JPH09224681A - タンパク質融合による切頭型耐熱性ｄｎａポリメラーゼの過発現及び精製 - Google Patents
タンパク質融合による切頭型耐熱性ｄｎａポリメラーゼの過発現及び精製Info
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- JPH09224681A JPH09224681A JP8205125A JP20512596A JPH09224681A JP H09224681 A JPH09224681 A JP H09224681A JP 8205125 A JP8205125 A JP 8205125A JP 20512596 A JP20512596 A JP 20512596A JP H09224681 A JPH09224681 A JP H09224681A
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- polymerase
- bst
- dna polymerase
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Abstract
(57)【要約】
【課題】 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのクロ
ーニング及び精製。 【解決手段】 ＤＮＡ組み換え及びタンパク質融合技術
を用いてＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼから３′→５′エ
キソヌクレアーゼ活性を除去することによって、耐熱性
の切頭型Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを得る。
ｏｐｈｉｌｕｓ由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのクロ
ーニング及び精製。 【解決手段】 ＤＮＡ組み換え及びタンパク質融合技術
を用いてＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼから３′→５′エ
キソヌクレアーゼ活性を除去することによって、耐熱性
の切頭型Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを得る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、耐熱性Ｂｓｔ Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩ、及び切頭型（ｔｒｕｎｃａｔｅ
ｄ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを組換えＤＮＡ技術やタ
ンパク質融合技術を用いて商業的に有用な量製造する方
法に関する。
ＮＡポリメラーゼＩ、及び切頭型（ｔｒｕｎｃａｔｅ
ｄ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを組換えＤＮＡ技術やタ
ンパク質融合技術を用いて商業的に有用な量製造する方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡは大半の生物の遺伝物質である。
ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡの複製や修復に関与する酵
素である。細菌、酵母及びヒトを含む種々の生物に由来
するＤＮＡポリメラーゼの単離や特性分析に関しては広
範な研究が行われている。
ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡの複製や修復に関与する酵
素である。細菌、酵母及びヒトを含む種々の生物に由来
するＤＮＡポリメラーゼの単離や特性分析に関しては広
範な研究が行われている。
【０００３】ＤＮＡポリメラーゼは、基本的な重合機能
の他に、そのポリペプチドのＮ末端ドメインに５’→
３’又は３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を含み得
る。両方のエキソヌクレアーゼが存在する場合、５’→
３’エキソヌクレアーゼドメインがＮ末端に存在し、そ
の次に３’→５’エキソヌクレアーゼドメイン及びＣ末
端ポリメラーゼドメインが来る。ニックトランスレーシ
ョンや修復のためには、進行する（ａｄｖａｎｃｉｎ
ｇ）ＤＮＡポリメラーゼの経路内にあるＤＮＡを５’→
３’方向に切り出しする５’→３’エキソヌクレアーゼ
が必要である。ミスマッチのヌクレオチドを３’→５’
方向に切り出しして正しく修復するには３’→５’エキ
ソヌクレアーゼ活性が必要である。配列の比較により３
種の３’→５’エキソヌクレアーゼ（Ｅｘｏ Ｉ、Ｉ
Ｉ、ＩＩＩ）が同定された（Ｂｌａｎｃｏ等，（１９９
１）Ｇｅｎｅ， １００， ２７−３８）。
の他に、そのポリペプチドのＮ末端ドメインに５’→
３’又は３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を含み得
る。両方のエキソヌクレアーゼが存在する場合、５’→
３’エキソヌクレアーゼドメインがＮ末端に存在し、そ
の次に３’→５’エキソヌクレアーゼドメイン及びＣ末
端ポリメラーゼドメインが来る。ニックトランスレーシ
ョンや修復のためには、進行する（ａｄｖａｎｃｉｎ
ｇ）ＤＮＡポリメラーゼの経路内にあるＤＮＡを５’→
３’方向に切り出しする５’→３’エキソヌクレアーゼ
が必要である。ミスマッチのヌクレオチドを３’→５’
方向に切り出しして正しく修復するには３’→５’エキ
ソヌクレアーゼ活性が必要である。配列の比較により３
種の３’→５’エキソヌクレアーゼ（Ｅｘｏ Ｉ、Ｉ
Ｉ、ＩＩＩ）が同定された（Ｂｌａｎｃｏ等，（１９９
１）Ｇｅｎｅ， １００， ２７−３８）。
【０００４】耐熱性真正細菌や耐熱性古細菌から幾つか
