JP2018508225A - 細菌核酸を検出し細菌性膣炎を診断するための方法および組成物 - Google Patents

細菌核酸を検出し細菌性膣炎を診断するための方法および組成物 Download PDF

Info

Publication number
JP2018508225A
JP2018508225A JP2017549041A JP2017549041A JP2018508225A JP 2018508225 A JP2018508225 A JP 2018508225A JP 2017549041 A JP2017549041 A JP 2017549041A JP 2017549041 A JP2017549041 A JP 2017549041A JP 2018508225 A JP2018508225 A JP 2018508225A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
specific
lactobacillus
sequence
target
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2017549041A
Other languages
English (en)
Other versions
JP6796593B2 (ja
JP2018508225A5 (ja
Inventor
バーバラ エル. イートン,
バーバラ エル. イートン,
デイモン ケー. ゲットマン,
デイモン ケー. ゲットマン,
トレイシー ポロウスキー,
トレイシー ポロウスキー,
Original Assignee
ジェン−プローブ・インコーポレーテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ジェン−プローブ・インコーポレーテッド filed Critical ジェン−プローブ・インコーポレーテッド
Publication of JP2018508225A publication Critical patent/JP2018508225A/ja
Publication of JP2018508225A5 publication Critical patent/JP2018508225A5/ja
Priority to JP2020190284A priority Critical patent/JP6970268B2/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6796593B2 publication Critical patent/JP6796593B2/ja
Priority to JP2021176198A priority patent/JP2022025106A/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6865Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112Disease subtyping, staging or classification
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156Polymorphic or mutational markers
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158Expression markers
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16Primer sets for multiplex assays
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

被験体における細菌性膣炎を診断するための方法であって、被験体試料中のLactobacillus sp.、Gardnerella vaginalisおよびEggerthella sp.のいずれか1つまたは複数の検出のためのアッセイを行うステップを含む方法を開示する。試料中のLactobacillus sp.、Gardnerella vaginalisおよび/またはEggerthella核酸を検出するための方法および組成物も開示する。

