功能性，
优选地，其中，该引物功能性是在SEQ ID NO:13处的引物功能性。
优选地，在一个实施方案中，本发明的方法中使用的引物，特别是用于人类疱疹病毒1(Human herpesvirus 1)的引物，是以下一些或优选全部：
1.FIP引物包含GTT GGG TGG TGG AGG AGA CGT CCT TTT GGT TCT TGT CGG T(SEQ ID NO:7)的序列；和/或
2.BIP引物包含GGT CGT CCC TCG CAT GAA GCG GCG TGG TAA GGC TGA TG(SEQID NO:8)的序列；和/或
3.LPF引物包含TTG GTG GGA ACC CCC GAT AC(SEQ ID NO:9)的序列；和/或
4.LPB引物包含AAC ATG ACC CAG ACC GGC AC(SEQ ID NO:10)的序列；和/或
5.B3引物包含TAC TTG GCA TGG GGG GTG(SEQ ID NO:11)的序列。
上述引物序列靶向人类疱疹病毒1的序列。特别地，上述引物靶向以下序列。
#AY240834.1_人类_疱疹病毒_1_分离株_E19_US4_和_US5_基因_完整_cds_和_US6_基因_部分_cds(#AY240834.1_Human_herpesvirus_1_isolate_E19_US4_and_US5_genes_com plete_cds_and_US6_gene_partial_cds)
TGACCGCCCCCGGGGGGCGGTGCTGTTTGCGGGTTGGCACAAAAAGACCCCGACCCGCGTCTGTGGTGTTTTTGGCATCATGTCGCCGGGCGCCATGCGTGCCGTTGTTCCCATTATCCCATTCCTTTTGGTTCTTGTCGGTGTATCGGGGGTTCCCACCAACGTCTCCTCCACCACCCAACCCCAACTCCCGACCACCGGTCGTCCCTCGCATGAAGCCCCCAACATGACCCAGACCGGCACCACCGACTCTCCCACCGCCATCAGCCTTACCACGCCCGACCACACACCCCCCATGCCAAGTATCGGACTGGAGGAGGAGGAGGAAGAGGAGGAGGGGGCCGGGGATGGCGAACATCTTGAGGGGGGAGATGGGACCCGTGACACCCTACCCCAGTCCCCGGGTCCAGCCGTCCCGTTGGCCGGGGATGACGAGAAGGACAAACCCAACCGTCCCGTAGTCCCACCCCCCGGTCCCAACAACTCCCCCGCGCGCCCCGAGACCAGTCGACCGAAGACACCCCCCACCAGGATCGGGCCGCTGGCAACTCGACCCACGACCCAACTCCCCTCAAAGGGGCGACCCTTGGTTCCGACGCCTCAACATACCCCGCTGTTCTCGTTCCTCACTGCCTCCCCCGCCCTGGACACCCTCTTCGTCATCAGCACCGTCATCCACACCTTATCGTTTGTGTGTATTGTTGCGATGGCGACACACCTGTGTGGCGGTTGGTCCAGACGCGGGCGACGCACACACCCTAGCGTGCGTTACGTGTGCCTGCCGCCCGAACGCGGGTAGGGTATGGGGAGAGCCTACACGCGGAAAGCAAGAACAATAAAGGCGGCGGGATCTAGTTGATATGCGTCTCTGGGTGTTTTTGGGGTGTGGCGGGCGCCGGGCGGTCATTGGACGGGGTGCAGTTAAATACATGCCCGGGACCCATGAAGCATGCGCGACTTCCGGGCCTCGGAACCCACCCGAAACGGCCAACGGACGTCTGAGCCAGGCCTGGCTATCCGGAGAAACAACACACGACTTGGCGTTCTGTGTGTCGCGATGTCTCTGCGCGCAGTCTGGCATCTGGGGCTTTTGGGAAGCCTCGTGGGGGCTGTTCTTGCCGCCACCCATCTGGGACCTGCGGCCAACACAACGGACCCCTTAACGCACGCCCCAGTGTCCCCTCACCCCAGCCCCCTGGGGGGCTTTGCCGTCCCCCTCGTAGTCGGTGGGCTGTGTGCCGTAGTCCTGGGGGCGGCGTGTCTGCTTGAGCTCCTGCGTCGTACGTGCCGCGGGTGGGGGCGTTACCATCCCTACATGGACCCAGTTGTCGTATAAGATGTCGGGTCCAAACTCCCGACACCACCAGCTGGCATGGTATAAATCACCGGTGCGCCCCCCAAACCATGTCCGGCAGGGGGATGGGCACCCAACAACACCGGGCTAACCAGGAAATCCGTGGCCCCGGCCCCCAACAAAGATCGCGGTAGCCCGGCCGTGTGACACTATCGTCCATACCGACCACACCGACGAATCCCCTAAGGGGGAGGGGCCATTTTACGAGGAGGAGGGGTATAACAAAGTCTGTCTTTAAAAAGCAGGGGTTAGGGAGTTGTTCGGTCATAAGCTTCAGCGCGAACGACCAACTACCCCGATCATCAGTTATCCTTAAGGTCTCTTTTGTGTGGTGCGTTCCGGTATGGGGGGGGCTGCCGCCAGGTTGGGGGCCGTGATTTTGTTTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCC TTGGCGGATGCCTCTCTT(SEQ ID NO:14)
在一些实施方案中，本发明的方法中使用的引物，特别是用于人类疱疹病毒1的引物，包含至少一种选自以下的引物：
a)FIP引物，其包含与序列：GTT GGG TGG TGG AGG AGA CGT CCT TTT GGT TCTTGT CGG T(SEQ ID NO:7)具有至少87％、90％、92％、95％、97％或100％序列同一性的序列，该序列仍然提供引物功能性，
