KR20230036102A - 인간 샘플내 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 등온 실시간 pcr 방법 - Google Patents

인간 샘플내 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 등온 실시간 pcr 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20230036102A
KR20230036102A KR1020237000753A KR20237000753A KR20230036102A KR 20230036102 A KR20230036102 A KR 20230036102A KR 1020237000753 A KR1020237000753 A KR 1020237000753A KR 20237000753 A KR20237000753 A KR 20237000753A KR 20230036102 A KR20230036102 A KR 20230036102A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sequence
nucleic acid
primer
dna
sample
Prior art date
Application number
KR1020237000753A
Other languages
English (en)
Inventor
사무엘 취르허
알렉산더 뤼티
레아 바이벨
Original Assignee
써터스 몰레큘러 다이어그노스틱스 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 써터스 몰레큘러 다이어그노스틱스 아게 filed Critical 써터스 몰레큘러 다이어그노스틱스 아게
Publication of KR20230036102A publication Critical patent/KR20230036102A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/101—Temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/119—Strand displacement amplification [SDA]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 샘플내 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 결정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 RNA- 및/또는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성 및 가닥-치환 활성의 활성들을 제공하는 하나 이상의 효소를 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 분석할 샘플에 부가하는 단계; 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 분석할 샘플에 적어도 5개의 DNA 프라이머를 부가하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 DNA 프라이머는 핵산 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하고, 적어도 하나의 DNA 프라이머는 핵산 서열에 역-상보적인 DNA 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 것인 단계; 생성된 샘플을 고정된 온도에서 인큐베이션하는 단계; 및 연장된 DNA 서열이 샘플내 존재하는지 여부를 결정하는 단계로서, 여기서 샘플내 연장된 DNA 서열의 존재는 샘플내 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함하고, 상기 샘플은 인간 대상체로부터 입수하고, F3 프라이머는 사용하지 않는다.

Description

인간 샘플내 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 등온 실시간 PCR 방법
본 발명은 샘플내 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 결정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 RNA- 및/또는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성 및 가닥-치환 활성 (strand-displacement activity)의 활성들을 제공하는 하나 이상의 효소를 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 분석할 샘플에 부가하는 단계; 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 분석할 샘플에 적어도 5개의 DNA 프라이머를 부가하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 DNA 프라이머는 핵산 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하고, 적어도 하나의 DNA 프라이머는 핵산 서열에 역-상보적인 DNA 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 것인 단계; 생성된 샘플을 고정된 온도에서 인큐베이션하는 단계; 및 연장된 DNA 서열이 샘플내 존재하는지 여부를 결정하는 단계로서, 여기서 샘플내 연장된 DNA 서열의 존재는 샘플내 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함하고, 상기 샘플은 인간 대상체로부터 입수하고, F3 프라이머는 사용하지 않는다.
인간 대상체로부터 입수한 샘플내에 핵산 서열이 존재하는지 여부를 결정하기 위한 다양한 방법이 존재한다. 대부분의 방법은 미리-결정된 서열, 가령 예를 들어 병원체에 존재할 것으로 예상되는 서열에 혼성화할 수 있는 핵산 분자에 의존한다.
그러나, 기존 테스트는 적절한 신뢰성이 부족한 결과를 매우 특이적이거나 또는 빠르게 제공한다. 따라서, 매우 특이적이고 빠르게 결과를 제공하는 방법에 대한 당해 기술 분야의 요구가 있다.
상기 기술적 문제는 본원에 제공되고 청구범위에서 특징으로 하는 구체예에 의해 해결된다.
따라서, 본 발명은 특히 하기 구체예에 관한 것이다.
1. 샘플내 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하고:
(a) RNA- 및/또는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성 및 가닥-치환 활성의 활성들을 제공하는 하나 이상의 효소를 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 분석할 샘플에 부가하는 단계;
(b) 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 분석할 샘플에 적어도 5개의 DNA 프라이머를 부가하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 DNA 프라이머는 상기 핵산 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하고, 적어도 하나의 DNA 프라이머는 상기 핵산 서열에 역-상보적인 DNA 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 것인 단계;
(c) 단계 (a) 및 (b)로부터 생성된 샘플을 고정된 온도에서 인큐베이션하는 단계;
(d) 연장된 DNA 서열이 샘플내 존재하는지 여부를 결정하는 단계로서, 여기서 샘플내 연장된 DNA 서열의 존재는 샘플내 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 나타내는 것인 단계;
상기 샘플은 인간 대상체로부터 입수하고, F3 프라이머는 사용하지 않는 방법.
2. 구체예 1에 있어서, 적어도 5개의 프라이머 중 4개는 각각 정방향 내부 프라이머 (forward inner primer: FIP), 역방향 내부 프라이머 (backward inner primer: BIP), 루프 프라이머 정방향 (loop primer forward: LPF) 및 루프 프라이머 역방향 (loop primer backwards: LPB)인 방법.
3. 구체예 1 또는 2에 있어서, 제5 프라이머는 B3 프라이머인 방법.
4. 구체예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 미리-결정된 핵산 서열은 RNA 또는 DNA 서열인 방법.
5. 구체예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 미리-결정된 RNA 또는 DNA 서열이 병원체에 포함되는 방법.
6. 구체예 5에 있어서, 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기생충인 방법.
7. 구체예 6에 있어서, 병원체는 인간 헤르페스바이러스 (herpesvirus) 또는 미코플라스마 속 (genus Mycoplasma) 박테리아인 방법.
8. 구체예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 고정 온도는 50 내지 75℃인 방법.
9. 구체예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 단계 (c)의 샘플을 1 내지 120분 동안 인큐베이션하는 방법.
10. 구체예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 샘플내 이중-가닥 연장된 DNA 서열의 존재는 이중-가닥 연장된 DNA 서열에 혼성화 가능한 핵산 분자를 사용하여 결정하고, 구체적으로 상기 핵산 분자는 이중-가닥 연장된 DNA 서열에 삽입되는 분자를 사용하거나 또는 혼탁도 측정 (turbidity measurement)을 사용하여 표지되는 방법.
11. 병원체 감염의 치료에 사용하기 위한 항-감염성 조성물 (anti-infective composition)로서, 대상체는 구체예 1 내지 10 중 어느 하나의 방법을 사용하여 병원체에 의해 감염된 것으로 이전에 결정된 것인 항-감염성 조성물.
12. 구체예 11에 있어서, 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기생충인 항-감염성 조성물.
13. 구체예 11 또는 12에 있어서, 항-감염성 조성물은 항바이러스제, 항생제, 항진균제 또는 구충제를 각각 포함하는 항-감염성 조성물.
14. 구체예 12 또는 13에 있어서, 병원체는 인간 헤르페스바이러스 또는 미코플라스마 속 박테리아인 항-감염성 조성물.
따라서, 제1 양상에서, 본 발명은 샘플내 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 결정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 RNA- 및/또는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성 및 가닥-치환 활성의 활성들을 제공하는 하나 이상의 효소를 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 분석할 샘플에 부가하는 단계; 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 분석할 샘플에 적어도 5개의 DNA 프라이머를 부가하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 DNA 프라이머는 핵산 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하고, 적어도 하나의 DNA 프라이머는 핵산 서열에 역-상보적인 DNA 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 것인 단계; 생성된 샘플을 고정된 온도에서 인큐베이션하는 단계; 및 이중-가닥 연장된 DNA 서열이 샘플내 존재하는지 여부를 결정하는 단계로서, 여기서 샘플내 이중-가닥 연장된 DNA 서열의 존재는 샘플내 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함하고, 상기 샘플은 인간 대상체로부터 입수하고, F3 프라이머는 사용하지 않는다.
본원에서 사용된, 용어 "미리-결정된 핵산 서열 (pre-determined nucleic acid sequence)"은 핵산 서열, 바람직하게는 RNA 또는 DNA 서열을 지칭하며, 여기서 당업자는 핵산 서열이 인간 대상체로부터 입수한 샘플 (예를 들어, 조직 샘플, 기관지폐포 세척액, 기관지 세척액, 인두 삼출물, 기관 흡인액, 혈액, 혈청, 혈장, 뼈, 피부, 연조직, 창자 (intestinal tract) 검체, 생식기 검체, 모유, 림프액, 뇌척수액, 흉수, 객담, 소변, 비강 분비물, 눈물, 담즙, 복수액, 고름 (pus), 활액 (synovial fluid), 유리체액, 질 분비물, 정액 및/또는 요도 조직) 내에 포함될 수 있음을 알고 있다. 구체적으로, 본 발명 내에서, 미리-결정된 핵산 서열은 본 발명의 방법을 사용하여 검출 가능한 서열이다. 즉, 당업자가 핵산 서열이 본원에 제공된 방법을 사용하여 인간 대상체로부터 입수한 샘플에서 검출될 가능성이 있는지 여부를 결정할 수 있는 경우 당업자가 이용할 수 있는 핵산 서열은 미리-결정된다. 본 발명 내에서, 미리-결정된 핵산 서열은 본 발명의 방법에서 사용되는 프라이머들 중 적어도 하나와 적어도 부분적으로 동일한 적어도 하나의 프라이머 결합 부위를 포함한다. 프라이머 결합 부위는 서열이 정확히 동일한 경우 또는 하나의 서열이 티미딘 대신에 우라실을 포함한다는 점에서만 상이한 경우 및/또는 하나의 서열이 각각의 비-변형된 뉴클레오티드(들) 대신에 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다는 점에서만 상이한 경우 프라이머 부위에 대해 동일한 것으로 간주된다.
본원에서 사용된, 용어 "DNA 프라이머 (DNA primer)" 또는 "프라이머 (primer)"는 상보적 핵산 서열에의 혼성화 시에, 예를 들어 효소적 핵산 복제 반응을 통해 연장될 수 있는 3'-말단 -OH 기를 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 본 발명에 따른 프라이머 세트는 핵산의 증폭, 즉 LAMP 분석 또는 RT-LAMP 분석에 사용된다. 프라이머 길이의 상한 및 하한은 모두 경험적으로 결정된다. 본원에 기재된 프라이머는 정방향 프라이머 (forward primer) 또는 역방향 프라이머 (reverse primer)일 수 있다. 본원에서 사용된, 용어 "역방향 프라이머 (backward primer)"는 폴리머라제가 DNA 서열의 상보적 가닥을 따라 한 방향으로 연장되도록 하기 위해 DNA 서열의 안티센스 가닥을 프라이밍하는 프라이머를 지칭한다. 적어도 하나의 역방향 프라이머는 또한 역전사를 위해 RT 프라이머로서 역할을 한다. 본원에서 사용된, 용어 "정방향 프라이머 (forward primer)"는 폴리머라제가 DNA 서열의 한 가닥을 따라 한 방향으로 연장되도록 하기 위해 DNA 서열의 센스 가닥을 프라이밍하는 프라이머를 지칭한다.