Description

配列表への言及
本出願は、EFS−Web経由で、ASCII形式で提出した配列表を含み、配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。2016年3月16日に作成した前記ASCIIコピーは、「DIA−0002−PCT_ST25.txt」という名であり、サイズは31KBである。
関連出願への相互参照
本出願は、米国特許法下における、2015年3月16日に出願された仮出願62/133,881号、2015年3月29日に出願された仮出願62/168,405号および2015年3月29日に出願された仮出願62/168,688号の利益を主張し、そのそれぞれを参照として本明細書に援用する。
米国国民健康栄養調査によると、14歳〜49歳の女性のほぼ3分の1は細菌性膣炎(BV)を有する。(AllsworthおよびPeipert、Obstetrics and Gynecology 109巻:114〜120頁、2007年を参照されたい)。BVは、膣分泌物の最も一般的な原因であり、多くの女性が病院に駆けつける理由である。BVは、早産、低出生体重、骨盤内炎症性疾患、HIVを含むSTD感染症の増加、および性交渉相手にHIVを移すより大きなリスクにも関連する。(SrinivasanおよびFredricks、Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases、2008巻、Article ID 750479、22頁、2008年を参照されたい)細菌性膣炎を有する女性は、悪臭を放つ膣分泌物または痛みを含む症状を有し得るが、診断可能なBVを有する女性のおよそ半数には明確な症状がない(SrivinvasanおよびFredricks、前掲を参照されたい)。
単独でBVの原因となることが公知である病因因子はない。大部分の研究者およびCDCは、細菌性膣炎は膣の正常な細菌叢の破壊の結果であると考えている。よくある感染症とは異なり、この腸内毒素症は、個々の細菌種の結果ではない。CDC Factsheet、2014年(CDCウェブサイトからのBV-Fact-Sheet-March-2014.pdf)を参照されたい。腸内毒素症は、膣などの身体環境の中での正常な微生物叢の破壊である。Nibaliら、Journal of Oral Microbiology 6巻:22962頁、2014年を参照されたい。
BVは、診療所ではAmsel判定基準を使用して、および検査室ではNugentスコアリングシステムを使用して診断される。後者は、グラム染色を活用する細菌形態型の計数に依拠する。この方法では、Nugentスコアは、腸内毒素症の視覚的評価である−それは悪い細菌を良い細菌に対して採点する。Nugentら、Journal of Clinical Microbiology 29巻:297〜301頁、1991年を参照されたい。Amsel判定基準は、BVに関連する主な徴候である、クルー細胞の存在、pH、色および匂いについて試料を評価する。Amselら、Am. J. Med.74巻:14〜22頁、1983年を参照されたい。試料の湿式マウントを顕微鏡で検査して、主にG.vaginalisからなると考えられる細菌で覆われたヒト上皮細胞であるクルー細胞を検出する。
分子試験は、一般に、細菌性膣炎と強い相関関係がある複数の生物を標的とする。どの生物が標的とされるかは試験によって異なる。ほぼ全ての場合、存在量の多い嫌気性菌、例えば、Atopobium、GardnerellaおよびMegasphaera種が標的とされる。
FDAによって唯一承認されているBV試験(BD Affirm VPIII 2010)は、Cartwrightら(Journal of Clinical Microbiology 51巻:3694〜3699頁、2013年)による研究において67.6%の感度および76.4%の特異度を有することが判明した。BVを診断するために、Affirm製品は、G.vaginalisをその唯一の指標として検出する。製品の添付文書には、Affirm製品が、採点型のグラム染色法と比較して95.1%の感度および83.3%の特異度があることが示されている。
Cartwrightら、前掲は、BVの診断のためのAtopobium vaginae、BVAB−2およびMegasphaera−1の検出に多重アッセイを使用した。彼らは、このアッセイの性能を、女性323名の集団(93%アフリカ系アメリカ人、7%非ヒスパニック系白人)でNugent結果とAmsel結果の組合せに対して測定した。彼らは、この試験には、NugentスコアとAmselスコアの組合せと比較して96.9%の感度および92.6%の特異度があると報告した。彼らは、単独でのNugentスコアに関するこのアッセイの結果を報告しなかった。
AllsworthおよびPeipert、Obstetrics and Gynecology 109巻:114〜120頁、2007年 SrinivasanおよびFredricks、Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases、2008巻、Article ID 750479、22頁、2008年 Nibaliら、Journal of Oral Microbiology 6巻:22962頁、2014年 Nugentら、Journal of Clinical Microbiology 29巻:297〜301頁、1991年 Amselら、Am. J. Med.74巻:14〜22頁、1983年 Journal of Clinical Microbiology 51巻:3694〜3699頁、2013年
一態様では、本発明は、被験体における細菌性膣炎(BV)の存在または非存在を決定するための方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、一般に以下のステップ:(a)BVを有することが疑われる被験体からの試料を用意するステップ;(b)試料中のLactobacillus sp.、G.vaginalis、およびEggerthella sp.の検出のためのアッセイを行うステップ;(c)Lactobacillus sp.、G.vaginalis、およびEggerthella sp.のそれぞれに陽性または陰性のいずれかのステータスを検出アッセイに基づいて割り当てるステップ;ならびに(d)ステップ(c)からの割り当てられたLactobacillus sp.ステータス、G.vaginalisステータスおよびEggerthella sp.ステータスの組合せに基づいて被験体におけるBVの存在または非存在を決定するステップであって、(i)G.vaginalisとEggerthella sp.両方について陰性のステータスは、被験体におけるBVの非存在を示し、(ii)G.vaginalisとEggerthella sp.両方について陽性のステータスは、被験体におけるBVの存在を示し、(iii)Lactobacillus sp.のステータスが陽性である場合には、G.vaginalisおよびEggerthellaの少なくとも一方について陰性のステータスは、被験体におけるBVの非存在を示し、(iv)Lactobacillus sp.のステータスが陰性である場合には、G.vaginalisおよびEggerthellaの少なくとも一方について陽性のステータスは、被験体におけるBVの存在を示す、ステップを含む。他の実施形態では、方法は、一般に以下のステップ:(a)BVを有することが疑われる被験体からの試料を用意するステップ;(b)試料中のLactobacillus sp.およびG.vaginalisの検出のためのアッセイを行うステップ;(c)Lactobacillus sp.およびG.vaginalisのそれぞれに陽性または陰性のいずれかのステータスを検出アッセイに基づいて割り当てるステップ;ならびに(d)ステップ(c)からの割り当てられたLactobacillus sp.ステータスおよびG.vaginalisステータスの組合せに基づいて被験体におけるBVの存在または非存在を決定するステップであって、(i)G.vaginalisについて陰性のステータスは、被験体におけるBVの非存在を示し、(ii)G.vaginalisのステータスが陽性である場合には、Lactobacillus sp.について陽性のステータスは被験体におけるBVの非存在を示し、Lactobacillus sp.について陰性のステータスは被験体におけるBVの存在を示す、ステップを含む。
上記のとおりのBVを診断するための方法の一部の実施形態では、Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.の検出のためのアッセイ、またはLactobacillus sp.およびG.vaginalisの検出のためのアッセイは、核酸に基づく検出アッセイである。一部の実施形態では、Lactobacillus sp.は、膣マイクロバイオームからのものである。一部の実施形態では、Eggerthella sp.は、膣マイクロバイオームからのものである。特に適切な核酸に基づく検出アッセイには、例えば、リアルタイムで行われ得る、等温増幅反応(例えば、転写媒介性増幅(TMA)反応)を含むアッセイなどの、増幅に基づくアッセイが含まれる。ある特定の実施形態では、核酸に基づく検出アッセイは、Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.の16S rRNA、またはLactobacillus sp.およびG.vaginalisの16S rRNAを標的とする。特定のバリエーションでは、核酸に基づく検出アッセイは、(i)配列番号1の約91位のヌクレオチドから約265位のヌクレオチドの領域に対応するLactobacillus sp.16S rRNA領域、(ii)配列番号3の約964位のヌクレオチドから約1036位のヌクレオチドの領域に対応するG.vaginalis 16S rRNA領域、および/または(iii)配列番号4の約165位のヌクレオチドから約259位のヌクレオチドの領域に対応するEggerthella sp.16S rRNA領域を標的とする。
核酸に基づく検出アッセイを含む上記のとおりのBVを診断するための方法の、ある特定の実施形態では、アッセイは、以下のステップ:
(1)試料を、
Lactobacillus sp.標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーであって、(i)第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列または配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列(target-hybridizing sequence)を含み、(ii)第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号6のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマー、
G.vaginalis標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーであって、(i)第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号12のヌクレオチド配列に実質的に対応する第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマー、ならびに
Eggerthella sp.標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のEggerthella特異的増幅オリゴマーであって、(i)第1のEggerthella特異的増幅オリゴマーは、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)第2のEggerthella特異的増幅オリゴマーは、配列番号16のヌクレオチド配列に実質的に対応する第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のEggerthella特異的増幅オリゴマー
と接触させるステップ;
(2)in vitro核酸増幅反応を行うステップであって、任意のLactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.標的核酸が、試料中に存在する場合、Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.標的領域に対応する1つまたは複数の増幅産物を生成するための鋳型として使用される、ステップ;ならびに
(3)1つまたは複数の増幅産物の存在または非存在を検出するステップ
を含む、増幅に基づくアッセイである。
核酸に基づく検出アッセイを含む、BVを診断するための方法の他の実施形態では、アッセイは、以下のステップ:
(1)試料を、
Lactobacillus sp.標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーであって、(i)第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列または配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号6のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマー、ならびに
G.vaginalis標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーであって、(i)第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号12のヌクレオチド配列に実質的に対応する第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマー
と接触させるステップ;
(2)in vitro核酸増幅反応を行うステップであって、任意のLactobacillus sp.およびG.vaginalis標的核酸が、試料中に存在する場合、Lactobacillus sp.およびG.vaginalis標的領域に対応する1つまたは複数の増幅産物を生成するための鋳型として使用される、ステップ;ならびに
(3)1つまたは複数の増幅産物の存在または非存在を検出するステップ
を含む、増幅に基づくアッセイである。
上記のとおりの増幅に基づく検出アッセイを含む、BVを診断するための方法の一部のバリエーションでは、第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号7の残基28〜45もしくは配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列を含み;第2のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号6のヌクレオチド配列を含み;第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列を含み;第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号12のヌクレオチド配列を含み;第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列を含み;および/または第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号16のヌクレオチド配列を含む。一部のそのような実施形態では、第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号7の残基28〜45もしくは配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列からなり;第2のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号6のヌクレオチド配列からなり;第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列からなり;第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号12のヌクレオチド配列からなり;第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列からなり;および/または第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号16のヌクレオチド配列からなる。
上記のとおりの増幅に基づく検出アッセイを含む、BVを診断するための方法の一部のバリエーションでは、第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、試料を、Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーとさらに接触させ、ここで、第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む。一部のそのような実施形態では、第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列を含む。特定のバリエーションでは、第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列からなる。
上記のとおりの増幅に基づく検出アッセイを含む、BVを診断するための方法の一部の実施形態では、第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマー、第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーおよび第1のEggerthella特異的増幅オリゴマーの少なくとも1つ(または第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマーおよび第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーの少なくとも一方)は、それぞれの、標的にハイブリダイズする配列(the respective target-hybridizing sequence)の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、試料を、Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーとさらに接触させる、一部のそのような実施形態では、第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。特に適切なプロモーター配列は、例えば、配列番号7の残基1〜27のヌクレオチド配列を有するプロモーター配列などの、T7プロモーター配列である。具体的なバリエーションでは、第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号7のヌクレオチド配列を有し、第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号13のヌクレオチド配列を有し、および/または第1のEggerthella特異的増幅オリゴマーは、配列番号17のヌクレオチド配列を有する。試料を、Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーとさらに接触させる上記のとおりの一部の実施形態では、第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号8のヌクレオチド配列を有する。
上記のとおりの増幅に基づく検出アッセイを含む、BVを診断するための方法の、ある特定の実施形態では、方法は、ステップ(2)の前に試料中の他の構成成分から、存在する場合には、Lactobacillus、G.vaginalisおよびEggerthella標的核酸を精製するまたはLactobacillusおよびG.vaginalis標的核酸を精製するステップをさらに含む。一部のそのような実施形態では、精製するステップは、試料を、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合した(covalently attached)、標的にハイブリダイズする配列を含む少なくとも1つの捕捉プローブオリゴマーと接触させるステップを含む。例えば、試料を、Lactobacillus特異的捕捉プローブオリゴマー、G.vaginalis特異的捕捉プローブオリゴマー、およびEggerthella特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させてもよく、ここで、Lactobacillus特異的、G.vaginalis特異的、およびEggerthella特異的捕捉プローブオリゴマーのそれぞれは、Lactobacillus、G.vaginalisまたはEggerthella標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズする、捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列(capture probe target-hybridizing sequence)をそれぞれ含み、ここで、Lactobacillus特異的、G.vaginalis特異的、およびEggerthella特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列のそれぞれは、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合されている。Lactobacillus sp.およびG.vaginalisの検出を対象とする一部の実施形態では、試料を、Lactobacillus特異的捕捉プローブオリゴマーおよびG.vaginalis特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させてもよく、ここで、Lactobacillus特異的およびG.vaginalis特異的捕捉プローブオリゴマーのそれぞれは、LactobacillusまたはG.vaginalis標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズする、捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列をそれぞれ含み、ここで、Lactobacillus特異的およびG.vaginalis特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列のそれぞれは、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合されている。具体的なバリエーションでは、Lactobacillus特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列は、配列番号5の残基1〜12のヌクレオチド配列に実質的に対応し、G.vaginalis特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列は、配列番号11の残基1〜17のヌクレオチド配列に実質的に対応し、および/またはEggerthella特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列は、配列番号15の残基1〜21のヌクレオチド配列に実質的に対応する。一部の実施形態では、Lactobacillus特異的捕捉プローブオリゴマーは、配列番号5のヌクレオチド配列を有し、G.vaginalis特異的捕捉プローブオリゴマーは、配列番号11のヌクレオチド配列を有し、および/またはEggerthella特異的捕捉プローブオリゴマーは、配列番号15のヌクレオチド配列を有する。
上記のとおりの増幅に基づく検出アッセイを含む、BVを診断するための方法の一部の実施形態では、検出するステップ(3)は、(i)1つまたは複数の増幅産物を、Lactobacillus sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のLactobacillus特異的検出プローブ、G.vaginalis標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のG.vaginalis特異的検出プローブ、およびEggerthella sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のEggerthella特異的検出プローブと、接触させるステップ、ならびに(ii)標的にハイブリダイズした任意のLactobacillus特異的、G.vaginalis特異的および/またはEggerthella特異的検出プローブの存在または非存在を検出するステップを含む。上記のとおりのLactobacillus sp.およびG.vaginalisの検出のための増幅に基づく検出アッセイを含む、BVを診断するための方法の一部の実施形態では、検出するステップ(3)は、(i)1つまたは複数の増幅産物を、Lactobacillus sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のLactobacillus特異的検出プローブ、およびG.vaginalis標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のG.vaginalis特異的検出プローブと、接触させるステップ、ならびに(ii)標的にハイブリダイズした任意のLactobacillus特異的および/またはG.vaginalis特異的検出プローブの存在または非存在を検出するステップを含む。一部の実施形態では、第1のLactobacillus特異的検出プローブは、配列番号9に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含み、第1のG.vaginalis特異的検出プローブは、配列番号14の残基1〜19に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含み、および/または第1のEggerthella特異的検出プローブは、配列番号18に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む。具体的なバリエーションでは、第1のLactobacillus特異的検出プローブは、配列番号9のヌクレオチド配列を有し、第1のG.vaginalis特異的検出プローブは、配列番号14のヌクレオチド配列を有し、および/または第1のEggerthella特異的検出プローブは、配列番号18のヌクレオチド配列を有する。上記のとおりの一部の実施形態では、検出するステップ(3)は、1つまたは複数の増幅産物を、Lactobacillus sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第2のLactobacillus特異的検出プローブと接触させるステップをさらに含み、ここで、第2のLactobacillus特異的検出プローブは、配列番号10の残基6〜21に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含み;一部のそのような実施形態では、第2のLactobacillus特異的検出プローブは、配列番号10のヌクレオチド配列を有する。
上記のとおりの増幅に基づく検出アッセイと第1のLactobacillus特異的検出プローブ、第1のG.vaginalis特異的検出プローブおよび第1のEggerthella特異的検出プローブの使用(または第1のLactobacillus特異的検出プローブおよび第1のG.vaginalis特異的検出プローブの使用)とを含む、BVを診断するための方法の、ある特定の実施形態では、前記プローブのそれぞれは標識を含む。1つまたは複数の増幅産物を第2のLactobacillus特異的検出プローブと接触させることをさらに含む一部の実施形態では、第2のLactobacillus特異的検出プローブは標識を含む。特に適切な標識には、化学発光標識および蛍光標識が含まれる。
上記のとおりの増幅に基づく検出アッセイと標識された検出プローブの使用とを含む、BVを診断するための方法の一部の実施形態では、検出するステップ(3)は、増幅するステップ(2)の間に行われる。一部のそのようなバリエーションでは、各検出プローブは、蛍光標識およびクエンチャーを含む。蛍光標識およびクエンチャーを含む、特に適切な検出プローブには、分子トーチ、分子ビーコン、およびTaqMan検出プローブが含まれる。
上記のとおりの増幅に基づく検出アッセイと検出プローブの使用とを含む、BVを診断するための方法の、ある特定の実施形態では、第1のLactobacillus特異的検出プローブ、第1のG.vaginalis特異的検出プローブおよび第1のEggerthella特異的検出プローブの少なくとも1つ(または第1のLactobacillus特異的検出プローブおよび第1のG.vaginalis特異的検出プローブの少なくとも一方)は、標的にハイブリダイズしない配列をさらに含む。1つまたは複数の増幅産物を第2のLactobacillus特異的検出プローブと接触させることをさらに含む一部の実施形態では、第2のLactobacillus特異的検出プローブは、標識にハイブリダイズしない配列をさらに含む。上記のとおりの一部のそのようなバリエーションでは、検出プローブのいずれか1つ(例えばそれぞれ)は、分子トーチまたは分子ビーコンである。
上記のとおりの増幅に基づく検出アッセイを含む、BVを診断するための方法の一部の実施形態では、ステップ(2)での増幅反応は、等温増幅反応である。特定のバリエーションでは、等温増幅反応は、転写媒介性増幅(TMA)反応である。ある特定の実施形態では、等温増幅反応は、リアルタイム増幅反応である。
上記のとおりのBVを診断するための方法の一部の実施形態では、方法は、BVに関連する10以下の細菌属の検出を含む。例えば、ある特定のバリエーションでは、方法は、BVに関連する5以下の細菌属の検出を含む。具体的なバリエーションでは、方法は、Lactobacillus、GardnerellaおよびEggerthella以外のBVに関連する細菌属の検出を含まない。別の具体的なバリエーションでは、方法は、LactobacillusおよびGardnerella以外のBVに関連する細菌属の検出を含まない。
上記のとおりのBVを診断するための方法の一部の実施形態では、BVの存在が被験体において示された場合には、方法は、BVのための処置レジメン(treatment regime)を被験体に施すステップをさらに含む。
上記のとおりのBVを診断するための方法の一部の実施形態では、方法は、被験体におけるBVを監視するための方法であり、被験体は、ステップ(a)の前にBVのための処置レジメンを受けている。一部のそのようなバリエーションでは、BVの存在が被験体において示された場合には、方法は、(i)BVのための処置レジメンを被験体に施すステップまたは(ii)BVのための異なる処置レジメンを被験体に施すステップのいずれかをさらに含む。
別の態様では、本発明は、多重検出方法を提供する。一部の実施形態では、多重検出方法は、試料中のLactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.のそれぞれ(each of each of)についての存在または非存在を決定するためのものである。方法は、一般に以下のステップ:
(1)Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.の少なくとも1つを含有することが疑われる試料を、
(a)Lactobacillus sp.標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーであって、(i)第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列または配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号6のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマー、
(b)G.vaginalis標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーであって、(i)第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号12のヌクレオチド配列に実質的に対応する第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマー、ならびに
(c)Eggerthella sp.標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のEggerthella特異的増幅オリゴマーであって、(i)第1のEggerthella特異的増幅オリゴマーは、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)第2のEggerthella特異的増幅オリゴマーは、配列番号16のヌクレオチド配列に実質的に対応する第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のEggerthella特異的増幅オリゴマー
と接触させるステップ;
(2)in vitro核酸増幅反応を行うステップであって、任意のLactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.標的核酸が、試料中に存在する場合、Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.標的領域に対応する1つまたは複数の増幅産物を生成するための鋳型として使用される、ステップ;ならびに
(3)1つまたは複数の増幅産物の存在または非存在を検出し、それにより試料中のLactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.の存在または非存在を決定するステップ
を含む。
他の実施形態では、多重検出方法は、試料中のLactobacillus sp.およびG.vaginalisのそれぞれ(each of each of)についての存在または非存在を決定するためのものである。方法は、一般に以下のステップ:
(1)Lactobacillus sp.およびG.vaginalisの少なくとも一方を含有することが疑われる試料を、
(a)Lactobacillus sp.標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーであって、(i)第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列または配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号6のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマー、ならびに
(b)G.vaginalis標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーであって、(i)第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号12のヌクレオチド配列に実質的に対応する第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマー
と接触させるステップ;
(2)in vitro核酸増幅反応を行うステップであって、任意のLactobacillus sp.およびG.vaginalis標的核酸が、試料中に存在する場合、Lactobacillus sp.およびG.vaginalis標的領域に対応する1つまたは複数の増幅産物を生成するための鋳型として使用される、ステップ;ならびに
(3)1つまたは複数の増幅産物の存在または非存在を検出し、それにより試料中のLactobacillus sp.およびG.vaginalisの存在または非存在を決定するステップ
を含む。
上記のとおりの多重方法の一部のバリエーションでは、第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号7の残基28〜45もしくは配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列を含み;第2のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号6のヌクレオチド配列を含み;第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列を含み;第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号12のヌクレオチド配列を含み;第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列を含み;および/または第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号16のヌクレオチド配列を含む。一部のそのような実施形態では、第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号7の残基28〜45もしくは配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列からなり;第2のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号6のヌクレオチド配列からなり;第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列からなり;第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号12のヌクレオチド配列からなり;第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列からなり;および/または第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号16のヌクレオチド配列からなる。
上記のとおりの多重方法の一部のバリエーションでは、第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、試料を、Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーとさらに接触させ、ここで、第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む。一部のそのような実施形態では、第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列を含む。特定のバリエーションでは、第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列からなる。
上記のとおりの多重方法の一部の実施形態では、第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマー、第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーおよび第1のEggerthella特異的増幅オリゴマーの少なくとも1つ(第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマーおよび第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーの少なくとも一方)は、それぞれの、標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、試料を、Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーとさらに接触させる、一部のそのような実施形態では、第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。特に適切なプロモーター配列は、例えば、配列番号7の残基1〜27のヌクレオチド配列を有するプロモーター配列などの、T7プロモーター配列である。具体的なバリエーションでは、第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号7のヌクレオチド配列を有し、第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号13のヌクレオチド配列を有し、および/または第1のEggerthella特異的増幅オリゴマーは、配列番号17のヌクレオチド配列を有する。試料を、Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーとさらに接触させる上記のとおりの一部の実施形態では、第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号8のヌクレオチド配列を有する。