b)BIP引物，其包含与序列：GGT CGT CCC TCG CAT GAA GCG GCG TGG TAA GGCTGA TG(SEQ ID NO:8)具有至少89％、92％、94％、97％或100％序列同一性的序列，该序列仍然提供引物功能性，
c)LPF引物，其包含与序列：TTG GTG GGA ACC CCC GAT AC(SEQ ID NO:9)具有至少85％、90％、95％或100％序列同一性的序列，该序列仍然提供引物功能性，
d)LPB引物，其包含与序列：AAC ATG ACC CAG ACC GGC AC(SEQ ID NO:10)具有至少85％、90％、95％或100％序列同一性的序列，该序列仍然提供引物功能性，
e)B3引物，其包含与序列TAC TTG GCA TGG GGG GTG(SEQ ID NO:11)具有至少88％、94％或100％序列同一性的序列，该序列仍然提供引物功能性，
优选地，其中，该引物功能性是在SEQ ID NO:14处的引物功能性。
相对于参考序列的“序列同一性百分比(％)”被定义为，在比对序列并引入间隙(如有必要)以实现最大序列同一性百分比之后，候选序列中与参考序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分比。以确定氨基酸序列同一性百分比为目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公众可用的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
然而，本领域技术人员熟知如何根据样本中待检测的靶序列设计可替代的或另外的引物序列(例如参见Jia,B.,et al.,2019,Frontiers in microbiology,10,2860)。
在本发明的方法中，特别是在其步骤(c)中，温度可以是固定的。
如本文所使用的术语“固定温度”是指保持温度条件恒定或几乎恒定，使得酶和引物可以实质上起作用。几乎恒定的温度条件的意思是，不仅设定温度被精确地保持，而且温度的轻微改变在它不破坏酶和引物的实质功能的程度内是可接受的。例如，约从0℃到10℃的温度改变是可接受的。
可以通过将温度保持在可以维持待使用的酶的活性的水平来实施在固定温度下的核酸扩增反应。此外，为了在所述核酸扩增反应中实现引物与靶核酸的退火，例如，为了设定反应温度，可以将温度设定在引物的Tm值附近或低于该Tm值，并且优选通过考虑引物的Tm值而将其设定在严格性水平。在所述核酸扩增反应中，扩增反应可以被重复直到酶失活或包括引物的试剂之一用完。
换言之，在恒定的温度下在相同的试管中孵育一种或多种酶、DNA引物和待分析的样本。该温度优选为在50℃和75℃之间。然而，温度也可以更低，例如在30℃和75℃之间。在可替代的实施方案中，使用降落式(touchdown)温度步骤。换言之，在分析过程中降低温度，例如从70℃的温度开始，然后降低至50℃。
在本发明的方法中，将一种或多种酶、DNA引物和待分析的样本在相同试管中孵育1至120分钟，优选1至60分钟、1至45分钟、1至30分钟或1至15分钟。在一优选的实施方案中，将样本孵育3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30分钟。
本发明的方法包括确定样本中是否存在双链延长的DNA序列的步骤，特别地，其中，样本中双链延长的DNA序列的存在表示样本中预定的核酸序列的存在。本领域技术人员熟知适用于确定样本中双链的DNA序列的存在的方法，特别是在待检测的序列已知的情况下。因此，本领域技术人员已知的用于该目的的任何方法都可以用在本发明中。然而，优选地，通过使用与延长的双链的DNA序列可杂交的核酸分子以确定延长的双链的DNA的存在，特别地，其中，使用嵌入延长的双链的DNA序列的分子或使用浊度测量来标记核酸分子。
如本文所使用的术语“标记”或其语法变型是指任何可检测的或生成信号的分子或报告分子(reporter molecule)。方便的标记包括比色标记、化学发光标记、生色标记、放射性标记和荧光标记，但是也可以使用酶标记(例如比色、发光、生色)方法或基于抗体的标记方法或信号生成系统。因此，如本文所使用的术语“标记”不仅包括直接可检测的信号发出或无源(passive)的部分，而且包括生成信号或参与信号生成反应的任何部分或可以以某种方式间接检测的任何部分。如本文所使用的“标记的”是指与可检测的标记相连接或者连接至(linked to)可检测的标记。
可以通过荧光报告来实现确定样本中是否存在延长的双链的DNA序列。此类方法中的大多数基于嵌入染料的使用，如溴化乙锭、SYBR Green、EvaGreen和YO-PRO-I(ZhangX,et al.2013,PLoS One 8(12):e82841；Mair G.et al.2013,BMC Veterinary Research9:108)。如本文所使用的，“嵌入”的试剂或染料是指能够在核酸双螺旋中的堆叠的碱基对之间非共价插入的试剂或部分。可以通过依赖于荧光共振能量转移(Forster resonanceenergy transfer，FRET)的机制的荧光技术来实现确定样本中是否存在延长的双链的DNA序列(Chen Q,et al.,1997,Biochemistry 36(15):4701-11)。在本发明的某些实施方案中，LPB和/或LPF在5'端被至少一个标记和/或受体荧光团标记。
如本文所使用的术语“浊度”是指使光被散射或吸收的流体或透明固体中的悬浮的和/或可溶颗粒的度量。在本发明的某些实施方案中，间接确定样本中是否存在延长的双链的DNA序列本质上依赖于作为反应副产物的焦磷酸盐的形成。焦磷酸根离子可以通过在核酸聚合期间将脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)结合至DNA链中而被释放，并且这些离子与反应混合物中存在的二价金属离子(特别是镁离子)反应，以生成白色不溶性焦磷酸镁沉淀物，如Mori Y.等人所描述(2001(Biochem.Biophys.Res.Commun.289:150-154))。这种参与导致反应溶液的浊度的逐渐增加，并且焦磷酸盐沉淀物可以依据浊度进行定量测量，或在离心后作为沉淀块通过肉眼观察到。在本发明的可替代的实施方案中，通过在反应中掺入锰离子和钙黄绿素来实现确定样本中是否存在延长的双链的DNA序列。钙黄绿素的荧光由于锰离子的结合自然淬灭。作为反应副产物的焦磷酸盐的生成通过沉淀从缓冲液中去除锰离子，并且与恢复的钙黄绿素荧光相结合的增加的浊度使得在可见光或紫外光激发下可以容易地目视读出(Tomita N.,et al.2008.Nat.Protoc.3:877-882)。在本发明的另一个实施方案中，通过由热稳定的萤火虫荧光素酶产生的生物发光监测在DNA合成过程中产生的焦磷酸盐向ATP的酶转化，用于确定样本中是否存在延长的双链的DNA序列(GandelmanOA.,et al.2010,PLoS One 5(11):el4155)。