RNA- 및/또는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성의 활성을 제공하는 효소는 DNA 또는 RNA 가닥으로 이루어진 주형에 기반하여 5'-＞3' 방향으로 DNA를 합성할 수 있다. 당업자가 알고 있는 바와 같이, 이러한 효소는 주형의 유리 3'-하이드록실 기에 뉴클레오티드를 연속적으로 부가할 것이다. 이와 관련하여, 주형 가닥은 Watson-Crick 염기 페어링 (Watson-Crick base pairing)에 기반하여 부가된 뉴클레오티드의 서열을 결정한다. DNA 폴리머라제의 활성은 RNA- 및/또는 DNA-의존성일 수 있다. 예시되는 폴리머라제는 Bst DNA 폴리머라제, Vent DNA 폴리머라제, Vent (엑소-) DNA 폴리머라제, Deep Vent DNA 폴리머라제, Deep Vent (엑소-) DNA 폴리머라제, Bca (엑소-) DNA 폴리머라제, DNA 폴리머라제 I Klenow 단편, Φ29 파지 DNA 폴리머라제, Z-TaqTM DNA 폴리머라제, ThermoPhi 폴리머라제, 9°Nm DNA 폴리머라제, 및 KOD DNA 폴리머라제를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 미국특허 번호 5,814,506; 5,210,036; 5,500,363; 5,352,778; 및 5,834,285; Nishioka, M., et al. (2001) J. Biotechnol. 88, 141; Takagi, M., et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63, 4504를 참조한다.
RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성의 활성을 제공하는 효소로서, 임의의 적절한 역전사효소가 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 사용되는 효소는 특별히 제한되지 않으며, 단 RNA를 주형으로 사용하여 cDNA를 합성하는 활성을 가져야 한다. 또한, 핵산 증폭 효소의 내열성을 개선하는 물질, 예컨대 트레할로스가 부가될 수 있다.
본 명세서에서 간단히 "5'-단부 측 (5'-end side)" 또는 "3'-단부 측 (3'-end side)"으로 표시되는 경우, 모든 경우에 주형으로 간주되는 사슬에서의 방향을 의미한다. 또한, 3'-단부 측이 상보적 사슬 합성의 시작점이 된다고 기재되는 경우, 이는 3'-단부 측 -OH 기가 상보적 사슬 합성의 시작점이라는 것을 의미한다.
본원에서 사용된, 용어 "가닥 치환 (strand displacement)"은 프라이머-개시 합성 중에 이중-가닥 DNA 분자 및/또는 이중-가닥 RNA 분자에서 DNA 및/또는 RNA 가닥을 분리하는 효소의 능력을 지칭한다.
본원에서 사용된, 용어 "혼성화 (hybridisation)"는 상보적 핵산 분자의 어닐링 (annealing)을 지칭한다. 2개의 핵산이 서로에 "혼성화하는 (hybridise to)" 경우, 또는 하나의 핵산이 다른 핵산에 "혼성화하는 (hybridise to)" 경우, 상기 2개의 핵산 분자가 특정 반응에 사용되는 특정 조건 (예를 들어, 온도, 염 및 다른 버퍼 조건)하에 서로 어닐링할 수 있는 충분한 수의 상보적 핵염기를 상기 2개의 핵산 분자가 나타낸다. 혼성화의 가장 일반적인 기전은 핵산 분자들의 상보적 핵염기들 사이의 수소 결합 (예를 들어, Watson-Crick, Hoogsteen 또는 reversed Hoogsteen 수소 결합)을 포함한다. 혼성화는 다양한 조건하에 발생할 수 있다. 엄격성 조건 (stringent conditions)은 서열-의존성이며, 혼성화될 핵산 분자의 특성 및 조성에 의해 결정된다. 핵산 혼성화 기술 및 조건은 당업자에게 알려져 있고, 광범위하게 기재되어 있다. 예를 들어, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed.. Cold Spring Harbor Press, 1989; Ausubel et al, 1987, Current Protocols in Molecular Biology; Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York; Tijessen, 1993, Hybridization with Nucleic Acid Probes, Elsevier Science Publishers, B.V.; and Kricka, 1992, Non-Isotopic DNA Probe Techniques, Academic Press, San Diego, California를 참조한다.
본원에서 사용된, 용어 "F3"은 프라이머 세트의 외부 정방향 프라이머를 지칭한다.
본 발명 내에서, 놀랍게도 F3 프라이머가 생략된 5-프라이머 시스템 (five-primer system)이 미리-결정된 핵산 서열을 검출하는데 가장 효과적이라는 것을 발견하였다. 본원에서 사용된 "가장 효과적인 (most efficient)"은 통상적으로 사용되는 기술보다 검출이 빠르고 감수성이 있지만, 핵산 예컨대 인간 헤르페스바이러스 또는 미코플라스마 속 박테리아로부터 유래된 핵산을 검출하는데 사용되는 테스트의 전제 조건인 신뢰성 (reliability)을 유지하는 것을 의미한다. 또한, 표준 LAMP 기술에서와 같이 6개의 프라이머 대신에 5개의 프라이머를 사용함으로써 더 짧은 표적 서열이 검출될 수 있음을 발견하였다.
본 발명은 미리-결정된 핵산 서열을 함유하는 샘플, 및 본 발명의 적어도 하나의 프라이머가 존재하는 반응 시스템에서 샘플내 미리-결정된 핵산 서열의 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함하는, 핵산을 증폭시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 소정의 구체예에서, 적어도 하나의 프라이머 종 (species)이 본 발명의 핵산 증폭 반응에 사용된다. 즉, 본원에 기재된 DNA 프라이머는 다른 프라이머와 조합하여 사용될 수 있거나, 또는 본원에 기재된 DNA 프라이머의 2개의 종이 사용될 수 있다.
본 발명의 방법 내에서 5개의 DNA 프라이머가 사용되는 것이 바람직하다.
일부 구체예에서, 본 발명에서 사용되는 프라이머 중 적어도 2개는 루프 프라이머 (loop primers)이다.
본원에서 사용된, 용어 "루프 프라이머 (loop primer)"는 미리-결정된 RNA 서열의 증폭 산물의 적어도 하나의 루프 영역에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 DNA 프라이머를 지칭한다. 루프 영역은 증폭 산물의 가닥을 자체적으로 어닐링하여 형성된다. 전형적으로, 루프 프라이머는 생성된 DNA 서열에 혼성화하고, 추가 DNA 연장 과정의 개시를 위한 시작점 수의 증가를 제공한다. 루프 프라이머를 사용하면 증폭 과정을 가속화할 수 있다.
본 발명 내에서, 적어도 5개의 프라이머는 각각 정방향 내부 프라이머 (FIP), 역방향 내부 프라이머 (BIP), 루프 프라이머 정방향 (LPF) 및 루프 프라이머 역방향 (LPB)을 포함하는 것이 바람직하다.
본원에서 사용된, 용어 "FIP" 또는 "정방향 내부 프라이머 (forward inner primer)"는 가닥 개시를 위한 서열 및 동일한 FIP-개시 가닥에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 정방향 프라이머를 지칭한다.
본원에서 사용된, 용어 "BIP" 또는 "역방향 내부 프라이머 (backward inner primer)"는 가닥 개시를 위한 서열 및 동일한 BIP-개시 가닥에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 지칭한다.
본원에서 사용된, 용어 "루프 프라이머 정방향 (loop primer forward)" 또는 "LPF"는 정방향 프라이머인 루프 프라이머를 지칭한다.
본원에서 사용된, 용어 "루프 프라이머 역방향 (loop primer backwards)" 또는 "LPB"는 역방향 프라이머인 루프 프라이머를 지칭한다.
바람직하게는, 적어도 5개의 프라이머는 B3 프라이머를 추가로 포함한다.
본원에서 사용된, 용어 "B3"은 프라이머 세트의 외부 역방향 프라이머를 지칭한다.
표적 핵산 또는 이의 상보적 서열에 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 DNA 프라이머는 길이가 적어도 10, 15 또는 18개의 뉴클레오티드일 수 있고, B3의 경우 적어도 10, 15, 17, 또는 18개의 뉴클레오티드, FIP 및 BIP의 경우 적어도 25, 30, 33 또는 36개의 뉴클레오티드, 및 LPF 및 LPB의 경우 적어도 10, 15, 17 또는 18개의 뉴클레오티드일 수 있다. 표적 핵산 서열에 특이적으로 결합하는 DNA 프라이머는 상응하는 영역과 적어도 80% 상보성, 구체적으로 90% 상보성, 보다 구체적으로 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보성을 갖는 핵산 서열을 가질 수 있다.
이러한 용어들은 통상적으로 루프-매개 등온 증폭 (loop-mediated isothermal amplification: LAMP) 방법과 관련된 방법, 예컨대 Nagamine et al. 2002. Molecular and Cellular Probes 16. 223-229에 기재된 방법에 사용된다.
본 발명의 방법 내에서, F3 프라이머는 사용되지 않으며, 따라서 제5 프라이머는 B3 프라이머인 것이 바람직하다. 이는 놀랍게도 B3 프라이머가 존재하지만 F3 프라이머가 부재할 때 검출이 더 빠르고 더 감수성이 있다는 것을 본 발명자들이 발견하였기 때문이다. 본 발명의 방법을 사용하여, 검출은 10분 이내에 가능하고 샘플내 미리-결정된 RNA 서열의 적은 수를 검출하는데 더 감수성이 있는 것으로 관찰되었다 (도 1). 즉, 첨부된 실시예에 나타난 바와 같이, 미코플라스마 속 박테리아의 16S rRNA의 미리-결정된 RNA 서열의 포지티브 검출은 5개의 프라이머, 구체적으로 FIP, BIP, LPF, LPB 및 B3을 사용하여 프라이머 및 효소 부가 후 10분 이내에 달성하였다 (도 1). 인간 헤르페스바이러스의 미리-결정된 DNA 서열의 포지티브 검출은 5개의 프라이머, 구체적으로 FIP, BIP, LPF, LPB 및 B3을 사용하여 프라이머 및 효소 부가 후 10분 이내에 달성하였다 (도 2). 따라서, 본 발명의 방법은 처음으로, 예를 들어 감염병의 대유행 발생을 제어하는데 중요한 감염을 검출하는 신뢰할 수 있고 빠른 방법을 제공한다.
본 발명의 방법 내에서, RNA- 및/또는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성 및 가닥-치환 활성의 활성들을 제공하는 하나 이상의 효소가 사용된다. 즉, RNA 서열의 경우, 분석할 RNA 서열에 3가지 활성 모두를 부가해야 한다. DNA 서열의 경우, RNA-의존성 DNA 폴리머라제의 활성은 요구되지 않는다. 상기 활성은 모두 2개/3개의 활성을 갖는 하나의 효소, 또는 각각 2개/3개의 활성 중 하나 이상의 활성을 갖는 여러 효소에 의해 제공될 수 있다.
미리-결정된 핵산 서열은 RNA 또는 DNA 서열인 것이 바람직하다.
일부 구체예에서, 미리-결정된 RNA 또는 DNA 서열이 병원체에 포함되는 것이 바람직하다. 즉, 본원에 제공된 방법은 인간 대상체로부터 입수한 샘플에서 병원체의 핵산 서열의 존재를 검출하는데 사용된다. 따라서 본 발명은 특히 인간 대상체가 병원체에 의해 유발된 질병을 앓고 있는지 또는 앓을 가능성이 있는지 여부를 진단하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 병원체의 핵산 서열의 존재는 본원에 제공된 방법을 사용하여 결정되었다.
일부 구체예에서, 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기생충이다.