上記のとおりの多重方法の、ある特定の実施形態では、方法は、ステップ(2)の前に試料中の他の構成成分から、存在する場合、Lactobacillus、G.vaginalisおよびEggerthella標的核酸を精製するまたはLactobacillusおよびG.vaginalis標的核酸を精製するステップをさらに含む。一部のそのような実施形態では、精製するステップは、試料を、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合した、標的にハイブリダイズする配列を含む少なくとも1つの捕捉プローブオリゴマーと接触させるステップを含む。例えば、試料を、Lactobacillus特異的捕捉プローブオリゴマー、G.vaginalis特異的捕捉プローブオリゴマー、およびEggerthella特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させてもよく、ここで、Lactobacillus特異的、G.vaginalis特異的、およびEggerthella特異的捕捉プローブオリゴマーのそれぞれは、Lactobacillus、G.vaginalisまたはEggerthella標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズする、捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列をそれぞれ含み、ここで、Lactobacillus特異的、G.vaginalis特異的、およびEggerthella特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列のそれぞれは、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合されている。Lactobacillus sp.およびG.vaginalisの検出を対象とする一部の実施形態では、試料を、Lactobacillus特異的捕捉プローブオリゴマーおよびG.vaginalis特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させてもよく、ここで、Lactobacillus特異的およびG.vaginalis特異的捕捉プローブオリゴマーのそれぞれは、LactobacillusまたはG.vaginalis標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズする、捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列をそれぞれ含み、ここで、Lactobacillus特異的およびG.vaginalis特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列のそれぞれは、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合されている。具体的なバリエーションでは、Lactobacillus特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列は、配列番号5の残基1〜12のヌクレオチド配列に実質的に対応し、G.vaginalis特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列は、配列番号11の残基1〜17のヌクレオチド配列に実質的に対応し、および/またはEggerthella特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列は、配列番号15の残基1〜21のヌクレオチド配列に実質的に対応する。一部の実施形態では、Lactobacillus特異的捕捉プローブオリゴマーは、配列番号5のヌクレオチド配列を有し、G.vaginalis特異的捕捉プローブオリゴマーは、配列番号11のヌクレオチド配列を有し、および/またはEggerthella特異的捕捉プローブオリゴマーは、配列番号15のヌクレオチド配列を有する。
上記のとおりの多重方法の一部の実施形態では、検出するステップ(3)は、(i)1つまたは複数の増幅産物を、Lactobacillus sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のLactobacillus特異的検出プローブ、G.vaginalis標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のG.vaginalis特異的検出プローブ、およびEggerthella sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のEggerthella特異的検出プローブと接触させるステップ、ならびに(ii)標的にハイブリダイズした任意のLactobacillus特異的、G.vaginalis特異的および/またはEggerthella特異的検出プローブの存在または非存在を検出するステップを含む。上記のとおりのLactobacillus sp.およびG.vaginalisの検出のための多重方法の一部の実施形態では、検出するステップ(3)は、(i)1つまたは複数の増幅産物を、Lactobacillus sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のLactobacillus特異的検出プローブ、およびG.vaginalis標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のG.vaginalis特異的検出プローブと接触させるステップ、ならびに(ii)標的にハイブリダイズした任意のLactobacillus特異的および/またはG.vaginalis特異的検出プローブの存在または非存在を検出するステップを含む。一部の実施形態では、第1のLactobacillus特異的検出プローブは、配列番号9に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含み、第1のG.vaginalis特異的検出プローブは、配列番号14の残基1〜19に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含み、および/または第1のEggerthella特異的検出プローブは、配列番号18に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む。具体的なバリエーションでは、第1のLactobacillus特異的検出プローブは、配列番号9のヌクレオチド配列を有し、第1のG.vaginalis特異的検出プローブは、配列番号14のヌクレオチド配列を有し、および/または第1のEggerthella特異的検出プローブは、配列番号18のヌクレオチド配列を有する。上記のとおりの一部の実施形態では、検出するステップ(3)は、1つまたは複数の増幅産物を、Lactobacillus sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第2のLactobacillus特異的検出プローブと接触させるステップをさらに含み、第2のLactobacillus特異的検出プローブは、配列番号10の残基6〜21に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含み;一部のそのような実施形態では、第2のLactobacillus特異的検出プローブは、配列番号10のヌクレオチド配列を有する。
上記のとおりの第1のLactobacillus特異的検出プローブ、第1のG.vaginalis特異的検出プローブおよび第1のEggerthella特異的検出プローブの使用(または第1のLactobacillus特異的検出プローブおよび第1のG.vaginalis特異的検出プローブの使用)を含む多重方法の、ある特定の実施形態では、プローブのそれぞれは標識を含む。1つまたは複数の増幅産物を第2のLactobacillus特異的検出プローブと接触させることをさらに含む一部の実施形態では、第2のLactobacillus特異的検出プローブは標識を含む。特に適切な標識には、化学発光標識および蛍光標識が含まれる。
上記のとおりの標識された検出プローブの使用を含む多重方法の一部の実施形態では、検出するステップ(3)は、増幅するステップ(2)の間に行われる。一部のそのようなバリエーションでは、各検出プローブは、蛍光標識およびクエンチャーを含む。蛍光標識およびクエンチャーを含む、特に適切な検出プローブには、分子トーチ、分子ビーコン、およびTaqMan検出プローブが含まれる。
上記のとおりの検出プローブの使用を含む多重方法の、ある特定の実施形態では、第1のLactobacillus特異的検出プローブ、第1のG.vaginalis特異的検出プローブおよび第1のEggerthella特異的検出プローブの少なくとも1つ(または第1のLactobacillus特異的検出プローブおよび第1のG.vaginalis特異的検出プローブの少なくとも一方)は、標的にハイブリダイズしない配列をさらに含む。1つまたは複数の増幅産物を第2のLactobacillus特異的検出プローブと接触させることをさらに含む一部の実施形態では、第2のLactobacillus特異的検出プローブは、標識にハイブリダイズしない配列をさらに含む。上記のとおりの一部のそのようなバリエーションでは、検出プローブのいずれか1つ(例えばそれぞれ)は、分子トーチまたは分子ビーコンである。
上記のとおりの多重方法の一部の実施形態では、ステップ(2)での増幅反応は、等温増幅反応である。特定のバリエーションでは、等温増幅反応は、転写媒介性増幅(TMA)反応である。ある特定の実施形態では、等温増幅反応は、リアルタイム増幅反応である。
別の態様では、本発明は、オリゴマーの組合せを提供する。一部の実施形態では、オリゴマーの組合せは、試料中のLactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.のそれぞれ(each of each of)についての存在または非存在を決定するためのものである。オリゴマーの組合せは、一般に以下のオリゴマー:
(a)Lactobacillus sp.標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーであって、(i)第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列または配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号6のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマー、
(b)G.vaginalis標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーであって、(i)第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号12のヌクレオチド配列に実質的に対応する第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマー、ならびに
(c)Eggerthella sp.標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のEggerthella特異的増幅オリゴマーであって、(i)第1のEggerthella特異的増幅オリゴマーは、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)第2のEggerthella特異的増幅オリゴマーは、配列番号16のヌクレオチド配列に実質的に対応する第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のEggerthella特異的増幅オリゴマー
を含む。
他の実施形態では、オリゴマーの組合せは、試料中のLactobacillus sp.およびG.vaginalisのそれぞれ(each of each of)についての存在または非存在を決定するためのものである。オリゴマーの組合せは、一般に以下のオリゴマー:
(a)Lactobacillus sp.標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーであって、(i)第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列または配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号6のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマー、ならびに
(b)G.vaginalis標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーであって、(i)第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号12のヌクレオチド配列に実質的に対応する第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマー
を含む。
上記のとおりのオリゴマーの組合せの一部のバリエーションでは、第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号7の残基28〜45もしくは配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列を含み;第2のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号6のヌクレオチド配列を含み;第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列を含み;第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号12のヌクレオチド配列を含み;第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列を含み;および/または第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号16のヌクレオチド配列を含む。一部のそのような実施形態では、第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号7の残基28〜45もしくは配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列からなり;第2のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号6のヌクレオチド配列からなり;第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列からなり;第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号12のヌクレオチド配列からなり;第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列からなり;および/または第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号16のヌクレオチド配列からなる。
上記のとおりのオリゴマーの組合せの一部のバリエーションでは、第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、オリゴマーの組合せは、Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーをさらに含み、ここで、第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む。一部のそのような実施形態では、第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列を含む。特定のバリエーションでは、第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列からなる。
上記のとおりのオリゴマーの組合せの一部の実施形態では、第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマー、第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーおよび第1のEggerthella特異的増幅オリゴマーの少なくとも1つ(または第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマーおよび第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーの少なくとも一方)は、それぞれの、標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、試料を、Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーとさらに接触させる、一部のそのような実施形態では、第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。特に適切なプロモーター配列は、例えば、配列番号7の残基1〜27のヌクレオチド配列を有するプロモーター配列などの、T7プロモーター配列である。具体的なバリエーションでは、第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号7のヌクレオチド配列を有し、第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号13のヌクレオチド配列を有し、および/または第1のEggerthella特異的増幅オリゴマーは、配列番号17のヌクレオチド配列を有する。試料を、Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーとさらに接触させる上記のとおりの一部の実施形態では、第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号8のヌクレオチド配列を有する。
上記のとおりのオリゴマーの組合せの、ある特定の実施形態では、オリゴマーの組合せは、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合した、標的にハイブリダイズする配列を含む少なくとも1つの捕捉プローブオリゴマーをさらに含む。例えば、オリゴマーの組合せは、Lactobacillus特異的捕捉プローブオリゴマー、G.vaginalis特異的捕捉プローブオリゴマー、およびEggerthella特異的捕捉プローブオリゴマーを含んでもよく、ここで、Lactobacillus特異的、G.vaginalis特異的、およびEggerthella特異的捕捉プローブオリゴマーのそれぞれは、Lactobacillus、G.vaginalisまたはEggerthella標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズする、捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列をそれぞれ含み、ここで、Lactobacillus特異的、G.vaginalis特異的、およびEggerthella特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列のそれぞれは、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合されている。Lactobacillus sp.およびG.vaginalisのそれぞれ(each of each of)についての存在または非存在を決定するためのオリゴマーの組合せを対象とする一部の実施形態では、オリゴマーの組合せは、Lactobacillus特異的捕捉プローブオリゴマーおよびG.vaginalis特異的捕捉プローブオリゴマーを含んでもよく、ここで、Lactobacillus特異的およびG.vaginalis特異的捕捉プローブオリゴマーのそれぞれは、LactobacillusまたはG.vaginalis標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズする、捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列をそれぞれ含み、Lactobacillus特異的およびG.vaginalis特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列のそれぞれは、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合されている。具体的なバリエーションでは、Lactobacillus特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列は、配列番号5の残基1〜12のヌクレオチド配列に実質的に対応し、G.vaginalis特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列は、配列番号11の残基1〜17のヌクレオチド配列に実質的に対応し、および/またはEggerthella特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列は、配列番号15の残基1〜21のヌクレオチド配列に実質的に対応する。一部の実施形態では、Lactobacillus特異的捕捉プローブオリゴマーは、配列番号5のヌクレオチド配列を有し、G.vaginalis特異的捕捉プローブオリゴマーは、配列番号11のヌクレオチド配列を有し、および/またはEggerthella特異的捕捉プローブオリゴマーは、配列番号15のヌクレオチド配列を有する。
上記のとおりのオリゴマーの組合せの一部の実施形態では、オリゴマーの組合せは、Lactobacillus sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のLactobacillus特異的検出プローブ、G.vaginalis標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のG.vaginalis特異的検出プローブ、およびEggerthella sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のEggerthella特異的検出プローブをさらに含む。上記のとおりのLactobacillus sp.およびG.vaginalisのそれぞれ(each of each of)についての存在または非存在を決定するためのオリゴマーの組合せの一部の実施形態では、オリゴマーの組合せは、Lactobacillus sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のLactobacillus特異的検出プローブ、およびG.vaginalis標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のG.vaginalis特異的検出プローブをさらに含む。一部の実施形態では、第1のLactobacillus特異的検出プローブは、配列番号9に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含み、第1のG.vaginalis特異的検出プローブは、配列番号14の残基1〜19に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含み、および/または第1のEggerthella特異的検出プローブは、配列番号18に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む。具体的なバリエーションでは、第1のLactobacillus特異的検出プローブは、配列番号9のヌクレオチド配列を有し、第1のG.vaginalis特異的検出プローブは、配列番号14のヌクレオチド配列を有し、および/または第1のEggerthella特異的検出プローブは、配列番号18のヌクレオチド配列を有する。上記のとおりの一部の実施形態では、オリゴマーの組合せは、Lactobacillus sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第2のLactobacillus特異的検出プローブをさらに含み、ここで、第2のLactobacillus特異的検出プローブは、配列番号10の残基6〜21に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含み;一部のそのような実施形態では、第2のLactobacillus特異的検出プローブは、配列番号10のヌクレオチド配列を有する。
上記のとおりの第1のLactobacillus特異的検出プローブ、第1のG.vaginalis特異的検出プローブおよび第1のEggerthella特異的検出プローブ(または第1のLactobacillus特異的検出プローブおよび第1のG.vaginalis特異的検出プローブ)を含むオリゴマーの組合せの、ある特定の実施形態では、プローブのそれぞれは標識を含む。第2のLactobacillus特異的検出プローブをさらに含む一部の実施形態では、第2のLactobacillus特異的検出プローブは標識を含む。特に適切な標識には、化学発光標識および蛍光標識が含まれる。
上記のとおりの標識された検出プローブを含むオリゴマーの組合せの一部の実施形態では、各検出プローブは、蛍光標識およびクエンチャーを含む。蛍光標識およびクエンチャーを含む、特に適切な検出プローブには、分子トーチ、分子ビーコン、およびTaqMan検出プローブが含まれる。
上記のとおりの検出プローブを含むオリゴマーの組合せの、ある特定の実施形態では、第1のLactobacillus特異的検出プローブ、第1のG.vaginalis特異的検出プローブおよび第1のEggerthella特異的検出プローブの少なくとも1つ(または第1のLactobacillus特異的検出プローブおよび第1のG.vaginalis特異的検出プローブの少なくとも一方)は、標的にハイブリダイズしない配列をさらに含む。第2のLactobacillus特異的検出プローブをさらに含む一部の実施形態では、第2のLactobacillus特異的検出プローブは、標的にハイブリダイズしない配列をさらに含む。上記のとおりの一部のそのようなバリエーションでは、検出プローブのいずれか1つ(例えばそれぞれ)は、分子トーチまたは分子ビーコンである。
なお別の態様では、本発明は、試料中のLactobacillus sp.の存在または非存在を決定するための方法を提供する。方法は、一般に以下のステップ:
(1)Lactobacillus sp.を含有することが疑われる試料を、Lactobacillus sp.標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーと接触させるステップであって、ここで、第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、第1および第2のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列をそれぞれ含み、ここで、第1および第2の増幅オリゴマーが、配列番号1の約91位のヌクレオチドから約265位のヌクレオチドの領域に対応するLactobacillus sp.16S rRNA領域を標的とする、ステップ;
(2)in vitro核酸増幅反応を行うステップであって、任意のLactobacillus sp.標的核酸が、試料中に存在する場合、Lactobacillus sp.標的領域に対応する1つまたは複数の増幅産物を生成するための鋳型として使用される、ステップ;ならびに
(3)1つまたは複数の増幅産物の存在または非存在を検出し、それにより試料中のLactobacillus sp.の存在または非存在を決定するステップ
を含む。
上記のとおりのLactobacillus sp.を検出するための方法の一部のバリエーションでは、第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号7の残基28〜45もしくは配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、および/または第2のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号6のヌクレオチド配列に実質的に対応する。一部のそのような実施形態では、第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号7の残基28〜45もしくは配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列を含む、またはそれからなり、および/または第2のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号6のヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。
上記のとおりのLactobacillus sp.を検出するための方法の一部の実施形態では、第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、試料を、Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーとさらに接触させ、ここで、第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む。一部のそのような実施形態では、第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。
上記のとおりのLactobacillus sp.を検出するための方法の一部の実施形態では、第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、第1のLactabacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含む。第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、試料を、Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーとさらに接触させる、一部のそのような実施形態では、第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。特に適切なプロモーター配列は、例えば、配列番号7の残基1〜27のヌクレオチド配列を有するプロモーター配列などの、T7プロモーター配列である。具体的なバリエーションでは、第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号7のヌクレオチド配列を有する。試料を、Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーとさらに接触させる上記のとおりの一部の実施形態では、第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号8のヌクレオチド配列を有する。
上記のとおりのLactobacillus sp.を検出するための方法の、ある特定の実施形態では、方法は、ステップ(2)の前にLactobacillus標的核酸を、存在する場合、試料中の他の構成成分から精製するステップをさらに含む。一部のそのような実施形態では、精製するステップは、試料を、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合した、標的にハイブリダイズする配列を含む少なくとも1つの捕捉プローブオリゴマーと接触させるステップを含む。例えば、試料を、Lactobacillus標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズする、捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列を含むLactobacillus特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させてもよく、ここで、Lactobacillus特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列は、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合されている。具体的なバリエーションでは、Lactobacillus特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列は、配列番号5の残基1〜12のヌクレオチド配列に実質的に対応する。一部の実施形態では、Lactobacillus特異的捕捉プローブオリゴマーは、配列番号5のヌクレオチド配列を有する。
上記のとおりのLactobacillus sp.を検出するための方法の一部の実施形態では、検出するステップ(3)は、(i)1つまたは複数の増幅産物を、Lactobacillus sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のLactobacillus特異的検出プローブと接触させるステップ、および(ii)標的にハイブリダイズした任意のLactobacillus特異的検出プローブの存在または非存在を検出するステップを含む。一部のそのような実施形態では、第1のLactobacillus特異的検出プローブは、配列番号9に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む。具体的なバリエーションでは、第1のLactobacillus特異的検出プローブは、配列番号9のヌクレオチド配列を有する。上記のとおりの一部の実施形態では、検出するステップ(3)は、1つまたは複数の増幅産物を、Lactobacillus sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第2のLactobacillus特異的検出プローブと接触させるステップをさらに含み、ここで、第2のLactobacillus特異的検出プローブは、配列番号10の残基6〜21に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含み;一部のそのような実施形態では、第2のLactobacillus特異的検出プローブは、配列番号10のヌクレオチド配列を有する。
上記のとおりのLactobacillus sp.を検出するための方法の、ある特定の実施形態では、方法が第1のLactobacillus特異的検出プローブの使用を含む場合、第1のLactobacillus特異的検出プローブは標識を含む。1つまたは複数の増幅産物を第2のLactobacillus特異的検出プローブと接触させることをさらに含む一部の実施形態では、第2のLactobacillus特異的検出プローブは標識を含む。特に適切な標識には、化学発光標識および蛍光標識が含まれる。
上記のとおりのLactobacillus sp.を検出するための方法の一部の実施形態では、方法が標識された検出プローブの使用を含む場合、検出するステップ(3)は、増幅するステップ(2)の間に行われる。一部のそのようなバリエーションでは、検出プローブは、蛍光標識およびクエンチャーを含む。蛍光標識およびクエンチャーを含む、特に適切な検出プローブには、分子トーチ、分子ビーコン、およびTaqMan検出プローブが含まれる。
上記のとおりのLactobacillus sp.を検出するための方法の、ある特定の実施形態では、方法が標識された検出プローブの使用を含む場合、第1のLactobacillus特異的検出プローブは、標的にハイブリダイズしない配列をさらに含む。方法の一部のバリエーションでは、第1のLactobacillus特異的検出プローブは、分子トーチまたは分子ビーコンである。
なお別の態様では、本発明は、試料中のG.vaginalisの存在または非存在を決定するための方法を提供する。方法は、一般に以下のステップを含む:
(1)G.vaginalisを含有することが疑われる試料を、G.vaginalis標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーと接触させるステップであって、ここで、第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーが、第1および第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列をそれぞれ含み、ここで、第1および第2の増幅オリゴマーが、配列番号3の約964位のヌクレオチドから約1036位のヌクレオチドの領域に対応するG.vaginalis 16S rRNA領域を標的とする、ステップ;
(2)in vitro核酸増幅反応を行うステップであって、ここで、任意のG.vaginalis標的核酸が、試料中に存在する場合、G.vaginalis標的領域に対応する1つまたは複数の増幅産物を生成するための鋳型として使用される、ステップ;ならびに
(3)1つまたは複数の増幅産物の存在または非存在を検出し、それにより試料中のG.vaginalisの存在または非存在を決定するステップ。
上記のとおりのG.vaginalisを検出するための方法の一部のバリエーションでは、第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、および/または第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号12のヌクレオチド配列に実質的に対応する。一部のそのような実施形態では、第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列を含み、もしくはそれからなり、および/または第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号12のヌクレオチド配列を含む、もしくはそれからなる。
上記のとおりのG.vaginalisを検出するための方法の一部の実施形態では、第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。特に適切なプロモーターは、例えば、配列番号7の残基1〜27のヌクレオチド配列を有するプロモーター配列などの、T7プロモーター配列である。具体的なバリエーションでは、第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号13のヌクレオチド配列を有する。
上記のとおりのG.vaginalisを検出するための方法の、ある特定の実施形態では、方法は、ステップ(2)の前にG.vaginalis標的核酸を、存在する場合、試料中の他の構成成分から精製するステップをさらに含む。一部の実施形態では、精製するステップは、試料を、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合した、標的にハイブリダイズする配列を含む少なくとも1つの捕捉プローブオリゴマーと接触させるステップをさらに含む。例えば、試料を、G.vaginalis標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズする、捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列を含むG.vaginalis特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させてもよく、ここで、G.vaginalis特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列は、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合されている。具体的なバリエーションでは、G.vaginalis特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列は、配列番号11の残基1〜17のヌクレオチド配列に実質的に対応する。一部の実施形態では、G.vaginalis特異的捕捉プローブオリゴマーは、配列番号11のヌクレオチド配列を有する。
上記のとおりのG.vaginalisを検出するための方法の一部の実施形態では、検出するステップ(3)は、(i)1つまたは複数の増幅産物を、G.vaginalis標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のG.vaginalis特異的検出プローブと接触させるステップ、および(ii)標的にハイブリダイズした任意のG.vaginalis特異的検出プローブの存在または非存在を検出するステップを含む。一部のそのような実施形態では、第1のG.vaginalis特異的検出プローブは、配列番号14の残基1〜19に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む。具体的なバリエーションでは、第1のG.vaginalis特異的検出プローブは、配列番号14のヌクレオチド配列を有する。