通常，由Becherer，Lisa等人("Loop-mediated isothermal amplification(LAMP)–review and classification of methods for sequence-specific detection."Analytical Methods 12.6(2020):717-746)描述的所有方法都可以与本发明的方法结合。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种治疗被病原体感染的受试者的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的治疗药物，其中，所述受试者先前已通过使用本发明所述的方法被确定为被所述病原体感染。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于治疗病原体感染的抗感染组合物，其中，所述受试者先前已通过使用本发明所述的方法被确定为被所述病原体感染。
如本文所使用的术语“抗感染组合物”是指包含抗病毒药、抗生素、抗真菌药和/或抗寄生物药的试剂(agent)或组合物。
在一个优选实施方案中，所述病原体为病毒、细菌、真菌或寄生物。在另一个优选实施方案中，所述治疗药物分别为抗病毒药、抗生素、抗真菌药或抗寄生物药。
如本文所使用的术语“抗病毒药”是指一种具有用于治疗病毒相关的疾病的性质的药物。抗病毒药尤其可以具有预防、抑制、压制、减少、不利地影响和/或干扰病毒的生长、存活、复制、功能和/或传播的性质。
在一些实施方案中，本文所描述的抗病毒药包含至少一种选自以下的试剂：抗疱疹病毒药、抗RNA病毒药和抗逆转录病毒药。
在一些实施方案中，本文所描述的抗病毒药包含至少一种选自以下的试剂：阿巴卡韦(Abacavir)、阿昔洛韦(Acyclovir)、阿德福韦(Adefovir)、金刚烷胺(Amantadine)、安普利近(Ampligen)、安普那韦(Amprenavir)、阿比朵尔(Umifenovir)、阿扎那韦(Atazanavir)、阿曲普拉(Atripla)、巴洛沙韦酯(Baloxavir marboxil)、必妥维(Biktarvy)、波普瑞韦(Boceprevir)、布尔韦肽(Bulevirtide)、西多福韦(Cidofovir)、可比司他(Cobicistat)、双汰芝(Combivir)、达卡他韦(Daclatasvir)、地瑞那韦(Darunavir)、地拉韦啶(Delavirdine)、达可挥(Descovy)、地达诺新(Didanosine)、二十二醇(Docosanol)、度鲁特韦(Dolutegravir)、多拉韦林(Doravirine)、依度尿苷(Edoxudine)、依非韦伦(Efavirenz)、埃替拉韦(Elvitegravir)、恩曲他滨(Emtricitabine)、恩夫韦地(Enfuvirtide)、恩替卡韦(Entecavir)、依曲韦林(Etravirine)、泛昔洛韦(Famciclovir)、福米韦森(Fomivirsen)、福沙那韦(Fosamprenavir)、膦甲酸(Foscarnet)、更昔洛韦(Ganciclovir)、伊巴他滨(Ibacitabine)、伊巴珠单抗(Ibalizumab)、碘苷(Idoxuridine)、咪喹莫特(Imiquimod)、异丙肌苷(Imunovir)、茚地那韦(Indinavir)、拉米夫定(Lamivudine)、乐特莫韦(Letermovir)、洛匹那韦(Lopinavir)、洛韦胺(Loviride)、马拉韦罗(Maraviroc)、甲吲噻腙(Methisazone)、吗啉胍(Moroxydine)、奈非那韦(Nelfinavir)、奈韦拉平(Nevirapine)、多吉美(Nexavir)、硝唑尼特(Nitazoxanide)、利托那韦(Norvir)、奥司他韦(Oseltamivir)、喷昔洛韦(Penciclovir)、帕拉米韦(Peramivir)、喷昔洛韦(Penciclovir)、帕拉米韦(Peramivir)、普来可那立(Pleconaril)、足叶草毒素(Podophyllotoxin)、雷特格韦(Raltegravir)、瑞德西韦(Remdesivir)、利巴韦林(Ribavirin)、利匹韦林(Rilpivirine)、利匹韦林(Rilpivirine)、金刚烷乙胺(Rimantadine)、利托那韦(Ritonavir)、沙奎那韦(Saquinavir)、司美匹韦(Simeprevir)、索非布韦(Sofosbuvir)、司他夫定(Stavudine)、他立韦林(Taribavirin)、特拉匹韦(Telaprevir)、替比夫定(Telbivudine)、替诺福韦(Tenofovir)、替拉那韦(Tipranavir)、曲氟尿苷(Trifluridine)、三协唯(Trizivir)、曲金刚胺(Tromantadine)、特鲁瓦达(Truvada)、阿比朵尔(Umifenovir)、伐昔洛韦(Valaciclovir)、缬更昔洛韦(Valganciclovir)、维立韦罗(Vicriviroc)、阿糖腺苷(Vidarabine)、扎西他滨(Zalcitabine)、扎那米韦(Zanamivir)以及齐多夫定(Zidovudine)。