본원에서 사용된, 용어 "바이러스 (virus)"는 유기체의 살아있는 세포 내부에서만 복제하는 감염체를 지칭한다. (예를 들어, 세포 내부 또는 바이러스 외피 내에) 스타디움 (stadium)을 포함하는 임의의 핵산이 본 발명에 의해 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 아데노비리데 (Adenoviridae), 아넬로비리데 (Anelloviridae), 아레나비리데 (Arenaviridae), 아스트로비리데 (Astroviridae), 부냐비리데 (Bunyaviridae), 부냐바이러스 (Bunyavirus), 칼리시비리데 (Caliciviridae), 코로나비리데 (Coronaviridae), 필로비리데 (Filoviridae), 플라비비리데 (Flaviviridae), 헤파드나비리데 (Hepadnaviridae), 헤르페스비리데 (Herpesviridae), 오르토믹소비리데 (Orthomyxoviridae), 파필로마비리데 (Papillomaviridae), 파라믹소비리데 (Paramyxoviridae), 파르보비리데 (Parvoviridae), 피코르나비리데 (Picornaviridae), 뉴모비리데 (Pneumoviridae), 폴리오마비리데 (Polyomaviridae), 폭스비리데 (Poxviridae), 레오비리데 (Reoviridae), 레트로비리데 (Retroviridae), 라브도비리데 (Rhabdoviridae), 라브도바이러스 (Rhabdovirus), 토가비리데 (Togaviridae)로 구성된 그룹으로부터 선택된 속의 적어도 하나의 바이러스의 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 결정하는데 사용된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 아비오트로피아 (Abiotrophia), 아크로모박터 (Achromobacter), 아시드아미노코커스 (Acidaminococcus), 아시도보락스 (Acidovorax), 아시네토박터 (Acinetobacter), 악티노바실러스 (Actinobacillus), 악티노바쿨룸 (Actinobaculum), 악티노마두라 (Actinomadura), 악티노마이세스 (Actinomyces), 아에로코커스 (Aerococcus), 아에로모나스 (Aeromonas), 아피피아 (Afipia), 아그로박테리움 (Agrobacterium), 알칼리게네스 (Alcaligenes), 알로이오코커스 (Alloiococcus) 알테로모나스 (Alteromonas) 아미콜라타 (Amycolata), 아미콜라톱시스 (Amycolatopsis), 안에어로보스피릴룸 (Anaerobospirillum), 안에어로라브두스 (Anaerorhabdus), "안귈리나 (Anguillina)", 아라크니아 (Arachnia), 아르카노박테리움 (Arcanobacterium), 아르코박터 (Arcobacter), 아르트로박터 (Arthrobacter), 아토포비움 (Atopobium), 아우레오박테리움 (Aureobacterium), 바실러스 (Bacillus), 박테로이데스 (Bacteroides), 발네아트릭스 (Balneatrix), 바르토넬라 (Bartonella), 베르게옐라 (Bergeyella), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 빌로필라 (Bilophila), 브란하멜라 (Branhamella), 보렐리아 (Borrelia), 보르데텔라 (Bordetella), 브라키스피라 (Brachyspira), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 브레비박테리움 (Brevibacterium), 브레분디모나스 (Brevundimonas), 브루셀라 (Brucella), 부르콜데리아 (Burkholderia), 부티아욱셀라 (Buttiauxella), 부티리비브리오 (Butyrivibrio), 칼림마토박테리움 (Calymmatobacterium), 캄필로박터 (Campylobacter), 카프노사이토파가 (Capnocytophaga), 카르디오박테리움 (Cardiobacterium), 카토넬라 (Catonella), 세데세아 (Cedecea), 셀룰로모나스 (Cellulomonas), 센티페다 (Centipeda), 클라미디아 (Chlamydia), 클라미도필라 (Chlamydophila), 크로모박테리움 (Chromobacterium), 키세오박테리움 (Chyseobacterium), 크리세오모나스 (Chryseomonas), 시트로박터 (Citrobacter), 클로스트리디움 (Clostridium), 콜린셀라 (Collinsella), 코마모나스 (Comamonas), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 콕시엘라 (Coxiella), 크립토박테리움 (Cryptobacterium), 델프티아 (Delftia), 데르마박터 (Dermabacter), 데르마토필루스 (Dermatophilus), 데설포모나스 (Desulfomonas), 데설포비브리오 (Desulfovibrio), 디알리스터 (Dialister), 디켈로박터 (Dichelobacter), 돌로시코커스 (Dolosicoccus), 돌로시그라눌룸 (Dolosigranulum), 에드워드시엘라 (Edwardsiella), 에게르텔라 (Eggerthella), 에를리치아 (Ehrlichia), 에이케넬라 (Eikenella), 엠페도박터 (Empedobacter), 엔테로박터 (Enterobacter), 엔테로코커스 (Enterococcus), 아르위니아 (Erwinia), 에리시펠로트릭스 (Erysipelothrix), 에스케리치아 (Escherichia), 유박테리움 (Eubacterium), 에윈겔라 (Ewingella), 엑시구오박테리움 (Exiguobacterium), 파클라미아 (Facklamia), 필리팍터 (Filifactor), 플라비모나스 (Flavimonas), 플라보박테리움 (Flavobacterium), 플렉시스피라 (Flexispira), 프란시셀라 (Francisella), 푸소박테리움 (Fusobacterium), 가르드네렐라 (Gardnerella), 게멜라 글로비카텔라 (Gemella Globicatella), 고르도나 (Gordona), 헤모필루스 (Haemophilus), 하프니아 (Hafnia), 헬리코박터 (Helicobacter), 헬로코커스 (Helococcus), 홀데마니아 (Holdemania), 이그나비그라눔 (Ignavigranum), 존소넬라 (Johnsonella), 킨겔라 (Kingella), 클레브시엘라 (Klebsiella), 코쿠리아 (Kocuria), 코세렐라 (Koserella), 쿠르티아 (Kurthia), 키토코커스 (Kytococcus), 락토바실러스 (Lactobacillus), 락토코커스 (Lactococcus), 라우트로피아 (Lautropia), 레클레르시아 (Leclercia), 레지오넬라 (Legionella), 레미노렐라 (Leminorella), 렙토스피라 (Leptospira), 렙토트리키아 (Leptotrichia), 루코노스톡 (Leuconostoc), 리스테리아 (Listeria), 리스토넬라 (Listonella), 메가스패라 (Megasphaera), 메틸로박테리움 (Methylobacterium), 마이크로박테리움 (Microbacterium), 마이크로코커스 (Micrococcus), 미추오켈라 (Mitsuokella), 모빌룬쿠스 (Mobiluncus), 모엘레렐라 (Moellerella), 모락셀라 (Moraxella), 모르가넬라 (Morganella), 미코박테리움 (Mycobacterium), 미코플라스마 (Mycoplasma), 미로이데스 (Myroides), 네이세리아 (Neisseria), 노카르디아 (Nocardia), 노카르디옵시스 (Nocardiopsis), 오크로박트룸 (Ochrobactrum), 오에스코비아 (Oeskovia), 올리겔라 (Oligella), 오리엔티아 (Orientia), 파에니바실러스 (Paenibacillus), 판토에아 (Pantoea), 파라클라미디아 (Parachlamydia), 파스테렐라 (Pasteurella), 페디오코커스 (Pediococcus), 펩토코커스 (Peptococcus), 펩토스트렙토코커스 (Peptostreptococcus), 포토박테리움 (Photobacterium), 포토라브두스 (Photorhabdus), 플레시오모나스 (Plesiomonas) 포르피리모나스 (Porphyrimonas), 프레보텔라 (Prevotella), 프로피오니박테리움 (Propionibacterium), 프로테우스 (Proteus), 프로비덴시아 (Providencia), 슈도모나스 (Pseudomonas), 슈도노카르디아 (Pseudonocardia), 슈도라미박터 (Pseudoramibacter), 사이크로박터 (Psychrobacter), 라넬라 (Rahnella), 랄스토니아 (Ralstonia), 로도코커스 (Rhodococcus), 리케치아 (Rickettsia), 로칼리메아 (Rochalimaea), 로세오모나스 (Roseomonas), 로티아 (Rothia), 루미노코커스 (Ruminococcus), 살모넬라 (Salmonella), 셀레노모나스 (Selenomonas), 세르풀리나 (Serpulina), 세라티아 (Serratia), 쉐웨넬라 (Shewenella), 시겔라 (Shigella), 심카니아 (Simkania), 슬라키아 (Slackia), 스핑고박테리움 (Sphingobacterium), 시핑고모나스 (Sphingomonas), 스피릴룸 (Spirillum), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 스테노트로포모나스 (Stenotrophomonas), 스토마토코커스 (Stomatococcus), 스트렙토바실러스 (Streptobacillus), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 숙시니비브리오 (Succinivibrio), 수테렐라 (Sutterella), 수토넬라 (Suttonella), 타투멜라 (Tatumella), 티시에렐라 (Tissierella), 트라불시엘라 (Trabulsiella), 트레포네마 (Treponema), 트로페리마 (Tropheryma), 차카무렐라 (Tsakamurella), 투리셀라 (Turicella), 우레아플라스마 (Ureaplasma), 바고코커스 (Vagococcus), 베일로넬라 (Veillonella), 비브리오 (Vibrio), 위크셀라 (Weeksella), 볼리넬라 (Wolinella), 크산토모나스 (Xanthomonas), 크세노르하브두스 (Xenorhabdus), 여시니아 (Yersinia) 및 요케넬라 (Yokenella)로 구성된 그룹으로부터 선택된 속으로부터 적어도 하나의 박테리아의 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 결정하는데 사용된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 칸디다 (Candida), 아스페르길루스 (Aspergillus), 크립토코커스 (Cryptococcus), 히스토플라스마 (Histoplasma), 뉴모시스티스 (Pneumocystis) 및/또는 스타키보트리스 (Stachybotrys)로 구성된 그룹으로부터 선택된 속의 적어도 하나의 진균의 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 결정하는데 사용된다.
본원에서 사용된, "기생충 (parasite)"은 제2 유기체 내부 또는 유기체 상에 사는 유기체를 지칭한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 체외 기생충 (Ectoparasites), 원생동물 유기체 (Protozoan organisms) 및/또는 연충 (Helminths) 예컨대 촌충 (Tapeworms), 흡충 (Flukes) 및/또는 회충 (Roundworms)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 속으로부터 적어도 하나의 기생충의 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 결정하는데 사용된다.
일 구체예에서, 특히 미코플라스마 뉴모니에 (Mycoplasma pneumoniae)의 경우, 본 발명의 방법에 사용되는 프라이머는 하기 중 일부 또는 바람직하게는 전부인 것이 바람직하다:
1. FIP 프라이머는 TGC GGG TCC CCG TCA ATT GCC TGG GTA GTA CAT TCG (서열 번호: 1)의 서열을 포함하고; 및/또는
2. BIP 프라이머는 CAA GTG GTG GAG CAT GTT TGT CAA GTC TAG GTA AGG (서열 번호: 2)의 서열을 포함하며, 및/또는
3. LPF 프라이머는 GTT TGA GTT TCA TTC TTG (서열 번호: 3)의 서열을 포함하고; 및/또는
4. LPB 프라이머는 CTT AAT TCG ACG GTA CAC (서열 번호: 4)의 서열을 포함하며; 및/또는
5. B3 프라이머는 TGT TTC CAT AAC TTT GCC (서열 번호: 5)의 서열을 포함한다.
상기 프라이머 서열은 미코플라스마 뉴모니에의 서열을 표적으로 한다. 구체적으로, 상기 프라이머는 하기 서열을 표적으로 한다.