上記のとおりのG.vaginalisを検出するための方法の、ある特定の実施形態では、第1のG.vaginalis特異的検出プローブ(detection probe detection probe)は、標識を含む。特に適切な標識には、化学発光標識および蛍光標識が含まれる。
上記のとおりのG.vaginalisを検出するための方法の一部の実施形態では、方法が標識された検出プローブの使用を含む場合、検出するステップ(3)は、増幅するステップ(2)の間に行われる。一部のそのようなバリエーションでは、検出プローブは、蛍光標識およびクエンチャーを含む。蛍光標識およびクエンチャーを含む、特に適切な検出プローブには、分子トーチ、分子ビーコン、またはTaqMan検出プローブが含まれる。
上記のとおりのG.vaginalisを検出するための方法の、ある特定の実施形態では、方法が標識された検出プローブの使用を含む場合、第1のG.vaginalis特異的検出プローブは、標的にハイブリダイズしない配列をさらに含む。方法の一部のバリエーションでは、第1のG.vaginalis特異的検出プローブは、分子トーチまたは分子ビーコンである。
さらに別の態様では、本発明は、試料中のEggerthella sp.の存在または非存在を決定するための方法を提供する。方法は、一般に以下のステップを含む:
(1)Eggerthella sp.を含有することが疑われる試料を、Eggerthella sp.標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のEggerthella特異的増幅オリゴマーと接触させるステップであって、ここで、第1および第2のEggerthella特異的増幅オリゴマーが、第1および第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列をそれぞれ含み、ここで、第1および第2の増幅オリゴマーが、配列番号4の約165位のヌクレオチドから約259位のヌクレオチドの領域に対応するEggerthella sp.16S rRNA領域を標的とする、ステップ;
(2)in vitro核酸増幅反応を行うステップであって、任意のEggerthella sp.標的核酸が、試料中に存在する場合、Eggerthella sp.標的領域に対応する1つまたは複数の増幅産物を生成するための鋳型として使用される、ステップ;ならびに
(3)1つまたは複数の増幅産物の存在または非存在を検出し、それにより試料中のEggerthella sp.の存在または非存在を決定するステップ。
上記のとおりのEggerthella sp.を検出するための方法の一部のバリエーションでは、第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列に実質的に対応し、および/または第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号16のヌクレオチド配列に実質的に対応する。一部のそのような実施形態では、第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列を含み、もしくはそれからなり、および/または第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号16のヌクレオチド配列を含む、もしくはそれからなる。
上記のとおりのEggerthella sp.を検出するための方法の一部の実施形態では、第1のEggerthella特異的増幅オリゴマーは、第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。特に適切なプロモーター配列は、例えば、配列番号7の残基1〜27のヌクレオチド配列を有するプロモーター配列などの、T7プロモーター配列である。具体的なバリエーションでは、第1のEggerthella特異的増幅オリゴマーは、配列番号17のヌクレオチド配列を有する。
上記のとおりのEggerthella sp.を検出するための方法の、ある特定の実施形態では、方法は、ステップ(2)の前にEggerthella sp.標的核酸を、存在する場合、試料中の他の構成成分から精製するステップをさらに含む。一部の実施形態では、精製するステップは、試料を、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合した、標的にハイブリダイズする配列を含む少なくとも1つの捕捉プローブオリゴマーと接触させるステップをさらに含む。例えば、試料を、Eggerthella sp.標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズする、捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列を含むEggerthella特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させてもよく、ここで、Eggerthella特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列は、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合されている。具体的なバリエーションでは、Eggerthella特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列は、配列番号15の残基1〜12のヌクレオチド配列に実質的に対応する。一部の実施形態では、Eggerthella特異的捕捉プローブオリゴマーは、配列番号15のヌクレオチド配列を有する。
上記のとおりのEggerthella sp.を検出するための方法の一部の実施形態では、検出するステップ(3)は、(i)1つまたは複数の増幅産物を、Eggerthella sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のEggerthella特異的検出プローブと接触させるステップ、および(ii)標的にハイブリダイズした任意のEggerthella特異的検出プローブの存在または非存在を検出するステップを含む。一部のそのような実施形態では、第1のEggerthella特異的検出プローブは、配列番号18に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む。具体的なバリエーションでは、第1のEggerthella特異的検出プローブは、配列番号18のヌクレオチド配列を有する。
上記のとおりのEggerthella sp.を検出するための方法の、ある特定の実施形態では、第1のEggerthella特異的検出プローブ(detection probe detection probe)は、標識を含む。特に適切な標識には、化学発光標識および蛍光標識が含まれる。
上記のとおりのEggerthella sp.を検出するための方法の一部の実施形態では、方法が標識された検出プローブの使用を含む場合、検出するステップ(3)は、増幅するステップ(2)の間に行われる。一部のそのようなバリエーションでは、検出プローブは、蛍光標識およびクエンチャーを含む。蛍光標識およびクエンチャーを含む、特に適切な検出プローブには、分子トーチ、分子ビーコン、またはTaqMan検出プローブが含まれる。
上記のとおりのEggerthella sp.を検出するための方法の、ある特定の実施形態では、方法が標識された検出プローブの使用を含む場合、第1のEggerthella特異的検出プローブは、標的にハイブリダイズしない配列をさらに含む。方法の一部のバリエーションでは、第1のEggerthella特異的検出プローブは、分子トーチまたは分子ビーコンである。
上記のとおりのLactobacillus sp.、G.vaginalis、またはEggerthella sp.のいずれか1つを検出するための方法の一部の実施形態では、ステップ(2)での増幅反応は、等温増幅反応である。特定のバリエーションでは、等温増幅反応は、転写媒介性増幅(TMA)反応である。ある特定の実施形態では、等温増幅反応は、リアルタイム増幅反応である。
さらに他の態様では、本発明は、試料中のLactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.のいずれか1つの存在または非存在を決定するためのオリゴマーの組合せを提供する。様々な実施形態では、オリゴマーの組合せは、試料中のLactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.の存在または非存在を決定するための方法について上で述べたとおりのオリゴマーを含む。
なお他の態様では、本発明は、被験体における細菌性膣炎(BV)の存在または非存在を決定するための組成物またはキットを提供する。組成物またはキットは、一般に、(a)Lactobacillus sp.標的核酸に特異的にハイブリダイズする第1の検出プローブ、および(b)G.vaginalis標的核酸に特異的にハイブリダイズする第2の検出プローブを含み、ここで、第1および第2の検出プローブの少なくとも一方は標識を含み、ここで、組成物またはキットは、(i)いずれの真菌種からの標的核酸に特異的にハイブリダイズする検出プローブも含まず、(ii)Lactobacillus sp.またはG.vaginalis以外のいずれの細菌種からの標的核酸に特異的にハイブリダイズする検出プローブも含まない。一部の実施形態では、第1の検出プローブは、L.gasseri標的核酸、L.crispatus標的核酸およびL.jensenii標的核酸の少なくとも1つに特異的にハイブリダイズする。一部の実施形態では、第1の検出プローブは、配列番号1の約91位のヌクレオチドから約265位のヌクレオチドの領域に対応するLactobacillus sp.16S rRNA領域を標的とし、および/または第2の検出プローブは、配列番号3の約964位のヌクレオチドから約1036位のヌクレオチドの領域に対応するG.vaginalis 16S rRNA領域を標的とする。特定のバリエーションでは、第1の検出プローブは、配列番号9に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含み、および/または第2の検出プローブは、配列番号14の残基1〜19に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含み;一部のそのような実施形態では、第1の検出プローブは、配列番号9のヌクレオチド配列を有し、および/または第2の検出プローブは、配列番号14のヌクレオチド配列を有する。ある特定の実施形態では、組成物またはキットは、Lactobacillus sp.標的核酸に特異的にハイブリダイズする第3の検出プローブ、例えば、配列番号10の残基6〜21に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む、第3の検出プローブをさらに含む。具体的なバリエーションでは、第3の検出プローブは、配列番号10のヌクレオチド配列を有する。
本発明のこれらの態様および他の態様は、本発明の以下の詳細な記載を参照することにより明らかになる。
定義
他に定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、記載される方法および組成物に関係する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用するとき、以下の用語および語句は、他に特定されない限り、それらに帰する意味を有する。
用語「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈が他に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。
「試料」は、Lactobacillus sp., Gardnerella vaginalis,もしくはEggerthella sp.またはその構成成分、例えば、核酸または核酸断片を含み得る任意の検体を含む。
試料には、Lactobacillus sp.、Gardnerella vaginalisもしくはEggerthella sp.またはそれらの構成成分(例えば、それら由来の標的核酸)を含有し得る、生きているまたは死亡したヒト由来の任意の組織または材料を含む「生物学的試料」が含まれ、例えば、膣スワブ試料、子宮頸部ブラシ試料、気管支鏡検査、気管支肺胞洗浄物(BAL)もしくは肺生検などの呼吸器組織もしくは呼吸器滲出物、痰、唾液、末梢血、血漿、血清、リンパ節、胃腸組織、糞便、尿、精液または他の体液もしくは材料を含む。生物学的試料を処理して、物理的または機械的に組織または細胞構造を破壊し、こうして細胞内の構成成分を、酵素、緩衝剤、塩、界面活性剤などをさらに含有してもよい溶液中に放出してもよく、それらは、標準的な方法を用いて、分析用に生物学的試料を調製するために使用される。また、試料は、加工された試料、例えば、試料を濾過デバイス上でもしくは濾過デバイスを通過させて得られたもの、または続く遠心分離、または媒体、マトリックスもしくは支持体への付着によって得られたものを含んでもよい。
「核酸」は、窒素含有複素環塩基または塩基類似体を有する、2つまたはそれ超の共有結合したヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含み、該ヌクレオシドがホスホジエステル結合または他の連結によってともに連結されてポリヌクレオチドを形成している、多量体化合物を指す。核酸には、RNA、DNAまたはキメラDNA−RNAポリマーもしくはオリゴヌクレオチド、およびそれらの類似体が含まれる。核酸「主鎖」は、多様な連結で構成されてもよく、該連結には、糖−ホスホジエステル連結、ペプチド−核酸結合(「ペプチド核酸」またはPNAにおいて、PCT番号WO95/32305号を参照されたい)、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結またはそれらの組合せの1つまたは複数が含まれる。核酸の糖部分は、リボースもしくはデオキシリボース、または公知の置換、例えば、2’−メトキシ置換および2’−ハロゲン化物置換(例えば2’−F)などを有する同様の化合物であってもよい。窒素含有塩基(nitrogenous base)は、慣用的な塩基(A、G、C、T、U)、それらの類似体(例えば、イノシン、5−メチルイソシトシン、イソグアニン;The Biochemistry of the Nucleic Acids 5〜36頁、Adamsら、編集、第11版、1992年;Abrahamら、2007年、BioTechniques 43巻:617〜24頁)であってもよく、これにはプリンまたはピリミジン塩基の誘導体(例えば、N−メチルデオキシグアノシン(deoxygaunosine)、デアザプリンまたはアザプリン、デアザピリミジンまたはアザピリミジン、5位または6位に置換基を有するピリミジン塩基、2位、6位および/または8位に変更された置換基または置き換えられた置換基を有するプリン塩基、例えば、2−アミノ−6−メチルアミノプリン、O−メチルグアニン、4−チオ−ピリミジン、4−アミノ−ピリミジン、4−ジメチルヒドラジン−ピリミジンおよびO−アルキル−ピリミジン、およびピラゾロ化合物、例えば未置換または3−置換ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン;米国特許第5,378,825号、同第6,949,367号およびPCT番号WO93/13121号)が含まれる。核酸には、主鎖が、1つまたは複数の残基に関して窒素含有塩基を含まない「無塩基の」残基が含まれてもよい(米国特許第5,585,481号)。核酸は、RNAおよびDNAにおいて見出されるような、慣用的な糖、塩基および連結のみを含んでもよく、または慣用的な構成成分および置換を含んでもよい(例えば、2’−メトキシ主鎖によって連結された慣用的な塩基、または慣用的な塩基および1つまたは複数の塩基類似体の混合物を含む核酸)。核酸には、1つまたは複数のヌクレオチド単量体が、RNA模倣糖コンホメーションにロックされた二環フラノース単位を有する「ロックド核酸」(LNA)が含まれてもよく、これは一本鎖RNA(ssRNA)、一本鎖DNA(ssDNA)または二本鎖DNA(dsDNA)中の相補配列に対するハイブリダイゼーション親和性を増進する(Vesterら、Biochemistry 43巻:13233〜41頁、2004年)。核酸には、核酸の機能または挙動を変える修飾塩基が含まれてもよく、例えば、さらなるヌクレオチドが核酸に付加されるのをブロックするため、3’末端にジデオキシヌクレオチドが付加されてもよい。in vitroで核酸を作製するための合成法は、当該技術分野において周知であるが、ルーチンの技術を用いて、核酸を天然供給源から精製してもよい。
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用するとき、核酸鎖を指す。本出願全体を通じて、核酸は5’末端から3’末端までで表される。標準核酸、例えば、DNAおよびRNAは、典型的には、「5’から3’」に、すなわち、成長中の核酸の3’末端へのヌクレオチドの付加によって合成される。
「ヌクレオチド」は、本明細書で使用するとき、リン酸基、5炭糖(5-carbon sugar)および窒素含有塩基からなる核酸のサブユニットである。RNA中で見出される5炭糖はリボースである。DNAにおいて、5炭糖は2’−デオキシリボースである。該用語にはまた、このようなサブユニットの類似体、例えば、リボースの2’位でのメトキシ基(2’−O−Me)も含まれる。
「核酸に基づく検出アッセイ」は、本明細書で使用するとき、標的核酸内の標的配列を検出するためのアッセイであって、標的配列に特異的にハイブリダイズするもう1つのオリゴヌクレオチドを利用するアッセイである。
本発明によるある特定の実施形態では、核酸に基づく検出アッセイは、「増幅に基づくアッセイ」、すなわち、核酸標的配列を増幅させるための1つまたは複数のステップを利用するアッセイである。検出アッセイで使用するための様々な増幅方法が当該技術分野において公知であり、そのうちのいくつかを本明細書中にさらに要約する。明確にするために、増幅に基づくアッセイは、例えば増幅に基づかないアッセイ方法(例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、または切断に基づくアッセイ)で使用されるステップなどの、標的配列を増幅させない1つまたは複数のステップを含み得る。
他の実施形態では、核酸に基づく検出アッセイは、「増幅に基づかないアッセイ」、すなわち、核酸標的配列を増幅させるいかなるステップにも依拠しないアッセイである。明確にするために、一切の対応する下流増幅オリゴマーの非存在下でのプライマーの伸長反応(例えば、結果としてRNA標的に相補的な一本鎖cDNAを生ずるがcDNAのコピーを生成しない、RNA:DNA二重鎖を生成するための逆転写酵素によるプライマーの伸長、続いてのRNAのRNアーゼ消化)を含む、核酸に基づく検出アッセイは、増幅に基づかないアッセイであると理解される。
例示的な、増幅に基づかないアッセイは、オーバーラップオリゴヌクレオチドの標的核酸への特異的ハイブリダイゼーションによって形成された線状二重鎖切断構造(linear duplex cleavage structure)の、フラップエンドヌクレアーゼによる、特異的切断に依拠するアッセイである、「切断に基づくアッセイ」である。これらのアッセイでは、標的にハイブリダイズしないフラップ領域を含有するプローブオリゴヌクレオチドは、フラップエンドヌクレアーゼによってオーバーラップ依存的な方法で切断されて切断産物を放出し、それは次に検出される。切断に基づくアッセイの原理は当該技術分野において周知であり、例示的なアッセイは、例えば、Lyamichevら(Nat. Biotechnol.17巻:292〜296頁、1999年)、Ryanら(Mol. Diagn.4巻:135〜144頁、1999年)、Allawiら(J. Clin. Microbiol.44巻:3443〜3447頁、2006年)、Browらへの米国特許第5,846,717号および同第6,706,471号ならびにDahlbergらへの米国特許第5,614,402号に記載されている。切断に基づくアッセイには、例えば、市販のInvader(登録商標)アッセイ(Hologic,Inc.、Madison、WI)が含まれる。
「標的核酸」は、本明細書で使用するとき、検出されるべき標的配列を含む核酸である。標的核酸は、本明細書で記載されるDNAまたはRNAであってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。標的核酸には、標的配列に加えて、他の配列が含まれてもよい。
「単離される」は、標的核酸を含有する試料が、その天然の環境から採取されることを意味するが、その用語は、精製のいかなる程度も意味しない。
用語「標的配列」は、本明細書で使用するとき、検出しようとする標的核酸の特定のヌクレオチド配列を指す。「標的配列」には、オリゴヌクレオチド(例えば、プローブオリゴヌクレオチド、プライミングオリゴヌクレオチドおよび/またはプロモーターオリゴヌクレオチド)が検出プロセス(例えば、増幅に基づく検出アッセイ、例えばTMAもしくはPCRなど、または増幅に基づかない検出アッセイ、例えば切断に基づくアッセイなど)中に複合体を形成する複合体形成配列が含まれる。標的核酸が元々一本鎖である場合、用語「標的配列」はまた、標的核酸に存在するような「標的配列」に相補的である配列も指す。標的核酸が元々二本鎖である場合、用語「標的配列」は、センス(+)鎖およびアンチセンス(−)鎖の両方を指す。標的配列を選択する際、当業者は、無関係の標的核酸間または近縁の標的核酸間の区別のために「固有の」配列を選択すべきであることを理解されたい。
「標的にハイブリダイズする配列(target-hybridizing sequence)」は、標的核酸配列とハイブリダイズするように構成されているオリゴマーの部分を指すように本明細書で使用される。好ましくは、標的にハイブリダイズする配列は、標的核酸配列と特異的にハイブリダイズするように構成されている。標的にハイブリダイズする配列は、それらがハイブリダイズするように構成されている標的配列の部分に100%相補的であってもよいが、必ずしもそうではない。標的にハイブリダイズする配列はまた、標的配列に対して、挿入、欠失および/または置換されたヌクレオチド残基を含んでもよい。標的配列への、標的にハイブリダイズする配列の100%未満の相補性は、例えば、標的核酸が種内の複数の株である場合に生じ得、例えば、Lactobacillusの種々の株にハイブリダイズするように構成されているオリゴマーに関する場合が挙げられる。標的核酸に100%未満の相補性を有するように、標的にハイブリダイズする配列を構成することについて他の理由があることは理解される。
Lactobacillus sp.、G. vaginalis、またはEggerthella sp.核酸の領域に言及した用語「配列を標的とする」は、本明細書で使用するとき、オリゴヌクレオチドが、本明細書に記載する検出を可能にする方式で標的配列にハイブリダイズするプロセスを指す。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的化されたLactobacillus sp.、G. vaginalis、またはEggerthella sp.核酸配列と相補的であり、ミスマッチを含有しない。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的化されたLactobacillus sp.、G. vaginalis、またはEggerthella sp.核酸配列と相補的であるが、該配列と1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのミスマッチを含有する。好ましくは、標的核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドには、標的配列に相補的な少なくとも10個から最大50個のヌクレオチドが含まれる。少なくとも10個および最大50個は、10個、50個およびそれらの間のそれぞれの整数を含むような包括的範囲であると理解される。好ましくは、オリゴマーは、標的配列に特異的にハイブリダイズする。
用語「するよう構成される」は、言及されるオリゴヌクレオチド標的にハイブリダイズする配列のポリヌクレオチド配列構成の実際の配置を示す。例えば、標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成されているオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で言及された配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を有する。
用語「に特異的にハイブリダイズするように構成されている」とは、本明細書で使用するとき、オリゴヌクレオチドの、標的にハイブリダイズする領域が、言及されたLactobacillus sp.、G. vaginalis、またはEggerthella sp.標的領域の配列を標的とし得るポリヌクレオチド配列を有するように設計されていることを意味する。このようなオリゴヌクレオチドは、その配列だけを標的化することに限定されるものではなく、Lactobacillus sp.、G. vaginalis、またはEggerthella sp.標的核酸を標的化するための組成物として、キットにおいて、または方法においてむしろ有用である。オリゴヌクレオチドは、試料からのLactobacillus sp.、G. vaginalis、またはEggerthella sp.を増幅および検出するためのアッセイの構成成分として機能するように設計され、したがって、試験試料中に一般的に見出される他の核酸の存在下でLactobacillus sp.、G. vaginalis、またはEggerthella sp.を標的化するように設計される。「に特異的にハイブリダイズする」とは、当該技術分野において理解されるように、非標的核酸へのいくらかの小レベルのハイブリダイゼーションが生じ得るため、排他的にハイブリダイズすることを意味しない。むしろ、「に特異的にハイブリダイズする」とは、試料中の標的核酸の正確な検出が決定され得るように、主に標的にハイブリダイズするようにアッセイにおいて機能するようにオリゴヌクレオチドが構成されることを意味する。用語「するように構成されている」は、オリゴヌクレオチドの標的にハイブリダイズする配列のポリヌクレオチド配列構成の実際の配置を示す。
用語「断片」は、Lactobacillus sp.、G. vaginalis、またはEggerthella sp.標的化核酸に言及して本明細書で使用するとき、連続する核酸の小片を指す。ある特定の実施形態では、断片には、Lactobacillus sp.、G. vaginalis、またはEggerthella sp.の16SリボソームRNA由来の連続するヌクレオチドが含まれ、ここで、断片中の16Sの連続するヌクレオチドの数は、全16Sについてのものよりも少ない。
用語「領域」は、本明細書で使用するとき、全核酸より小さい核酸の部分を指す。例えば、言及される核酸がオリゴヌクレオチドプロモータープライマーである場合、用語「領域」は、全オリゴヌクレオチドのより小さいプロモーター部分を指すように使用されてもよい。同様におよび例のみとして、核酸が16SリボソームRNAである場合、用語「領域」は、核酸のより小さい領域を指すように使用されてもよく、ここで、より小さな領域は本発明の1つまたは複数のオリゴヌクレオチドによって標的化される。別の非限定的な例として、言及される核酸がアンプリコンである場合、領域なる用語は、プローブの標的にハイブリダイズする配列によるハイブリダイゼーションのために同定されるより小さいヌクレオチド配列を指すように使用されてもよい。
交換可能な用語「オリゴマー」、「オリゴ」および「オリゴヌクレオチド」は、一般的に1,000ヌクレオチド(nt)残基未満を有する核酸を指し、約5nt残基の下限および約500〜900nt残基の上限を有する範囲のポリマーを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約12〜15ntの下限および約50〜600ntの上限を有するサイズ範囲にあり、そして他の実施形態は、約15〜20ntの下限および約22〜100ntの上限を有する範囲にある。オリゴヌクレオチドは、天然に存在する供給源から精製されてもよく、または多様な周知の酵素的もしくは化学的方法のいずれかを用いて合成されてもよい。オリゴヌクレオチドなる用語は、試薬に対するいかなる特定の機能も示さない;むしろ、一般的に、本明細書に記載される全てのこのような試薬を包括するように使用される。オリゴヌクレオチドは、多様な異なる機能を果たし得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、相補鎖に特異的であり、それにハイブリダイズすることができ、さらに核酸ポリメラーゼの存在下で伸長することができる場合には、プライマーとして機能し得る;オリゴヌクレオチドは、RNAポリメラーゼによって認識される配列を含み、転写を可能にする場合には、プライマーとして機能し、プロモーターを提供することができる(例えば、T7プライマー);オリゴヌクレオチドは、標的核酸またはそのアンプリコンにハイブリダイズすることができ、検出可能な部分(例えば、アクリジニウム−エステル化合物)をさらに提供する場合、標的核酸を検出するために機能することができる。
本明細書で使用するとき、特定の参照核酸配列に「実質的に対応する」オリゴヌクレオチドとは、オリゴヌクレオチドが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で同じ標的核酸配列とハイブリダイズするという点で、オリゴヌクレオチドが参照核酸配列と類似したハイブリダイゼーション特性を有するように、参照核酸配列に十分に類似していることを意味する。当業者は、「実質的に対応するオリゴヌクレオチド」が、参照配列と異なるが、同じ標的核酸配列になおもハイブリダイズし得ることを理解する。また、第2の核酸に対応する第1の核酸が、そのRNAおよびDNAを含み、文脈が明確に他に指示しない限り、その相補体を含むことが理解される。核酸からのこの変化は、配列内の同一塩基の割合、またはプローブもしくはプライマーとその標的配列との間の完全に相補的な塩基の割合の観点で記述されてもよい。したがって、ある特定の実施形態では、塩基同一性または相補性のこれらの割合が100%から約80%である場合、オリゴヌクレオチドは、参照核酸配列に「実質的に対応する」。好ましい実施形態では、割合は100%から約85%である。より好ましい実施形態では、この割合は、100%から約90%である;他の好ましい実施形態では、この割合は、100%から約95%である。同様に、核酸または増幅された核酸の領域は、参照核酸配列に対応するものとして、本明細書において言及され得る。当業者は、許容できないレベルの非特異的なハイブリダイゼーションを引き起こすことなしに、特異的な標的配列に対するハイブリダイゼーションを可能にする相補性の様々な割合で要求され得るハイブリダイゼーション条件への様々な改変を理解する。
「増幅オリゴマー」は、少なくともその3’末端が標的核酸に相補的であり、標的核酸またはその相補体にハイブリダイズし、核酸増幅反応に関与するオリゴマーである。増幅オリゴマーの例は、標的核酸にハイブリダイズし、増幅プロセスにおいてポリメラーゼによって伸長される3’OH末端を含有する「プライマー」である。増幅オリゴマーの別の例は、(例えば、3’がブロックされた末端を有するため)ポリメラーゼによって伸長されないが、増幅に関与しまたは促進するオリゴマーである。例えば、増幅オリゴヌクレオチドの5’領域は、標的核酸に相補的でないプロモーター配列(「プロモータープライマー」または「プロモータープロバイダー」と称されてもよい)を含み得る。当業者は、プライマーとして機能する増幅オリゴマーが、5’プロモーター配列を含むように改変されてもよく、したがってプロモータープライマーとして機能し得ることを理解する。3’がブロックされた末端の組み込みは、プロモータープライマーをさらに改変し、ここでは、プロモータープライマーは標的核酸にハイブリダイズし、転写を開始させる働きをする上流プロモーター配列を提供することができるが、オリゴ伸長のためのプライマーを提供しない。このような改変されたオリゴは、本明細書において「プロモータープロバイダー」オリゴマーと称される。増幅オリゴヌクレオチドのサイズ範囲には、長さが約10〜約70ntであり(いかなるプロモーター配列もポリAテールも含まない)、標的核酸配列の領域(またはその相補鎖)に相補的である少なくとも約10個の連続する塩基またはさらに少なくとも12個の連続する塩基を含有するものが挙げられる。連続する塩基は、増幅オリゴマーが結合する標的配列に少なくとも80%、または少なくとも90%、または完全に相補的である。増幅オリゴマーは、増幅反応に関与するが、標的核酸もしくは鋳型配列に相補的でなく、それに含有されない、改変されたヌクレオチドもしくは類似体、または追加のヌクレオチドを任意選択で含んでもよい。オリゴヌクレオチド、アンプリコンまたは他の核酸の長さに関する範囲について言及する場合、その範囲は全ての整数を含む(例えば、長さが19〜25個の連続するヌクレオチドには19、20、21、22、23、24および25が含まれる)ことが理解される。
本明細書で使用するとき、「プロモーター」は、特定の部位で核酸に結合し、RNAの転写を開始するためのシグナルとして、DNA依存性RNAポリメラーゼ(「転写酵素」)によって認識される特異的核酸配列である。
本明細書で使用するとき、「プロモータープロバイダー」または「プロバイダー」は、第1および第2の領域を含み、その3’末端からのDNA合成の開始を防止するよう改変されたオリゴヌクレオチドを指す。プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドの「第1の領域」は、DNA鋳型にハイブリダイズする塩基配列を含み、該ハイブリダイズする配列(hybridizing sequence)は、プロモーター領域の3’に位置するが、必ずしもこれに隣接しない。プロモーターオリゴヌクレオチドのハイブリダイズする部分は、典型的には、長さが少なくとも10ヌクレオチドであり、長さは最長50またはそれ超のヌクレオチドまで伸長可能である。「第2の領域」は、RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む。プロモーターオリゴヌクレオチドは、好ましくは上記のようにその3’末端でブロッキング部分を含む、RNAまたはDNA依存性DNAポリメラーゼ、例えば、逆転写酵素によって伸長不能であるように操作される。本明細書で言及されるように、「T7プロバイダー」は、T7 RNAポリメラーゼによって認識されるオリゴヌクレオチド配列を提供するブロックされたプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドである。
「増幅」は、標的核酸配列またはその相補体もしくはその断片の複数コピーを得るための任意の公知の手技を指す。複数コピーは、アンプリコンまたは増幅産物と称され得る。公知の増幅方法には、熱サイクリング増幅方法と等温増幅方法の両方が含まれる。一部の実施形態では、等温増幅方法が好ましい。レプリカーゼ媒介性増幅、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)、および転写媒介性または転写関連増幅は、核酸増幅方法の非限定的な例である。レプリカーゼ媒介性増幅は、自己複製RNA分子、およびQB−レプリカーゼなどのレプリカーゼを用いる(例えば、米国特許第4,786,600号)。PCR増幅は、DNAポリメラーゼ、プライマー対およびサーマルサイクリングを用いて、dsDNAの2つの相補鎖の、またはcDNAから、複数コピーを合成する(例えば、米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号および同第4,800,159号)。LCR増幅は、複数のサイクルのハイブリダイゼーション、ライゲーションおよび変性を用いることによって、4つまたはそれ超の異なるオリゴヌクレオチドを用いて、標的およびその相補鎖を増幅する(例えば、米国特許第5,427,930号および同第5,516,663号)。SDAは、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプライマー、および標的配列を含む半改変DNA二重鎖の一方の鎖にニックを入れるエンドヌクレアーゼを用いて、それにより一連のプライマー伸長および鎖置換ステップで増幅が起こる(例えば、米国特許第5,422,252号、同第5,547,861号;および同第5,648,211号)。好ましい実施形態は、RNA標的核酸の増幅に適した増幅方法、例えば、転写媒介性増幅(TMA)またはNASBAを使用するが、本明細書に開示されるオリゴマーが他の増幅方法においてプライマーとして容易に使用され得ることは当業者には明らかである。
「転写関連増幅」(本明細書において「転写媒介性増幅」(TMA)ともいう)は、RNAポリメラーゼを用いて、核酸鋳型から複数のRNA転写物を産生する核酸増幅を指す。これらの方法は、一般的に、RNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、およびプロモーター配列を含む鋳型相補性オリゴヌクレオチドを使用し、任意選択で、1つまたは複数の他のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。TMAは、本明細書に記載するようなHSV標的配列を増幅および検出するために使用される増幅法の実施形態である。転写関連増幅の変形は、先に詳細に開示されるように、当該技術分野において周知である(例えば、米国特許第4,868,105号;同第5,124,246号;同第5,130,238号;同第5,399,491号;同第5,437,990号;同第5,554,516号;および同第7,374,885号;ならびにPCT公報第WO88/01302号;同第WO88/10315号および同第WO95/03430号)。当業者は、ポリメラーゼによるオリゴマー配列の伸長に基づく増幅法において、開示される組成物を用いてもよいことを理解する。
本明細書で使用するとき、用語「リアルタイムTMA」は、リアルタイム検出手段によって監視される標的核酸の単一プライマー転写媒介性増幅(「TMA」)を指す。
「増幅産物」と交換可能に使用される用語「アンプリコン」は、標的配列内に含有される配列に相補的または相同である、増幅手技中に生成される核酸分子を指す。これらの用語は、一本鎖増幅産物、二本鎖増幅産物、または二本鎖増幅産物の鎖の一方を指すために使用され得る。
「プローブ」、「検出プローブ」、「検出オリゴヌクレオチド」および「検出プローブオリゴマー」は、本明細書において交換可能に使用され、ハイブリダイゼーションを促進して標的配列または増幅された核酸の検出を可能にする条件下で、核酸中または増幅された核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズする核酸オリゴマーを指す。検出は、直接的(例えば、その標的配列に直接ハイブリダイズするプローブ)または間接的(例えば、中間分子構造を介してその標的に連結されるプローブ)のいずれであってもよい。プローブは、DNA、RNA、それらの類似体、またはそれらの組合せであってもよく、これらは標識されていてもよくまたは標識されていなくてもよい。プローブの「標的配列」は、一般的に、標準的塩基対形成によってプローブオリゴマーの少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする、より大きい核酸配列内のより小さい核酸配列を指す。プローブは、プローブの三次元立体構造に寄与する標的特異的配列および他の配列を含んでもよい(例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,118,801号;同第5,312,728号;同第6,849,412号;同第6,835,542号;同第6,534,274号;および同第6,361,945号;ならびに米国公開第20060068417号)。好ましい実施形態では、検出プローブは2’メトキシ主鎖を含み、その結果、より強いシグナルを得ることができる。
用語「TaqMan(登録商標)プローブ」は、蛍光色素を典型的に5’塩基上に、および非蛍光性の消光色素(クエンチャー)を典型的に3’塩基上に含有する、検出オリゴヌクレオチドを指す。照射されると、励起した蛍光色素は、蛍光を発するのではなく、近くの消光色素分子にエネルギーを伝達し、非蛍光基質を生じる。増幅中、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性がTaqManプローブを切断してフルオロフォアをクエンチャーから分離し、それにより未消光シグナルを増幅の指標としてフルオロフォアから発光させる。