如本文所使用的术语“抗生素”是指一种具有用于抗细菌和/或治疗细菌相关的疾病的性质的试剂或组合物。抗生素尤其可以具有预防、抑制、压制、减少、不利地影响和/或干扰至少一种细菌的生长、存活、复制、功能和/或传播的性质。在一些实施方案中，本文所描述的抗生素包含至少一种选自以下的试剂：抗菌噬菌体、大环内酯类(例如，红霉素(erythromycin))、青霉素类(例如，萘夫西林(nafcillin))、头孢菌素类(例如，头孢唑啉(cefazolin))、碳青霉烯类(例如，亚胺培南(imipenem))、单环β-内酰胺类(例如，氨曲南(aztreonam))、其它β-内酰胺类抗生素、β-内酰胺类抑制剂(例如，舒巴坦(sulbactam))、唑烷酮类(oxalines)(例如，利奈唑胺(linezolid))、氨基糖苷类(例如，庆大霉素(gentamicin))、氯霉素(chloramphenicol)、磺胺类(例如，磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole))、糖肽类(例如，万古霉素(vancomycin))、喹诺酮类(例如，环丙沙星(ciprofloxacin))、四环素类(例如，米诺环素(minocycline))、夫西地酸(fusidic acid)、甲氧苄啶(trimethoprim)、甲硝唑(metronidazole)、克林霉素(clindamycin)、莫匹罗星(mupirocin)、利福霉素类(例如，利福平(rifampin))、链阳菌素类(例如，奎奴普丁(quinupristin)和达福普汀(dalfopristin))、脂蛋白(例如，达托霉素(daptomycin))和多烯类(例如，两性霉素B(amphotericin B))。在一些实施方案中，本文所描述的抗生素包含至少一种选自以下的试剂：阿莫西林(amoxicillin)、阿奇霉素(azithromycin)、阿莫西林(amoxicillin)/克拉维酸(clavulanate)、克林霉素(clindamycin)、头孢氨苄(cephalexin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole)/甲氧苄啶(trimethoprim)和甲硝唑(metronidazole)。
如本文所使用的术语“抗真菌药”是指一种具有用于治疗真菌相关的疾病的性质的试剂或组合物。抗真菌药尤其可以具有预防、抑制、压制、减少、不利地影响和/或干扰至少一种真菌的生长、存活、复制、功能和/或传播的性质。
在一些实施方案中，本文所描述的抗真菌药包含至少一种选自以下的试剂：棘白菌素类(echinocandins)、咪唑类抗真菌剂(imidazole antifungal)、羊毛甾醇14α-去甲基酶抑制剂(lanosterol 14α-demethylase inhibitor)和三唑类抗真菌剂(triazoleantifungal)。在一些实施方案中，抗真菌药包含至少一种选自以下的试剂：阿巴芬净(Abafungin)、乙酸、吖啶琐辛(Acrisorcin)、蒜素(Allicin)、氨基康定(Aminocandin)、阿莫罗芬(Amorolfine)、两性霉素B、阿尼芬净(Anidulafungin)、芽孢菌霉素(Bacillomycin)、联苯苄唑(Bifonazole)、灰瘟素A(Blasticidin A)、硼酸、溴柳氯苯胺(Bromochlorosalicylanilide)、布替萘芬(Butenafine)、杀念珠菌素(Candicidin)、辛酸、卡泊芬净(Caspofungin)、浅蓝菌素(Cerulenin)、氯登妥因(Chlordantoin)、氯苄达唑(Chlormidazole)、2-(4-氯苯氧)乙醇(Chlorophetanol)、氯二甲苯酚(Chloroxylenol)、环吡酮胺(Ciclopirox)、西洛芬净(Cilofungin)、肉桂(Cinnamon)、氯碘羟喹(Clioquinol)、克勒奥林(Creolin)、鳄鱼油(Crocodile oil)、克伦塔伦(Cruentaren)、结晶紫(Crystalviolet)、地马唑(Dimazole)、果蝇霉素(Drosomycin)、棘白菌素(Echinocandin)、棘白菌素B、依托南(Ethonam)、芬替克洛(Fenticlor)、菲律宾菌素(Filipin)、灰黄霉素(Griseofulvin)、Halicylindramide、氯丙炔碘(Haloprogin)、哈霉素(Hamycin)、扁柏脂素(Hinokinin)、氢化可的松(hydrocortisone)、虱螨脲(Lufenuron)、卢立康唑(Luliconazole)、药用真菌(Medicinal fungi)、Melafix、米卡芬净(Miltefosine)、分枝杆菌素(Mycobacillin)、纳他霉素(Natamycin)、尼可霉素(Nikkomycin)、制霉菌素(Nystatin)、奥洛托密德(Orotomide)、阜孢霉素B(Papulacandin B)、大黄素甲醚(Parietin)、培西洛星(Pecilocin)、戊烷脒(Pentamidine)、表霉素(Perimycin)、羟吡酮(Piroctone olamine)、纽莫康定(Pneumocandin)、多烯抗真菌药、Ptilomycalin A、硝吡咯菌素(Pyrrolnitrin)、利莫罗近(Rimoprogin)、二硫化硒(Selenium disulfide)、重菇醇(Sparassol)、链霉菌分离株(Streptomyces isolate)、二苯嗪硫酮(Sulbentine)、他伐硼罗(Tavaborole)、茶树油、特比萘芬(Terbinafine)、蒂壳酰胺F(Theonellamide F)、桧酚酮(Thujaplicin)、百里香(Thyme)、替克拉酮(Ticlatone)、托西拉酯(Tolciclate)、托萘酯(Tolnaftate)、曲古菌素A(Trichostatin A)、三氯生(Triclosan)、三甲曲沙(Trimetrexate)、十一碳烯酸、杀黑星菌素(Venturicidin)、乙烯二噻烯(Vinyldithiin)、白凡士林(Vusion)以及吡硫翁锌(Zinc pyrithione)。