#AF132740.1_Mycoplasma_pneumoniae_strain_ATCC_15531_16S_ribosomal_RNA_gene_and_16S-23S_rRNA_intergenic_spacer_complete_sequence
TTAACGCTGGCGGCATGCCTAATACATGCAAGTCGATCGAAAGTAGTAATACTTTAGAGGCGAACGGGTGAGTAACACGTATCCAATCTACCTTATAATGGGGGATAACTAGTTGAAAGACTAGCTAATACCGCATAAGAACTTTGGTTCGCATGAATCAAAGTTGAAAGGACCTGCAAGGGTTCGTTATTTGATGAGGGTGCGCCATATCAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCAATGACGTGTAGCTATGCTGAGAAGTAGAATAGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTTCACAATGAGCGAAAGCTTGATGGAGCAATGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTTAAGATTGTAAAGTTCTTTTATTTGGGAAGAATGACTTTAGCAGGTAATGGCTAGAGTTTGACTGTACCATTTTGAATAAGTGACGACTAACTATGTGCCAGCAGTCGCGGTAATACATAGGTCGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCAAGCGCAGGCGGATTGAAAAGTCTGGTGTTAAAGGCAGCTGCTTAACAGTTGTATGCATTGGAAACTATTAATCTAGAGTGTGGTAGGGAGTTTTGGAATTTCATGTGGAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGAAAACTTAGGCCATTACTGACGCTTAGGCTTGAAAGTGTGGGGAGCAAATAGGATTAGATACCCTAGTAGTCCACACCGTAAACGATAGATACTAGCTGTCGGGGCGATCCCCTCGGTAGTGAAGTTAACACATTAAGTATCTCGCCTGGGTAGTACATTCGCAAGAATGAAACTCAAACGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGTGGTGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGGTACACGAAAAACCTTACCTAGACTTGACATCCTTGGCAAAGTTATGGAAACATAATGGAGGTTAACCGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCGTTAGTTACATTGTCTAGCGAGACTGCTAATGCAAATTGGAGGAAGGAAGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTAGGGCTGCAAACGTGCTACAATGGCCAATACAAACAGTCGCCAGCTTGTAAAAGTGAGCAAATCTGTAAAGTTGGTCTCAGTTCGGATTGAGGGCTGCAATTCGTCCTCATGAAGTCGGAATCACTAGTAATCGCGAATCAGCTATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCAAACTATGAAAGCTGGTAATATTTAAAAACGTGTTGCTAACCATTAGGAAGCGCATGTCAAGGATAGCACCGGTGATTGGAGTTAAGTCGTAACAAGGTACCCCTACGAGAACGTGGGGGTGGATCACCTCCTTTCTAATGGAGTTTTTTACTTTTTCTTTTCATCTTTAATAAAGATAAATACTAAACAAAACATCAAAATCCATTTATTTATCGGTGGTAAATTAAACCCAAATCCCTGTTTGGTCTCACAACTAACATATTTGGTCAGATTGTATCCAGTTCTGAAAGAACATTTCCGCTTCTTTCAAAACTGAAAACGACAATCTTTCTAGTTCCAAATAAATACCAAAGGATCAATACAATAAGTTACTAAGGGCTTATGGTG (서열 번호: 13)
일부 구체예에서, 구체적으로 미코플라스마 뉴모니에의 경우, 본 발명의 방법에 사용된 프라이머는 하기의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다:
a) 서열: TGC GGG TCC CCG TCA ATT GCC TGG GTA GTA CAT TCG (서열 번호: 1)에 대해 적어도 88%, 91%, 94%, 97% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 서열은 여전히 프라이머 기능을 제공하는 것인 FIP 프라이머,
b) 서열: CAA GTG GTG GAG CAT GTT TGT CAA GTC TAG GTA AGG (서열 번호: 2)에 대해 적어도 88%, 91%, 94%, 97% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 서열은 여전히 프라이머 기능을 제공하는 것인 BIP 프라이머,
c) 서열: GTT TGA GTT TCA TTC TTG (서열 번호: 3)에 대해 적어도 88%, 94%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 서열은 여전히 프라이머 기능을 제공하는 것인 LPF 프라이머,
d) 서열: CTT AAT TCG ACG GTA CAC (서열 번호: 4)에 대해 적어도 88%, 94%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 서열은 여전히 프라이머 기능을 제공하는 것인 LPB 프라이머, 및
e) 서열: TGT TTC CAT AAC TTT GCC (서열 번호: 5)에 대해 적어도 88%, 94%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 서열은 여전히 프라이머 기능을 제공하는 것인 B3 프라이머,
바람직하게는, 상기 프라이머 기능은 서열 번호: 13의 프라이머 기능이다.
일 구체예에서, 특히 인간 헤르페스바이러스 1 (Human herpesvirus 1)의 경우, 본 발명의 방법에 사용되는 프라이머는 하기 중 일부 또는 바람직하게는 전부인 것이 바람직하다:
1. FIP 프라이머는 GTT GGG TGG TGG AGG AGA CGT CCT TTT GGT TCT TGT CGG T (서열 번호: 7)의 서열을 포함하고; 및/또는
2. BIP 프라이머는 GGT CGT CCC TCG CAT GAA GCG GCG TGG TAA GGC TGA TG (서열 번호: 8)의 서열을 포함하며, 및/또는
3. LPF 프라이머는 TTG GTG GGA ACC CCC GAT AC (서열 번호: 9)의 서열을 포함하고; 및/또는
4. LPB 프라이머는 AAC ATG ACC CAG ACC GGC AC (서열 번호: 10)의 서열을 포함하며; 및/또는
5. B3 프라이머는 TAC TTG GCA TGG GGG GTG (서열 번호: 11)의 서열을 포함한다.
상기 프라이머 서열은 인간 헤르페스바이러스 1의 서열을 표적으로 한다. 구체적으로, 상기 프라이머는 하기 서열을 표적으로 한다:
#AY240834.1_Human_herpesvirus_1_isolate_E19_US4_and_US5_genes_complete_cds_and_US6_gene_partial_cds
TGACCGCCCCCGGGGGGCGGTGCTGTTTGCGGGTTGGCACAAAAAGACCCCGACCCGCGTCTGTGGTGTTTTTGGCATCATGTCGCCGGGCGCCATGCGTGCCGTTGTTCCCATTATCCCATTCCTTTTGGTTCTTGTCGGTGTATCGGGGGTTCCCACCAACGTCTCCTCCACCACCCAACCCCAACTCCCGACCACCGGTCGTCCCTCGCATGAAGCCCCCAACATGACCCAGACCGGCACCACCGACTCTCCCACCGCCATCAGCCTTACCACGCCCGACCACACACCCCCCATGCCAAGTATCGGACTGGAGGAGGAGGAGGAAGAGGAGGAGGGGGCCGGGGATGGCGAACATCTTGAGGGGGGAGATGGGACCCGTGACACCCTACCCCAGTCCCCGGGTCCAGCCGTCCCGTTGGCCGGGGATGACGAGAAGGACAAACCCAACCGTCCCGTAGTCCCACCCCCCGGTCCCAACAACTCCCCCGCGCGCCCCGAGACCAGTCGACCGAAGACACCCCCCACCAGGATCGGGCCGCTGGCAACTCGACCCACGACCCAACTCCCCTCAAAGGGGCGACCCTTGGTTCCGACGCCTCAACATACCCCGCTGTTCTCGTTCCTCACTGCCTCCCCCGCCCTGGACACCCTCTTCGTCATCAGCACCGTCATCCACACCTTATCGTTTGTGTGTATTGTTGCGATGGCGACACACCTGTGTGGCGGTTGGTCCAGACGCGGGCGACGCACACACCCTAGCGTGCGTTACGTGTGCCTGCCGCCCGAACGCGGGTAGGGTATGGGGAGAGCCTACACGCGGAAAGCAAGAACAATAAAGGCGGCGGGATCTAGTTGATATGCGTCTCTGGGTGTTTTTGGGGTGTGGCGGGCGCCGGGCGGTCATTGGACGGGGTGCAGTTAAATACATGCCCGGGACCCATGAAGCATGCGCGACTTCCGGGCCTCGGAACCCACCCGAAACGGCCAACGGACGTCTGAGCCAGGCCTGGCTATCCGGAGAAACAACACACGACTTGGCGTTCTGTGTGTCGCGATGTCTCTGCGCGCAGTCTGGCATCTGGGGCTTTTGGGAAGCCTCGTGGGGGCTGTTCTTGCCGCCACCCATCTGGGACCTGCGGCCAACACAACGGACCCCTTAACGCACGCCCCAGTGTCCCCTCACCCCAGCCCCCTGGGGGGCTTTGCCGTCCCCCTCGTAGTCGGTGGGCTGTGTGCCGTAGTCCTGGGGGCGGCGTGTCTGCTTGAGCTCCTGCGTCGTACGTGCCGCGGGTGGGGGCGTTACCATCCCTACATGGACCCAGTTGTCGTATAAGATGTCGGGTCCAAACTCCCGACACCACCAGCTGGCATGGTATAAATCACCGGTGCGCCCCCCAAACCATGTCCGGCAGGGGGATGGGCACCCAACAACACCGGGCTAACCAGGAAATCCGTGGCCCCGGCCCCCAACAAAGATCGCGGTAGCCCGGCCGTGTGACACTATCGTCCATACCGACCACACCGACGAATCCCCTAAGGGGGAGGGGCCATTTTACGAGGAGGAGGGGTATAACAAAGTCTGTCTTTAAAAAGCAGGGGTTAGGGAGTTGTTCGGTCATAAGCTTCAGCGCGAACGACCAACTACCCCGATCATCAGTTATCCTTAAGGTCTCTTTTGTGTGGTGCGTTCCGGTATGGGGGGGGCTGCCGCCAGGTTGGGGGCCGTGATTTTGTTTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGGATGCCTCTCTT (서열 번호: 14)
일부 구체예에서, 구체적으로 인간 헤르페스바이러스 1의 경우, 본 발명의 방법에 사용된 프라이머는 하기의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다:
a) 서열: GTT GGG TGG TGG AGG AGA CGT CCT TTT GGT TCT TGT CGG T (서열 번호: 7)에 대해 적어도 87%, 90%, 92%, 95%, 97% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 서열은 여전히 프라이머 기능을 제공하는 것인 FIP 프라이머,
b) 서열: GGT CGT CCC TCG CAT GAA GCG GCG TGG TAA GGC TGA TG (서열 번호: 8)에 대해 적어도 89%, 92%, 94%, 97% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 서열은 여전히 프라이머 기능을 제공하는 것인 BIP 프라이머,
c) 서열: TTG GTG GGA ACC CCC GAT AC (서열 번호: 9)에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 서열은 여전히 프라이머 기능을 제공하는 것인 LPF 프라이머,
d) 서열: AAC ATG ACC CAG ACC GGC AC (서열 번호: 10)에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 서열은 여전히 프라이머 기능을 제공하는 것인 LPB 프라이머, 및
e) 서열 TAC TTG GCA TGG GGG GTG (서열 번호: 11)에 대해 적어도 88%, 94%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 서열은 여전히 프라이머 기능을 제공하는 것인 B3 프라이머,
바람직하게는, 상기 프라이머 기능은 서열 번호: 14의 프라이머 기능이다.