本明細書で使用するとき、「標識」は、検出されるまたは検出可能シグナルをもたらす、プローブに直接的または間接的に繋がれた部分または化合物を指す。直接標識は、共有結合または非共有相互作用、例えば、水素結合、疎水性相互作用およびイオン性相互作用、またはキレートもしくは配位錯体の形成を含む、標識をプローブに連結する結合または相互作用を通じて起こってもよい。間接標識は、直接的または間接的のいずれかで標識され、検出可能シグナルを増幅することができる、橋架け部分または「リンカー」、例えば結合対メンバー、抗体またはさらなるオリゴマーの使用を通じて起こってもよい。標識には、任意の検出可能な部分、例えば、放射性核種、リガンド(例えば、ビオチン、アビジン)、酵素または酵素基質、反応性基、または発色団(例えば、色素、粒子、または検出可能な色を与えるビーズ)、発光化合物(例えば、生物発光、燐光または化学発光標識)、またはフルオロフォアが含まれる。標識は、混合物中の結合した標識プローブが、未結合標識プローブのものと異なる検出可能な変化、例えば、不安定性または示差的な分解特性を示す、ホモジニアスアッセイにおいて検出可能であり得る。標識または標識プローブの未結合型から結合型を物理的に除去せずに、「ホモジニアス検出可能標識」を検出してもよい(例えば、米国特許第5,283,174号;同第5,656,207号;および同第5,658,737号)。標識には、化学発光化合物、例えば、標準的アクリジニウムエステル(「AE」)および誘導体を含むAE化合物が含まれる(例えば、米国特許第5,656,207号;同第5,658,737号および同第5,639,604号)。合成および核酸に標識を結合させ、標識を検出する方法は周知である。(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989年)、第10章、米国特許第5,658,737号、同第5,656,207号、同第5,547,842号、同第5,283,174号、および同第4,581,333号)。1を超える標識、および1を超える標識タイプは、特定のプローブ上に存在してもよく、または検出は、検出可能シグナルを生じる化合物で各プローブが標識されている、プローブの混合物を用いてもよい(例えば、米国特許第6,180,340号および同第6,350,579号)。
本明細書で使用するとき、「分子トーチ」と称される構造は、別個の自己相補性領域(「閉鎖ドメイン」)を含むように設計され、これらの領域は、繋ぐ領域(joining region)(「標的結合ドメイン」)によって接続されており、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする。標的閉鎖ドメインを含むヌクレオチド配列の全てまたは一部は、標的結合ドメインとしても機能し得る。したがって、標的閉鎖配列は、標的結合配列、標的に結合しない配列、およびそれらの組合せを含むことができる。
「捕捉プローブ」、「捕捉オリゴヌクレオチド」、「標的補足オリゴヌクレオチド」および「捕捉プローブオリゴマー」は、本明細書において交換可能に使用され、標準的塩基対形成によって、標的核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズし、固定されたプローブ上の結合パートナーに繋ぎ、標的核酸を支持体に捕捉する核酸オリゴマーを指す。捕捉オリゴマーの一例には、2つの結合領域を含むオリゴヌクレオチド:標的ハイブリダイジング配列および固定化プローブ結合領域を含む。この例のバリエーションでは、該2つの領域は、1つまたは複数のリンカーによって一緒に繋がれた2種の異なるオリゴマーに存在し得る。捕捉オリゴマーの別の実施形態は、標的ハイブリダイジング配列は、標的核酸に非特異的に結合し、該核酸を支持体上の固定化プローブに連結する、ランダムまたは非ランダムのポリGU配列、ポリGT配列またはポリU配列を含む配列である。固定化プローブ結合領域は、テールと称される核酸配列であり得る。テールには、約10〜40ヌクレオチド(例えば、A10〜A40)の、または支持粒子もしくは支持マトリックスに結合された相補的な固定化配列に結合している約14〜33nt(例えば、T14〜T30)の、実質的にホモポリマーのテールが含まれる。したがって、好ましい核酸テールの非限定的な例は、一部の実施形態では、T0〜410〜40配列を含み得る。捕捉オリゴマーの別の例は、標的にハイブリダイズする配列、および核酸配列でない結合対メンバーである、2つの領域を含む。
本明細書で使用するとき、「固定化オリゴヌクレオチド」、「固定化プローブ」または「固定化核酸」は、捕捉オリゴマーを支持体に、直接的または間接的に繋ぐ核酸結合パートナーを指す。支持体に繋がれた固定化プローブは、試料中の未結合物質から捕捉プローブに結合した標的の分離を容易にする。固定化プローブの一実施形態は、試料中の未結合物質からの結合標的配列の分離を容易にする、支持体に繋がれるオリゴマーである。支持体には、公知の物質、例えば、マトリックスおよび溶液中の遊離粒子が含まれてもよく、これは、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シラン、ポリプロピレン、金属または他の組成物からできていてもよく、その一実施形態は磁気誘引可能粒子(magnetically attractable particle)である。支持体は、固定化プローブが直接的(共有結合、キレート化もしくはイオン性相互作用を介して)または間接的に(1つまたは複数のリンカーを介して)繋がれる、単分散磁気球体(例えば、均一サイズ±5%)であってもよく、この場合、プローブと支持体との間の連結または相互作用は、ハイブリダイゼーション条件中、安定である。
図1Aは、Lactobacillus 16SリボソームRNA遺伝子(GenBankで受託番号NR_041800.1 GI:343201103に見出されるLactobacillus crispatus株ATCC 33820 16SリボソームRNA遺伝子、部分配列)の参照配列(配列番号1)を示す。図1Bは、Lactobacillus jensenii 16SリボソームRNA遺伝子、部分配列、GenBank受託番号NR_025087.1 GI:219857499の参照配列(配列番号88)を示す。 図1Aは、Lactobacillus 16SリボソームRNA遺伝子(GenBankで受託番号NR_041800.1 GI:343201103に見出されるLactobacillus crispatus株ATCC 33820 16SリボソームRNA遺伝子、部分配列)の参照配列(配列番号1)を示す。図1Bは、Lactobacillus jensenii 16SリボソームRNA遺伝子、部分配列、GenBank受託番号NR_025087.1 GI:219857499の参照配列(配列番号88)を示す。
図2は、Lactobacillus 16SリボソームRNA遺伝子(GenBankで受託番号HE573914.1 GI:341599788に見出されるLactobacillus gasseri部分的16S rRNA遺伝子、標準菌株CIP 102991T株)の参照配列(配列番号2)を示す。
図3は、Gardnerella vaginalis 16SリボソームRNA遺伝子(GenBankで受託番号NR_044694.2 GI:545589071に見出されるGardnerella vaginalis株594 16SリボソームRNA遺伝子、完全配列)の参照配列(配列番号3)を示す。
図4は、Eggerthella 16SリボソームRNA遺伝子(GenBankで受託番号AY738656.1 GI:52222145に見出される無培養Eggerthella sp.クローン123−f2 68 16SリボソームRNA遺伝子、部分配列)の参照配列(配列番号4)を示す。
本発明は、一般に、試料中の選ばれた細菌生物の存在または非存在を決定するための方法および組成物を対象とする。一部の実施形態では、本発明は、被験体における細菌性膣炎(BV)を診断するための方法および組成物を提供する。他の、非相互排他的実施形態では、本発明は、試料中のLactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.のいずれか1つまたは複数の検出のための方法であって、Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.の1つまたは複数からの16S rRNA標的核酸(target nucleic)の、増幅に基づく検出を行うステップを含む方法を提供する。本発明は、試料中のLactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.のいずれか1つまたは複数を検出するためのオリゴマーの組合せを含む、組成物(反応混合物を含む)およびキットをさらに提供する。オリゴマーの組合せは、一般に、試料中のLactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.の1つまたは複数を検出するための少なくとも2つの増幅オリゴマーを含み、例えば捕捉プローブおよび/または検出プローブなどの、Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/またはEggerthella sp.の増幅に基づく検出を行うための本明細書に記載される1つまたは複数の追加のオリゴマーをさらに含み得る。
BVを診断するための方法は、一般に、BVを有することが疑われる被験体からの試料中のLactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.の1つまたは複数の存在または非存在を検出するステップを含む。詳細には、試料中のLactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.のそれぞれについての特異的検出、または試料中のLactobacillus sp.およびG.vaginalisのそれぞれについての特異的検出のためにアッセイが行われる。検出アッセイからの結果に基づいて、陽性または陰性のいずれかのステータスが、Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.のそれぞれ、またはLactobacillus sp.およびG.vaginalisのそれぞれに割り当てられ、割り当てられたLactobacillus sp.ステータス、G.vaginalisステータスおよびEggerthella sp.ステータスの組合せに基づいて、または割り当てられたLactobacillus sp.ステータスおよびG.vaginalisステータスの組合せに基づいて、被験体におけるBVの存在または不在が決定される。
詳細には、陽性または陰性のいずれかのステータスがLactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.のそれぞれに割り当てられた場合、G.vaginalisおよびEggerthella sp.両方について陰性のステータスは、被験体におけるBVの非存在を示し、G.vaginalisおよびEggerthella sp.両方について陽性のステータスは、被験体におけるBVの存在を示す。さらに、Lactobacillus sp.のステータスが陽性である場合には、G.vaginalisおよびEggerthellaの少なくとも一方について陰性のステータスは、被験体におけるBVの非存在を示し、Lactobacillus sp.のステータスが陰性である場合には、G.vaginalisおよびEggerthellaの少なくとも一方について陽性のステータスは、被験体におけるBVの存在を示す。下の表1は、Lactobacillus、G.vaginalisおよびEggerthellaについての複合ステータスに基づくBV指標マトリックスを示す。
あるいは、陽性または陰性のいずれかのステータスが、Lactobacillus sp.およびG.vaginalisのそれぞれに割り当てられた場合、G.vaginalisについて陰性のステータスは、被験体におけるBVの非存在を示す。さらに、G.vaginalisのステータスが陽性である場合には、Lactobacillus sp.について陽性のステータスは、被験体におけるBVの非存在を示し、Lactobacillus sp.について陰性のステータスは、被験体におけるBVの存在を示す。しかし、試料中のG.vaginalisの高コピー数(例えば、≧1.4×1010コピー/mL)の存在は、被験体におけるBVの陽性指標であることに留意されたい。下の表2は、LactobacillusおよびG.vaginalisについての複合ステータスに基づくBV指標マトリックスを示す。
Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/またはEggerthella sp.をいずれの適切な方法を使用して検出してもよいが、核酸に基づく検出アッセイを使用してこれらの細菌を検出するのが現在は好ましい。本発明による核酸に基づく検出アッセイは、試料中に存在することが疑われる他の核酸と最小の交差反応性でLactobacillus sp.、G.vaginalis、またはEggerthella sp.の標的核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを一般に利用する。したがって、Lactobacillus sp.、G.vaginalis、またはEggerthella sp.の選ばれた種についての核酸に基づく検出のためのオリゴヌクレオチドは、例えば、Trichomonas sp.;Trichomonas vaginalis;Candida sp.;Clostridiales目からの細菌;Clostridium様sp.;Atopobium sp.;Atopobium vaginae;腸内細菌;Peptostreptococcus micros;Aerococcus christensenii;Leptotrichia amnionii;Peptoniphilus sp.;Dialister sp.;Mycoplasma hominis;Sneathia sanguinegens;Anaerococcus tetradius;Mobiluncus sp.;Mobiluncus hominis;Megasphaera sp.;Prevotella sp.;Leptotrichia sanguinegens;およびFinegoldia magnaを含む、他の細菌属内の種と最小の交差反応性を有する。一態様では、本発明による核酸に基づく検出アッセイは、これらの生物の1つもしくは複数(one of more)、またはBVに関連する他の細菌属、を検出するための構成成分をさらに含む。
特定の実施形態では、核酸に基づく検出アッセイは、Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/もしくはEggerthella sp.の16S rRNA、または16S rRNAをコードする遺伝子を標的とする。16S rRNAまたはコードする遺伝子の特に適切な標的領域は、(i)配列番号1の約91位のヌクレオチドから約265位のヌクレオチドの領域に対応するLactobacillus sp.16S rRNA領域、(ii)配列番号2の約90位のヌクレオチドから約263位のヌクレオチドの領域に対応するLactobacillus sp.16S rRNA領域、(iii)配列番号3の約964位のヌクレオチドから約1036位のヌクレオチドの領域に対応するG.vaginalis 16S rRNA領域、および(iv)配列番号4の約165位のヌクレオチドから約259位のヌクレオチドの領域に対応するEggerthella sp.16S rRNA領域である。上記のとおりの16S rRNA領域を標的とする核酸に基づく検出アッセイの具体的なバリエーションでは、(a)Lactobacillus特異的オリゴヌクレオチドは、配列番号6に示される配列に実質的に対応する配列、配列番号7の残基28〜45に示される配列に実質的に対応する配列、配列番号8の残基28〜45に示される配列に実質的に対応する配列、配列番号9に示される配列に実質的に対応する配列、もしくは配列番号10の残基6〜21に示される配列に実質的に対応する配列を含む、標的にハイブリダイズする領域を含み、(b)G.vaginalis特異的オリゴヌクレオチドは、配列番号12に示される配列に実質的に対応する配列、配列番号13の残基28〜45に示される配列に実質的に対応する配列、もしくは配列番号14の残基1〜19に示される配列に実質的に対応する配列を含む、標的にハイブリダイズする領域を含み、および/または(c)Eggerthella特異的オリゴヌクレオチドは、配列番号16に示される配列に実質的に対応する配列、配列番号17の残基28〜51に示される配列に実質的に対応する配列、もしくは配列番号18に示される配列に実質的に対応する配列を含む、標的にハイブリダイズする領域を含む。一部のそのような実施形態では、(a)Lactobacillus特異的オリゴヌクレオチドは、配列番号6に示される配列、配列番号7の残基28〜45に示される配列、配列番号8の残基28〜45に示される配列、もしくは配列番号9に示される配列を含む、もしくはそれからなる、標的にハイブリダイズする領域を含み、(b)G.vaginalis特異的オリゴヌクレオチドは、配列番号12に示される配列、配列番号13の残基28〜45に示される配列、もしくは配列番号14の残基1〜19に示される配列を含む、もしくはそれからなる、標的にハイブリダイズする領域を含み、および/または(c)Eggerthella特異的オリゴヌクレオチドは、配列番号16に示される配列、配列番号17の残基28〜51に示される配列、もしくは配列番号18に示される配列を含む、もしくはそれからなる、標的にハイブリダイズする領域を含む。ある特定の実施形態では、核酸に基づく検出アッセイは、上記で特定したものから選択されるオリゴヌクレオチドであり得る、少なくとも2つもしくは3つのLactobacillus特異的オリゴヌクレオチド、少なくとも2つもしくは3つのG.vaginalis特異的オリゴヌクレオチド、および/または少なくとも2つもしくは3つのEggerthella特異的オリゴヌクレオチドを利用する。
核酸に基づく検出アッセイの使用を含む方法の一部の実施形態では、増幅に基づくアッセイが、Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/またはEggerthella sp.を検出するために使用される。そのようなバリエーションは、in vitro核酸増幅反応を利用して細菌標的核酸内の標的配列を増幅させるステップ、および増幅産物を、例えば、増幅産物と試料中の細菌標的の存在を示すシグナルを提供する核酸検出プローブとを特異的にハイブリダイズさせることによって、検出するステップを、一般に含む。増幅ステップは、標的核酸が試料中に存在する場合に、標的核酸中の標的配列(例えば、16SrRNA宙の標的配列)に特異的な2つまたはそれより多くの増幅オリゴマーと試料とを接触させて増幅産物を生成するステップを含む。増幅は、例えば、鋳型鎖を使用して、増幅オリゴマー(プライマー)からの配列を伸長するための少なくとも1つの核酸ポリメラーゼととを用いることなどによって、標的配列またはその相補体の追加コピーを合成する。増幅産物を検出するための一実施形態は、選択された増幅オリゴマーによって増幅された配列、例えば、選択された増幅オリゴマー対によって挟まれた標的配列に含まれる配列に特異的な少なくとも1つのプローブと増幅産物とを接触させるステップを含むハイブリダイゼーションステップを使用する。適切な増幅法としては、例えば、レプリカーゼ媒介性増幅、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)および転写媒介性増幅または転写関連増幅(TMA)が挙げられる。このような増幅法は、当該技術分野において周知であり(例えば、定義セクションの増幅方法の議論、前掲を参照されたい)、本発明の方法に従って容易に使用される。
例えば、TMA増幅を使用するいくつかの増幅法は、以下のステップを含む。簡単には、増幅される配列を含有する標的核酸は、一本鎖核酸(例えば、ssRNAまたはssDNA)として提供される。当業者は、二本鎖核酸(例えば、dsDNA)の従来の融解が一本鎖標的核酸を提供するために使用され得ることを理解する。プロモータープライマーは、その標的配列で標的核酸に特異的に結合し、逆転写酵素(RT)は、鋳型として標的鎖を用いて、プロモータープライマーの3’末端を伸長し、標的配列鎖のcDNAコピーを作製し、RNA:DNA二重鎖をもたらす。RNアーゼはRNA:DNA二重鎖のRNA鎖を消化し、第2のプライマーは、プロモータープライマー末端から下流のcDNA鎖上に位置するその標的配列に特異的に結合する。RTは、第1のcDNA鋳型を用いて、第2のプライマーの3’末端を伸長することによって新たなDNA鎖を合成して、機能的プロモーター配列を含有するdsDNAを作製する。次に、プロモーター配列に特異的なRNAポリメラーゼは転写を開始して、反応における最初の標的鎖の約100〜1000個の増幅されたコピー(「アンプリコン」)であるRNA転写物を生成する。第2のプライマーがアンプリコンのそれぞれにおいてその標的配列に特異的に結合し、RTがアンプリコンRNA鋳型からDNAコピーを作製してRNA:DNA二重鎖を生成する場合に、増幅は継続する。反応混合物中のRNアーゼは、RNA:DNA二重鎖からアンプリコンRNAを消化し、プロモータープライマーは、新たに合成されたDNAにおいてその相補的配列に特異的に結合する。RTはプロモータープライマーの3’末端を伸長して、RNAポリメラーゼが標的鎖に相補的である付加的なアンプリコンに結合して転写するための機能的プロモーターを含有するdsDNAを作製する。より多くのアンプリコンのコピーを作製する自己触媒サイクルは、反応の過程で繰り返し、試料中に存在する標的核酸の約10億倍の増幅をもたらす。増幅産物は、増幅産物に含有される標的配列に特異的に結合するプローブを用いて、増幅中にリアルタイムで、または増幅反応の終了時に検出することができる。結合したプローブから生じるシグナルの検出は、試料中の標的核酸の存在を示す。
一部の実施形態では、方法は、「リバース」TMA反応を利用する。このようなバリエーションでは、最初のまたは「フォワード」の増幅オリゴマーは、標的領域の3’末端付近で標的核酸にハイブリダイズするプライミングオリゴヌクレオチドである。逆転写酵素(RT)は、鋳型として標的核酸を用いて、プライマーの3’末端を伸長することによってcDNA鎖を合成する。第2のまたは「リバース」の増幅オリゴマーは、合成されたcDNA鎖内に含有される標的配列にハイブリダイズするように構成されている、標的にハイブリダイズする配列を有するプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。第2の増幅オリゴマーがプロモータープライマーである場合、RTは、鋳型としてcDNA鎖を用いてプロモータープライマーの3’末端を伸長し、標的配列鎖の第2のcDNAコピーを作製し、それにより、機能的プロモーター配列を含有するdsDNAを作製する。次に、増幅は、RNAポリメラーゼを利用したプロモーター配列からの転写の開始について、上述したように本質的に継続する。あるいは、第2の増幅オリゴマーがプロモータープロバイダーである場合、標的領域の5’末端付近にある標的配列にハイブリダイズする終結オリゴヌクレオチドは、典型的には、終結オリゴヌクレオチドの3’末端でプライミングオリゴマーの伸長を終結させるために利用され、それにより、プライミングオリゴマーからの伸長によって合成された最初のcDNA鎖について定義された3’末端を提供する。次に、プロモータープロバイダーの標的にハイブリダイズする配列は、最初のcDNA鎖の定義された3’末端にハイブリダイズし、cDNA鎖の3’末端は、プロモータープロバイダーのプロモーター配列に相補的な配列を付加するように伸長され、その結果、二本鎖プロモーター配列を形成する。その後、最初のcDNA鎖は鋳型として使用し、二本鎖プロモーターを認識し、そこから転写を開始するRNAポリメラーゼを用いて、プロモーター部分を含まない最初のcDNA鎖に相補的な複数のRNA転写物を転写する。次いで、これらのRNA転写物のそれぞれは、第1のプライミング増幅オリゴマーからさらなる増幅のための鋳型として機能するために利用可能である。
増幅に基づく検出アッセイを含むある特定の実施形態では、少なくとも2つの増幅オリゴマーの組合せが、Lactobacillus sp.16S rRNAまたはLactobacillus sp.16S rRNAをコードする遺伝子の検出に利用される。オリゴマーの組合せは、配列番号1の約91位のヌクレオチドから約265位のヌクレオチドの領域に対応するLactobacillus sp.核酸標的領域、および/または配列番号2の約90位のヌクレオチドから約263位のヌクレオチドの領域に対応するLactobacillus sp.核酸標的領域、を増幅させるための第1および第2の増幅オリゴマーを含み得る。例えば、一部の実施形態では、第1の増幅オリゴマーは、配列番号7の残基28〜45もしくは配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含み、および/または第2の増幅オリゴマーは、配列番号6のヌクレオチド配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む。より特定のバリエーションでは、第1の増幅オリゴマーは、配列番号7の残基28〜45もしくは配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列を含む、もしくはそれからなる、標的にハイブリダイズする配列を含み、および/または第2の増幅オリゴマーは、配列番号6のヌクレオチド配列を含む、もしくはそれからなる、標的にハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、第1の増幅オリゴマーが、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む場合、増幅検出アッセイは、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む、第3の増幅オリゴマーをさらに利用し、一部のそのようなバリエーションでは、第3の増幅オリゴマーは、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる、標的にハイブリダイズする配列を含む。上記のとおりの一部の実施形態では、少なくとも1つの増幅は、それぞれの、標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列(例えば、T7プロモーター配列、例えば、配列番号7の残基1〜27のヌクレオチド配列など)をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダー(promoter provide)であり;一部のそのような実施形態では、第1の増幅オリゴマーは、プロモータープライマーもしくはプロモータープロバイダーであり、および/または、存在する場合、第3の増幅オリゴマーは、プロモータープライマーもしくはプロモータープロバイダーである。より具体的なバリエーションでは、第1の増幅オリゴマーは、配列番号7のヌクレオチド配列からなり、第2の増幅オリゴマーは、配列番号6のヌクレオチド配列からなり、および/または、存在する場合、第3の増幅オリゴマーは、配列番号8のヌクレオチド配列からなる。
増幅に基づく検出アッセイを含むある特定の実施形態では、少なくとも2つの増幅オリゴマーの組合せが、G.vaginalis 16S rRNAまたはG.vaginalis 16S rRNAをコードする遺伝子の検出に利用される。オリゴマーの組合せは、配列番号3の約964位のヌクレオチドから約1036位のヌクレオチドの領域に対応するG.vaginalis核酸標的領域を増幅させるための第1および第2の増幅オリゴマーを含み得る。例えば、一部の実施形態では、第1の増幅オリゴマーは、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含み、および/または第2の増幅オリゴマーは、配列番号12のヌクレオチド配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む。より特定のバリエーションでは、第1の増幅オリゴマーは、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列を含む、もしくはそれからなる、標的にハイブリダイズする配列を含み、および/または第2の増幅オリゴマーは、配列番号12のヌクレオチド配列を含む、もしくはそれからなる、標的にハイブリダイズする配列を含む。上記のとおりの一部の実施形態では、少なくとも1つの増幅は、それぞれの、標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列(例えば、T7プロモーター配列、例えば、配列番号7の残基1〜27のヌクレオチド配列など)をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダー(promoter provide)であり;一部のそのような実施形態では、第1の増幅オリゴマーは、プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。より具体的なバリエーションでは、第1の増幅オリゴマーは、配列番号13のヌクレオチド配列からなり、および/または第2の増幅オリゴマーは、配列番号12のヌクレオチド配列からなる。
増幅に基づく検出アッセイを含むある特定の実施形態では、少なくとも2つの増幅オリゴマーの組合せが、Eggerthella sp.16S rRNAまたはEggerthella sp.16S rRNAをコードする遺伝子の検出に利用される。オリゴマーの組合せは、配列番号4の約165位のヌクレオチドから約259位のヌクレオチドの領域に対応するEggerthella sp.核酸標的領域を増幅させるための第1および第2の増幅オリゴマーを含み得る。例えば、一部の実施形態では、第1の増幅オリゴマーは、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含み、および/または第2の増幅オリゴマーは、配列番号16のヌクレオチド配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む。より特定のバリエーションでは、第1の増幅オリゴマーは、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列を含む、もしくはそれからなる、標的にハイブリダイズする配列を含み、および/または第2の増幅オリゴマーは、配列番号16のヌクレオチド配列を含む、もしくはそれからなる、標的にハイブリダイズする配列を含む。上記のとおりの一部の実施形態では、少なくとも1つの増幅は、それぞれの、標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列(例えば、T7プロモーター配列、例えば、配列番号7の残基1〜27のヌクレオチド配列など)をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダー(promoter provide)であり;一部のそのような実施形態では、第1の増幅オリゴマーは、プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。より具体的なバリエーションでは、第1の増幅オリゴマーは、配列番号17のヌクレオチド配列からなり、および/または第2の増幅オリゴマーは、配列番号16のヌクレオチド配列からなる。
増幅産物の検出は、増幅された標的配列に特に関連するシグナルを検出するための様々な方法によって達成され得る。核酸は、検出可能な電気的変化などの物理的な変化をもたらす表面に会合し得る。増幅された核酸は、マトリックス中でもしくはその上で該核酸を濃縮し、該核酸もしくはそれらと会合した色素(例えば、臭化エチジウムもしくはサイバーグリーンなどのインターカレーティング剤)を検出することによって、または溶液相にある核酸と会合した色素の増加を検出することによって検出され得る。検出の他の方法は、増幅産物の配列に特異的にハイブリダイズするように構成されている核酸検出プローブを使用して、プローブ:産物複合体の存在を検出することができるか、または増幅産物と関連した検出可能なシグナルを増幅し得るプローブの複合体を用いることによる(例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,424,413号;同第5,451,503号;および同第5,849,481号)。増幅産物と特異的に会合する直接的または間接的に標識されたプローブは、試料中の標的核酸の存在を示す検出可能なシグナルを提供する。具体的には、増幅産物は、HEVゲノムRNAの配列中の標的配列またはHEVゲノムRNAの配列に相補的な標的配列を含み、プローブは、試験される試料中にHEV核酸の存在を示す増幅産物に含有される配列に直接的または間接的に結合する。例えば、標的核酸が、Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/またはEggerthella sp.の16S rRNAである場合、増幅産物は、16S rRNA中の標的配列を含有するか、または16S rRNA中の配列に相補的な標的配列を含有し、プローブは、増幅産物に含有される配列に直接的または間接的に結合して、試験される試料中のLactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/またはEggerthella sp.の16S rRNAの存在を示す。
相補的な増幅された配列にハイブリダイズする検出プローブは、DNAもしくはRNAオリゴマー、またはDNAヌクレオチドとRNAヌクレオチドとの組合せを含有するオリゴマー、または改変された主鎖を用いて合成されたオリゴマー、例えば、1つまたは複数の2’−メトキシ置換されたリボヌクレオチドを含むオリゴマーであり得る。増幅された配列を検出するために使用されるプローブは、標識されていなくてもよく、間接的に(例えば、プローブ上の部分に別の結合パートナーを結合させることによって)検出され得、または様々な検出可能な標識で標識され得る。BVを診断するための一部の実施形態において、例えば、転写媒介性増幅(TMA)を用いたある特定の実施形態では、検出プローブは、線状化学発光標識されたプローブ、例えば、線状アクリジニウムエステル(AE)標識されたプローブなどである。
検出するステップはまた、増幅された配列、例えば、その核酸塩基配列の全てまたは一部などに関する追加情報を提供することができる。検出は、増幅反応が終了した後に行ってもよく、または標的領域を増幅させるのと同時に、例えばリアルタイムで行ってもよい。一実施形態では、検出するステップは、ホモジニアス検出、例えば、混合物からのハイブリダイズしていないプローブの除去を伴わずに、ハイブリダイズしたプローブの検出を可能にする(例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,639,604号および同第5,283,174号を参照されたい)。
増幅産物を増幅ステップ終了間近または終了時に検出する実施形態では、線状検出プローブを使用して、増幅産物に対するプローブのハイブリダイゼーションを示すシグナルを得ることができる。このような検出の一例は、標的核酸にハイブリダイズする、発光的に標識されたプローブを使用する。次に、発光標識は、ハイブリダイズしていないプローブから加水分解される。検出は、ルミノメーターを使用して化学発光によって行われる。(例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第WO89/002476号を参照されたい)。リアルタイム検出を使用する他の実施形態では、検出プローブは、ヘアピンプローブ、例えば、分子ビーコン、分子トーチ、またはプローブが増幅産物に結合するときに検出されるレポーター部分で標識されるハイブリダイゼーションスイッチプローブなどであってもよい。このようなプローブは、標的にハイブリダイズする配列および標的にハイブリダイズしない配列を含むことができる。このようなプローブの多様な形態は先に記載されている(例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,118,801号;同第5,312,728号;同第5,925,517号;同第6,150,097号;同第6,849,412号;同第6,835,542号;同第6,534,274号;および同第6,361,945号;ならびに米国特許出願公開第20060068417A1号および同第20060194240A1号を参照されたい)。
Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/もしくはEggerthella sp.16S rRNAまたはLactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/もしくはEggerthella sp.16S rRNAをコードする遺伝子を標的とする増幅に基づく検出アッセイを含むある特定の実施形態では、方法は、Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/またはEggerthella sp.16S rRNA増幅産物に特異的にハイブリダイズする1つまたは複数の検出プローブを利用する。特定のバリエーションでは、Lactobacillus特異的検出プローブは、配列番号1の約91位のヌクレオチドから約265位のヌクレオチドの領域に対応する核酸標的領域に、および/もしくは配列番号2の約90位のヌクレオチドから約263位のヌクレオチドの領域に対応するLactobacillus sp.核酸標的領域に特異的にハイブリダイズし、G.vaginalis特異的検出プローブは、配列番号3の約964位のヌクレオチドから約1036位のヌクレオチドの領域に対応する核酸標的領域に特異的にハイブリダイズし、ならびに/またはEggerthella特異的プローブは、配列番号4の約165位のヌクレオチドから約259位のヌクレオチドの領域に対応する核酸標的領域に特異的にハイブリダイズする。例えば、一部のバリエーションでは、Lactobacillus sp.増幅産物の検出のためのプローブは、配列番号9の配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列、または配列番号10の残基6〜21の配列に実質的に対応する配列を含む(例えば、配列番号9の標的にハイブリダイズする配列または配列番号10の残基6〜21を含むプローブ)。一部のバリエーションでは、G.vaginalis増幅産物の検出のためのプローブは、配列番号14の残基1〜19の配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む(例えば、配列番号14の残基1〜19の標的にハイブリダイズする配列を含むプローブ)。一部のバリエーションでは、Eggerthella sp.増幅産物の検出のためのプローブは、配列番号18の配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む(例えば、配列番号18の標的にハイブリダイズする配列を含むプローブ)。ある特定の実施形態では、Lactobacillus sp.増幅産物の検出のためのプローブは、配列番号9もしくは配列番号10の配列を含み、もしくはそれからなり、G.vaginalis増幅産物の検出のためのプローブは、配列番号14の配列を含み、もしくはそれからなり、および/またはEggerthella sp.増幅産物の検出のためのプローブは、配列番号18の配列を含む、もしくはそれからなる。
核酸に基づく検出アッセイの使用を含む方法の一部の実施形態では、増幅に基づかないアッセイが、Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/またはEggerthella sp.を検出するために使用される。一部のそのような実施形態では、増幅に基づかないアッセイは、標的核酸に対する特異的検出プローブのハイブリダイゼーションを含むハイブリダイゼーションアッセイである。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイを行うための方法は、当該技術分野において十分に開発されている。ハイブリダイゼーションアッセイ手順および条件は用途によって異なり、例えば、Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual(3版、Cold Spring Harbor、N.Y.、2002年)、ならびにBergerおよびKimmel、Methods in Enzymology、152巻、Guide to Molecular Cloning Techniques(Academic Press, Inc.、San Diego、Calif.、1987年)において言及されたものを含む、公知の一般的結合方法に従って選択される。一般に、プローブおよび試料は、特異的核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合され、そしてその後、プローブのそのそれぞれの標的に対する特異的ハイブリダイゼーションが検出される。核酸ハイブリダイゼーションは、様々なアッセイ形式に適応できる。1つの適切な形式は、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに特に適応できるサンドイッチアッセイ形式である。サンドイッチ型アッセイの主構成成分は、固体支持体であり、この固体支持体に、標識されておらず、かつ、DNA配列の一部分に相補的である、固定化核酸プローブが吸着しているまたは共有結合している。標的核酸を固定化プローブにハイブリダイズさせ、そして第2の、標識された検出プローブ−固定化された、標識されていない核酸プローブがハイブリダイズされるのと同じDNA鎖の第2の、異なる領域に相補的であるプローブ−を[標的核酸]:[固定化プローブ]二重鎖にハイブリダイズさせて、標的核酸を検出する。別の例示的な形式は、シグナル伝達因子として適切な電極表面に固定化された標識されていない検出プローブにハイブリダイズされた標的核酸の電気化学的検出を利用する。例えば、Drummondら、Nat. Biotechnol.21巻:1192頁、2003年;Gooding、Electroanalysis 14巻:1149頁、2002年;Wang、Anal. Chim. Acta 469巻:63頁、2002年;Cagninら、Sensors 9巻:3122頁、2009年;KatzおよびWillner、Electroanalysis 15巻:913頁、2003年;DanielsおよびPourmand、Electroanalysis 19巻:1239頁、2007年を参照されたい。