の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが単離された。これらのポ
リメラーゼは、その耐熱性を基準にして３つのグループ
に分けることができる。高度好熱菌から単離されたＤＮ
Ａポリメラーゼは１００℃で安定である。例えば、Ｔｈ
ｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＶｅ
ｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼは１００℃で２時
間の半減期を有し、このことは１００℃で２時間インキ
ュベートした後に、Ｖｅｎｔポリメラーゼの重合活性の
半分が保持されることを意味している（Ｋｏｎｇ等，
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１９６５−１
９７５（１９９３），同文献の内容は参考として本明細
書の一部を構成するものとする）。超耐熱性のＴｈｅｒ
ｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓから単離されたＴａｑ ＤＮ
Ａポリメラーゼは９５℃で１．６時間の半減期を有する
（Ｋｏｎｇ等，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，上掲
（１９９３），同文献の内容は参考として本明細書の一
部を構成するものとする）。Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラー
ゼＩは第３のグループである中度好熱菌に属し、６５℃
で安定である。
の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが単離された。これらのポ
リメラーゼは、その耐熱性を基準にして３つのグループ
に分けることができる。高度好熱菌から単離されたＤＮ
Ａポリメラーゼは１００℃で安定である。例えば、Ｔｈ
ｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＶｅ
ｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼは１００℃で２時
間の半減期を有し、このことは１００℃で２時間インキ
ュベートした後に、Ｖｅｎｔポリメラーゼの重合活性の
半分が保持されることを意味している（Ｋｏｎｇ等，
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１９６５−１
９７５（１９９３），同文献の内容は参考として本明細
書の一部を構成するものとする）。超耐熱性のＴｈｅｒ
ｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓから単離されたＴａｑ ＤＮ
Ａポリメラーゼは９５℃で１．６時間の半減期を有する
（Ｋｏｎｇ等，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，上掲
（１９９３），同文献の内容は参考として本明細書の一
部を構成するものとする）。Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラー
ゼＩは第３のグループである中度好熱菌に属し、６５℃
で安定である。
【０００５】Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼは最初Ｓｔｅ
ｎｅｓｈ及びＲｏｅ（Ｓｔｅｎｅｓｈ及びＲｏｅ Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ２７２：
１５６−６（１９７２））によって単離され、Ｋａｂｏ
ｅｖ等（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １４５：２１
−６（１９８１））は更にＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ
を精製し、このポリメラーゼが分子量７６ｋＤａで、
５’→３’及び３’→５’の両方のエキソヌクレアーゼ
活性を有すると結論付けた（上記文献の内容は参考とし
て本明細書の一部を構成するものとする）。ポリメラー
ゼに対するエキソヌクレアーゼの相対活性は非常に低
く、Ｋａｂｏｅｖはそれが汚染によるものであり得ると
コメントとした。Ｓｅｌｌｍａｎ等（Ｓｅｌｌｍａｎｎ
等，Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４：４３５０−
４３５５（１９９２），同文献の内容は参考として本明
細書の一部を構成するものとする）は、エキソヌクレア
ーゼ活性を持たない９５ｋＤａのＢｓｔ ＤＮＡポリメ
ラーゼを精製した。Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼはクロ
ーニングされたように思えるが（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＴ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙのカタログ）、クローニング手順や
配列情報に関する刊行物は入手できない。Ｅｐｉｃｅｎ
ｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓは、５’→３’及び
３’→５’の両方のエキソヌクレアーゼ活性がｒＢｓｔ
ＤＮＡポリメラーゼ中に存在すると報告している。
ｎｅｓｈ及びＲｏｅ（Ｓｔｅｎｅｓｈ及びＲｏｅ Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ２７２：
１５６−６（１９７２））によって単離され、Ｋａｂｏ
ｅｖ等（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １４５：２１