참조 서열에 대한 "서열 동일성 퍼센트 (%)"는 서열들을 정렬하고, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 필요한 경우 갭 (gaps)을 도입한 후에, 후보 서열의 뉴클레오티드가 참조 서열의 뉴클레오티드와 동일한 퍼센트로 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 목적의 정렬은 예를 들어 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여, 당해 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열 정렬을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
그러나, 당업자는 샘플내 검출할 표적 서열에 따라 대체 또는 추가 프라이머 서열을 디자인하는 방법을 잘 알고 있다 (예를 들어, Jia, B., et al., 2019, Frontiers in microbiology, 10, 2860 참조).
본 발명의 방법에서, 구체적으로 이의 단계 (c)에서, 온도는 고정될 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "고정된 온도 (fixed temperature)"는 효소 및 프라이머가 실질적으로 기능할 수 있도록 온도 조건을 일정하거나 또는 거의 일정하게 유지하는 것을 지칭한다. 거의 일정한 온도 조건은 설정한 온도를 정확하게 유지하는 것 뿐만 아니라, 효소 및 프라이머의 실질적인 기능을 손상시키지 않는 범위 내에서 약간의 온도 변화만이 허용 가능하다는 것을 의미한다. 예를 들어, 약 0 내지 10℃의 온도 변화가 허용된다.
고정된 온도하에 핵산 증폭 반응은 사용할 효소의 활성이 유지될 수 있는 수준으로 온도를 유지함으로써 수행될 수 있다. 또한, 상기 핵산 증폭 반응에서 프라이머를 표적 핵산에 어닐링하기 위해, 예를 들어 반응 온도는 프라이머의 Tm 값 부근 또는 그 미만의 온도로 설정할 수 있으며, 프라이머의 Tm 값을 고려하여 엄격성 수준으로 이를 설정하는 것이 바람직하다. 상기 핵산 증폭 반응에서, 증폭 반응은 효소가 불활성화되거나, 또는 프라이머를 포함한 시약들 중 하나가 소진될 때까지 반복될 수 있다.
즉, 하나 이상의 효소, DNA 프라이머 및 분석할 샘플을 동일한 튜브에서 일정한 온도로 인큐베이션한다. 상기 온도는 바람직하게는 50 내지 75℃이다. 그러나, 상기 온도는 또한 더 낮을 수 있으며, 예를 들어 30 내지 75℃일 수 있다. 대안적인 구체예에서, 터치다운 온도 단계 (touchdown temperature step)가 사용된다. 즉, 상기 온도는 분석 과정 중에 더 낮으며, 예를 들어 70℃의 온도에서 시작하여 이후에 50℃로 더 낮춘다.
본 발명의 방법에서, 하나 이상의 효소, DNA 프라이머 및 분석할 샘플을 동일한 튜브에서 1분 내지 120분, 바람직하게는 1분 내지 60분, 1분 내지 45분, 1분 내지 30분, 또는 1분 내지 15분 동안 인큐베이션한다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 샘플을 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30분 동안 인큐베이션한다.
본 발명의 방법은 이중-가닥 연장된 DNA 서열이 샘플내에 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 구체적으로 샘플내 이중-가닥 연장된 DNA 서열의 존재는 샘플내 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 나타낸다. 당업자는 특히 검출할 서열이 알려져 있는 경우, 샘플내 이중-가닥 DNA 서열의 존재를 결정하기 위해 사용되는 적합한 방법을 잘 알고 있다. 따라서, 해당 목적을 위해 당업자에게 알려진 임의의 방법이 본 발명 내에서 사용될 수 있다. 그러나, 연장된 이중-가닥 DNA의 존재는 연장된 이중-가닥 DNA 서열에 혼성화할 수 있는 핵산 분자를 사용하여 결정되는 것이 바람직하며, 구체적으로 핵산 분자는 연장된 이중-가닥 DNA 서열에 삽입되는 분자를 사용하거나 또는 혼탁도 측정을 사용하여 표지된다.
본원에서 사용된, 용어 "표지 (label)" 또는 이의 문법적 변형은 임의의 검출 가능하거나 또는 신호-생성 분자 또는 리포터 분자를 지칭한다. 편리한 표지로는 비색, 화학발광, 발색, 방사성 및 형광 표지를 포함하지만, 효소적 (예: 비색, 발광, 발색) 또는 항체-기반 표지화 방법 또는 신호-생성 시스템이 또한 사용될 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 "표지 (label)"는 직접 검출 가능한 신호-제공 또는 수동적 모이어티뿐만 아니라, 신호를 생성하거나 또는 신호 생성 반응에 참여하거나 또는 어떤 방식으로든 간접적으로 검출할 수 있는 임의의 모이어티를 포함한다. 본원에서 사용된 "표지된 (labelled)"은 검출 가능한 표지와 연결되거나 또는 이에 결합되는 것을 의미한다.
연장된 이중-가닥 DNA 서열이 샘플내에 존재하는지 여부를 결정하는 것은 형광 보고 (fluorescence reporting)를 통해 달성될 수 있다. 이러한 접근법의 대부분은 삽입 염료 (intercalating dyes), 예컨대 에티듐 브로마이드, SYBR Green, EvaGreen 및 YO-PRO-I의 사용에 기반한다 (Zhang X, et al. 2013, PLoS One 8(12):e82841; Mair G. et al. 2013, BMC Veterinary Research 9: 108.). 본원에서 사용된, "삽입하는 (intercalates)" 물질 또는 염료는 핵산 이중 나선으로 적층된 염기쌍들 사이에 비-공유 삽입이 가능한 물질 또는 모이어티를 지칭한다. 연장된 이중-가닥 DNA 서열이 샘플내에 존재하는지 여부를 결정하는 것은 FRET (Forster resonance energy transfer) 기전에 의존하는 형광 기술에 의해 달성될 수 있다 (Chen Q, et al., 1997, Biochemistry 36(15):4701- 11). 본 발명의 소정의 구체예에서, LPB 및/또는 LPF는 적어도 하나의 표지 및/또는 수용체 형광단으로 5' 단부에서 표지된다.
본원에서 사용된, 용어 "혼탁도 (turbidity)"는 빛이 산란되거나 또는 흡수되도록 하는 유체 또는 투명한 고체 중에 부유 및/또는 가용성 입자의 척도를 지칭한다. 본 발명의 소정의 구체예에서, 연장된 이중-가닥 DNA 서열이 샘플내에 존재하는지 여부에 대한 간접적인 결정은 본질적으로 반응 부산물로서 피로포스페이트의 형성에 의존한다. 피로포스페이트 이온은 핵산 중합 중에 DNA 가닥에 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP)를 혼입함으로써 방출될 수 있으며, 이들 이온은 반응 혼합물에 존재하는 2가 금속 이온, 구체적으로 마그네슘 이온과 반응하여 백색의 불용성 마그네슘 피로포스페이트 침전물을 생성한다 (Mori Y., et al. 2001 (Biochem. Biophys. Res. Commun. 289: 150-154에 기재된 바와 같음). 이러한 침전물은 반응 용액의 혼탁도를 점진적으로 증가시키고, 피로포스페이트 침전물은 혼탁도 측면에서 정량적으로 측정될 수 있거나, 또는 원심분리 후 펠렛으로서 육안으로 관찰될 수 있다. 본 발명의 대안적인 구체예에서, 연장된 이중-가닥 DNA 서열이 샘플내에 존재하는지 여부를 결정하는 것은 반응에서 망간 이온 및 칼세인 (calcein)의 혼입을 통해 달성된다. 칼세인 형광은 망간 이온의 결합에 의해 자연적으로 퀀칭된다. 반응 부산물로서 피로포스페이트 생성은 침전을 통해 버퍼로부터 망간 이온을 제거하고, 칼세인 형광 회복과 결합된 혼탁도 증가는 가시광선 또는 UV 광선으로 여기 시에 용이한 시각적 판독을 가능하게 한다 (Tomita N., et al. 2008. Nat. Protoc. 3:877-882). 본 발명의 또 다른 구체예에서, DNA 합성 중에 생성되는 ATP로 피로포스페이트의 효소적 전환은 연장된 이중-가닥 DNA 서열이 샘플내에 존재하는지 여부를 결정하기 위해 열안정성 반딧불이 (firefly) 루시퍼라제에 의해 생성된 생물발광을 통해 모니터링한다 (Gandelman OA., et al. 2010, PLoS One 5(11): el4155).
일반적으로, Becherer, Lisa, 등 ("Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-review and classification of methods for sequence-specific detection." Analytical Methods 12.6 (2020): 717-746)이 기재한 모든 방법은 본 발명의 방법과 조합될 수 있다.
추가 구체예에서, 본 발명은 병원체에 의해 감염된 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 대상체에게 유효량의 치료 약물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 대상체는 이전에 본 발명의 방법을 사용하여 병원체에 의해 감염된 것으로 결정되었다.
추가 구체예에서, 본 발명은 병원체 감염의 치료에 사용하기 위한 항-감염성 조성물에 관한 것이며, 상기 대상체는 이전에 본 발명의 방법을 사용하여 병원체에 의해 감염된 것으로 결정되었다.
본원에서 사용된, 용어 "항-감염성 조성물 (anti-infective composition)"은 항바이러스 약물, 항생제 약물, 항진균 약물 및/또는 구충 약물을 포함하는 약제 또는 조성물을 지칭한다.
바람직한 구체예에서, 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기생충이다. 추가의 바람직한 구체예에서, 상기 치료 약물은 각각 항바이러스, 항생제, 항진균 또는 구충 약물이다.