如本文所使用的术语“抗寄生物药”是指一种具有用于治疗寄生物相关的疾病的性质的药物。抗寄生物药尤其可以具有预防、抑制、压制、减少、不利地影响和/或干扰寄生物的生长、存活、复制、功能和/或传播的性质。在一些实施方案中，本文所描述的抗寄生物药包含至少一种选自以下的试剂：阿维菌素(abamectin)、阿巴美他(abametapir)、抗绦虫剂、阿普西特(arprinocid)、硫乙胂胺(arsenamide)、杀蛔虫剂(ascaricide)、阿维菌素(avermectin)、羟萘酸苄酚宁(bephenium hydroxynaphthoate)、硫双二氯酚(bithionol)、卡巴多司(carbadox)、氯羟吡啶(clopidol)、螨蜱胺(cymiazole)、癸氧喹酯(decoquinate)、双氯酚(dichlorophen)、地克珠利(diclazuril)、乙胺嗪(diethylcarbamazine)、二甲硝咪唑(dimetridazole)、杀外寄生物药(ectoparasiticide)、艾默德斯(emodepside)、依普菌素(eprinomectin)、乙氧酰胺苯甲酯(ethopabate)、非昔硝唑(fexinidazole)、氟苯咪唑(flubendazole)、常山酮(halofuginone)、海恩酮(hycanthone)、氯化氮氨菲啶(isometamidium chloride)、伊维菌素(ivermectin)、拉沙里菌素(lasalocid)、马拉松(malathion)、药用真菌、美拉索明(melarsomine)、美曲磷酯(metrifonate)、米尔贝肟(milbemycin oxime)/虱螨脲(lufenuron)、那拉霉素(narasin)、硝呋莫司(nifurtimox)/依氟鸟氨酸(eflornithine)、尼立达唑(niridazole)、硝唑尼特(nitazoxanide)、硝碘酚腈(nitroxinil)、奥替普拉(oltipraz)、氨磺乐灵(oryzalin)、奥沙尼喹(oxamniquine)、奥克太尔(oxantel)、帕呋拉定(pafuramidine)、氯菊酯(permethrin)、吡喹酮(praziquantel)、普罗帕脒(propamidine)、喹匹拉明(quinapyramine)、氯苯胍(robenidine)、水杨基氧肟酸(salicylhydroxamic acid)、盐霉素(salinomycin)、西拉菌素(selamectin)、锑波芬(stibophen)、链霉菌分离株、模板：抗节肢动物药物、四苯基卟啉磺酸盐(tetraphenylporphine sulfonate)、噻苯达唑(tiabendazole)以及托曲珠利(toltrazuril)。
在一些实施方案中，本发明涉及本发明使用的所述抗感染组合物，其中，所述病原体为人类疱疹病毒或支原体属的细菌。
本领域技术人员知晓一旦已经使用本发明的方法确定了病原体，如何治疗病原体感染。
本发明的方法能够有效地确定病原体，并且有助于早期检测、筛查、监测和/或确认既往感染。
因此，通过本发明的方法实现的病原体的确定可以随后改善感染的治疗、减少病原体传播和/或避免疾病进展。
本发明还涉及一种试剂盒，特别是用于确定来自人类受试者的样本中的预定的核酸序列的存在的试剂盒。试剂盒可以包含本发明方法中使用的所有五种引物或本文使用的六种引物。试剂盒可以包含多于一个的靶向不同靶序列的引物系统，其中，不同靶序列可以是相同病原体或不同病原体的一部分，例如，通过使用含有淬灭剂-荧光团双链区的引物(Tanner NA,Zhang Y,Evans TC Jr.Simultaneous multiple target detection inreal-time loop-mediated isothermal amplification.Biotechniques.2012；53(2):81-89.)。因此，试剂盒可以用于在一个实验中确定多于一个的预定的核酸序列的存在。
在本发明的特别优选的实施方案中，本发明的(在上下文中待制备的)试剂盒或本发明的方法和用途还可以包括或提供有使用手册(instruction manual)。例如，所述使用手册可以指导技术人员(如何)在本文提供的诊断用途中和根据本发明使用本发明的试剂盒。特别地，所述使用手册可以包括使用或应用本文提供的方法或用途的指南。
除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管类似于或相当于本文所描述的方法和材料的那些可以用于本发明的实践或测试中，但是下文描述了合适的方法和材料。如果存在冲突，将以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅为说明性的，而并非旨在限制。
除非另有说明，否则可以根据本领域众所周知的常规方法以及在遍及本说明书中引用的和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所描述的方法来实施本文所描述的一般方法和技术。例如，参见Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2ded.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)和Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates(1992),以及Harlow and Lane Antibodies:ALaboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)。
虽然在附图和前文的描述中详细说明并描述了本发明的方面，但是这种说明和描述被认为是说明性或示例性的，而不是限制性的。可以理解的是，在以下权利要求的范围和精神内，本领域技术人员可以进行改变和修改。特别地，本发明涵盖了具有来自上文和下文描述的不同实施方案的特征的任何组合的其它实施方案。
图1示出了使用五引物或六引物和本文提供的方法用于检测柔膜菌纲的细菌中预定的16S rRNA序列的五引物和六引物系统的比较。
图2示出了使用五引物或六引物和本文提供的方法用于检测人类疱疹病毒1中预定的DNA序列的五引物和六引物系统的比较。