−６（１９８１））は更にＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ
を精製し、このポリメラーゼが分子量７６ｋＤａで、
５’→３’及び３’→５’の両方のエキソヌクレアーゼ
活性を有すると結論付けた（上記文献の内容は参考とし
て本明細書の一部を構成するものとする）。ポリメラー
ゼに対するエキソヌクレアーゼの相対活性は非常に低
く、Ｋａｂｏｅｖはそれが汚染によるものであり得ると
コメントとした。Ｓｅｌｌｍａｎ等（Ｓｅｌｌｍａｎｎ
等，Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４：４３５０−
４３５５（１９９２），同文献の内容は参考として本明
細書の一部を構成するものとする）は、エキソヌクレア
ーゼ活性を持たない９５ｋＤａのＢｓｔ ＤＮＡポリメ
ラーゼを精製した。Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼはクロ
ーニングされたように思えるが（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＴ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙのカタログ）、クローニング手順や
配列情報に関する刊行物は入手できない。Ｅｐｉｃｅｎ
ｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓは、５’→３’及び
３’→５’の両方のエキソヌクレアーゼ活性がｒＢｓｔ
ＤＮＡポリメラーゼ中に存在すると報告している。
【０００６】耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは分子生物学や
医薬研究で非常に有用である。例えば、Ｔａｑ ＤＮＡ
ポリメラーゼの耐熱性は、ＤＮＡ増幅（Ｌａｗｙｅｒ，
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６４：６４２７−
６４３７（１９８９），同文献の内容は参考として本明
細書の一部を構成するものとする）のためのポリメラー
ゼ連鎖反応法（米国特許第４，６８３，１９５号、第
４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号）の
収率、特異性、自動化及び有用性に大きく寄与した。他
の具体例は、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの大断片（Ｂ
ｓｔ Ｌ．Ｆ．）のＤＮＡ配列決定のための使用である
（Ｙｅ， Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｓｉｎｉｃａ， ３０：
５０３−５０６（１９８７）；ＭｃＣｌａｒｙ， ＤＮ
Ａ ＳＥＱ． １：１７３−１８０（１９９１）、同文
献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものと
する）。耐熱性Ｂｓｔポリメラーゼを用いることによ
り、配列決定反応を高温（６５℃）で行って二次構造を
壊し、オートラジオグラム上で均一なバンド強さと低い
バックグラウンドを得ることができる。Ｂｓｔ Ｌ．
Ｆ．は、Ｂｅｃｔｏｎ ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＧ． Ｔ
ｅｒｒａｎｃｅ Ｗａｌｋｅｒ等によって開発された等
温指数的ＤＮＡ増幅技術である鎖置換増幅法（Ｓｔｒａ
ｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）でも使用され得る。例えば、Ｗａ
ｌｋｅｒ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ８９：３９２−３９６（１９９２）（同文献
の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとす
る）を参照されたい。
医薬研究で非常に有用である。例えば、Ｔａｑ ＤＮＡ
ポリメラーゼの耐熱性は、ＤＮＡ増幅（Ｌａｗｙｅｒ，
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６４：６４２７−
６４３７（１９８９），同文献の内容は参考として本明
細書の一部を構成するものとする）のためのポリメラー
ゼ連鎖反応法（米国特許第４，６８３，１９５号、第
４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号）の
収率、特異性、自動化及び有用性に大きく寄与した。他
の具体例は、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの大断片（Ｂ
ｓｔ Ｌ．Ｆ．）のＤＮＡ配列決定のための使用である
（Ｙｅ， Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｓｉｎｉｃａ， ３０：
５０３−５０６（１９８７）；ＭｃＣｌａｒｙ， ＤＮ
Ａ ＳＥＱ． １：１７３−１８０（１９９１）、同文
献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものと
する）。耐熱性Ｂｓｔポリメラーゼを用いることによ
り、配列決定反応を高温（６５℃）で行って二次構造を
壊し、オートラジオグラム上で均一なバンド強さと低い
バックグラウンドを得ることができる。Ｂｓｔ Ｌ．
Ｆ．は、Ｂｅｃｔｏｎ ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＧ． Ｔ
ｅｒｒａｎｃｅ Ｗａｌｋｅｒ等によって開発された等
温指数的ＤＮＡ増幅技術である鎖置換増幅法（Ｓｔｒａ
ｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）でも使用され得る。例えば、Ｗａ