본원에서 사용된, 용어 "항바이러스 약물 (antiviral drug)"은 바이러스-관련 질병에 대한 치료에 유용한 특성을 갖는 약물을 지칭한다. 항바이러스 약물은 특히 바이러스의 성장, 생존, 복제, 기능 및/또는 전파를 방지, 저해, 억제, 감소, 유해 영향 및/또는 방해하는 특성을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 항바이러스 약물은 항-헤르페스 바이러스 약물, 항-RNA 바이러스 약물 및 항레트로바이러스 약물의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 약제를 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 항바이러스 약물은 아바카비르 (Abacavir), 아시클로비르 (Acyclovir), 아데포비르 (Adefovir), 아만타딘 (Amantadine), 암플리겐 (Ampligen), 암프레나비르 (Amprenavir), 우미페노비르 (Umifenovir), 아타자나비르 (Atazanavir), 아트리플라 (Atripla), 발록사비르 마르복실 (Baloxavir marboxil), 비크타르비 (Biktarvy), 보세프레비르 (Boceprevir), 불레비르타이드 (Bulevirtide), 시도포비르 (Cidofovir), 코비시스타트 (Cobicistat), 콤비비르 (Combivir), 다클라타스비르 (Daclatasvir), 다루나비르 (Darunavir), 델라비르딘 (Delavirdine), 데스코비 (Descovy), 디다노신 (Didanosine), 도코사놀 (Docosanol), 돌루테그라비르 (Dolutegravir), 도라비린 (Doravirine), 에독수딘 (Edoxudine), 에파비렌즈 (Efavirenz), 엘비테그라비르 (Elvitegravir), 엠트리시타빈 (Emtricitabine), 엔푸비르타이드 (Enfuvirtide), 엔테카비르 (Entecavir), 에트라비린 (Etravirine), 팜시클로비르 (Famciclovir), 포미비르센 (Fomivirsen), 포삼프레나비르 (Fosamprenavir), 포스카르네트 (Foscarnet), 간시클로비르 (Ganciclovir), 이바시타빈 (Ibacitabine), 이발리주맙 (Ibalizumab), 이독수리딘 (Idoxuridine), 이미퀴모드 (Imiquimod), 이무노비르 (Imunovir), 인디나비르 (Indinavir), 라미부딘 (Lamivudine), 레테르모비르 (Letermovir), 로피나비르 (Lopinavir), 로비라이드 (Loviride), 마라비록 (Maraviroc), 메티사존 (Methisazone), 모록시딘 (Moroxydine), 넬피나비르 (Nelfinavir), 네비라핀 (Nevirapine), 넥사비르 (Nexavir), 니타족사나이드 (Nitazoxanide), 노르비르 (Norvir), 오셀타미비르 (Oseltamivir), 펜시클로비르 (Penciclovir), 페라미비르 (Peramivir), 펜시클로비르 (Penciclovir), 페라미비르 (Peramivir), 플레코나릴 (Pleconaril), 포도필로톡신 (Podophyllotoxin), 랄테그라비르 (Raltegravir), 렘데시비르 (Remdesivir), 리바비린 (Ribavirin), 릴피비린 (Rilpivirine), 릴피비린 (Rilpivirine), 리만타딘 (Rimantadine), 리토나비르 (Ritonavir), 사퀴나비르 (Saquinavir), 시메프레비르 (Simeprevir), 소포스부비르 (Sofosbuvir), 스타부딘 (Stavudine), 타리바비린 (Taribavirin), 텔라프레비르 (Telaprevir), 텔비부딘 (Telbivudine), 테노포비르 (Tenofovir), 티프라나비르 (Tipranavir), 트리플루리딘 (Trifluridine), 트리지비르 (Trizivir), 트로만타딘 (Tromantadine), 트루바다 (Truvada), 우미페노비르 (Umifenovir), 발라시클로비르 (Valaciclovir), 발간시클로비르 (Valganciclovir), 비크리비록 (Vicriviroc), 비다라빈 (Vidarabine), 잘시타빈 (Zalcitabine), 자나미비르 (Zanamivir) 및 지도부딘 (Zidovudine)의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 약제를 포함한다.
본원에서 사용된, 용어 "항생제 약물 (antibiotic drug)"은 박테리아에 대항하는 유용한 특성을 갖고 및/또는 박테리아-관련 질병의 치료에 유용한 약제 및 조성물을 지칭한다. 항생제 약물은 특히 적어도 하나의 박테리아의 성장, 생존, 복제, 기능 및/또는 전파를 방지, 저해, 억제, 감소, 유해 영향 및/또는 방해하는 특성을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 항생제 약물은 항-박테리아 파지 (anti-bacterial phages), 마크롤라이드 (macrolides) (예: 에리트로마이신), 페니실린 (예: 나프실린), 세팔로스포린 (예: 세파졸린), 카르바페넴 (예: 이미페넴), 모노박탐 (예: 아즈트레오남), 다른 베타-락탐 항생제, 베타-락탐 억제제 (예: 설박탐), 옥살린 (예: 리네졸리드), 아미노글리코시드 (예: 겐타마이신), 클로람페니콜, 설폰아미드 (예: 설파메톡사졸), 글리코펩티드 (예: 반코마이신), 퀴놀론 (예: 시프로플록사신), 테트라사이클린 (예: 미노사이클린), 푸시드산, 트리메토프림, 메트로니다졸, 클린다마이신, 무피로신, 리파마이신 (예: 리팜핀), 스트렙토그라민 (예: 퀴누프리스틴 및 달포프리스틴) 지질단백질 (lipoprotein) (예: 다프토마이신) 및 폴리엔 (polyenes) (예: 암포테리신 B)의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 약제를 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 항생제 약물은 아목시실린, 아지트로마이신, 아목시실린/클라불라네이트, 클린다마이신, 세팔렉신, 시프로플록사신, 설파메톡사졸/트리메토프림 및 메트로니다졸의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 약제를 포함한다.
본원에서 사용된, 용어 "항진균 약물 (antifungal drug)"은 진균-관련 질병의 치료에 유용한 특성을 갖는 약제 및 조성물을 지칭한다. 항진균 약물은 특히 적어도 진균의 성장, 생존, 복제, 기능 및/또는 전파를 방지, 저해, 억제, 감소, 유해 영향 및/또는 방해하는 특성을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 항진균 약물은 에키노칸딘스 (echinocandins), 이미다졸 항진균제 (imidazole antifungals), 라노스테롤 14α-데메틸라제 억제제 (lanosterol 14α-demethylase inhibitors) 및 트리아졸 항진균제 (triazole antifungals)의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 약제를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 항진균 약물은 아바푼긴 (Abafungin), 아세트산 (Acetic acid), 아크리소르신 (Acrisorcin), 알리신 (Allicin), 아미노칸딘 (Aminocandin), 아모롤핀 (Amorolfine), 암포테리신 B (Amphotericin B), 아니둘라푼긴 (Anidulafungin), 바실로마이신 (Bacillomycin), 비포나졸 (Bifonazole), 블라스티시딘 A (Blasticidin A), 붕산 (Boric acid), 브로모클로로살리실아닐라이드 (Bromochlorosalicylanilide), 부테나핀 (Butenafine), 칸디시딘 (Candicidin), 카프릴산 (Caprylic acid), 카스포푼긴 (Caspofungin), 세룰레닌 (Cerulenin), 클로르단토인 (Chlordantoin), 클로르미다졸 (Chlormidazole), 클로로페타놀 (Chlorophetanol), 클로록시레놀 (Chloroxylenol), 시클로피록스 (Ciclopirox), 실로푼긴 (Cilofungin), 신나몬 (Cinnamon), 클리오퀴놀 (Clioquinol), 크레올린 (Creolin), 크로코다일 오일 (Crocodile oil), 크루엔타렌 (Cruentaren), 크리스탈 바이올렛 (Crystal violet), 디마졸 (Dimazole), 드로소마이신 (Drosomycin), 에키노칸딘 (Echinocandin), 에키노칸틴 B (Echinocandin B), 에토남 (Ethonam), 펜티클로르 (Fenticlor), 필리핀 (Filipin), 그리세오풀빈 (Griseofulvin), 할리실린드라마이드 (Halicylindramide), 할로프로긴 (Haloprogin), 하마이신 (Hamycin), 히노키닌 (Hinokinin), 하이드로코르티손 (hydrocortisone), 루페누론 (Lufenuron), 룰리코나졸 (Luliconazole), 의료용 진균 (Medicinal fungi), 멜라픽스 (Melafix), 미카푼긴 (Micafungin), 밀테포신 (Miltefosine), 미코바실린 (Mycobacillin), 나타마이신 (Natamycin), 닉코마이신 (Nikkomycin), 니스타틴 (Nystatin), 오로토마이드 (Orotomide), 파풀라칸딘 B (Papulacandin B), 파리에틴 (Parietin), 페실로신 (Pecilocin), 펜타미딘 (Pentamidine), 페리마이신 (Perimycin), 피록톤 올라민 (Piroctone olamine), 뉴모칸딘 (Pneumocandin), 폴리엔 항진균제 (Polyene antimycotic), 프틸로마이칼린 A (Ptilomycalin A), 피롤니트린 (Pyrrolnitrin), 리모프로긴 (Rimoprogin), 셀레늄 디설파이드 (Selenium disulfide), 스파라솔 (Sparassol), 스트렙토마이세스 단리물 (Streptomyces isolates), 설벤틴 (Sulbentine), 타바보롤 (Tavaborole), 티트리 오일 (Tea tree oil), 테르비나핀 (Terbinafine), 테오넬라미드 F (Theonellamide F), 투자플리신 (Thujaplicin), 타임 (Thyme), 티클라톤 (Ticlatone), 톨시클레이트 (Tolciclate), 톨나프테이트 (Tolnaftate), 트리코스타틴 A (Trichostatin A), 트리클로산 (Triclosan), 트리메트렉세이트 (Trimetrexate), 운데실렌산 (Undecylenic acid), 벤투리시딘 (Venturicidin), 비닐디티인 (Vinyldithiin), 부시온 (Vusion) 및 아연 피리티온 (Zinc pyrithione)의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 약제를 포함한다.
본원에서 사용된, 용어 "구충 약물 (antiparasitic drug)"은 기생충-관련 질병의 치료에 유용한 특성을 갖는 약물을 지칭한다. 구충 약물은 특히 기생충의 성장, 생존, 복제, 기능 및/또는 전파를 방지, 저해, 억제, 감소, 유해 영향 및/또는 방해하는 특성을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 구충 약물은 아바멕틴 (abamectin), 아바메타피르 (abametapir), 항세스토달제 (anticestodal agent), 아르프리노시드 (arprinocid), 아르센아미드 (arsenamide), 아스카리사이드 (ascaricide), 아베르멕틴 (avermectin), 베페니움 하이드록시나프토에이트 (bephenium hydroxynaphthoate), 비티오놀 (bithionol), 카르바독스 (carbadox), 클로피돌 (clopidol), 시미아졸 (cymiazole), 데코퀴네이트 (decoquinate), 디클로로펜 (dichlorophen), 디클라주릴 (diclazuril), 디에틸카르바마진 (diethylcarbamazine), 디메트리다졸 (dimetridazole), 체외기생충 살충제 (ectoparasiticide), 에모뎁사이드 (emodepside), 에프리노멕틴 (eprinomectin), 에토파베이트 (ethopabate), 펙시니다졸 (fexinidazole), 플루벤다졸 (flubendazole), 할로푸기논 (halofuginone), 하이칸톤 (hycanthone), 이소메타미디움 클로라이드 (isometamidium chloride), 이베르멕틴 (ivermectin), 라살로시드 (lasalocid), 말라티온 (malathion), 의료용 진균 (medicinal fungi), 멜라르소민 (melarsomine), 메트리포네이트 (metrifonate), 밀베마이신 옥심 (milbemycin oxime)/루페누론 (lufenuron), 나라신 (narasin), 니푸르티목스 (nifurtimox)/에플로르니틴 (eflornithine), 니리다졸 (niridazole), 니타족사나이드 (nitazoxanide), 니트록시닐 (nitroxinil), 올티프라즈 (oltipraz), 오리잘린 (oryzalin), 옥삼니퀸 (oxamniquine), 옥산텔 (oxantel), 파푸라미딘 (pafuramidine), 페르메트린 (permethrin), 프라지쿠안텔 (praziquantel), 프로파미딘 (propamidine), 퀴나피라민 (quinapyramine), 로베니딘 (robenidine), 살리실하이드록삼산 (salicylhydroxamic acid), 살리노마이신 (salinomycin), 셀라멕틴 (selamectin), 스티보펜 (stibophen), 스트렙토마이세스 단리물 (streptomyces isolates), 주형: 항-절지동물 약제 (template:anti-arthropod medications), 테트라페닐포르핀 설포네이트 (tetraphenylporphine sulfonate), 티아벤다졸 (tiabendazole) 및 톨트라주릴 (toltrazuril)의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 약제를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 사용을 위한 항-감염성 조성물에 관한 것이며, 상기 병원체는 인간 헤르페스바이러스 또는 미코플라스마 속 박테리아이다.