此外，在权利要求书中，词语“包括/包含(comprising)”不排除其它元素或步骤，而不定冠词“一个(a)”或“一种(an)”不排除多个。单个单元可以实现权利要求中列举的若干特征的功能。特别地，与属性或值相关的术语“本质上”、“约”、“近似”等也分别准确地定义了属性或值。权利要求中的任何附图标记都不应被解释为对范围的限制。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。可以理解的是，考虑到上面提供的一般描述，可以实施各种其它实施例。
不具有F3的新的5引物系统与具有F3的6引物系统一样有效地扩增柔膜菌
表1-引物
Figure BDA0004113285430000241
表2-引物混合物：新的5引物系统
终浓度
FIP 1.6μM
BIP 1.6μM
LPF 0.8μM
LPB 0.8μM
B3 0.4μM
表3-引物混合物:LAMP 6引物系统
终浓度
FIP 1.6μM
BIP 1.6μM
LPF 0.8μM
LPB 0.8μM
B3 0.2μM
F3 0.2μM
表4-引物/酶混合物(PEM)
Vol/rx
等温反应混合物(master mix) 15.0μl
引物混合物 2.0μl
17.0μl
每次反应添加17.0μl的PEM
模板添加
添加8.0μl提取的RNA
添加8.0μl作为阴性分析对照的无核糖核酸酶(RNase)的H2O
表5-用于等温扩增与染料采集的设置
Figure BDA0004113285430000251
不具有F3的新的5引物系统与具有F3的6引物系统一样有效地扩增人类疱疹病毒1
表6-引物
Figure BDA0004113285430000252
表7-引物混合物：新的5引物系统
Figure BDA0004113285430000253
Figure BDA0004113285430000261
表8-引物混合物:LAMP 6引物系统
终浓度
FIP 1.6μM
BIP 1.6μM
LPF 0.8μM
LPB 0.8μM
B3 0.2μM
F3 0.2μM
表9-引物/酶混合物(PEM)
Vol/rx
等温反应混合物(master mix) 15.0μl
引物混合物 2.0μl
17.0μl
每次反应添加17.0μl的PEM
模板添加
添加8.0μl提取的RNA
添加8.0μl作为阴性分析对照的无核糖核酸酶(RNase)的H2O
表10-用于等温扩增与染料采集的设置
Figure BDA0004113285430000262
序列表
<110> 赛特斯分子诊断股份公司
<120> 确定人类样本中预定的核酸序列存在的等温实时PCR方法
<130> AD2230 PCT BS
<150> EP20179110.0
<160> 14
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FIP引物 柔膜菌
<400> 1
tgcgggtccc cgtcaattgc ctgggtagta cattcg 36
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BIP引物 柔膜菌
<400> 2
caagtggtgg agcatgtttg tcaagtctag gtaagg 36
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LPF引物 柔膜菌
<400> 3
gtttgagttt cattcttg 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LPB引物 柔膜菌
<400> 4
cttaattcga cggtacac 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B3引物 柔膜菌
<400> 5
tgtttccata actttgcc 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F3引物 柔膜菌
<400> 6
gttaacacat taagtatc 18
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FIP引物 人类疱疹病毒1
<400> 7
gttgggtggt ggaggagacg tccttttggt tcttgtcggt 40
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BIP引物 人类疱疹病毒1
<400> 8
ggtcgtccct cgcatgaagc ggcgtggtaa ggctgatg 38
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LPF引物 人类疱疹病毒1
<400> 9
ttggtgggaa cccccgat 18
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LPB引物 人类疱疹病毒1
<400> 10
aacatgaccc agaccggcac 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B3引物 人类疱疹病毒1
<400> 11
tacttggcat ggggggtg 18
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F3引物 人类疱疹病毒1
<400> 12
gccgttgttc ccattatccc 20
<210> 13
<211> 1740
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 肺炎支原体菌株ATCC 15531 16S核糖体RNA基因和16S-23S rRNA基因间隔区
<400> 13
ttaacgctgg cggcatgcct aatacatgca agtcgatcga aagtagtaat actttagagg 60
cgaacgggtg agtaacacgt atccaatcta ccttataatg ggggataact agttgaaaga 120
ctagctaata ccgcataaga actttggttc gcatgaatca aagttgaaag gacctgcaag 180