ｌｋｅｒ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ８９：３９２−３９６（１９９２）（同文献
の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとす
る）を参照されたい。
【０００７】Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ドメ
インをズブチリシン（プロテイナーゼ）による部分消化
によって重合ドメインから分離して、Ｅ． ｃｏｌｉ
Ｐｏｌ Ｉのクレノー断片に類似する７５ｋＤａ ＤＮ
Ａポリメラーゼドメイン（「大断片」と称する）を産生
することができる（Ｙｅ， Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｓｉｎ
ｉｃａ， 上掲（１９８７）、同文献の内容は参考とし
て本明細書の一部を構成するものとする）。ズブチリシ
ンを使用してＢｓｔ Ｌ．Ｆ．を産生することができる
が、ズブチリシンによってＢｓｔポリメラーゼが非特異
的分解を起こすため、その有効性は低い。
インをズブチリシン（プロテイナーゼ）による部分消化
によって重合ドメインから分離して、Ｅ． ｃｏｌｉ
Ｐｏｌ Ｉのクレノー断片に類似する７５ｋＤａ ＤＮ
Ａポリメラーゼドメイン（「大断片」と称する）を産生
することができる（Ｙｅ， Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｓｉｎ
ｉｃａ， 上掲（１９８７）、同文献の内容は参考とし
て本明細書の一部を構成するものとする）。ズブチリシ
ンを使用してＢｓｔ Ｌ．Ｆ．を産生することができる
が、ズブチリシンによってＢｓｔポリメラーゼが非特異
的分解を起こすため、その有効性は低い。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従って、これまでに産
生されたもので見られる欠点や無効性を克服するＢｓｔ
Ｉ ＤＮＡポリメラーゼ（その大断片を含む）の新規製
造方法が必要となる。
生されたもので見られる欠点や無効性を克服するＢｓｔ
Ｉ ＤＮＡポリメラーゼ（その大断片を含む）の新規製
造方法が必要となる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、耐熱性Ｂｓｔ
ＤＮＡポリメラーゼＩ、及び切頭型耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼを組換えＤＮＡ技術やタンパク質融合技術を用
いて商業的に有用な量製造する方法に関する。
ＤＮＡポリメラーゼＩ、及び切頭型耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼを組換えＤＮＡ技術やタンパク質融合技術を用
いて商業的に有用な量製造する方法に関する。
【００１０】具体的には、好ましい一実施態様では、
３’→５’エキソヌクレアーゼを含まず、５’→３’エ
キソヌクレアーゼ活性を含んでいる点で、これまでに報
告されたＢｓｔポリメラーゼとは異なるＢｓｔＩ ＤＮ
Ａポリメラーゼを提供する。他の好ましい実施態様で
は、５’→３’エキソヌクレアーゼを不活化してもよ
い。本発明は更に、組換えＤＮＡ技術やタンパク質融合
技術を用いたＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩの大断片の
独特の製造方法を提供する。タンパク質融合系では、ク
ローニングした遺伝子を、マルトース結合タンパク質
（ＭＢＰ）をコードするｍａｌＥ遺伝子の下流のｐＭＡ
Ｌベクター内に挿入すると、ＭＢＰ融合タンパク質が発
現される（Ｇｕａｎ， Ｃ等，（１９８７）Ｇｅｎｅ
６７，２１−３０； Ｍａｉｎａ， Ｃ．Ｖ．等，（１
９８８）Ｇｅｎｅ ７４，３６５−３７３，同文献の内
容は参考として本明細書の一部を構成するものとす
る）。この技術は、多量の融合タンパク質を発現するた
めに強いＰｔａｃプロモーターとＭＢＰ翻訳開始シグナ
ルを使用する。次いで、ＭＢＰの一ステップ親和性精製
により融合タンパク質を精製することができる（Ｋｅｌ
ｌｅｒｍａｎ及びＦｅｒｅｎｃｉ（１９８２）Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ９０， ４５９−４
６３，同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成
するものとする）。
３’→５’エキソヌクレアーゼを含まず、５’→３’エ
キソヌクレアーゼ活性を含んでいる点で、これまでに報
告されたＢｓｔポリメラーゼとは異なるＢｓｔＩ ＤＮ
Ａポリメラーゼを提供する。他の好ましい実施態様で
は、５’→３’エキソヌクレアーゼを不活化してもよ
い。本発明は更に、組換えＤＮＡ技術やタンパク質融合
技術を用いたＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩの大断片の
独特の製造方法を提供する。タンパク質融合系では、ク
ローニングした遺伝子を、マルトース結合タンパク質
（ＭＢＰ）をコードするｍａｌＥ遺伝子の下流のｐＭＡ
Ｌベクター内に挿入すると、ＭＢＰ融合タンパク質が発
現される（Ｇｕａｎ， Ｃ等，（１９８７）Ｇｅｎｅ
６７，２１−３０； Ｍａｉｎａ， Ｃ．Ｖ．等，（１
９８８）Ｇｅｎｅ ７４，３６５−３７３，同文献の内
容は参考として本明細書の一部を構成するものとす
る）。この技術は、多量の融合タンパク質を発現するた
めに強いＰｔａｃプロモーターとＭＢＰ翻訳開始シグナ
ルを使用する。次いで、ＭＢＰの一ステップ親和性精製
により融合タンパク質を精製することができる（Ｋｅｌ
ｌｅｒｍａｎ及びＦｅｒｅｎｃｉ（１９８２）Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ９０， ４５９−４
６３，同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成