ハイブリダイゼーションアッセイを含むある特定の実施形態では、検出プローブは、Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/もしくはEggerthella sp.16S rRNA、またはLactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/もしくはEggerthella sp.16S rRNAをコードする遺伝子の検出に利用される。そのような実施形態では、Lactobacillus sp.16S rRNAもしくはLactobacillus sp.16S rRNAをコードする遺伝子を検出するためのプローブは、配列番号1の約91位のヌクレオチドから約265位のヌクレオチドの領域に対応する核酸標的領域に、および/もしくは配列番号2の約90位のヌクレオチドから約263位のヌクレオチドの領域に対応するLactobacillus sp.核酸標的領域に特異的にハイブリダイズし、G.vaginalis 16S rRNAもしくはG.vaginalis 16S rRNAをコードする遺伝子を検出するためのプローブは、配列番号3の約964位のヌクレオチドから約1036位のヌクレオチドの領域に対応する核酸標的領域に特異的にハイブリダイズし、ならびに/またはEggerthella sp.16S rRNAもしくはEggerthella sp.16S rRNAをコードする遺伝子を検出するためのプローブは、配列番号4の約165位のヌクレオチドから約259位のヌクレオチドの領域に対応する核酸標的領域に特異的にハイブリダイズする。例えば、一部のバリエーションでは、Lactobacillus sp.16S rRNAまたはLactobacillus sp.16S rRNAをコードする遺伝子を検出するためのプローブは、配列番号9の配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列、または配列番号10の残基6〜21の配列に実質的に対応する配列を含む(例えば、配列番号9の標的にハイブリダイズする配列または配列番号10の残基6〜21を含むプローブ)。一部のバリエーションでは、G.vaginalis 16S rRNAまたはG.vaginalis 16S rRNAをコードする遺伝子を検出するためのプローブは、配列番号14の残基1〜19の配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む(例えば、配列番号14の残基1〜19の標的にハイブリダイズする配列を含むプローブ)。一部のバリエーションでは、Eggerthella sp.16S rRNAまたはEggerthella sp.16S rRNAをコードする遺伝子を検出するためのプローブは、配列番号18の配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む(例えば、配列番号18の標的にハイブリダイズする配列を含むプローブ)。ある特定の実施形態では、Lactobacillus sp.16S rRNAまたはLactobacillus sp.16S rRNAをコードする遺伝子を検出するためのプローブは、配列番号9もしくは配列番号10の配列を含み、もしくはそれからなり、G.vaginalis 16S rRNAもしくはG.vaginalis sp.16S rRNAをコードする遺伝子を検出するためのプローブは、配列番号14の配列を含み、もしくはそれからなり、および/またはEggerthella sp.16S rRNAもしくはEggerthella sp.16S rRNAをコードする遺伝子を検出するためのプローブは、配列番号18の配列を含む、もしくはそれからなる。
一部の実施形態では、Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/またはEggerthella sp.の検出のための増幅に基づかないアッセイは、標的にハイブリダイズしないフラップ領域を含有するプローブオリゴヌクレオチドがフラップエンドヌクレアーゼによってオーバーラップ依存的方法で切断されて切断産物を放出し、その結果、その切断産物が検出される、切断に基づくアッセイである。例示的な、切断に基づくアッセイ試薬は、例えば、Lyamichevら、(Nat. Biotechnol.17巻:292〜296頁、1999年)、Ryanら(Mol. Diagn.4巻:135〜144頁、1999年)、およびAllawiら(J. Clin. Microbiol.44巻:3443〜3447頁、2006年)に記載されている。フラップエンドヌクレアーゼ反応の適切な条件は公知であり、または当該技術分野において公知の方法(例えば、Kaiserら、J. Biol. Chem.274巻:2138〜721394頁、1999年を参照されたい)を使用して容易に決定することができる。方法において使用され得る例示的なフラップエンドヌクレアーゼには、Thermus aquaticus DNAポリメラーゼI、Thermus thermophilus DNAポリメラーゼI、哺乳動物FEN−1、Archaeoglobus fulgidus FEN−1、Methanococcus jannaschii FEN−1、Pyrococcus furiosus FEN−1、Methanobacterium thermoautotrophicum FEN−1、Thermus thermophilus FEN−1、CLEAVASE(登録商標)(Hologic,Inc.、Madison、WI)、S.cerevisiae RTH1、S.cerevisiae RAD27、Schizosaccharomyces pombe rad2、バクテリオファージT5 5’−3’エキソヌクレアーゼ、Pyrococcus horikoshii FEN−1、ヒトエンドヌクレアーゼ1、仔牛胸腺5’−3’エキソヌクレアーゼが含まれ、真正細菌、真核生物および古細菌におけるそれらのホモログ、例えば、構造特異的酵素のクラスIIファミリーのメンバー、ならびにそれらの酵素的に活性な変異体またはバリアントを含む。フラップエンドヌクレアーゼの説明は、例えば、Lyamichevら、Science 260巻:778〜783頁、1993年;Eisら、Nat. Biotechnol.19巻:673〜676頁、2001年;Shenら、Trends in Bio. Sci.23巻:171〜173頁、1998年;Kaiserら、J. Biol. Chem.274巻:21387〜21394頁、1999年;Maら、J. Biol. Chem.275巻:24693〜24700頁、2000年;Allawiら、J. Mol. Biol.328巻:537〜554頁、2003年;Sharmaら、J. Biol. Chem.278巻:23487〜23496頁、2003年;およびFengら、Nat. Struct. Mol. Biol.11巻:450〜456頁、2004年において見出され得る。
ある特定のバリエーションでは、切断に基づくアッセイは、Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/またはEggerthella sp.のRNA標的核酸を検出し、切断に基づくアッセイは、RNA:DNA線状二重鎖構造を切断することができるフラップエンドヌクレアーゼを利用する。一部の代替実施形態では、切断に基づくアッセイは、Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/またはEggerthella sp.のDNA標的核酸を検出し、前記切断に基づくアッセイは、DNA:DNA線状二重鎖構造を切断することができるフラップエンドヌクレアーゼを利用する。RNA:DNA二重鎖を切断することができる例示的なフラップエンドヌクレアーゼには、Thermus属のポリメラーゼ欠損5’ヌクレアーゼ、ならびにある特定のCLEAVASE(登録商標)酵素(Hologic,Inc.、Madison、WI)、例えば、CLEAVASE(登録商標)BN(TaqポリメラーゼのBstX−NotI欠失、米国特許第5,614,402号を参照されたい)、CLEAVASE(登録商標)II(完全長Taqポリメラーゼの「AG」変異体、米国特許第5,614,402号を参照されたい)、CLEAVASE(登録商標)VII(完全長Thermus thermophilusポリメラーゼの合成不全変異)、CLEAVASE(登録商標)IX(Tth DNAポリメラーゼのポリメラーゼ欠損変異体)、およびCLEAVASE(登録商標)XII(taq DNAポリメラーゼおよびTth DNAポリメラーゼの断片から構築されたポリメラーゼ欠損キメラポリメラーゼ)などが含まれる。DNA:DNA二重鎖を切断することができる例示的なフラップエンドヌクレアーゼには、上記で示されるフラップエンドヌクレアーゼ、ならびにCLEAVASE(登録商標)2.0(Archaeoglobus fulgidus FEN−1)、CLEAVASE(登録商標)2.1(C末端に6つのヒスチジンを有するArchaeoglobus fulgidus FEN−1)、CLEAVASE(登録商標)3.0(Archaeoglobus veneficus FEN−1)、およびCLEAVASE(登録商標)3.1(C末端に6つのヒスチジンを有するArchaeoglobus veneficus FEN−1)が含まれる。
一部の実施形態では、切断に基づくアッセイは、Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/またはEggerthella sp.のRNA標的核酸を検出し、アッセイは、RNA標的領域のDNA相補体を合成するためのステップを含み、そのときcDNA鎖を、オーバーラップしている第1および第2のプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせて、フラップエンドヌクレアーゼによる切断のための線状二重鎖切断構造を形成する。RNA依存性DNAポリメラーゼ(逆転写酵素)を使用して、RNA鋳型からcDNAを合成するための反応条件は、当該技術分野において周知である。
核酸に基づく検出アッセイを利用するある特定の実施形態では、方法は、Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/またはEggerthella sp.標的核酸を試料中の他の構成成分から精製するステップをさらに含む。このような精製は、他の試料構成成分から試料中に含有される生物を分離および/または濃縮する方法を含み得る(may include may include)。特定の実施形態では、標的核酸を精製することは、他の試料構成成分から標的核酸を特異的にまたは非特異的に分離するために標的核酸を捕捉することを含む。非特異的な標的捕捉法は、実質的に水性の混合物からの核酸の選択的沈殿、支持体へ核酸を付着させ、支持体を洗浄して他の試料構成成分を取り除くこと、またはLactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/もしくはEggerthella sp.核酸と他の試料構成成分を含有する混合物から核酸を物理的に分離する他の手段を伴い得る。
一部の実施形態では、Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/またはEggerthella sp.の標的核酸(例えば、16S rRNA標的核酸、または16S rRNAをコードする遺伝子)は、標的核酸を捕捉プローブオリゴマーにハイブリダイズさせることによって他の試料構成成分から分離される。捕捉プローブオリゴマーは、他の試料構成成分から分離される[標的核酸]:[捕捉プローブ]複合体が形成されるように、標的核酸に特異的にまたは非特異的にハイブリサイズするように構成されている、標的にハイブリダイズする配列を含む。標的核酸の非特異的捕捉に適した標的にハイブリダイズする配列を含む捕捉プローブは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際PCT公開第WO2008/016988号に記載されている。Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/またはEggerthella sp.16S rRNA標的核酸に特異的にハイブリダイズするように構成されている、標的にハイブリダイズする配列(複数可)を含む、一部の具体的なバリエーションでは、Lactobacillus特異的捕捉プローブは、配列番号5の残基1〜12のヌクレオチド配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列(例えば、配列番号5の残基1〜12の標的にハイブリダイズする配列を含む捕捉プローブ)を含み;G.vaginalis特異的捕捉プローブは、配列番号11の残基1〜17のヌクレオチド配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列(例えば、配列番号11の残基1〜17の標的にハイブリダイズする配列を含む捕捉プローブ)を含み;および/またはEggerthella特異的捕捉プローブは、配列番号15の残基1〜21のヌクレオチド配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む(例えば、配列番号15の残基1〜21の標的にハイブリダイズする配列を含む捕捉プローブ)。好ましいバリエーションでは、捕捉プローブは、[標的核酸]:[捕捉プローブ]複合体を固定化プローブに結合させて、[標的核酸]:[捕捉プローブ]:[固定化プローブ]複合体を形成し、それを試料から分離し、任意選択で洗浄して、標的でない試料構成成分を除去する(例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,110,678号、同第6,280,952号および同第6,534,273号を参照されたい)。このようなバリエーションでは、捕捉プローブオリゴマーは、捕捉プローブを結合させる、付着させる、配列または部分をさらに含み、固体支持体に結合した固定化プローブにその標的配列を結合させ、それにより、ハイブリダイズした標的核酸を他の試料構成成分から分離することができる。
より具体的な実施形態では、捕捉プローブオリゴマーは、標的核酸に相補的でないが、固定化プローブ上の配列に特異的にハイブリダイズし、それにより、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,110,678号において先に記載されているような、標的核酸を他の試料構成成分から分離することを可能にする部分として機能する、テール部分(例えば、3’テール)を含む。任意の配列は、一般的に長さが約5〜50ntであるテール領域において使用することができ、好ましい実施形態は、固体支持体、例えばマトリックスまたは粒子に結合した相補的な固定化配列(例えば、ポリ−T)に結合する約10〜40nt(例えば、A10〜A40)、より好ましくは、約14〜33nt(例えば、A14〜A30またはT14〜T30)の、実質的にホモポリマーであるテールを含む。Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/またはEggerthella sp.16S rRNA標的核酸に特異的にハイブリダイズするように構成されている、標的にハイブリダイズする配列(複数可)を含む一部のそのような実施形態では、Lactobacillus特異的捕捉プローブは、配列番号5のヌクレオチド配列を含み、もしくはそれからなり、G.vaginalis特異的捕捉プローブは、配列番号11のヌクレオチド配列を含み、もしくはそれからなり、および/またはEggerthella特異的捕捉プローブは、配列番号15のヌクレオチド配列を含む、もしくはそれからなる。
標的捕捉は、ハイブリダイズする条件下で、通常は「テール配列」:「固定化プローブ配列」二重鎖のTより高い温度で、標的核酸にハイブリダイズする1つまたは複数の捕捉プローブオリゴマーを含有する溶液相混合物中で典型的に行われる。捕捉プローブテールを含む実施形態に関しては、[標的核酸]:[捕捉プローブ]複合体は、捕捉プローブテールが固定化プローブにハイブリダイズするようにハイブリダイゼーション条件を調整することによって捕捉され、次に、固体支持体上の全複合体が他の試料構成成分から分離される。[固定化プローブ]:[捕捉プローブ]:[標的核酸]が結合した支持体を1回または複数回洗浄して、他の試料構成成分をさらに除いてもよい。好ましい実施形態は、常磁性ビーズなどの粒子状固体支持体を使用し、その結果、[標的核酸]:[捕捉プローブ]:[固定化プローブ]複合体が結合した粒子を洗浄溶液に懸濁させ、洗浄溶液から、好ましくは磁気引力の使用によって、取り出すことができる。増幅に基づく検出アッセイの使用を含む方法の実施形態では、処理ステップの数を制限するために、支持体上の複合体中の標的核酸を増幅オリゴマーと単に混合し、増幅ステップを進めることによって、標的核酸を増幅してもよい。
BVを診断するための方法の一部の実施形態では、Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/またはEggerthella sp.の検出が被験体におけるBVを示す場合、方法は、被験体におけるBVを処置するステップをさらに含む。BVのための処置レジメンは当該技術分野において一般に公知であり、例えば、抗生物質薬、例えばメトロニダゾール(例えば、FLAGYL、METROGEL−VAGINAL)、クリンダマイシン(例えば、CLEOCIN、CLINDESSE)、およびチニダゾール(例えば、TINDAMAX)、の投与を含む。ある特定のバリエーションでは、被験体は、前にBVと診断されたことがない。他の実施形態では、被験体は、前にBVと診断されたことがあり、本開示の診断方法が行われる時点でBVのための処置を受けている。このようなバリエーションは、被験体におけるBVの処置のモニタリングに特に有用である。例えば、方法が、BVが被験体になお存在することを示す場合には、被験体は、処置を継続し得る。一部の実施形態では、同じ処置レジメン(すなわち、本診断方法が行われる時点で被験体が受けている同じ処置)が被験体に再び施される。あるいは、処置を受けている被験体におけるBVの存在継続は、進行中の処置の変更が必要であることを示し得、異なる処置レジメン(例えば、異なる薬物療法、または薬物の投薬量および/もしくは頻度の増加)が被験体に施される。
本発明によるLactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/またはEggerthella sp.の存在または非存在の検出を、各標的について別々に(例えば、別々の反応容器で、逐次的にまたは並行して)行っても、または多重反応システムとして一緒に行ってもよい。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載される方法(例えば、BVを診断するための方法)は、反応混合物が複数(例えば、少なくとも2つ、3つ、4つまたはそれ超)の異なる標的配列を並行してアッセイするための試薬を含有する、多重反応を利用する。これらの場合、反応混合物は、検出アッセイを行うための複数の異なる標的特異的オリゴヌクレオチドを含有し得る。例えば、増幅に基づく検出アッセイを利用する方法では、多重反応は、増幅オリゴマーの複数のセット(例えば、複数の対)(例えば、PCRプライマーの複数の対、またはTMA増幅オリゴマーの複数の対(例えば、TMAのための、プロモータープライマーと非プロモータープライマーの複数の対、またはプロモータープロバイダーと非プロモータープライマーの複数の対))を含有し得る。切断に基づく検出アッセイを利用する他の実施形態では、多重反応は、異なるフラップを有する複数のプローブオリゴヌクレオチド、複数の異なるオーバーラッププローブオリゴヌクレオチド、および異なるフラップを、それらが切断され次第、検出するための複数の異なるFRETカセットを含有し得る。
さらなる微生物検出アッセイを、BVに関係づけられる複数の微生物の存在および/または相対量を決定するために、同様に行うことができる。単なる例として、そのような複数の微生物は、嫌気性グラム陽性球菌;Trichomonas sp.;Trichomonas vaginalis;Candida sp.;Eggerthella sp.;Clostridiales目からの細菌;Clostridium様sp.;Atopobium sp.;Atopobium vaginae;腸内細菌;Peptostreptococcus micros;Aerococcus christensenii;Leptotrichia amnionii;Peptoniphilus sp.;Dialister sp.;Mycoplasma hominis;Sneathia sanguinegens;Anaerococcus tetradius;Mobiluncus sp.;Mobiluncus hominis;Eggerthella hongkongensis;Prevotella sp.;Megasphaera sp.;Leptotrichia sanguinegensおよびFinegoldia magnaのうちの1つまたは複数を含むことができる。アッセイを別々に行っても、または多重化してもよい。したがって、BVの診断は、複数の微生物を同定すること、および任意選択で、試料中のそれらの相対存在量を決定することを含むことができる。
ある特定の実施形態では、BVを診断するための方法は、BVに関連する10以下の細菌属の検出を含む。他の実施形態では、方法は、BVに関連する9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、または4以下の細菌属の検出を含む。一部のバリエーションでは、方法は、Lactobacillus、GardnerellaおよびEggerthella以外のBVに関連する細菌属の検出を含まない。
また、本発明によって、試料中のLactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.のいずれか1つまたは複数の存在または非存在を決定するためのオリゴマーが提供される。様々な実施形態では、オリゴマーの組合せは、試料中のLactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/またはEggerthella sp.の存在または非存在を決定するための方法について本明細書中で述べるとおりのオリゴマーを含む。一部のバリエーションでは、オリゴマーの組合せは、少なくとも1つのLactobacillus特異的オリゴヌクレオチド(例えば、異なる標的配列にそれぞれが結合する、少なくとも2つまたは3つのLactobacillus特異的オリゴヌクレオチド);少なくとも1つのG.vaginalis特異的オリゴヌクレオチド(例えば、異なる標的配列にそれぞれが結合する、少なくとも2つまたは3つのG.vaginalis特異的オリゴヌクレオチド);および少なくとも1つのEggerthella特異的オリゴヌクレオチド(例えば、異なる標的配列にそれぞれが結合する、少なくとも2つまたは3つのEggerthella特異的オリゴヌクレオチド)を含む。一部のバリエーションでは、オリゴマーの組合せは、少なくとも2つのLactobacillus特異的オリゴヌクレオチド(例えば、異なる標的配列にそれぞれが結合する、少なくとも3つのLactobacillus特異的オリゴヌクレオチド);少なくとも2つのG.vaginalis特異的オリゴヌクレオチド(例えば、異なる標的配列にそれぞれが結合する、少なくとも3つのG.vaginalis特異的オリゴヌクレオチド);および/または少なくとも2つのEggerthella特異的オリゴヌクレオチド(例えば、異なる標的配列にそれぞれが結合する、少なくとも3つのEggerthella特異的オリゴヌクレオチド)を含む。一部の実施形態では、オリゴマーの組合せ Lactobacillus sp.核酸標的領域を増幅させるための少なくとも2つのLactobacillus特異的増幅オリゴヌクレオチド;G.vaginalis核酸標的領域を増幅させるための少なくとも2つのG.vaginalis特異的増幅オリゴヌクレオチド;および/またはEggerthella sp.核酸標的領域を増幅させるための少なくとも2つのEggerthella特異的増幅オリゴヌクレオチド。オリゴマーの組合せは、反応混合物の、またはオリゴマーを含むキットの形態であってもよい。反応混合物またはキットは、多数の任意選択の構成成分、例えば、捕捉プローブ核酸、または捕捉プローブ核酸のアレイなどをさらに含み得る。増幅反応混合物に関して、反応混合物は、典型的には、in vitroで増幅を行うのに適した他の試薬、例えば、バッファ、塩溶液、適切なヌクレオチド三リン酸(例えば、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、ATP、CTP、GTPおよびUTP)、および/または酵素(例えば、逆転写酵素および/またはRNAポリメラーゼ)などを含み、典型的には、Eggerthella、Prevotellaおよび/またはLactobacillus標的核酸が存在してもよくまたは存在しなくてもよい試験試料の構成成分を含む。Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよび/またはEggerthella sp.の1つまたは複数の標的核酸領域の増幅のためのオリゴマーの組合せを含むキットは、in vitroで増幅を行うのに適した他の試薬、例えば、バッファ、塩溶液、適切なヌクレオチド三リン酸(例えば、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、ATP、CTP、GTPおよびUTP)、および/または酵素(例えば、逆転写酵素および/またはRNAポリメラーゼ)なども含み得る。共通の標的核酸を標的とする増幅オリゴマーの組合せと一緒に検出プローブを含む、オリゴマーの組合せ(例えば、反応混合物またはキット)に関して、増幅オリゴマーおよび検出プローブオリゴマーの選択は、共通の標的領域によって結びつけられる(すなわち、組合せは、増幅オリゴマーの組合せによって増幅可能な配列に結合するプローブを含む)。
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに例証される。
(実施例1)
RT−TMAに基づくアッセイのための試薬
別段の指定がない限り、本明細書に記載するRT−TMAに基づくアッセイで一般に使用する試薬は、以下のものを含む。標的捕捉試薬(TCR)、汎用試薬処方:250mM HEPES、1.88M LiCl、310mM LiOH、100mM EDTA、pH6.4、および(dT)14オリゴマーが共有結合している250μg/mlの常磁性粒子(0.7〜1.05マイクロメートル粒子、Sera−Mag(商標)MG−CM)。洗浄溶液:10mM HEPES、150mM NaCl、6.5mM NaOH、1mM EDTA、0.3%(v/v)エタノール、0.02%(w/v)メチルパラベン、0.01%(w/v)プロピルパラベン、および0.1%(w/v)ラウリル硫酸ナトリウム、pH7.5。増幅試薬、リアルタイム試薬処方:11.61mM Tris塩基、14.94mM Tris−HCl、28.5mM MgCl、23.30mM KCl、3.3%グリセロール、0.02%PRO CLIN 300、0.05mM 酢酸亜鉛二水和物、dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP各0.76mM、ATP、CTPおよびGTP各6.50mM、7.50mM UTP、を含有する溶液。これにプライマーを添加してもよい。RT−TMA酵素:57.46mM HEPES、49.58mM N−アセチル−L−システイン、0.98mM EDTA遊離酸、0.039mM EDTA二ナトリウム二水和物、0.10v/v TRITON X−100、49.61mM KCl、0.20v/vグリセロール、0.03w/vトレハロース二水和物、MMLV逆転写酵素(RT)およびT7 RNAポリメラーゼ。プロモーター試薬、リアルタイム試薬処方:増幅試薬と同じ試薬処方。
増幅オリゴおよびトーチについてのオリゴスクリーニング実験を、二相リアルタイムTMA形式を使用してOEMプラットフォーム(Stratagene Mx3000)で行った。簡単に言うと、標的特異的捕捉オリゴ(15pmol/rxn)およびT7オリゴ(5pmol/rxn)を含有する100μlのTCR試薬と共に試料を62℃で30分間インキュベートし、次に、20分間室温に下げた。TCOおよび標的rRNAと結合した磁気ビーズを洗浄し、15pmol/rxn NT7オリゴを含有する増幅試薬中に溶出させた。酵素試薬(25μl)の添加およびプロモーター試薬(25μl)のその後の添加中、試料を43℃でインキュベートした。プロモーター試薬は、15pmol/rxn T7オリゴおよび15pmol/rxnトーチオリゴを含有した。標的アンプリコンrRNAへのトーチの結合および結果として起こるクエンチャーからの色素分離を示す蛍光発光を、Stratagene装置で30秒ごとに1時間、リアルタイムで測定した。蛍光曲線プロファイルを標的の増幅について分析した。
いくつかのT7オリゴをLactobacillus sp.標的系についてスクリーニングして、これらのオリゴのアッセイでの全L.spp標的検出に最適な組合せを同定した。2つのT7オリゴをアッセイへ組み入れるために選択した。特にL.gasseriの検出を改善する、およびLactobacillus iners(非標的Lactobacillus種)の交差検出を低減させるために、追加のトーチオリゴを開発し、試験した。いくつかのトーチは、L.gasseriについて良好な性能を示し、1つは、L.iners交差検出について最高の低減を示した。G.vaginalisについては2つの異なるT7オリゴをアッセイのための競合内部対照の組み入れの可能性についてスクリーニングし、G.vaginalisにはT7/NT7オリゴを、およびG.vaginalis対IC検出にはトーチ特異的オリゴを利用した。異なる標的特異的標的捕捉オリゴを設計し、スクリーニングして、共通のBV標的捕捉オリゴに対する各標的系についてのアッセイの性能を比較した。各BV標的系について1つの標的特異的TCOを選択した。追加のTCOをL.spp標的についてスクリーニングし、3つのL.spp標的の検出に関して全体的に最高のバランスを提供する1つのTCOを選択した。多重細菌性膣炎アッセイの最適化ついてスクリーニングしたプライマーのリストを表1に列挙する。
標的増幅および検出の最適化後、オリゴを各BV標的のために選択し、後続の実験をPanther装置プラットフォーム(Panther instrument platform)で実施した。増幅および検出反応は、特定された全てのBV標的はもちろん核酸内部対照も増幅し、検出するように構成した。簡単に言うと、溶解した標的を、標的捕捉オリゴ、固定化プローブに繋がれた磁気ビーズ、およびT7プライマーと組み合わせた。標的捕捉オリゴおよびT7プライマーをそれらの意図された標的にハイブリダイズさせるように反応条件を規定した。一連の洗浄ステップを行って、細胞構成成分、培養培地および輸送培地などを除去した。洗浄ステップ後、洗浄され、捕捉された標的核酸に第1の増幅試薬を添加した。第1の増幅試薬は、非T7プライマーのみを含有した。酵素添加前にプライマーアニーリングステップはなく、増幅の開始は酵素の添加時に起こり、その後、42℃で5分間のインキュベーションステップを行った。T7プライマーと検出プローブとしてのトーチとを含有する第2の増幅試薬を、5分間42℃でのインキュベーション反応後に第1の増幅試薬に添加した。リアルタイム検出をこのステップの間に行い、それぞれの異なる検出プローブ上のFam、Hex、RoxおよびCy5.5色素標識を検出するために使用した4つの別個の蛍光光度計によって測定した。
(実施例2)
BV標的核酸の増幅および検出のためのオリゴマーの組合せの感度および特異度の試験
Aptima検体輸送培地(STM)にスパイクした、半対数(half log)漸増量の溶解物(L.spp標的およびG.vaginalisについて)またはEggerthellaについてのin vitro転写物(IVT)を試験して、BV標的の分析感度を評価した。Panther装置において各パネル濃度(各標的について、合計N=10の濃度)で15回繰り返してスクリーニングした。オリゴを多重キット形式で試験したが、各BV標的を別々にスクリーニングした。アッセイは、TCOプライマー(15pmol/rxn)、T7プライマー(5または15pmol/rxnのいずれかで)、NT7プライマー(15pmol/rxn)、およびトーチプライマー(15pmol/rxn)を使用した。Probit分析を行って、BV標的のそれぞれについて95%および50%検出レベルを決定した。95%の確率(95%CL)で、検出限界(LoD)を決定した:L.crispatus、3.4×10(3.2×10〜3.5×10)CFU/ml;L.jensenii、3.1×10(3.0×10〜3.2×10)CFU/ml;L.gasseri、3.2×10(3.1×10〜3.2×10)CFU/ml;G.vaginalis、107(103〜110)CFU/ml;Eggerthella、1.1×10(1.0×10〜1.2×10)コピー/ml。
各BV標的に対する最適プライマーセットの交差反応性を、それぞれ4〜5生物の16のプールパネルに対して試験した。G.vaginalisを検出するために最適化したプライマーセットに関して、いずれの生物についても有意な交差検出は観察されなかった。L.spp標的を検出するために最適化したプライマーセットは、スクリーニングしたプールパネルの1つと交差反応した。追加実験により、交差反応する生物がLactobacillus acidophilusであることを決定した。L.acidophilusは、腸内微生物であり、アッセイに対してリスクがないと決定した。Eggerthella標的を検出するために最適化したプライマーセットは、スクリーニングしたプールパネルの1つと交差反応した。追加実験により、交差反応する生物がNeisseria gonorrhoeaeであることを決定した。N.gonorrhoeaeは、高リスク交差検出であり、追加のプライマーをEggerthellaについてスクリーニングした。最適化された新たなプライマーセットは、1×10CFU/mlまでN.gonorrhoeaeの検出をうまく排除した。
(実施例3)
BV標的核酸を検出するためのRT−TMAアッセイの臨床的感度
膣スワブ患者検体(n=200、4カ所の異なる臨床現場から収集したもの)を使用して細菌性膣炎アッセイの臨床性能を評価し、これは、およそ100の陽性および100の陰性試料(Cartwright判定基準を利用)を含んだ。標的検出に利用した各蛍光チャネル(Fam、Hex、Cy5.5)におけるカットオフとしてTTimeを使用した:L.spp、25分間;G.vaginalis、12.5分間;Eggerthella、40分間。細菌性膣炎アッセイ臨床性能を感度について分析し:93.8%(86.2〜97.3)、特異度について分析した:88.6%(79.7〜93.9)。
およそ同量の陽性および陰性試料(Cartwright判定基準を利用)を含む、98のThinPrep/膣スワブペア試料も、臨床的実行可能性および細菌性膣炎アッセイ性能について評価した。陽性試料の全体一致率=93.8%;陰性試料の全体一致率=100%;中間試料の全体一致率=87.5%。
(実施例4)
BV標的核酸を検出するためのRT−TMAアッセイの臨床的感度
この試験に関しては、前に実施例1で説明したものと比較して増幅およびプロモーター試薬処方を調整した。増幅試薬、リアルタイム試薬処方:11.61mM Tris塩基、14.94mM Tris−HCl、31.0mM MgCl、23.30mM KCl、3.3%グリセロール、0.02%PRO CLIN 300、0.05mM 酢酸亜鉛二水和物、dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP各0.83mM、ATP、CTPおよびGTP各7.00mM、8.00mM UTP、を含有する溶液。これにプライマーを添加してもよい。RT−TMA酵素:57.46mM HEPES、49.58mM N−アセチル−L−システイン、0.98mM EDTA遊離酸、0.039mM EDTA二ナトリウム二水和物、0.10v/v TRITON X−100、49.61mM KCl、0.20v/vグリセロール、0.03w/vトレハロース二水和物、MMLV逆転写酵素(RT)およびT7 RNAポリメラーゼ。プロモーター試薬、リアルタイム試薬処方:増幅試薬と同じ試薬処方。
オリゴ濃度最適化実験を実施して、細菌性膣炎アッセイの各オリゴについて最適な濃度を決定した。オリゴ濃度を滴定し、性能の差を実証する濃度でSTMにスパイクした標的IVTに対してスクリーニングした。この試験から、アッセイの性能を最適化するためにオリゴ濃度を調整することを決定した。TCR試薬に関しては、Lactobacillus sp.、EggerthellaおよびGardnerellaについてのTCOを15pmol/rxnから10pmol/rxnに調整した。全てのT7プライマーをTCR試薬から除去した。増幅試薬に関しては、EggerthellaのためのNT7を15pmol/rxnから10pmol/rxnに調整し、LactobacillusおよびGardnerellaのためのNT7を15pmol/rxnから5pmol/rxnに調整した。プロモーター試薬中のT7オリゴに関しては、Lactobacillus sp.T7オリゴ配列番号7を処方から除去し、Lactobacillus T7オリゴ配列番号8は処方中に残存し、それを15pmol/rxnから4pmol/rxnに調整し、Eggerthella T7を15pmol/rxnから10pmol/rxnに調整し、Gardnerella T7を15pmol/rxnから5pmol/rxnに調整した。プロモーター試薬中のトーチオリゴに関しては、L.gasseri検出のためにLactobacillus sp.トーチ(配列番号10)を15pmol/rxnから10pmol/rxnに調整し、L.crispatusおよびL.jensenii検出のためにLactobacillus sp.トーチを15pmol/rxnから20pmol/rxnに調整し、GardnerellaトーチおよびEggerthellaトーチを15pmol/rxnから20pmol/rxnに調整した。
膣スワブ患者検体(n=353、3カ所の異なる臨床現場から収集したもの)を使用して細菌性膣炎アッセイの臨床性能を評価し、これは、培養結果に従って78の陽性、41の中間、および234の陰性を含んだ。Amsel判定基準を用いて中間ステータスを分けて、4の陽性および37の陰性を得た。試料が、FAMに関して2000RFU、HEXに関して2000RFU、および/またはROXに関して1600RFUを超えるRFUシグナルを有していれば、陽性判定基準が決定された。FAMチャネルでの陽性結果は、Lactobacillus sp.についての陽性結果に対応し、HEXでの陽性結果は、Eggerthellaについての陽性結果に対応し、ROXチャネルでの陽性結果は、全てGardnerellaについての陽性に対応した。陽性結果を決定するためにTTimeカットオフを利用しなかった。細菌性膣炎アッセイ臨床性能を、Eggerthella標的を含めておよび含めずに感度および特異度について分析した。アッセイの感度は、Eggerthellaありで96.3(89.7〜99.2)およびEggerthellaなしで96.3(89.7〜99.2)であった。アッセイの特異度は、Eggerthellaありで86.7(82.1〜90.5)およびEggerthellaなしで87.5(82.9〜91.2)であった。試料試験結果からEggerthella検出を含めないほうが良好な特異度が得られる(特異度向上は偽陽性の除去に起因した)。さらに、Eggerthellaの結果は、Gardnerellaも陽性の結果であることが決定されたときにのみ陽性であることが判明し、Eggerthellaステータスを単独で使用することによって決定されたBV陽性試料はなかった。結果は、特異度向上がBVアッセイ処方からのEggerthellaの排除によって得られ、したがって、アッセイからの除去を支持することを実証する。
以上のことから、本発明の具体的な実施形態が例示の目的のために本明細書に記載されているが、種々の改変が本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除き、限定されるものではない。本明細書において引用された全ての刊行物、特許および特許出願は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (213)