당업자는 일단 병원체가 본 발명의 방법을 사용하여 특정되면 병원체에 의한 감염을 치료하는 방법을 알고 있다.
본 발명의 방법은 병원체를 효과적으로 결정할 수 있고, 조기 검출, 스크리닝, 모니터링 및/또는 과거 감염의 확인을 용이하게 한다.
그러므로, 본 발명의 방법에 의해 가능해진 병원체의 결정은 후속적으로 감염 치료를 개선하고, 병원체 확산을 감소시키고 및/또는 질병 진행을 피할 수 있다.
본 발명은 또한 키트 (kit), 구체적으로 인간 대상체로부터의 샘플내 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 결정하는데 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 본 발명의 방법에 사용되는 5개의 프라이머 모두 또는 본원에서 사용되는 6개의 프라이머를 포함할 수 있다. 키트는 상이한 표적 서열을 표적으로 하는 하나 초과의 프라이머 시스템을 포함할 수 있으며, 상기 상이한 표적 서열은 예를 들어 소광제-형광단 듀플렉스 영역을 함유하는 프라이머를 사용함으로써, 동일한 병원체 또는 상이한 병원체의 일부일 수 있다 (Tanner NA, Zhang Y, Evans TC Jr. Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification. Biotechniques. 2012;53(2):81-89.). 이와 같이, 하나의 실험에서 하나 초과의 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해 키트를 사용할 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 키트 (문맥상 제조됨) 또는 본 발명의 방법 및 용도는 지침 매뉴얼(들)을 추가로 포함하거나, 또는 이와 함께 제공될 수 있다. 예를 들어, 상기 지침 매뉴얼(들)은 본 발명에 따라 본원에 제공되는 진단 용도에서 본 발명의 키트를 사용하는 방법을 당업자에게 가이드할 수 있다. 구체적으로, 상기 지침 매뉴얼(들)은 본원에 제공된 방법 또는 용도를 사용하거나 또는 적용하기 위한 가이드를 포함할 수 있다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술을 가진 자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재된다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도는 아니다.
본원에 기재된 일반적인 방법 및 기술은 달리 지시하지 않는 한 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 당해 기술 분야에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), and Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)을 참조한다.
본 발명의 양상이 도면 및 전술한 설명에서 상세하게 예시되고 설명되지만, 이러한 예시 및 설명은 제한적이지 않고 예시적이거나 또는 실증적인 것으로 간주되어야 한다. 하기 청구범위의 범위 및 사상 내에서 변경 및 수정이 당업자에 의해 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 구체적으로, 본 발명은 상기 및 하기에 기재된 다양한 구체예로부터의 특징들의 임의의 조합을 갖는 추가 구체예를 포함한다.
도 1은 5개 또는 6개 프라이머 및 본원에 제공된 방법을 사용하여 몰리쿠테스강 박테리아에서 미리-결정된 16S rRNA 서열을 검출하기 위한 5개 및 6개 프라이머 시스템의 비교를 보여준다.
도 2는 5개 또는 6개 프라이머 및 본원에 제공된 방법을 사용하여 인간 헤르페스바이러스 1에서 미리-결정된 DNA 서열을 검출하기 위한 5개 및 6개 프라이머 시스템의 비교를 보여준다.
또한, 청구범위에서, 단어 "포함하는 (comprising)"은 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않으며, 부정관사 "a" 또는 "an"은 복수를 배제하지 않는다. 단일 유닛이 청구범위에 인용된 여러 특징들의 기능을 수행할 수 있다. 속성 또는 값과 관련하여 용어 "본질적으로 (essentially)", "약 (about)", "대략 (approximately)" 및 유사어는 또한 구체적으로 각각 속성을 정확하게 또는 값을 정확하게 정의한다. 청구범위에서 임의의 참조 기호는 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기에 제공된 일반적인 설명을 고려하여, 다양한 다른 구체예가 실시될 수 있음을 이해해야 한다.
F3이 부재한 신규한 5 프라이머 시스템은 F3이 존재하는 6 프라이머 시스템만큼 효과적으로 몰리쿠테스를 증폭한다.
프라이머
FIP TGC GGG TCC CCG TCA ATT GCC TGG GTA GTA CAT TCG (서열 번호: 1) LPF GTT TGA GTT TCA TTC TTG (서열 번호: 3)
BIP CAA GTG GTG GAG CAT GTT TGT CAA GTC TAG GTA AGG (서열 번호: 2) LPB CTT AAT TCG ACG GTA CAC (서열 번호: 4)
B3 TGT TTC CAT AAC TTT GCC (서열 번호: 5) F3 GTT AAC ACA TTA AGT ATC (서열 번호: 6)
프라이머 믹스: 신규한 5 프라이머 시스템
최종 농도.
FIP 1.6 μM
BIP 1.6 μM
LPF 0.8 μM
LPB 0.8 μM
B3 0.4 μM
프라이머 믹스: LAMP 6 프라이머 시스템
최종 농도
FIP 1.6 μM
BIP 1.6 μM
LPF 0.8 μM
LPB 0.8 μM
B3 0.2 μM
F3 0.2 μM
프라이머/효소 믹스 (PEM)
Vol/rx
등온 마스터 믹스 15.0 μl
프라이머 믹스 2.0 μl
17.0 μl
반응당 PEM 17.0 μl를 부가한다.
주형 부가
추출된 RNA 8.0 μl를 부가한다.
네가티브 분석 대조군으로서 무-RNase H2O 8.0 μl를 부가한다.
등온 증폭 및 염료 포착을 위한 설정
주기 온도 포착 시간 램프 속도
증폭 25 65℃ 없음 27 s 4.4℃
단일 30 s 4.4℃
채널 염료 Quant 인자 용융 인자 통합 시간
염료 포착 #1, 470/514 SYBR Green I 20.00 1.2 동적
F3이 부재한 신규한 5 프라이머 시스템은 F3이 존재하는 6 프라이머 시스템만큼 효과적으로 인간 헤르페스바이러스 1을 증폭한다.
프라이머
FIP GTT GGG TGG TGG AGG AGA CGT CCT TTT GGT TCT TGT CGG T (서열 번호: 7) LPF TTG GTG GGA ACC CCC GAT AC (서열 번호: 9)
BIP GGT CGT CCC TCG CAT GAA GCG GCG TGG TAA GGC TGA TG (서열 번호: 8) LPB AAC ATG ACC CAG ACC GGC AC (서열 번호: 10)
B3 TAC TTG GCA TGG GGG GTG (서열 번호: 11) F3 GCC GTT GTT CCC ATT ATC CC (서열 번호: 12)
프라이머 믹스: 신규한 5 프라이머 시스템
최종 농도.
FIP 1.6 μM
BIP 1.6 μM
LPF 0.8 μM
LPB 0.8 μM
B3 0.4 μM
프라이머 믹스: LAMP 6 프라이머 시스템
최종 농도
FIP 1.6 μM
BIP 1.6 μM
LPF 0.8 μM
LPB 0.8 μM
B3 0.2 μM
F3 0.2 μM
프라이머/효소 믹스 (PEM)
Vol/rx
등온 마스터 믹스 15.0 μl
프라이머 믹스 2.0 μl
17.0 μl
반응당 PEM 17.0 μl를 부가한다.
주형 부가
추출된 DNA 8.0 μl를 부가한다.
네가티브 분석 대조군으로서 무-RNase H2O 8.0 μl를 부가한다.
등온 증폭 및 염료 포착을 위한 설정
주기 온도 포착 시간 램프 속도
증폭 25 65℃ 없음 27 s 4.4℃
단일 30 s 4.4℃
채널 염료 Quant 인자 용융 인자 통합 시간
염료 포착 #1, 470/514 SYBR Green I 20.00 1.2 동적
SEQUENCE LISTING <110> Certus molecular diagnostics AG <120> Method for determining presence of a pre-determined nucleic acid sequence in human samples <130> AD2230 PCT BS <150> EP20179110.0 <160> 14 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer Mollicutes <400> 1 tgcgggtccc cgtcaattgc ctgggtagta cattcg 36 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer Mollicutes <400> 2 caagtggtgg agcatgtttg tcaagtctag gtaagg 36 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPF primer Mollicutes <400> 3 gtttgagttt cattcttg 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPB primer Mollicutes <400> 4 cttaattcga cggtacac 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer Mollicutes <400> 5 tgtttccata actttgcc 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 pimer Mollicutes <400> 6 gttaacacat taagtatc 18 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer Human herpesvirus 1 <400> 7 gttgggtggt ggaggagacg tccttttggt tcttgtcggt 40 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer Human herpesvirus 1 <400> 8 ggtcgtccct cgcatgaagc ggcgtggtaa ggctgatg 38 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPF primer Human herpesvirus 1 <400> 9 ttggtgggaa cccccgat 18 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPB primer Human herpesvirus 1 <400> 10 aacatgaccc agaccggcac 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer Human herpesvirus 1 <400> 11 tacttggcat ggggggtg 18 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer Human herpesvirus 1 <400> 12 gccgttgttc ccattatccc 20 <210> 13 <211> 1740 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mycoplasma pneumoniae strain ATCC 15531 16S ribosomal RNA gene and 16S-23S rRNA intergenic spacer <400> 13 ttaacgctgg cggcatgcct aatacatgca agtcgatcga aagtagtaat actttagagg 60 cgaacgggtg agtaacacgt atccaatcta ccttataatg ggggataact agttgaaaga 120 ctagctaata ccgcataaga actttggttc gcatgaatca aagttgaaag gacctgcaag 180 ggttcgttat ttgatgaggg tgcgccatat cagctagttg gtggggtaac ggcctaccaa 240 ggcaatgacg tgtagctatg ctgagaagta gaatagccac aatgggactg agacacggcc 300 catactccta cgggaggcag cagtagggaa tttttcacaa tgagcgaaag cttgatggag 360 caatgccgcg tgaacgatga aggtctttaa gattgtaaag ttcttttatt tgggaagaat 420 gactttagca ggtaatggct agagtttgac tgtaccattt tgaataagtg acgactaact 480 atgtgccagc agtcgcggta atacataggt cgcaagcgtt atccggattt attgggcgta 540 aagcaagcgc aggcggattg aaaagtctgg tgttaaaggc agctgcttaa cagttgtatg 600 cattggaaac tattaatcta gagtgtggta gggagttttg gaatttcatg tggagcggtg 660 aaatgcgtag atatatgaag gaacaccagt ggcgaaggcg aaaacttagg ccattactga 720 cgcttaggct tgaaagtgtg gggagcaaat aggattagat accctagtag tccacaccgt 780 aaacgataga tactagctgt cggggcgatc ccctcggtag tgaagttaac acattaagta 840 tctcgcctgg gtagtacatt cgcaagaatg aaactcaaac ggaattgacg gggacccgca 900 caagtggtgg agcatgttgc ttaattcgac ggtacacgaa aaaccttacc tagacttgac 960 atccttggca aagttatgga aacataatgg aggttaaccg agtgacaggt ggtgcatggt 1020 tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatc 1080 gttagttaca ttgtctagcg agactgctaa tgcaaattgg aggaaggaag ggatgacgtc 1140 aaatcatcat gccccttatg tctagggctg caaacgtgct acaatggcca atacaaacag 1200 tcgccagctt gtaaaagtga gcaaatctgt aaagttggtc tcagttcgga ttgagggctg 1260 caattcgtcc tcatgaagtc ggaatcacta gtaatcgcga atcagctatg tcgcggtgaa 1320 tacgttctcg ggtcttgtac acaccgcccg tcaaactatg aaagctggta atatttaaaa 1380 acgtgttgct aaccattagg aagcgcatgt caaggatagc accggtgatt ggagttaagt 1440 cgtaacaagg tacccctacg agaacgtggg ggtggatcac ctcctttcta atggagtttt 1500 ttactttttc ttttcatctt taataaagat aaatactaaa caaaacatca aaatccattt 1560 atttatcggt ggtaaattaa acccaaatcc ctgtttggtc tcacaactaa catatttggt 1620 cagattgtat ccagttctga aagaacattt ccgcttcttt caaaactgaa aacgacaatc 1680 tttctagttc caaataaata ccaaaggatc aatacaataa gttactaagg gcttatggtg 1740 <210> 14 <211> 1799 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human herpesvirus 1 isolate E19 US4 and US5 genes complete