するものとする）。
【００１１】１つの好ましいアプローチによれば、本発
明のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩをＢａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからほぼ均質
になるまで精製し、そのＮ末端の最初の２１アミノ酸残
基の配列を決定した。このアミノ酸配列に基づいて、縮
重オリゴヌクレオチドを作製した。Ｂｓｔ ＰｏｌＩ遺
伝子の３’末端ヌクレオチド配列を決定するために逆Ｐ
ＣＲを実施した。Ｂｓｔ染色体ＤＮＡをＮｇｏＭＩ又は
Ｓａｕ３ＡＩで消化し、次いでＴ４リガーゼを用いて連
結して環を形成した。使用する２個のプライマーは、遺
伝子の３’末端付近の６４２ｂｐ ＤＮＡ断片の配列デ
ータを用いて設計した。この断片を、Ｐｏｌ Ｉ様ＤＮ
Ａポリメラーゼ中に保存されたアミノ酸配列モチーフの
存在に基づいてクローニングした。ＰＣＲ断片のヌクレ
オチド配列を決定し、ＢｓｔＰｏｌ Ｉ遺伝子の３’末
端を同定した。５’末端及び３’末端両方のヌクレオチ
ド配列を決定した後に、全Ｂｓｔ Ｐｏｌ Ｉ遺伝子を
ＰＣＲにより増幅し、これをｐＥＴ２１ａ発現ベクター
内にクローニングした。耐熱性Ｂｓｔ Ｐｏｌ Ｉを組
換えプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ中で産生し、その後
全Ｂｓｔ Ｐｏｌ Ｉ遺伝子のヌクレオチド配列を決定
した。Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼをズブチリシンで部
分消化して、ＢｓｔポリメラーゼＩの大断片を生成し
た。ズブチリシンで部分消化した断片を生成し、この大
断片のＮ末端アミノ酸配列を決定した。その後、切頭型
（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ内に発現
させようとしたが失敗した。切頭型ｍＲＮＡ又はタンパ
ク質はｉｎ ｖｉｖｏで不安定であると考えられる。更
には、Ｂｓｔ大断片はホロ酵素に比べてＥ． ｃｏｌｉ
宿主に対して致死的であり、クローニングに際し問題と
なった。このような問題を克服し、更には精製ステップ
を簡略化するために、ＭＢＰ融合タンパク質を産生する
ことによって転写ｍＲＮＡを安定化させるか又はより安
定したもしくはほとんど致死的ではない翻訳タンパク質
を製造することを期待して、５’末切頭型Ｂｓｔ Ｐｏ
ｌ Ｉ遺伝子をｐＭＡＬ−ｃ２ベクター内にクローニン
グした。実際、融合タンパク質及び大きな切断Ｂｓｔ断
片は共に６５℃で活性を有した。
明のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩをＢａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからほぼ均質
になるまで精製し、そのＮ末端の最初の２１アミノ酸残
基の配列を決定した。このアミノ酸配列に基づいて、縮
重オリゴヌクレオチドを作製した。Ｂｓｔ ＰｏｌＩ遺
伝子の３’末端ヌクレオチド配列を決定するために逆Ｐ
ＣＲを実施した。Ｂｓｔ染色体ＤＮＡをＮｇｏＭＩ又は
Ｓａｕ３ＡＩで消化し、次いでＴ４リガーゼを用いて連
結して環を形成した。使用する２個のプライマーは、遺
伝子の３’末端付近の６４２ｂｐ ＤＮＡ断片の配列デ
ータを用いて設計した。この断片を、Ｐｏｌ Ｉ様ＤＮ
Ａポリメラーゼ中に保存されたアミノ酸配列モチーフの
存在に基づいてクローニングした。ＰＣＲ断片のヌクレ
オチド配列を決定し、ＢｓｔＰｏｌ Ｉ遺伝子の３’末
端を同定した。５’末端及び３’末端両方のヌクレオチ
ド配列を決定した後に、全Ｂｓｔ Ｐｏｌ Ｉ遺伝子を
ＰＣＲにより増幅し、これをｐＥＴ２１ａ発現ベクター
内にクローニングした。耐熱性Ｂｓｔ Ｐｏｌ Ｉを組
換えプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ中で産生し、その後
全Ｂｓｔ Ｐｏｌ Ｉ遺伝子のヌクレオチド配列を決定
した。Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼをズブチリシンで部
分消化して、ＢｓｔポリメラーゼＩの大断片を生成し
た。ズブチリシンで部分消化した断片を生成し、この大
断片のＮ末端アミノ酸配列を決定した。その後、切頭型
（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ内に発現
させようとしたが失敗した。切頭型ｍＲＮＡ又はタンパ
ク質はｉｎ ｖｉｖｏで不安定であると考えられる。更
には、Ｂｓｔ大断片はホロ酵素に比べてＥ． ｃｏｌｉ
宿主に対して致死的であり、クローニングに際し問題と
なった。このような問題を克服し、更には精製ステップ
を簡略化するために、ＭＢＰ融合タンパク質を産生する
ことによって転写ｍＲＮＡを安定化させるか又はより安
定したもしくはほとんど致死的ではない翻訳タンパク質
を製造することを期待して、５’末切頭型Ｂｓｔ Ｐｏ
ｌ Ｉ遺伝子をｐＭＡＬ−ｃ２ベクター内にクローニン
グした。実際、融合タンパク質及び大きな切断Ｂｓｔ断
片は共に６５℃で活性を有した。
【００１２】
【発明の実施の形態】Ｂｓｔ Ｐｏｌ Ｉ大断片の製造
について本明細書に記載する好ましい方法は以下のステ
ップからなる： １． Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩをＢａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから精製す
る。この生物は好熱菌であって、増殖温度範囲は４５℃
〜７０℃である。細胞増殖後、以下のような複数ステッ
ププロセスを用いてＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩを精
製する。まず、細胞を緩衝液Ａ（２０ｍＭＫＰＯ4緩衝