  1. 試料中のLactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.のそれぞれについての存在または非存在を決定するための多重方法であって、
    (1)Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.の少なくとも1つを含有することが疑われる試料を、
    (a)Lactobacillus sp.標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーであって、(i)該第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号7の残基28〜45または配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)該第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号6のヌクレオチド配列に実質的に対応する第2のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマー、
    (b)G.vaginalis標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーであって、(i)該第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーが、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)該第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーが、配列番号12のヌクレオチド配列に実質的に対応する第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマー、ならびに
    (c)Eggerthella sp.標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のEggerthella特異的増幅オリゴマーであって、(i)該第1のEggerthella特異的増幅オリゴマーが、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)該第2のEggerthella特異的増幅オリゴマーが、配列番号16のヌクレオチド配列に実質的に対応する第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のEggerthella特異的増幅オリゴマー
    と接触させるステップ;
    (2)in vitro核酸増幅反応を行うステップであって、任意のLactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.標的核酸が、該試料中に存在する場合、該Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.標的領域に対応する1つまたは複数の増幅産物を生成するための鋳型として使用される、ステップ;ならびに
    (3)該1つまたは複数の増幅産物の存在または非存在を検出し、それにより該試料中のLactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.の存在または非存在を決定するステップ
    を含む方法。
  2. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、前記試料を、前記Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーとさらに接触させ、
    該第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、
    請求項1に記載の方法。
  3. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45もしくは配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列を含み;
    前記第2のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号6のヌクレオチド配列を含み;
    前記第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列を含み;
    前記第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号12のヌクレオチド配列を含み;
    前記第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列を含み;および/または
    前記第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号16のヌクレオチド配列を含む、
    請求項1に記載の方法。
  4. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、前記試料を、前記Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーとさらに接触させ、
    該第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列を含む、第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、
    請求項1または3に記載の方法。
  5. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45もしくは配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列からなり;
    前記第2のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号6のヌクレオチド配列からなり;
    前記第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列からなり;
    前記第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号12のヌクレオチド配列からなり;
    前記第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列からなり;および/または
    前記第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号16のヌクレオチド配列からなる、
    請求項1または3に記載の方法。
  6. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、前記試料を、前記Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーとさらに接触させ、
    該第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列からなる、第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、
    請求項1、3および5のいずれかに記載の方法。
  7. 前記第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマー、前記第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーおよび前記第1のEggerthella特異的増幅オリゴマーの少なくとも1つが、それぞれの、標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、前記試料を、前記Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーとさらに接触させ、
    該第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーであり、該第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含む、
    請求項1、3、5および7のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、前記第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである、請求項2、4および6のいずれかに記載の方法。
  10. 前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、請求項7または9に記載の方法。
  11. 前記プロモーター配列が、配列番号7の残基1〜27のヌクレオチド配列を有する、請求項10に記載の方法。
  12. 前記第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号7のヌクレオチド配列を有し;
    前記第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーが、配列番号13のヌクレオチド配列を有し;および/または
    前記第1のEggerthella特異的増幅オリゴマーが、配列番号17のヌクレオチド配列を有する、
    請求項7に記載の方法。
  13. 前記第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号8のヌクレオチド配列を有する、請求項9に記載の方法。
  14. ステップ(2)の前に前記Lactobacillus、G.vaginalisおよびEggerthella標的核酸を、存在する場合、前記試料中の他の構成成分から精製するステップをさらに含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記精製するステップが、前記試料を、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合した、標的にハイブリダイズする配列を含む少なくとも1つの捕捉プローブオリゴマーと接触させるステップを含む、請求項14に記載の方法。
  16. 前記試料を、Lactobacillus特異的捕捉プローブオリゴマー、G.vaginalis特異的捕捉プローブオリゴマー、およびEggerthella特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させ、
    該Lactobacillus特異的、G.vaginalis特異的およびEggerthella特異的捕捉プローブオリゴマーのそれぞれが、前記Lactobacillus、G.vaginalisまたはEggerthella標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズする、捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列をそれぞれ含み、
    該Lactobacillus特異的、G.vaginalis特異的およびEggerthella特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列のそれぞれが、前記固定化プローブに結合する前記配列または部分に共有結合されている、
    請求項15に記載の方法。
  17. 前記Lactobacillus特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列が、配列番号5の残基1〜12のヌクレオチド配列に実質的に対応し、
    前記G.vaginalis特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列が、配列番号11の残基1〜17のヌクレオチド配列に実質的に対応し、および/または
    前記Eggerthella特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列が、配列番号15の残基1〜21のヌクレオチド配列に実質的に対応する、
    請求項16に記載の方法。
  18. 前記Lactobacillus特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号5のヌクレオチド配列を有し、
    前記G.vaginalis特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号11のヌクレオチド配列を有し、および/または
    前記Eggerthella特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号15のヌクレオチド配列を有する、
    請求項17に記載の方法。
  19. 前記検出するステップ(3)が、
    前記1つまたは複数の増幅産物を、前記Lactobacillus sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のLactobacillus特異的検出プローブ、前記G.vaginalis標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のG.vaginalis特異的検出プローブ、および前記Eggerthella sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のEggerthella特異的検出プローブと接触させるステップ、ならびに
    標的にハイブリダイズした任意のLactobacillus特異的、G.vaginalis特異的および/またはEggerthella特異的検出プローブの存在または非存在を検出するステップ
    を含む、請求項1〜18のいずれかに記載の方法。
  20. 前記第1のLactobacillus特異的検出プローブが、配列番号9に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含み、
    前記第1のG.vaginalis特異的検出プローブが、配列番号14の残基1〜19に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含み、および/または
    前記第1のEggerthella特異的検出プローブが、配列番号18に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む、
    請求項19に記載の方法。
  21. 前記第1のLactobacillus特異的検出プローブが、配列番号9のヌクレオチド配列を有し;
    前記第1のG.vaginalis特異的検出プローブが、配列番号14のヌクレオチド配列を有し;および/または
    前記第1のEggerthella特異的検出プローブが、配列番号18のヌクレオチド配列を有する、
    請求項20に記載の方法。
  22. 前記検出するステップ(3)が、前記1つまたは複数の増幅産物を、前記Lactobacillus sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第2のLactobacillus特異的検出プローブと接触させるステップをさらに含み、前記第2のLactobacillus特異的検出プローブが、配列番号10の残基6〜21に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む、請求項20または21に記載の方法。
  23. 前記第2のLactobacillus特異的検出プローブが、配列番号10のヌクレオチド配列を有する、請求項22に記載の方法。
  24. 前記第1のLactobacillus特異的検出プローブ、前記第1のG.vaginalis特異的検出プローブおよび前記第1のEggerthella特異的検出プローブのそれぞれが標識を含む、請求項19または20に記載の方法。
  25. 前記第2のLactobacillus特異的検出プローブが標識を含む、請求項22に記載の方法。
  26. 前記標識が、化学発光標識または蛍光標識である、請求項24または25に記載の方法。
  27. 前記検出するステップ(3)が、前記増幅するステップ(2)の間に行われる、請求項24または25に記載の方法。
  28. 各検出プローブが、蛍光標識およびクエンチャーを含む、請求項27に記載の方法。
  29. 各検出プローブが、分子トーチ、分子ビーコン、またはTaqMan検出プローブである、請求項28に記載の方法。
  30. 前記第1のLactobacillus特異的検出プローブ、前記第1のG.vaginalis特異的検出プローブおよび前記第1のEggerthella特異的検出プローブの少なくとも1つが、標的にハイブリダイズしない配列をさらに含む、請求項19または20に記載の方法。
  31. 前記第1のLactobacillus特異的検出プローブ、前記第1のG.vaginalis特異的検出プローブおよび前記第1のEggerthella特異的検出プローブのそれぞれが、分子トーチまたは分子ビーコンである、請求項30に記載の方法。
  32. 前記第2のLactobacillus特異的検出プローブが、標的にハイブリダイズしない配列をさらに含む、請求項22に記載の方法。
  33. 前記第2のLactobacillus特異的検出プローブが、分子トーチまたは分子ビーコンである、請求項32に記載の方法。
  34. ステップ(2)での前記増幅反応が、等温増幅反応である、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記増幅反応が、転写媒介性増幅(TMA)反応である、請求項34に記載の方法。
  36. 前記増幅反応が、リアルタイム増幅反応である、請求項34または35に記載の方法。
  37. 試料中のLactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.のそれぞれについての存在または非存在を決定するためのオリゴマーの組合せであって、
    (a)Lactobacillus sp.標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーであって、(i)該第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列または配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)該第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号6のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマー;
    (b)G.vaginalis標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーであって、(i)該第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)該第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号12のヌクレオチド配列に実質的に対応する第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマー、ならびに
    (c)Eggerthella sp.標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のEggerthella特異的増幅オリゴマーであって、(i)該第1のEggerthella特異的増幅オリゴマーは、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)該第2のEggerthella特異的増幅オリゴマーは、配列番号16のヌクレオチド配列に実質的に対応する第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のEggerthella特異的増幅オリゴマー
    を含む、オリゴマーの組合せ。
  38. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、前記オリゴマーの組合せが、前記Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーをさらに含み、
    前記第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、
    請求項37に記載のオリゴマーの組合せ。
  39. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45もしくは配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列を含み;
    前記第2のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号6のヌクレオチド配列を含み; 前記第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列を含み; 前記第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号12のヌクレオチド配列を含み;
    前記第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列を含み;および/または 前記第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号16のヌクレオチド配列を含む、請求項37に記載のオリゴマーの組合せ。
  40. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、前記オリゴマーの組合せが、前記Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーをさらに含み、
    該第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列を含む、第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、
    請求項37または39に記載のオリゴマーの組合せ。
  41. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号7の残基28〜45もしくは配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列からなり;
    前記第2のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号6のヌクレオチド配列からなり;
    前記第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列からなり;
    前記第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号12のヌクレオチド配列からなり;
    前記第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列からなり;および/または
    前記第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号16のヌクレオチド配列からなる、
    請求項37または39に記載のオリゴマーの組合せ。
  42. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、前記オリゴマーの組合せが、前記Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーをさらに含み、
    該第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列からなる、第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、
    請求項37、39および41のいずれかに記載のオリゴマーの組合せ。
  43. 前記第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマー、前記第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーおよび前記第1のEggerthella特異的増幅オリゴマーの少なくとも1つが、それぞれの、標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである、請求項37〜42のいずれか一項に記載のオリゴマーの組合せ。
  44. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、オリゴマーの組合せが、前記Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーをさらに含み、
    該第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーであり、該第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含む、
    請求項37、39、41および43のいずれか一項に記載のオリゴマーの組合せ。
  45. 前記第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、前記第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである、請求項38、40および42のいずれかに記載のオリゴマーの組合せ。
  46. 前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、請求項43または45に記載のオリゴマーの組合せ。
  47. 前記プロモーター配列が、配列番号7の残基1〜27のヌクレオチド配列を有する、請求項46に記載のオリゴマーの組合せ。
  48. 前記第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号7のヌクレオチド配列を有し;
    前記第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーが、配列番号13のヌクレオチド配列を有し;および/または
    前記第1のEggerthella特異的増幅オリゴマーが、配列番号17のヌクレオチド配列を有する、
    43に記載のオリゴマーの組合せ。
  49. 前記第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号8のヌクレオチド配列を有する、請求項45に記載のオリゴマーの組合せ。
  50. 固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合した、標的にハイブリダイズする配列を含む少なくとも1つの捕捉プローブオリゴマーをさらに含む、請求項37〜49のいずれかに記載のオリゴマーの組合せ。
  51. Lactobacillus特異的捕捉プローブオリゴマー、G.vaginalis特異的捕捉プローブオリゴマー、およびEggerthella特異的捕捉プローブオリゴマーを含み、
    該Lactobacillus特異的、G.vaginalis特異的およびEggerthella特異的捕捉プローブオリゴマーのそれぞれが、前記Lactobacillus、G.vaginalisまたはEggerthella標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズする、捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列をそれぞれ含み、
    該Lactobacillus特異的、G.vaginalis特異的およびEggerthella特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列のそれぞれが、前記固定化プローブに結合する前記配列または部分に共有結合されている、
    請求項50に記載のオリゴマーの組合せ。
  52. 前記Lactobacillus特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列が、配列番号5の残基1〜12のヌクレオチド配列に実質的に対応し、
    前記G.vaginalis特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列が、配列番号11の残基1〜17のヌクレオチド配列に実質的に対応し、および/または
    前記Eggerthella特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列が、配列番号15の残基1〜21のヌクレオチド配列に実質的に対応する、
    請求項51に記載のオリゴマーの組合せ。
  53. 前記Lactobacillus特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号5のヌクレオチド配列を有し、
    前記G.vaginalis特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号11のヌクレオチド配列を有し、および/または
    前記Eggerthella特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号15のヌクレオチド配列を有する、
    請求項52に記載のオリゴマーの組合せ。
  54. 前記Lactobacillus sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のLactobacillus特異的検出プローブ、前記G.vaginalis標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のG.vaginalis特異的検出プローブ、および前記Eggerthella sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のEggerthella特異的検出プローブをさらに含む、請求項37〜53のいずれかに記載のオリゴマーの組合せ。
  55. 前記第1のLactobacillus特異的検出プローブが、配列番号9に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含み、
    前記第1のG.vaginalis特異的検出プローブが、配列番号14の残基1〜19に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含み、および/または
    前記第1のEggerthella特異的検出プローブが、配列番号18に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む、
    請求項54に記載のオリゴマーの組合せ。
  56. 前記第1のLactobacillus特異的検出プローブが、配列番号9のヌクレオチド配列を有し;
    前記第1のG.vaginalis特異的検出プローブが、配列番号14のヌクレオチド配列を有し;および/または
    前記第1のEggerthella特異的検出プローブが、配列番号18のヌクレオチド配列を有する、
    請求項55に記載のオリゴマーの組合せ。
  57. 前記Lactobacillus sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第2のLactobacillus特異的検出プローブをさらに含み、該第2のLactobacillus特異的検出プローブが、配列番号10の残基6〜21に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む、請求項55または56に記載のオリゴマーの組合せ。
  58. 前記第2のLactobacillus特異的検出プローブが、配列番号10のヌクレオチド配列を有する、請求項57に記載のオリゴマーの組合せ。
  59. 前記第1のLactobacillus特異的検出プローブ、前記第1のG.vaginalis特異的検出プローブおよび前記第1のEggerthella特異的検出プローブのそれぞれが標識を含む、請求項54または55に記載のオリゴマーの組合せ。
  60. 前記第2のLactobacillus特異的検出プローブが標識を含む、請求項57に記載のオリゴマーの組合せ。
  61. 前記標識が、化学発光標識または蛍光標識である、請求項59または60に記載のオリゴマーの組合せ。
  62. 各検出プローブが、蛍光標識およびクエンチャーを含む、請求項59または60に記載のオリゴマーの組合せ。
  63. 各検出プローブが、分子トーチ、分子ビーコン、またはTaqMan検出プローブである、請求項62に記載のオリゴマーの組合せ。
  64. 前記第1のLactobacillus特異的検出プローブ、前記第1のG.vaginalis特異的検出プローブおよび前記第1のEggerthella特異的検出プローブの少なくとも1つが、標的にハイブリダイズしない配列をさらに含む、請求項54または55に記載のオリゴマーの組合せ。
  65. 前記第1のLactobacillus特異的検出プローブ、前記第1のG.vaginalis特異的検出プローブおよび前記第1のEggerthella特異的検出プローブのそれぞれが、分子トーチまたは分子ビーコンである、請求項64に記載のオリゴマーの組合せ。
  66. 前記第2のLactobacillus特異的検出プローブが、標的にハイブリダイズしない配列をさらに含む、請求項57に記載のオリゴマーの組合せ。
  67. 前記第2のLactobacillus特異的検出プローブが、分子トーチまたは分子ビーコンである、請求項66に記載のオリゴマーの組合せ。
  68. 被験体における細菌性膣炎(BV)の存在または非存在を決定するための方法であって、
    (a)BVを有することが疑われる被験体からの試料を用意するステップ;
    (b)該試料中のLactobacillus sp.、G.vaginalis、およびEggerthella sp.の検出のためのアッセイを行うステップ;
    (c)Lactobacillus sp.、G.vaginalis、およびEggerthella sp.のそれぞれに陽性または陰性のいずれかのステータスを該検出アッセイに基づいて割り当てるステップ;ならびに
    (d)ステップ(c)からの該割り当てられたLactobacillus sp.ステータス、G.vaginalisステータス、およびEggerthella sp.ステータスの組合せに基づいて該被験体におけるBVの存在または非存在を決定するステップであって、
    (i)G.vaginalisとEggerthella sp.両方について陰性のステータスが、該被験体におけるBVの非存在を示し、
    (ii)G.vaginalisとEggerthella sp.両方について陽性のステータスが、該被験体におけるBVの存在を示し、
    (iii)Lactobacillus sp.のステータスが陽性である場合には、G.vaginalisおよびEggerthellaの少なくとも一方について陰性のステータスが、該被験体におけるBVの非存在を示し、
    (iv)Lactobacillus sp.のステータスが陰性である場合には、G.vaginalisおよびEggerthellaの少なくとも一方について陽性のステータスが、該被験体におけるBVの存在を示す、ステップ
    を含む方法。
  69. Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.の検出のための前記アッセイが、核酸に基づく検出アッセイである、請求項68に記載の方法。
  70. 前記核酸に基づく検出アッセイが、Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.の16S rRNAを標的とする、請求項69に記載の方法。
  71. 前記核酸に基づく検出アッセイが、
    (i)配列番号1の約91位のヌクレオチドから約265位のヌクレオチドの領域に対応するLactobacillus sp.16S rRNA領域、
    (ii)配列番号3の約964位のヌクレオチドから約1036位のヌクレオチドの領域に対応するG.vaginalis 16S rRNA領域、および/または
    (iii)配列番号4の約165位のヌクレオチドから約259位のヌクレオチドの領域に対応するEggerthella sp.16S rRNA領域
    を標的とする、請求項70に記載の方法。
  72. 前記核酸に基づく検出アッセイが、増幅に基づくアッセイである、請求項70〜71のいずれかに記載の方法。
  73. 前記増幅に基づくアッセイが、等温増幅反応を含む、請求項72に記載の方法。
  74. 前記増幅反応が、転写媒介性増幅(TMA)反応である、請求項73に記載の方法。
  75. 前記増幅反応が、リアルタイム増幅反応である、請求項73または74に記載の方法。
  76. 前記核酸に基づく検出アッセイが、
    (1)前記試料を、
    Lactobacillus sp.標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーであって、(i)該第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列または配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)該第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号6のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマー;G.vaginalis標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーであって、(i)該第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)該第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号12のヌクレオチド配列に実質的に対応する第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマー、ならびに
    Eggerthella sp.標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のEggerthella特異的増幅オリゴマーであって、(i)該第1のEggerthella特異的増幅オリゴマーは、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)該第2のEggerthella特異的増幅オリゴマーは、配列番号16のヌクレオチド配列に実質的に対応する第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のEggerthella特異的増幅オリゴマー
    と接触させるステップ;
    (2)in vitro核酸増幅反応を行うステップであって、任意のLactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.標的核酸が、該試料中に存在する場合、該Lactobacillus sp.、G.vaginalisおよびEggerthella sp.標的領域に対応する1つまたは複数の増幅産物を生成するための鋳型として使用される、ステップ;ならびに
    (3)該1つまたは複数の増幅産物の存在または非存在を検出するステップ
    を含む、増幅に基づくアッセイである、請求項70に記載の方法。
  77. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、前記試料を、前記Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーとさらに接触させ、
    該第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、
    請求項76に記載の方法。
  78. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45もしくは配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列を含み;
    前記第2のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号6のヌクレオチド配列を含み;
    前記第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列を含み;
    前記第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号12のヌクレオチド配列を含み;
    前記第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列を含み;および/または
    前記第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号16のヌクレオチド配列を含む、
    請求項76に記載の方法。
  79. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、前記試料を、前記Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーとさらに接触させ、
    該第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列を含む、第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、
    請求項76または78に記載の方法。
  80. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号7の残基28〜45もしくは配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列からなり;
    前記第2のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号6のヌクレオチド配列からなり;
    前記第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列からなり;
    前記第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号12のヌクレオチド配列からなり;
    前記第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列からなり;および/または
    前記第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号16のヌクレオチド配列からなる、
    請求項76または78に記載の方法。
  81. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、前記試料を、前記Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーとさらに接触させ、
    該第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列からなる、第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、
    請求項76、78および80のいずれかに記載の方法。
  82. 前記第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマー、前記第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーおよび前記第1のEggerthella特異的増幅オリゴマーの少なくとも1つが、それぞれの、標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである、請求項76〜81のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、前記試料を、前記Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーとさらに接触させ、
    該第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーであり、該第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含む、
    請求項76、78、80および82のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、前記第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである、請求項77、79および81のいずれかに記載の方法。
  85. 前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、請求項82または84に記載の方法。
  86. 前記プロモーター配列が、配列番号7の残基1〜27のヌクレオチド配列を有する、請求項85に記載の方法。
  87. 前記第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号7のヌクレオチド配列を有し;
    前記第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーが、配列番号13のヌクレオチド配列を有し;および/または
    前記第1のEggerthella特異的増幅オリゴマーが、配列番号17のヌクレオチド配列を有する、
    請求項82に記載の方法。
  88. 前記第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号8のヌクレオチド配列を有する、請求項84に記載の方法。
  89. ステップ(2)の前に前記Lactobacillus、G.vaginalisおよびEggerthella標的核酸を、存在する場合、前記試料中の他の構成成分から精製するステップをさらに含む、請求項76〜88のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記精製するステップが、前記試料を、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合した、標的にハイブリダイズする配列を含む少なくとも1つの捕捉プローブオリゴマーと接触させるステップを含む、請求項89に記載の方法。
  91. 前記試料を、Lactobacillus特異的捕捉プローブオリゴマー、G.vaginalis特異的捕捉プローブオリゴマー、およびEggerthella特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させ、
    該Lactobacillus特異的、G.vaginalis特異的およびEggerthella特異的捕捉プローブオリゴマーのそれぞれが、前記Lactobacillus、G.vaginalisまたはEggerthella標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズする、捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列をそれぞれ含み、
    該Lactobacillus特異的、G.vaginalis特異的およびEggerthella特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列のそれぞれが、前記固定化プローブに結合する前記配列または部分に共有結合されている、
    請求項90に記載の方法。
  92. 前記Lactobacillus特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列が、配列番号5の残基1〜12のヌクレオチド配列に実質的に対応し、
    前記G.vaginalis特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列が、配列番号11の残基1〜17のヌクレオチド配列に実質的に対応し、および/または
    前記Eggerthella特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列が、配列番号15の残基1〜21のヌクレオチド配列に実質的に対応する、
    請求項91に記載の方法。
  93. 前記Lactobacillus特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号5のヌクレオチド配列を有し、
    前記G.vaginalis特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号11のヌクレオチド配列を有し、および/または
    前記Eggerthella特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号15のヌクレオチド配列を有する、
    請求項92に記載の方法。
  94. 前記検出するステップ(3)が、
    前記1つまたは複数の増幅産物を、前記Lactobacillus sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のLactobacillus特異的検出プローブ、前記G.vaginalis標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のG.vaginalis特異的検出プローブ、および前記Eggerthella sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のEggerthella特異的検出プローブと接触させるステップ、ならびに
    標的にハイブリダイズした任意のLactobacillus特異的、G.vaginalis特異的および/またはEggerthella特異的検出プローブの存在または非存在を検出するステップ
    を含む、請求項76〜93のいずれかに記載の方法。
  95. 前記第1のLactobacillus特異的検出プローブが、配列番号9に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含み、
    前記第1のG.vaginalis特異的検出プローブが、配列番号14の残基1〜19に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含み、および/または
    前記第1のEggerthella特異的検出プローブが、配列番号18に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む、
    請求項94に記載の方法。
  96. 前記第1のLactobacillus特異的検出プローブが、配列番号9のヌクレオチド配列を有し;
    前記第1のG.vaginalis特異的検出プローブが、配列番号14のヌクレオチド配列を有し;および/または
    前記第1のEggerthella特異的検出プローブが、配列番号18のヌクレオチド配列を有する、
    請求項95に記載の方法。
  97. 前記検出するステップ(3)が、前記1つまたは複数の増幅産物を、前記Lactobacillus sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第2のLactobacillus特異的検出プローブと接触させるステップをさらに含み、前記第2のLactobacillus特異的検出プローブが、配列番号10の残基6〜21に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む、請求項95または96に記載の方法。
  98. 前記第2のLactobacillus特異的検出プローブが、配列番号10のヌクレオチド配列を有する、請求項97に記載の方法。
  99. 前記第1のLactobacillus特異的検出プローブ、前記第1のG.vaginalis特異的検出プローブおよび前記第1のEggerthella特異的検出プローブのそれぞれが標識を含む、請求項94または95に記載の方法。
  100. 前記第2のLactobacillus特異的検出プローブが標識を含む、請求項97に記載の方法。
  101. 前記標識が、化学発光標識または蛍光標識である、請求項99または100に記載の方法。
  102. 前記検出するステップ(3)が、前記増幅するステップ(2)の間に行われる、請求項99または100に記載の方法。
  103. 各検出プローブが、蛍光標識およびクエンチャーを含む、請求項102に記載の方法。
  104. 各検出プローブが、分子トーチ、分子ビーコン、またはTaqMan検出プローブである、請求項103に記載の方法。
  105. 前記第1のLactobacillus特異的検出プローブ、前記第1のG.vaginalis特異的検出プローブおよび前記第1のEggerthella特異的検出プローブの少なくとも1つが、標的にハイブリダイズしない配列をさらに含む、請求項94または95に記載の方法。
  106. 前記第1のLactobacillus特異的検出プローブ、前記第1のG.vaginalis特異的検出プローブおよび前記第1のEggerthella特異的検出プローブのそれぞれが、分子トーチまたは分子ビーコンである、請求項105に記載の方法。
  107. 前記第2のLactobacillus特異的検出プローブが、標的にハイブリダイズしない配列をさらに含む、請求項97に記載の方法。
  108. 前記第2のLactobacillus特異的検出プローブが、分子トーチまたは分子ビーコンである、請求項107に記載の方法。
  109. ステップ(2)での前記増幅反応が、等温増幅反応である、請求項76〜108のいずれか一項に記載の方法。
  110. 前記増幅反応が、転写媒介性増幅(TMA)反応である、請求項109に記載の方法。
  111. 前記増幅反応が、リアルタイム増幅反応である、請求項109または110に記載の方法。
  112. BVに関連する10以下の細菌属の検出を含む、請求項68〜111のいずれかに記載の方法。
  113. BVに関連する5以下の細菌属の検出を含む、請求項68〜111のいずれかに記載の方法。
  114. Lactobacillus、GardnerellaおよびEggerthella以外のBVに関連する細菌属の検出を含まない、請求項68〜111のいずれかに記載の方法。
  115. BVの存在が前記被験体において示された場合には、BVのための処置レジメンを該被験体に施すステップをさらに含む、請求項68〜114のいずれかに記載の方法。
  116. 該被験体におけるBVを監視するための方法であり、該被験体がステップ(a)の前にBVのための処置レジメンを受けている、請求項68〜114のいずれかに記載の方法。
  117. BVの存在が前記被験体において示された場合には、(i)BVのための前記処置レジメンを該被験体に施すステップまたは(ii)BVのための異なる処置レジメンを該被験体に施すステップのいずれかをさらに含む、請求項116に記載の方法。
  118. 試料中のLactobacillus sp.の存在または非存在を決定するための方法であって、
    (1)Lactobacillus sp.を含有することが疑われる試料を、Lactobacillus sp.標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーと接触させるステップであって、該第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、第1および第2のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列をそれぞれ含み、該第1および第2の増幅オリゴマーが、配列番号1の約91位のヌクレオチドから約265位のヌクレオチドの領域に対応するLactobacillus sp.16S rRNA領域を標的とする、ステップ;
    (2)in vitro核酸増幅反応を行うステップであって、任意のLactobacillus sp.標的核酸が、該試料中に存在する場合、該Lactobacillus sp.標的領域に対応する1つまたは複数の増幅産物を生成するための鋳型として使用される、ステップ;ならびに
    (3)該1つまたは複数の増幅産物の存在または非存在を検出し、それにより該試料中のLactobacillus sp.の存在または非存在を決定するステップ
    を含む方法。
  119. (i)前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45または配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、(ii)前記第2のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号6のヌクレオチド配列に実質的に対応する、請求項118に記載の方法。
  120. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、前記試料を、前記Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーとさらに接触させ、
    該第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、
    請求項118または119に記載の方法。
  121. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号7の残基28〜45もしくは配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列を含み;および/または前記第2のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号6のヌクレオチド配列を含む、請求項118または119に記載の方法。
  122. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、前記試料を、前記Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーとさらに接触させ、
    該第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列を含む、第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、
    請求項118、119または121に記載の方法。
  123. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号7の残基28〜45もしくは配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列からなり;および/または
    前記第2のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号6のヌクレオチド配列からなる、
    請求項118、119または121に記載の方法。
  124. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、前記試料を、前記Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーとさらに接触させ、
    該第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列からなる、第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、
    請求項118、119、121または123のいずれかに記載の方法。
  125. 前記第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマー、前記第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーが、前記第1のLactabacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである、請求項118〜124のいずれか一項に記載の方法。
  126. 前記第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、前記試料を、前記Lactobacillus sp.標的領域を増幅させるための第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーとさらに接触させ、
    該第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーであり、該第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含む、
    請求項118、119、121、123および125のいずれか一項に記載の方法。
  127. 前記第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、前記第3のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである、請求項120、122および124のいずれかに記載の方法。
  128. 前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、請求項125または127に記載の方法。
  129. 前記プロモーター配列が、配列番号7の残基1〜27のヌクレオチド配列を有する、請求項128に記載の方法。
  130. 前記第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号7のヌクレオチド配列を有する、
    請求項125に記載の方法。
  131. 前記第3のLactobacillus特異的増幅オリゴマーが、配列番号8のヌクレオチド配列を有する、請求項127に記載の方法。
  132. ステップ(2)の前に前記Lactobacillus標的核酸を、存在する場合、前記試料中の他の構成成分から精製するステップをさらに含む、請求項118〜131のいずれか一項に記載の方法。
  133. 前記精製するステップが、前記試料を、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合した、標的にハイブリダイズする配列を含む少なくとも1つの捕捉プローブオリゴマーと接触させるステップを含む、請求項132に記載の方法。
  134. 前記試料を、前記Lactobacillus標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズする、捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列を含むLactobacillus特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させ、該Lactobacillus特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列が、前記固定化プローブに結合する前記配列または部分に共有結合されている、請求項133に記載の方法。
  135. 前記Lactobacillus特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列が、配列番号5の残基1〜12のヌクレオチド配列に実質的に対応する、請求項134に記載の方法。
  136. 前記Lactobacillus特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号5のヌクレオチド配列を有する、
    請求項135に記載の方法。
  137. 前記検出するステップ(3)が、
    前記1つまたは複数の増幅産物を、前記Lactobacillus sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のLactobacillus特異的検出プローブと接触させるステップ、および
    標的にハイブリダイズした任意のLactobacillus特異的検出プローブの存在または非存在を検出するステップ
    を含む、請求項118〜136のいずれかに記載の方法。
  138. 前記第1のLactobacillus特異的検出プローブが、配列番号9に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む、請求項137に記載の方法。
  139. 前記第1のLactobacillus特異的検出プローブが、配列番号9のヌクレオチド配列を有する、請求項138に記載の方法。
  140. 前記検出するステップ(3)が、前記1つまたは複数の増幅産物を、前記Lactobacillus sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第2のLactobacillus特異的検出プローブと接触させるステップをさらに含み、前記第2のLactobacillus特異的検出プローブが、配列番号10の残基6〜21に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む、請求項138または139に記載の方法。
  141. 前記第2のLactobacillus特異的検出プローブが、配列番号10のヌクレオチド配列を有する、請求項140に記載の方法。
  142. 前記第1のLactobacillus特異的検出プローブが標識を含む、請求項137または138に記載の方法。
  143. 前記第2のLactobacillus特異的検出プローブが標識を含む、請求項140に記載の方法。
  144. 前記標識が、化学発光標識または蛍光標識である、請求項142または143に記載の方法。
  145. 前記検出するステップ(3)が、前記増幅するステップ(2)の間に行われる、請求項142または143に記載の方法。
  146. 各検出プローブが、蛍光標識およびクエンチャーを含む、請求項145に記載の方法。
  147. 各検出プローブが、分子トーチ、分子ビーコン、またはTaqMan検出プローブである、請求項146に記載の方法。
  148. 前記第1のLactobacillus特異的検出プローブが、標的にハイブリダイズしない配列をさらに含む、請求項137に記載の方法。
  149. 前記第1のLactobacillus特異的検出プローブが、分子トーチまたは分子ビーコンである、請求項137または138に記載の方法。
  150. 前記第2のLactobacillus特異的検出プローブが、標的にハイブリダイズしない配列をさらに含む、請求項140に記載の方法。
  151. 前記第2のLactobacillus特異的検出プローブが、分子トーチまたは分子ビーコンである、請求項140または150に記載の方法。
  152. 試料中のG.vaginalisの存在または非存在を決定するための方法であって、
    (1)G.vaginalisを含有することが疑われる試料を、G.vaginalis標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーと接触させるステップであって、該第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーが、第1および第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列をそれぞれ含み、該第1および第2の増幅オリゴマーが、配列番号3の約964位のヌクレオチドから約1036位のヌクレオチドの領域に対応するG.vaginalis 16S rRNA領域を標的とする、ステップ;
    (2)in vitro核酸増幅反応を行うステップであって、任意のG.vaginalis標的核酸が、該試料中に存在する場合、該G.vaginalis標的領域に対応する1つまたは複数の増幅産物を生成するための鋳型として使用される、ステップ;ならびに
    (3)該1つまたは複数の増幅産物の存在または非存在を検出し、それにより該試料中のG.vaginalisの存在または非存在を決定するステップ
    を含む方法。
  153. (i)前記第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応し、(ii)前記第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号12のヌクレオチド配列に実質的に対応する、請求項152に記載の方法。
  154. 前記第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列を含む;および/または
    前記第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号12のヌクレオチド配列を含む、請求項152または153に記載の方法。
  155. 前記第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列からなり;および/または
    前記第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号12のヌクレオチド配列からなる、請求項152〜154のいずれか一項に記載の方法。
  156. 前記第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーが、前記第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである、請求項152〜155のいずれか一項に記載の方法。
  157. 前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、請求項155に記載の方法。
  158. 前記プロモーター配列が、配列番号7の残基1〜27のヌクレオチド配列を有する、請求項156に記載の方法。
  159. 前記第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーが、配列番号13のヌクレオチド配列を有する、請求項155に記載の方法。
  160. ステップ(2)の前に前記G.vaginalis標的核酸を、存在する場合、前記試料中の他の構成成分から精製するステップをさらに含む、請求項152〜158のいずれか一項に記載の方法。
  161. 前記精製するステップが、前記試料を、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合した、標的にハイブリダイズする配列を含む少なくとも1つの捕捉プローブオリゴマーと接触させるステップを含む、請求項159に記載の方法。
  162. 前記試料を、前記G.vaginalis標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズする、捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列を含むG.vaginalis特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させ、該G.vaginalis特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列が、前記固定化プローブに結合する前記配列または部分に共有結合されている、請求項160に記載の方法。
  163. 前記G.vaginalis特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列が、配列番号11の残基1〜17のヌクレオチド配列に実質的に対応する、請求項161に記載の方法。
  164. 前記G.vaginalis特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号11のヌクレオチド配列を有する、請求項162に記載の方法。
  165. 前記検出するステップ(3)が、
    前記1つまたは複数の増幅産物を、前記G.vaginalis標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のG.vaginalis特異的検出プローブと接触させるステップ、および
    標的にハイブリダイズした任意のG.vaginalis特異的検出プローブの存在または非存在を検出するステップ
    を含む、請求項152〜163のいずれかに記載の方法。
  166. 前記第1のG.vaginalis特異的検出プローブが、配列番号14の残基1〜19に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む、請求項164に記載の方法。
  167. 前記第1のG.vaginalis特異的検出プローブが、配列番号14のヌクレオチド配列を有する、請求項165に記載の方法。
  168. 前記第1のG.vaginalis特異的検出プローブ検出プローブが標識を含む、請求項164または165に記載の方法。
  169. 前記標識が、化学発光標識または蛍光標識である、請求項167に記載の方法。
  170. 前記検出するステップ(3)が、前記増幅するステップ(2)の間に行われる、請求項167に記載の方法。
  171. 前記検出プローブが、蛍光標識およびクエンチャーを含む、請求項169に記載の方法。
  172. 前記検出プローブが、分子トーチ、分子ビーコン、またはTaqMan検出プローブである、請求項170に記載の方法。
  173. 前記第1のG.vaginalis特異的検出プローブが、標的にハイブリダイズしない配列をさらに含む、請求項164または165に記載の方法。
  174. 前記第1のG.vaginalis特異的検出プローブが、分子トーチまたは分子ビーコンである、請求項164または172に記載の方法。
  175. 試料中のEggerthella sp.の存在または非存在を決定するための方法であって、
    (1)Eggerthella sp.を含有することが疑われる試料を、Eggerthella sp.標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のEggerthella特異的増幅オリゴマーと接触させるステップであって、該第1および第2のEggerthella特異的増幅オリゴマーが、第1および第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列をそれぞれ含み、該第1および第2の増幅オリゴマーが、配列番号4の約165位のヌクレオチドから約259位のヌクレオチドの領域に対応するEggerthella sp.16S rRNA領域を標的とする、ステップ;
    (2)in vitro核酸増幅反応を行うステップであって、任意のEggerthella sp.標的核酸が、該試料中に存在する場合、該Eggerthella sp.標的領域に対応する1つまたは複数の増幅産物を生成するための鋳型として使用される、ステップ;ならびに
    (3)前記1つまたは複数の増幅産物の存在または非存在を検出し、それにより前記試料中のEggerthella sp.の存在または非存在を決定するステップ
    を含む方法。
  176. (i)前記第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列に実質的に対応し、(ii)前記第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列が、配列番号16のヌクレオチド配列に実質的に対応する、請求項174に記載の方法。
  177. 前記第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列を含み;および/または 前記第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号16のヌクレオチド配列を含む、
    請求項174または175に記載の方法。
  178. 前記第1のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号17の残基28〜51のヌクレオチド配列からなり;および/または
    前記第2のEggerthella特異的な標的にハイブリダイズする配列は、配列番号16のヌクレオチド配列からなる、
    請求項174〜176のいずれか一項に記載の方法。
  179. 前記第1のEggerthella特異的増幅オリゴマーが、前記それぞれの標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである、請求項174〜177のいずれか一項に記載の方法。
  180. 前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、請求項178に記載の方法。
  181. 前記プロモーター配列が、配列番号7の残基1〜27のヌクレオチド配列を有する、請求項179に記載の方法。
  182. 前記第1のEggerthella特異的増幅オリゴマーが、配列番号17のヌクレオチド配列を有する、請求項178に記載の方法。
  183. ステップ(2)の前に前記Eggerthella標的核酸を、存在する場合、前記試料中の他の構成成分から精製するステップをさらに含む、請求項174〜181のいずれか一項に記載の方法。
  184. 前記精製するステップが、前記試料を、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合した、標的にハイブリダイズする配列を含む少なくとも1つの捕捉プローブオリゴマーと接触させるステップを含む、請求項182に記載の方法。
  185. 前記試料を、前記Eggerthella標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズする、捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列を含むEggerthella特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させ、該Eggerthella特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列が、前記固定化プローブに結合する前記配列または部分に共有結合されている、請求項183に記載の方法。
  186. 前記Eggerthella特異的捕捉プローブの標的にハイブリダイズする配列が、配列番号15の残基1〜21のヌクレオチド配列に実質的に対応する、請求項184に記載の方法。
  187. 前記Eggerthella特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号15のヌクレオチド配列を有する、請求項185に記載の方法。
  188. 前記検出するステップ(3)が、
    前記1つまたは複数の増幅産物を、前記Eggerthella sp.標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のEggerthella特異的検出プローブと接触させるステップ、および
    標的にハイブリダイズした任意のEggerthella特異的検出プローブの存在または非存在を検出するステップ
    を含む、請求項174〜186のいずれかに記載の方法。
  189. 前記第1のEggerthella特異的検出プローブが、配列番号18に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む、請求項187に記載の方法。
  190. 前記第1のEggerthella特異的検出プローブが、配列番号18のヌクレオチド配列を有する、請求項188に記載の方法。
  191. 前記第1のEggerthella特異的検出プローブが標識を含む、請求項187または188に記載の方法。
  192. 前記標識が、化学発光標識または蛍光標識である、請求項190に記載の方法。
  193. 前記検出するステップ(3)が、前記増幅するステップ(2)の間に行われる、請求項190に記載の方法。
  194. 前記検出プローブが、蛍光標識およびクエンチャーを含む、請求項192に記載の方法。
  195. 前記検出プローブが、分子トーチ、分子ビーコン、またはTaqMan検出プローブである、請求項193に記載の方法。
  196. 前記第1のEggerthella特異的検出プローブが、標的にハイブリダイズしない配列をさらに含む、請求項187に記載の方法。
  197. 前記第1のEggerthella特異的検出プローブが、分子トーチまたは分子ビーコンである、請求項187または195に記載の方法。
  198. ステップ(2)での前記増幅反応が、等温増幅反応である、請求項118〜196のいずれか一項に記載の方法。
  199. 前記増幅反応が、転写媒介性増幅(TMA)反応である、請求項197に記載の方法。
  200. 前記増幅反応が、リアルタイム増幅反応である、請求項197または198に記載の方法。
  201. 試料中のLactobacillus sp.およびG.vaginalisのそれぞれについての存在または非存在を決定するための多重方法であって、
    (1)Lactobacillus sp.およびG.vaginalisの少なくとも一方を含有することが疑われる試料を、
    (a)Lactobacillus sp.標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーであって、(i)該第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列または配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)該第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号6のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマー;ならびに
    (b)G.vaginalis標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーであって、(i)該第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)該第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号12のヌクレオチド配列に実質的に対応する第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマー
    と、接触させるステップ;
    (2)in vitro核酸増幅反応を行うステップであって、任意のLactobacillus sp.およびG.vaginalis標的核酸が、該試料中に存在する場合、該Lactobacillus sp.およびG.vaginalis標的領域に対応する1つまたは複数の増幅産物を生成するための鋳型として使用される、ステップ;ならびに
    (3)該1つまたは複数の増幅産物の存在または非存在を検出し、それにより該試料中のLactobacillus sp.およびG.vaginalisの存在または非存在を決定するステップ
    を含む方法。
  202. Lactobacillus sp.が前記試料中で検出されず、G.vaginalisが該試料中で検出される、請求項200に記載の方法。
  203. G.vaginalisが、前記試料中で1.4×1010コピー/mLより多く検出される、請求項200に記載の方法。
  204. 試料中のLactobacillus sp.およびG.vaginalisのそれぞれについての存在または非存在を決定するためのオリゴマーの組合せであって、
    (a)Lactobacillus sp.標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーであって、(i)該第1のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号7の残基28〜45のヌクレオチド配列または配列番号8の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)該第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマーは、配列番号6のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のLactobacillus特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のLactobacillus特異的増幅オリゴマー;ならびに
    (b)G.vaginalis標的核酸の標的領域を増幅させるための第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーであって、(i)該第1のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号13の残基28〜45のヌクレオチド配列に実質的に対応する第1のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列を含み、(ii)該第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマーは、配列番号12のヌクレオチド配列に実質的に対応する第2のG.vaginalis特異的な標的にハイブリダイズする配列を含む、第1および第2のG.vaginalis特異的増幅オリゴマー
    を含む、オリゴマーの組合せ。
  205. 被験体における細菌性膣炎(BV)の存在または非存在を決定するための方法であって、
    (a)BVを有することが疑われる被験体からの試料を用意するステップ;
    (b)該試料中のLactobacillus sp.およびG.vaginalisの検出のためのアッセイを行うステップ;
    (c)Lactobacillus sp.およびG.vaginalisのそれぞれに陽性または陰性のいずれかのステータスを該検出アッセイに基づいて割り当てるステップ;ならびに
    (d)ステップ(c)からの該割り当てられたLactobacillus sp.ステータスおよびG.vaginalisステータスの組合せに基づいて該被験体におけるBVの存在または非存在を決定するステップであって、
    (i)G.vaginalisについて陰性のステータスが、該被験体におけるBVの非存在を示し、
    (ii)G.vaginalisのステータスが陽性である場合には、Lactobacillus sp.について陽性のステータスが該被験体におけるBVの非存在を示し、Lactobacillus sp.について陰性のステータスが該被験体におけるBVの存在を示す、ステップ
    を含む方法。
  206. Lactobacillus sp.標的核酸に特異的にハイブリダイズする第1の検出プローブ、および
    G.vaginalis標的核酸に特異的にハイブリダイズする第2の検出プローブ
    を含む組成物であって、
    該第1および第2の検出プローブの少なくとも一方が標識を含み、
    (i)いずれの真菌種からの標的核酸に特異的にハイブリダイズする検出プローブも含まず、(ii)Lactobacillus sp.またはG.vaginalis以外のいずれの細菌種からの標的核酸に特異的にハイブリダイズする検出プローブも含まない、組成物。
  207. Lactobacillus sp.標的核酸に特異的にハイブリダイズする第1の検出プローブ、および
    G.vaginalis標的核酸に特異的にハイブリダイズする第2の検出プローブ
    を含むキットであって、
    該第1および第2の検出プローブの少なくとも一方が標識を含み、
    (i)いずれの真菌種からの標的核酸に特異的にハイブリダイズする検出プローブも含まず、(ii)Lactobacillus sp.またはG.vaginalis以外のいずれの細菌種からの標的核酸に特異的にハイブリダイズする検出プローブも含まない、キット。
  208. 前記第1の検出プローブが、L.gasseri標的核酸、L.crispatus標的核酸およびL.jensenii標的核酸の少なくとも1つに特異的にハイブリダイズする、請求項205に記載の組成物または請求項206に記載のキット。
  209. 前記第1の検出プローブが、配列番号1の約91位のヌクレオチドから約265位のヌクレオチドの領域に対応するLactobacillus sp.16S rRNA領域を標的とし、および/または
    前記第2の検出プローブが、配列番号3の約964位のヌクレオチドから約1036位のヌクレオチドの領域に対応するG.vaginalis 16S rRNA領域を標的とする、
    請求項205に記載の組成物または請求項206に記載のキット。
  210. 前記第1の検出プローブが、配列番号9に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含み、および/または
    前記第2の検出プローブが、配列番号14の残基1〜19に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む、
    請求項205に記載の組成物または請求項206に記載のキット。
  211. 前記第1の検出プローブが、配列番号9のヌクレオチド配列を有し、および/または
    前記第2の検出プローブが、配列番号14のヌクレオチド配列を有する、
    請求項205に記載の組成物または請求項206に記載のキット。
  212. 前記Lactobacillus sp.標的核酸に特異的にハイブリダイズする第3の検出プローブをさらに含み、該第3の検出プローブが、配列番号10の残基6〜21に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする配列を含む、請求項209または210に記載の組成物またはキット。
  213. 前記第3の検出プローブが、配列番号10のヌクレオチド配列を有する、請求項211に記載の組成物またはキット。
JP2017549041A 2015-03-16 2016-03-16 細菌核酸を検出し細菌性膣炎を診断するための方法および組成物 Active JP6796593B2 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020190284A JP6970268B2 (ja) 2015-03-16 2020-11-16 細菌核酸を検出し細菌性膣炎を診断するための方法および組成物
JP2021176198A JP2022025106A (ja) 2015-03-16 2021-10-28 細菌核酸を検出し細菌性膣炎を診断するための方法および組成物