ggttcgttat ttgatgaggg tgcgccatat cagctagttg gtggggtaac ggcctaccaa 240
ggcaatgacg tgtagctatg ctgagaagta gaatagccac aatgggactg agacacggcc 300
catactccta cgggaggcag cagtagggaa tttttcacaa tgagcgaaag cttgatggag 360
caatgccgcg tgaacgatga aggtctttaa gattgtaaag ttcttttatt tgggaagaat 420
gactttagca ggtaatggct agagtttgac tgtaccattt tgaataagtg acgactaact 480
atgtgccagc agtcgcggta atacataggt cgcaagcgtt atccggattt attgggcgta 540
aagcaagcgc aggcggattg aaaagtctgg tgttaaaggc agctgcttaa cagttgtatg 600
cattggaaac tattaatcta gagtgtggta gggagttttg gaatttcatg tggagcggtg 660
aaatgcgtag atatatgaag gaacaccagt ggcgaaggcg aaaacttagg ccattactga 720
cgcttaggct tgaaagtgtg gggagcaaat aggattagat accctagtag tccacaccgt 780
aaacgataga tactagctgt cggggcgatc ccctcggtag tgaagttaac acattaagta 840
tctcgcctgg gtagtacatt cgcaagaatg aaactcaaac ggaattgacg gggacccgca 900
caagtggtgg agcatgttgc ttaattcgac ggtacacgaa aaaccttacc tagacttgac 960
atccttggca aagttatgga aacataatgg aggttaaccg agtgacaggt ggtgcatggt 1020
tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatc 1080
gttagttaca ttgtctagcg agactgctaa tgcaaattgg aggaaggaag ggatgacgtc 1140
aaatcatcat gccccttatg tctagggctg caaacgtgct acaatggcca atacaaacag 1200
tcgccagctt gtaaaagtga gcaaatctgt aaagttggtc tcagttcgga ttgagggctg 1260
caattcgtcc tcatgaagtc ggaatcacta gtaatcgcga atcagctatg tcgcggtgaa 1320
tacgttctcg ggtcttgtac acaccgcccg tcaaactatg aaagctggta atatttaaaa 1380
acgtgttgct aaccattagg aagcgcatgt caaggatagc accggtgatt ggagttaagt 1440
cgtaacaagg tacccctacg agaacgtggg ggtggatcac ctcctttcta atggagtttt 1500
ttactttttc ttttcatctt taataaagat aaatactaaa caaaacatca aaatccattt 1560
atttatcggt ggtaaattaa acccaaatcc ctgtttggtc tcacaactaa catatttggt 1620
cagattgtat ccagttctga aagaacattt ccgcttcttt caaaactgaa aacgacaatc 1680
tttctagttc caaataaata ccaaaggatc aatacaataa gttactaagg gcttatggtg 1740
<210> 14
<211> 1799
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人类疱疹病毒1分离株E19 US4和US5基因完整cds和US6基因部分cds
<400> 14
tgaccgcccc cggggggcgg tgctgtttgc gggttggcac aaaaagaccc cgacccgcgt 60
ctgtggtgtt tttggcatca tgtcgccggg cgccatgcgt gccgttgttc ccattatccc 120
attccttttg gttcttgtcg gtgtatcggg ggttcccacc aacgtctcct ccaccaccca 180
accccaactc ccgaccaccg gtcgtccctc gcatgaagcc cccaacatga cccagaccgg 240
caccaccgac tctcccaccg ccatcagcct taccacgccc gaccacacac cccccatgcc 300
aagtatcgga ctggaggagg aggaggaaga ggaggagggg gccggggatg gcgaacatct 360
tgagggggga gatgggaccc gtgacaccct accccagtcc ccgggtccag ccgtcccgtt 420
ggccggggat gacgagaagg acaaacccaa ccgtcccgta gtcccacccc ccggtcccaa 480
caactccccc gcgcgccccg agaccagtcg accgaagaca ccccccacca ggatcgggcc 540
gctggcaact cgacccacga cccaactccc ctcaaagggg cgacccttgg ttccgacgcc 600
tcaacatacc ccgctgttct cgttcctcac tgcctccccc gccctggaca ccctcttcgt 660