液，ｐＨ６．５；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０ｍＭ β−メ
ルカプトエタノール）中に懸濁させ、超音波処理し、遠
心分離にかける。ＫＰＯ4濃度は上清中２００ｍＭに調
整し、次いで上清を、ＤＥＡＥセファロースカラムのよ
うな核酸に対して高い親和性を示すカラムに通す。上清
溶液中に存在する核酸はＤＥＡＥに結合するため、核酸
はＫＰＯ4塩濃度２００ｍＭでカラムを素通りするタン
パク質と分離される。素通りしたタンパク質をヘパリン
セファロースカラムに添加する。カラムを洗浄し、ＤＮ
Ａポリメラーゼ酵素活性を緩衝液Ａ中０→０．７Ｍ Ｋ
Ｃｌのような直線勾配で溶離する。緩衝液Ｂ（２０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４；０．５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ；１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）中でピーク
ＤＮＡポリメラーゼ活性を透析し、Ｑ−セファロースカ
ラムに添加する。酵素活性を緩衝液Ｂ中０．０２５→１
Ｍ ＫＣｌのような直線勾配で溶離する。再度、ＤＮＡ
ポリメラーゼのピーク活性を透析し、ヘパリンＴｓｋ１
カラム（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ）に添加する。酵素を、緩
衝液Ｂ中０．０２５→１ＭＫＣｌ直線勾配で溶離する。
この段階での酵素純度は約９５％である（図１）。
について本明細書に記載する好ましい方法は以下のステ
ップからなる： １． Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩをＢａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから精製す
る。この生物は好熱菌であって、増殖温度範囲は４５℃
〜７０℃である。細胞増殖後、以下のような複数ステッ
ププロセスを用いてＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩを精
製する。まず、細胞を緩衝液Ａ（２０ｍＭＫＰＯ4緩衝
液，ｐＨ６．５；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０ｍＭ β−メ
ルカプトエタノール）中に懸濁させ、超音波処理し、遠
心分離にかける。ＫＰＯ4濃度は上清中２００ｍＭに調
整し、次いで上清を、ＤＥＡＥセファロースカラムのよ
うな核酸に対して高い親和性を示すカラムに通す。上清
溶液中に存在する核酸はＤＥＡＥに結合するため、核酸
はＫＰＯ4塩濃度２００ｍＭでカラムを素通りするタン
パク質と分離される。素通りしたタンパク質をヘパリン
セファロースカラムに添加する。カラムを洗浄し、ＤＮ
Ａポリメラーゼ酵素活性を緩衝液Ａ中０→０．７Ｍ Ｋ
Ｃｌのような直線勾配で溶離する。緩衝液Ｂ（２０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４；０．５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ；１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）中でピーク
ＤＮＡポリメラーゼ活性を透析し、Ｑ−セファロースカ
ラムに添加する。酵素活性を緩衝液Ｂ中０．０２５→１
Ｍ ＫＣｌのような直線勾配で溶離する。再度、ＤＮＡ
ポリメラーゼのピーク活性を透析し、ヘパリンＴｓｋ１
カラム（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ）に添加する。酵素を、緩
衝液Ｂ中０．０２５→１ＭＫＣｌ直線勾配で溶離する。
この段階での酵素純度は約９５％である（図１）。
【００１３】２． ステップ１で得たＢｓｔ Ｐｏｌ
Ｉ酵素を、Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ，Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ． ２６２：１００３５−１００３８（１９８
７）の手順に従って電気泳動及びエレクトロブロッティ
ングに付す。上記文献の内容は参考として本明細書の一
部を構成するものとする。膜をクーマシーブルーＲ−２
５０で染色し、９０ｋＤａの主タンパク質バンドを切り
出し、Ｗａｉｔｅ−Ｒｅｅｓ等， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．， １７３：５２０７−５２１９（１９９１）
の手順に従って連続的に分解させた。上記文献の内容は
参考として本明細書の一部を構成するものとする。９０
ｋＤａタンパク質の最初の２１残基はＭｅｔ−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａ
ｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｙ
ｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
（配列番号３）である。Ｂｓｔ Ｐｏｌ Ｉ遺伝子の
Ｅ．ｃｏｌｉ内へのクローニング及び発現を行うため
に、制限酵素（ＸｂａＩ）クローニング部位及びリボソ
ーム結合部位を含む縮重プライマー（プライマーＡ）を
アミノ酸配列に基づいて作製する。
Ｉ酵素を、Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ，Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ． ２６２：１００３５−１００３８（１９８
７）の手順に従って電気泳動及びエレクトロブロッティ
ングに付す。上記文献の内容は参考として本明細書の一