cds and US6 gene partial cds <400> 14 tgaccgcccc cggggggcgg tgctgtttgc gggttggcac aaaaagaccc cgacccgcgt 60 ctgtggtgtt tttggcatca tgtcgccggg cgccatgcgt gccgttgttc ccattatccc 120 attccttttg gttcttgtcg gtgtatcggg ggttcccacc aacgtctcct ccaccaccca 180 accccaactc ccgaccaccg gtcgtccctc gcatgaagcc cccaacatga cccagaccgg 240 caccaccgac tctcccaccg ccatcagcct taccacgccc gaccacacac cccccatgcc 300 aagtatcgga ctggaggagg aggaggaaga ggaggagggg gccggggatg gcgaacatct 360 tgagggggga gatgggaccc gtgacaccct accccagtcc ccgggtccag ccgtcccgtt 420 ggccggggat gacgagaagg acaaacccaa ccgtcccgta gtcccacccc ccggtcccaa 480 caactccccc gcgcgccccg agaccagtcg accgaagaca ccccccacca ggatcgggcc 540 gctggcaact cgacccacga cccaactccc ctcaaagggg cgacccttgg ttccgacgcc 600 tcaacatacc ccgctgttct cgttcctcac tgcctccccc gccctggaca ccctcttcgt 660 catcagcacc gtcatccaca ccttatcgtt tgtgtgtatt gttgcgatgg cgacacacct 720 gtgtggcggt tggtccagac gcgggcgacg cacacaccct agcgtgcgtt acgtgtgcct 780 gccgcccgaa cgcgggtagg gtatggggag agcctacacg cggaaagcaa gaacaataaa 840 ggcggcggga tctagttgat atgcgtctct gggtgttttt ggggtgtggc gggcgccggg 900 cggtcattgg acggggtgca gttaaataca tgcccgggac ccatgaagca tgcgcgactt 960 ccgggcctcg gaacccaccc gaaacggcca acggacgtct gagccaggcc tggctatccg 1020 gagaaacaac acacgacttg gcgttctgtg tgtcgcgatg tctctgcgcg cagtctggca 1080 tctggggctt ttgggaagcc tcgtgggggc tgttcttgcc gccacccatc tgggacctgc 1140 ggccaacaca acggacccct taacgcacgc cccagtgtcc cctcacccca gccccctggg 1200 gggctttgcc gtccccctcg tagtcggtgg gctgtgtgcc gtagtcctgg gggcggcgtg 1260 tctgcttgag ctcctgcgtc gtacgtgccg cgggtggggg cgttaccatc cctacatgga 1320 cccagttgtc gtataagatg tcgggtccaa actcccgaca ccaccagctg gcatggtata 1380 aatcaccggt gcgcccccca aaccatgtcc ggcaggggga tgggcaccca acaacaccgg 1440 gctaaccagg aaatccgtgg ccccggcccc caacaaagat cgcggtagcc cggccgtgtg 1500 acactatcgt ccataccgac cacaccgacg aatcccctaa gggggagggg ccattttacg 1560 aggaggaggg gtataacaaa gtctgtcttt aaaaagcagg ggttagggag ttgttcggtc 1620 ataagcttca gcgcgaacga ccaactaccc cgatcatcag ttatccttaa ggtctctttt 1680 gtgtggtgcg ttccggtatg gggggggctg ccgccaggtt gggggccgtg attttgtttg 1740 tcgtcatagt gggcctccat ggggtccgcg gcaaatatgc cttggcggat gcctctctt 1799

Claims (14)

  1. 샘플내 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) RNA- 및/또는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성 및 가닥-치환 활성 (strand-displacement activity)의 활성들을 제공하는 하나 이상의 효소를 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 분석할 샘플에 부가하는 단계;
    (b) 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 분석할 샘플에 적어도 5개의 DNA 프라이머를 부가하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 DNA 프라이머는 상기 핵산 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하고, 적어도 하나의 DNA 프라이머는 상기 핵산 서열에 역-상보적인 DNA 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 것인 단계;
    (c) 단계 (a) 및 (b)로부터 생성된 샘플을 고정된 온도에서 인큐베이션하는 단계;
    (d) 연장된 DNA 서열이 샘플내 존재하는지 여부를 결정하는 단계로서, 여기서 샘플내 연장된 DNA 서열의 존재는 샘플내 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함하고,
    상기 샘플은 인간 대상체로부터 입수하고, F3 프라이머는 사용하지 않는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 적어도 5개의 프라이머 중 4개는 각각 정방향 내부 프라이머 (forward inner primer: FIP), 역방향 내부 프라이머 (backward inner primer: BIP), 루프 프라이머 정방향 (loop primer forward: LPF) 및 루프 프라이머 역방향 (loop primer backwards: LPB)인 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 제5 프라이머는 B3 프라이머인 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 미리-결정된 핵산 서열은 RNA 또는 DNA 서열인 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 미리-결정된 RNA 또는 DNA 서열이 병원체에 포함되는 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기생충인 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 병원체는 인간 헤르페스바이러스 (herpesvirus) 또는 미코플라스마 속 (genus Mycoplasma) 박테리아인 방법.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 고정 온도는 50 내지 75℃인 방법.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 샘플을 1 내지 120분 동안 인큐베이션하는 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 샘플내 이중-가닥 연장된 DNA 서열의 존재는 이중-가닥 연장된 DNA 서열에 혼성화 가능한 핵산 분자를 사용하여 결정하고, 구체적으로 상기 핵산 분자는 이중-가닥 연장된 DNA 서열에 삽입되는 분자를 사용하거나 또는 혼탁도 측정 (turbidity measurement)을 사용하여 표지되는 방법.
  11. 병원체 감염의 치료에 사용하기 위한 항-감염성 조성물 (anti-infective composition)로서, 대상체는 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 병원체에 의해 감염된 것으로 이전에 결정된 것인 항-감염성 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기생충인 항-감염성 조성물.
  13. 청구항 11 또는 12에 있어서, 항-감염성 조성물은 항바이러스제, 항생제, 항진균제 또는 구충제를 각각 포함하는 항-감염성 조성물.
  14. 청구항 12 또는 13에 있어서, 병원체는 인간 헤르페스바이러스 또는 미코플라스마 속 박테리아인 항-감염성 조성물.
KR1020237000753A 2020-06-09 2021-06-09 인간 샘플내 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 등온 실시간 pcr 방법 KR20230036102A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20179110 2020-06-09
EP20179110.0 2020-06-09
PCT/EP2021/065547 WO2021250138A2 (en) 2020-06-09 2021-06-09 Isothermal real-time pcr method for determining presence of a pre-determined nucleic acid sequence in human samples

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230036102A true KR20230036102A (ko) 2023-03-14

Family

ID=71083455

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237000753A KR20230036102A (ko) 2020-06-09 2021-06-09 인간 샘플내 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 등온 실시간 pcr 방법

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230250498A1 (ko)
EP (1) EP4162079A2 (ko)
JP (1) JP2023528981A (ko)
KR (1) KR20230036102A (ko)
CN (1) CN116096919A (ko)
AU (1) AU2021286886A1 (ko)
CA (1) CA3181856A1 (ko)
WO (1) WO2021250138A2 (ko)

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5210036A (en) 1990-04-26 1993-05-11 New England Biolabs, Inc. Purified thermostable DNA polymerase obtainable from thermococcus litoralis
US5500363A (en) 1990-04-26 1996-03-19 New England Biolabs, Inc. Recombinant thermostable DNA polymerase from archaebacteria
US5352778A (en) 1990-04-26 1994-10-04 New England Biolabs, Inc. Recombinant thermostable DNA polymerase from archaebacteria
US5814506A (en) 1995-08-02 1998-09-29 New England Biolabs, Inc. Over-expression and purification of a truncated thermostable DNA polymerase by protein fusion
US7872116B2 (en) * 2007-02-06 2011-01-18 American Type Culture Collection (Atcc) Identification of cell culture contaminants among Mollicutes species by a PCR based assay
CN103525909A (zh) * 2013-09-12 2014-01-22 周燕斌 鲍曼不动杆菌实时荧光环介导等温扩增试剂盒
EP3390663B1 (en) * 2015-12-18 2024-04-17 Selfdiagnostics OÜ Method for the detection of a sexually transmitted infectious pathogen
KR20180124619A (ko) * 2017-05-12 2018-11-21 주식회사 엠모니터 Lamp를 이용한 마이코플라즈마 검출용 프라이머 및 그 용도

Also Published As

Publication number Publication date
CN116096919A (zh) 2023-05-09
US20230250498A1 (en) 2023-08-10
AU2021286886A1 (en) 2023-01-19
CA3181856A1 (en) 2021-12-16
JP2023528981A (ja) 2023-07-06
WO2021250138A3 (en) 2022-02-10
WO2021250138A2 (en) 2021-12-16
EP4162079A2 (en) 2023-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11851720B2 (en) Direct amplification and detection of viral and bacterial pathogens
US20170335379A1 (en) Detection of nucleic acids in crude matrices
US11225693B2 (en) Compositions and methods for identifying drug resistant tuberculosis
AU2002230901B2 (en) Method and kit for enhancing the association rates of polynucleotides
US20230250498A1 (en) Isothermal real-time pcr method for determining presence of a pre-determined nucleic acid sequence in human samples
EP3230468B1 (en) Methods and kits for detecting antibiotic resistant bacteria
EP3387149B1 (en) Isothermal amplification for the detection of influenza viruses in a sample.
US20230227926A1 (en) Isothermal real-time pcr method for determining presence of a pre-determined nucleic acid sequence in animal samples
WO2023156078A1 (en) A method for detecting the presence of at least two pathogens in a sample
US20220305496A1 (en) Methods and compositions for detecting target nucleic acids and resolving sample matrices
US10266903B2 (en) Methods and compositions for detecting antibiotic resistant bacteria
KR20240038203A (ko) 호흡기 바이러스 감염 진단을 위한 RT-qLAMP용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 키트