catcagcacc gtcatccaca ccttatcgtt tgtgtgtatt gttgcgatgg cgacacacct 720
gtgtggcggt tggtccagac gcgggcgacg cacacaccct agcgtgcgtt acgtgtgcct 780
gccgcccgaa cgcgggtagg gtatggggag agcctacacg cggaaagcaa gaacaataaa 840
ggcggcggga tctagttgat atgcgtctct gggtgttttt ggggtgtggc gggcgccggg 900
cggtcattgg acggggtgca gttaaataca tgcccgggac ccatgaagca tgcgcgactt 960
ccgggcctcg gaacccaccc gaaacggcca acggacgtct gagccaggcc tggctatccg 1020
gagaaacaac acacgacttg gcgttctgtg tgtcgcgatg tctctgcgcg cagtctggca 1080
tctggggctt ttgggaagcc tcgtgggggc tgttcttgcc gccacccatc tgggacctgc 1140
ggccaacaca acggacccct taacgcacgc cccagtgtcc cctcacccca gccccctggg 1200
gggctttgcc gtccccctcg tagtcggtgg gctgtgtgcc gtagtcctgg gggcggcgtg 1260
tctgcttgag ctcctgcgtc gtacgtgccg cgggtggggg cgttaccatc cctacatgga 1320
cccagttgtc gtataagatg tcgggtccaa actcccgaca ccaccagctg gcatggtata 1380
aatcaccggt gcgcccccca aaccatgtcc ggcaggggga tgggcaccca acaacaccgg 1440
gctaaccagg aaatccgtgg ccccggcccc caacaaagat cgcggtagcc cggccgtgtg 1500
acactatcgt ccataccgac cacaccgacg aatcccctaa gggggagggg ccattttacg 1560
aggaggaggg gtataacaaa gtctgtcttt aaaaagcagg ggttagggag ttgttcggtc 1620
ataagcttca gcgcgaacga ccaactaccc cgatcatcag ttatccttaa ggtctctttt 1680
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Claims (14)

1.一种用于确定样本中预定的核酸序列的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)向待分析是否存在预定的核酸序列的样本中添加一种或多种提供RNA-依赖性和/或DNA-依赖性DNA聚合酶活性与链置换活性的活性的酶；
(b)向待分析是否存在预定的核酸序列的所述样本中添加至少五种DNA引物，其中，至少一种DNA引物包含与所述核酸序列可杂交的序列并且至少一种DNA引物包含与与所述核酸序列反向互补的DNA序列可杂交的序列；
(c)在固定温度孵育步骤(a)和(b)得到的所述样本；
(d)确定所述样本中是否存在延长的DNA序列，
其中，所述样本中所述延长的DNA序列的存在表示所述样本中所述预定的核酸序列的存在，
其中，所述样本从人类受试者获得，并且其中未使用F3引物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少五种引物中的四种分别为正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向环引物(LPF)和反向环引物(LPB)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，第五种引物为B3引物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述预定的核酸序列为RNA序列或DNA序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述预定的RNA序列或DNA序列包含在病原体中。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述病原体为病毒、细菌、真菌或寄生物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述病原体为人类疱疹病毒或支原体属的细菌。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述固定温度在50℃和75℃之间。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，将步骤(c)中的所述样本孵育1分钟至120分钟。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，通过使用与所述双链延长的DNA序列可杂交的核酸分子，特别地，其中所述核酸分子被标记，使用嵌入所述双链延长的DNA序列的分子或使用浊度测量来确定所述样本中所述双链延长的DNA序列的存在。
11.一种用于治疗病原体的感染的抗感染组合物，其中，所述受试者先前已通过使用根据权利要求1至10中任一项所述的方法被确定为被所述病原体感染。
12.根据权利要求11使用的所述抗感染组合物，其中，所述病原体为病毒、细菌、真菌或寄生物。
13.根据权利要求11或12使用的所述抗感染组合物，其中，所述抗感染组合物分别包括抗病毒药、抗生素、抗真菌药或抗寄生物药。
14.根据权利要求12至13中任一项使用的所述抗感染组合物，其中，所述病原体为人类疱疹病毒或支原体属的细菌。
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