部を構成するものとする。膜をクーマシーブルーＲ−２
５０で染色し、９０ｋＤａの主タンパク質バンドを切り
出し、Ｗａｉｔｅ−Ｒｅｅｓ等， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．， １７３：５２０７−５２１９（１９９１）
の手順に従って連続的に分解させた。上記文献の内容は
参考として本明細書の一部を構成するものとする。９０
ｋＤａタンパク質の最初の２１残基はＭｅｔ−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａ
ｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｙ
ｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
（配列番号３）である。Ｂｓｔ Ｐｏｌ Ｉ遺伝子の
Ｅ．ｃｏｌｉ内へのクローニング及び発現を行うため
に、制限酵素（ＸｂａＩ）クローニング部位及びリボソ
ーム結合部位を含む縮重プライマー（プライマーＡ）を
アミノ酸配列に基づいて作製する。
【００１４】３． Ｂｓｔ Ｐｏｌ Ｉ遺伝子がＰＣＲ
によって直接クローニングされ得るように３’末端ヌク
レオチド配列を決定するために、ＮｇｏＭＩ及びＳａｕ
３ＡＩで切断／自己連結したＢ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムＤＮＡ鋳型から逆ＰＣＲ産物
を増幅させる。ＮｇｏＭＩで消化、自己連結したＢｓｔ
ＤＮＡを鋳型として使用した反応では、寸法が約０．９
５ｋｂの断片が得られる。Ｓａｕ３ＡＩで消化、自己連
結したＢｓｔ ＤＮＡを鋳型として使用した反応では、
寸法が約１．５ｋｂの断片が得られる。０．９５ｋｂ及
び１．５ｋｂの２つの増幅ＤＮＡバンドをアガロースゲ
ルから切り出し、直接ＤＮＡの配列決定に付す。終結コ
ドン（ＴＡＡ）がＮｇｏＭＩで消化／自己連結した配列
中１８０塩基対に見出され、これはＢｓｔ ＤＮＡポリ
メラーゼＩ遺伝子の終結コドンであると考えられる。Ｂ
ｓｔ Ｐｏｌ Ｉ遺伝子の３’末端にアニーリングす
る、ＮｏｔＩクローニング部位を含む他のプライマー
（プライマーＢ）を作製する。
によって直接クローニングされ得るように３’末端ヌク
レオチド配列を決定するために、ＮｇｏＭＩ及びＳａｕ
３ＡＩで切断／自己連結したＢ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムＤＮＡ鋳型から逆ＰＣＲ産物
を増幅させる。ＮｇｏＭＩで消化、自己連結したＢｓｔ
ＤＮＡを鋳型として使用した反応では、寸法が約０．９
５ｋｂの断片が得られる。Ｓａｕ３ＡＩで消化、自己連
結したＢｓｔ ＤＮＡを鋳型として使用した反応では、
寸法が約１．５ｋｂの断片が得られる。０．９５ｋｂ及
び１．５ｋｂの２つの増幅ＤＮＡバンドをアガロースゲ
ルから切り出し、直接ＤＮＡの配列決定に付す。終結コ
ドン（ＴＡＡ）がＮｇｏＭＩで消化／自己連結した配列
中１８０塩基対に見出され、これはＢｓｔ ＤＮＡポリ
メラーゼＩ遺伝子の終結コドンであると考えられる。Ｂ
ｓｔ Ｐｏｌ Ｉ遺伝子の３’末端にアニーリングす
る、ＮｏｔＩクローニング部位を含む他のプライマー
（プライマーＢ）を作製する。
【００１５】４． ＰＣＲ反応を実施すると、予測され
る２．６ｋｂバンドがアガロースゲル上で観察される。
ゲルから２．６ｋｂ断片を精製し、次いでＮｏｔＩ及び
ＸｂａＩで消化し、ＮｏｔＩ／ＸｂａＩで消化したｐＥ
Ｔ−２１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏ
ｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）内にクローニングする。Ｂ
ｓｔ Ｐｏｌ Ｉ遺伝子を含む組換えプラスミドをＥＲ
２１６９コンピテント細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈ
ｕｓｅｔｔｓ）内に形質転換する。６５℃で耐熱性のＤ
ＮＡポリメラーゼ活性（約３０，０００ｕ／ｇ宿主細
胞）が中温好性Ｅ． ｃｏｌｉ宿主で観察され、このこ
とはＢｓｔ Ｐｏｌ Ｉ遺伝子のクローニング及び発現
に成功したことを示している。中断のない２６３１ｂｐ
の読み取り枠（ＯＲＦ）に相当する全Ｂｓｔ Ｐｏｌ
Ｉ遺伝子のヌクレオチド配列を決定する（図２Ａ、２
Ｂ、２Ｃ）。２６３１ｂｐ遺伝子は分子量計算値９９，
００７．６７の８７６アミノ酸タンパク質をコードし、
この分子量は１０→２０％ポリアクリルアミド勾配ゲル
上で観察された約９７ｋＤａの分子量と一致する（図
１）。
る２．６ｋｂバンドがアガロースゲル上で観察される。
ゲルから２．６ｋｂ断片を精製し、次いでＮｏｔＩ及び
ＸｂａＩで消化し、ＮｏｔＩ／ＸｂａＩで消化したｐＥ
Ｔ−２１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏ
ｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）内にクローニングする。Ｂ
ｓｔ Ｐｏｌ Ｉ遺伝子を含む組換えプラスミドをＥＲ
２１６９コンピテント細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈ
ｕｓｅｔｔｓ）内に形質転換する。６５℃で耐熱性のＤ
ＮＡポリメラーゼ活性（約３０，０００ｕ／ｇ宿主細
胞）が中温好性Ｅ． ｃｏｌｉ宿主で観察され、このこ
とはＢｓｔ Ｐｏｌ Ｉ遺伝子のクローニング及び発現
に成功したことを示している。中断のない２６３１ｂｐ
の読み取り枠（ＯＲＦ）に相当する全Ｂｓｔ Ｐｏｌ
Ｉ遺伝子のヌクレオチド配列を決定する（図２Ａ、２
Ｂ、２Ｃ）。２６３１ｂｐ遺伝子は分子量計算値９９，
００７．６７の８７６アミノ酸タンパク質をコードし、
この分子量は１０→２０％ポリアクリルアミド勾配ゲル
上で観察された約９７ｋＤａの分子量と一致する（図