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562133881P 2015-03-16 2015-03-16
US62/133,881 2015-03-16
US201562168405P 2015-05-29 2015-05-29
US201562168688P 2015-05-29 2015-05-29
US62/168,688 2015-05-29
US62/168,405 2015-05-29
PCT/US2016/022628 WO2016149357A1 (en) 2015-03-16 2016-03-16 Methods and compositions for detecting bacterial nucleic acid and diagnosing bacterial vaginosis

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020190284A Division JP6970268B2 (ja) 2015-03-16 2020-11-16 細菌核酸を検出し細菌性膣炎を診断するための方法および組成物

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2018508225A true JP2018508225A (ja) 2018-03-29
JP2018508225A5 JP2018508225A5 (ja) 2019-04-11
JP6796593B2 JP6796593B2 (ja) 2020-12-09

Family

ID=56919495

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017549041A Active JP6796593B2 (ja) 2015-03-16 2016-03-16 細菌核酸を検出し細菌性膣炎を診断するための方法および組成物
JP2020190284A Active JP6970268B2 (ja) 2015-03-16 2020-11-16 細菌核酸を検出し細菌性膣炎を診断するための方法および組成物
JP2021176198A Pending JP2022025106A (ja) 2015-03-16 2021-10-28 細菌核酸を検出し細菌性膣炎を診断するための方法および組成物

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020190284A Active JP6970268B2 (ja) 2015-03-16 2020-11-16 細菌核酸を検出し細菌性膣炎を診断するための方法および組成物
JP2021176198A Pending JP2022025106A (ja) 2015-03-16 2021-10-28 細菌核酸を検出し細菌性膣炎を診断するための方法および組成物

Country Status (7)

Country Link
US (3) US10550438B2 (ja)
EP (2) EP3271484B1 (ja)
JP (3) JP6796593B2 (ja)
CN (1) CN107429297A (ja)
AU (2) AU2016233298B2 (ja)
CA (1) CA2977821A1 (ja)
WO (1) WO2016149357A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020166708A1 (ja) * 2019-02-15 2020-08-20 コンビ株式会社 新規乳酸菌およびそれを含有する組成物
JP2021534764A (ja) * 2018-08-24 2021-12-16 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 細菌の核酸を検出し、細菌性膣炎を診断するための組成物および方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6796593B2 (ja) * 2015-03-16 2020-12-09 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 細菌核酸を検出し細菌性膣炎を診断するための方法および組成物
CN112384611B (zh) * 2018-05-23 2024-01-09 Ko生物技术有限公司 卷曲乳杆菌kbl693菌株及其用途
US20220047653A1 (en) * 2018-08-10 2022-02-17 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating and preventing inflammatory diseases
CN110283921A (zh) * 2019-07-12 2019-09-27 中生方政生物技术股份有限公司 加德纳杆菌、白色念珠菌双重检测的引物、探针组、试剂盒及检测方法
US20220205020A1 (en) * 2020-12-30 2022-06-30 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for detection of bacteria and fungi associated with bacterial and candida vaginosis
EP4289964A4 (en) 2022-04-18 2024-10-09 Beijing Originpoly Bio Tec Co Ltd PRIMER-PROBE COMBINATION AND KIT FOR VAGINAL MICROECOSYSTEM DETECTION
CN114480694B (zh) * 2022-04-18 2022-06-17 北京起源聚禾生物科技有限公司 阴道微生态检测引物探针组合及试剂盒
WO2024006762A1 (en) * 2022-06-27 2024-01-04 The Uab Research Foundation Nucleic acid probes and their uses for the detection of prevotella bivia

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013036928A1 (en) * 2011-09-08 2013-03-14 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bv-associated bacterial nucleic acid
JP2014528698A (ja) * 2011-07-15 2014-10-30 ジェン−プロウブ インコーポレイテッド シングルプレックス又はマルチプレックスアッセイにおいてヒトパルボウイルス核酸を検出及びa型肝炎ウイルス核酸を検出するための組成物及び方法

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2422956A1 (fr) 1978-04-13 1979-11-09 Pasteur Institut Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede
US4786600A (en) 1984-05-25 1988-11-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Autocatalytic replication of recombinant RNA
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4868105A (en) 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
DE3785658T2 (de) 1986-08-11 1993-08-12 Siska Diagnostics Inc Methoden und zusammensetzungen fuer tests mit nukleinsaeuresonden.
US5541308A (en) 1986-11-24 1996-07-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms
IL86724A (en) 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
CA1340843C (en) 1987-07-31 1999-12-07 J. Lawrence Burg Selective amplification of target polynucleotide sequences
EP0638807B1 (en) 1987-09-21 2002-07-17 Gen-Probe Incorporated Protection assay
US5283174A (en) 1987-09-21 1994-02-01 Gen-Probe, Incorporated Homogenous protection assay
US5639604A (en) 1987-09-21 1997-06-17 Gen-Probe Incorporated Homogeneous protection assay
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5124246A (en) 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
US5118801A (en) 1988-09-30 1992-06-02 The Public Health Research Institute Nucleic acid process containing improved molecular switch
US5656207A (en) 1989-06-24 1997-08-12 Gen Probe Incorporated Detecting or quantifying multiple analytes using labelling techniques
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
US5427930A (en) 1990-01-26 1995-06-27 Abbott Laboratories Amplification of target nucleic acids using gap filling ligase chain reaction
US5516663A (en) 1990-01-26 1996-05-14 Abbott Laboratories Ligase chain reaction with endonuclease IV correction and contamination control
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5849481A (en) 1990-07-27 1998-12-15 Chiron Corporation Nucleic acid hybridization assays employing large comb-type branched polynucleotides
US5846717A (en) 1996-01-24 1998-12-08 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage
DE69233599T2 (de) 1991-12-24 2006-12-14 Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad Unterbrochene 2'-modifizierte Oligonukleotide
US5424413A (en) 1992-01-22 1995-06-13 Gen-Probe Incorporated Branched nucleic acid probes
WO1993022461A1 (en) 1992-05-06 1993-11-11 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit
US5614402A (en) 1992-12-07 1997-03-25 Third Wave Technologies, Inc. 5' nucleases derived from thermostable DNA polymerase
US5422252A (en) 1993-06-04 1995-06-06 Becton, Dickinson And Company Simultaneous amplification of multiple targets
AU689789B2 (en) 1993-07-23 1998-04-09 Gen-Probe Incorporated Methods for enhancing nucleic acid amplification
US5925517A (en) 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5648211A (en) 1994-04-18 1997-07-15 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification using thermophilic enzymes
US5547861A (en) 1994-04-18 1996-08-20 Becton, Dickinson And Company Detection of nucleic acid amplification
JPH10500310A (ja) 1994-05-19 1998-01-13 ダコ アクティーゼルスカブ 淋菌及びトラコーマ クラミジアの検出のためのpna プローブ
DE69535240T2 (de) 1994-10-28 2007-06-06 Gen-Probe Inc., San Diego Zusammensetzungen und Verfahren für die gleichzeitige Detektion und Quantifizierung von einer Mehrheit spezifischer Nuklein Säure Sequenzen
US6218529B1 (en) * 1995-07-31 2001-04-17 Urocor, Inc. Biomarkers and targets for diagnosis, prognosis and management of prostate, breast and bladder cancer
US6706471B1 (en) 1996-01-24 2004-03-16 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage
AU713667B2 (en) 1996-04-12 1999-12-09 Phri Properties, Inc. Detection probes, kits and assays
US6534273B2 (en) 1997-05-02 2003-03-18 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
WO1998050583A1 (en) 1997-05-02 1998-11-12 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
US6180340B1 (en) 1997-10-31 2001-01-30 Gen-Probe Incorporated Extended dynamic range assays
US6949367B1 (en) 1998-04-03 2005-09-27 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for mismatch discrimination
US6361945B1 (en) 1998-07-02 2002-03-26 Gen-Probe Incorporated Molecular torches
US7829079B2 (en) 2002-03-28 2010-11-09 Christian Hansen A/S Lactobacillus iners for the enhancement of urogenital health
US20040022764A1 (en) * 2002-07-31 2004-02-05 Hanan Polansky Inhibition of microcompetition with a foreign polynucleotide as treatment of chronic disease
DK1778867T3 (da) 2004-07-01 2010-08-02 Gen Probe Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til detektering af nucleinsyrer i en biologisk prøve
DE602005026730D1 (de) 2004-08-27 2011-04-14 Gen Probe Inc Einfach-Primernukleinsäuren-Erweiterungsverfahren
US7627437B2 (en) 2005-01-14 2009-12-01 Idaho Research Foundation Categorization of microbial communities
WO2006093892A2 (en) 2005-02-28 2006-09-08 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods of detecting an analyte by using a nucleic acid hybridization switch probe
US7625704B2 (en) 2005-08-31 2009-12-01 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions for identifying bacteria associated with bacteria vaginosis
US9051601B2 (en) 2006-08-01 2015-06-09 Gen-Probe Incorporated Methods of nonspecific target capture of nucleic acids
FR2909099B1 (fr) 2006-11-24 2012-10-19 Univ Aix Marseille Ii Methode de diagnostic et de suivi d'une vaginose bacterienne par quantification moleculaire.
US20110151462A1 (en) 2007-09-10 2011-06-23 Katherine Tynan Bacterial vaginosis apparatus and diagnostic methods
EP4276190A3 (en) * 2009-12-03 2023-12-27 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for the diagnosis of bacterial vaginosis
WO2011103274A1 (en) * 2010-02-17 2011-08-25 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect atopobium vaginae nucleic acid
EP2702166B1 (en) * 2011-04-25 2018-06-06 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bv-associated bacterial nucleic acid
US9970060B2 (en) * 2011-11-23 2018-05-15 Medical Diagnostic Laboratories, Llc Quantitation and profiling of vaginal microflora
US9057111B2 (en) 2012-02-20 2015-06-16 Laboratory Corporation Of America Holdings Diagnostic methods and markers for bacterial vaginosis
JP6796593B2 (ja) * 2015-03-16 2020-12-09 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 細菌核酸を検出し細菌性膣炎を診断するための方法および組成物
JP7389111B2 (ja) * 2018-08-24 2023-11-29 ジェン-プローブ・インコーポレーテッド 細菌の核酸を検出し、細菌性膣炎を診断するための組成物および方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014528698A (ja) * 2011-07-15 2014-10-30 ジェン−プロウブ インコーポレイテッド シングルプレックス又はマルチプレックスアッセイにおいてヒトパルボウイルス核酸を検出及びa型肝炎ウイルス核酸を検出するための組成物及び方法
WO2013036928A1 (en) * 2011-09-08 2013-03-14 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bv-associated bacterial nucleic acid

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PLOS ONE, vol. 6, no. 9, JPN6020000532, 2011, pages 25082 - 1, ISSN: 0004190655 *
PLOS ONE, vol. 8, no. 10, JPN6020000533, 4 October 2013 (2013-10-04), pages 76589 - 1, ISSN: 0004190656 *
PLOS ONE, vol. 8, no. 4, JPN6020000531, 9 April 2013 (2013-04-09), pages 60670 - 1, ISSN: 0004190654 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021534764A (ja) * 2018-08-24 2021-12-16 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 細菌の核酸を検出し、細菌性膣炎を診断するための組成物および方法
JP7389111B2 (ja) 2018-08-24 2023-11-29 ジェン-プローブ・インコーポレーテッド 細菌の核酸を検出し、細菌性膣炎を診断するための組成物および方法
WO2020166708A1 (ja) * 2019-02-15 2020-08-20 コンビ株式会社 新規乳酸菌およびそれを含有する組成物
JPWO2020166708A1 (ja) * 2019-02-15 2021-12-16 コンビ株式会社 新規乳酸菌およびそれを含有する組成物

Also Published As

Publication number Publication date
US20180291430A1 (en) 2018-10-11
EP3910075A1 (en) 2021-11-17
US10550438B2 (en) 2020-02-04
EP3271484A4 (en) 2018-11-14
US11268156B2 (en) 2022-03-08
EP3271484B1 (en) 2021-06-02
US20210277451A1 (en) 2021-09-09
JP6796593B2 (ja) 2020-12-09
JP6970268B2 (ja) 2021-11-24
CA2977821A1 (en) 2016-09-22
AU2016233298B2 (en) 2021-09-02
JP2022025106A (ja) 2022-02-09
WO2016149357A1 (en) 2016-09-22
AU2016233298A1 (en) 2017-09-14
US12031187B2 (en) 2024-07-09
CN107429297A (zh) 2017-12-01
EP3271484A1 (en) 2018-01-24
US20200109444A1 (en) 2020-04-09
AU2021277704A1 (en) 2021-12-23
AU2021277704B2 (en) 2022-04-28
JP2021035391A (ja) 2021-03-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6970268B2 (ja) 細菌核酸を検出し細菌性膣炎を診断するための方法および組成物
US11884957B2 (en) Methods for diagnosing bacterial vaginosis
JP7292217B2 (ja) 試料中のバベシア種の核酸の検出
JP2023171960A (ja) 細菌の核酸を検出し、細菌性膣炎を診断するための組成物および方法
JP2019501652A (ja) Candida種を検出するための方法及び組成物
JP2008508875A (ja) opa遺伝子の5’非翻訳領域を用いたナイセリア・ゴノレアの検出法

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190226

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20190226

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20191213

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20200110

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20200407

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200525

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20201016

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20201116

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6796593

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250