１）。
【００１６】５． Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩをプ
ロテアーゼズブチリシンで消化すると、Ｂｓｔ大断片
（Ｂｓｔ Ｌ．Ｆ．）が産生されることが観察された。
ＢｓｔＬ．Ｆ．は５’→３’エキソヌクレアーゼドメイ
ンの欠如した切頭型ポリメラーゼであり、ＤＮＡの配列
分析で非常に有用な酵素である（Ｙｅ及びＨｏｎｇ，Ｓ
ｃｉｅｎｔｉａ Ｓｉｎｉｃａ， ３０：５０３−５０
６（１９８７）、同文献の内容は参考として本明細書の
一部を構成するものとする）。ズブチリシンを使用して
Ｂｓｔ Ｌ．Ｆ．を産生することができるが、ズブチリ
シンによってＢｓｔポリメラーゼの非特異的分解が生じ
るために有効性は低い。本発明によれば、Ｂｓｔ Ｌ．
Ｆ．を５’末端に欠失を有するＢｓｔ Ｐｏｌ Ｉ遺伝
子から直接産生する方がズブチリシン消化よりも効果的
であり、このズブチリシン消化はＤＮＡの配列決定や鎖
置換増幅法（Ｗａｌｋｅｒ等、上掲）のような用途でよ
り有用である。しかしながら、Ｂｓｔ Ｌ．Ｆ．のクロ
ーニング及び発現のための独創的な実験は失敗した。転
写されるｍＲＮＡ、又は切頭型遺伝子から翻訳されるタ
ンパク質はｉｎ ｖｉｖｏで不安定であると考えられ
る。更には、Ｂｓｔ大断片はＥ． ｃｏｌｉ宿主に対し
て非常に致死的であり、ポリメラーゼ活性が低いか又は
ポリメラーゼ活性を持たない変異体だけが選択されたと
考えられる。このような問題を克服するために、ＭＢＰ
−Ｂｓｔ Ｌ．Ｆ．融合タンパク質を産生することによ
って転写ｍＲＮＡを安定化させるか又はより安定したも
しくはほとんど致死的ではない翻訳タンパク質を製造す
ることを期待して、５’末端切頭型Ｂｓｔ Ｐｏｌ Ｉ
遺伝子をｐＭＡＬ−ｃ２ベクター内にクローニングし
た。
ロテアーゼズブチリシンで消化すると、Ｂｓｔ大断片
（Ｂｓｔ Ｌ．Ｆ．）が産生されることが観察された。
ＢｓｔＬ．Ｆ．は５’→３’エキソヌクレアーゼドメイ
ンの欠如した切頭型ポリメラーゼであり、ＤＮＡの配列
分析で非常に有用な酵素である（Ｙｅ及びＨｏｎｇ，Ｓ
ｃｉｅｎｔｉａ Ｓｉｎｉｃａ， ３０：５０３−５０
６（１９８７）、同文献の内容は参考として本明細書の
一部を構成するものとする）。ズブチリシンを使用して
Ｂｓｔ Ｌ．Ｆ．を産生することができるが、ズブチリ
シンによってＢｓｔポリメラーゼの非特異的分解が生じ
るために有効性は低い。本発明によれば、Ｂｓｔ Ｌ．
Ｆ．を５’末端に欠失を有するＢｓｔ Ｐｏｌ Ｉ遺伝
子から直接産生する方がズブチリシン消化よりも効果的
であり、このズブチリシン消化はＤＮＡの配列決定や鎖
置換増幅法（Ｗａｌｋｅｒ等、上掲）のような用途でよ
り有用である。しかしながら、Ｂｓｔ Ｌ．Ｆ．のクロ
ーニング及び発現のための独創的な実験は失敗した。転
写されるｍＲＮＡ、又は切頭型遺伝子から翻訳されるタ
ンパク質はｉｎ ｖｉｖｏで不安定であると考えられ
る。更には、Ｂｓｔ大断片はＥ． ｃｏｌｉ宿主に対し
て非常に致死的であり、ポリメラーゼ活性が低いか又は
ポリメラーゼ活性を持たない変異体だけが選択されたと
考えられる。このような問題を克服するために、ＭＢＰ
−Ｂｓｔ Ｌ．Ｆ．融合タンパク質を産生することによ
って転写ｍＲＮＡを安定化させるか又はより安定したも
しくはほとんど致死的ではない翻訳タンパク質を製造す
ることを期待して、５’末端切頭型Ｂｓｔ Ｐｏｌ Ｉ
遺伝子をｐＭＡＬ−ｃ２ベクター内にクローニングし
た。
【００１７】Ｂｓｔ Ｌ．Ｆ．のＮ末端境界部分を解明
するために、精製したＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ
（図１）を適量のズブチリシンで消化し、次いでズブチ
リシンで消化した大きな断片を、トリス−トリシン１０
→２０％ポリアクリルアミド勾配ゲル（Ｎｏｖｅｘ，
Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）上の電
気泳動に付し、次いでエレクトロブロッティングした
（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ， ２６２：１００３５−１００３８（１９８７）、
同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するも
のとする）。ＢｓｔＬ．Ｆ．に相当する約６７ｋＤａの
タンパク質バンドを切り出し、Ｎ末端タンパク質の配列
決定に付した（Ｗａｉｔｅ−Ｒｅｅｓ等，上掲）。６７
ｋＤａタンパク質の最初の７残基はＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番号４）
に相当し、これはズブチリシン切断部位がＡｌａ２８９
〜Ａｌａ２９０の間に位置することを示している（図２
Ａ、２Ｂ、２Ｃ）。大断片のＮ末端アミノ酸配列は、ク
ローニングしたＢｓｔ Ｐｏｌ Ｉ遺伝子から推定され
るアミノ酸配列に適合する（図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ）。
するために、精製したＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ
（図１）を適量のズブチリシンで消化し、次いでズブチ
リシンで消化した大きな断片を、トリス−トリシン１０
→２０％ポリアクリルアミド勾配ゲル（Ｎｏｖｅｘ，
Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）上の電
気泳動に付し、次いでエレクトロブロッティングした
（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ， ２６２：１００３５−１００３８（１９８７）、
同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するも
のとする）。ＢｓｔＬ．Ｆ．に相当する約６７ｋＤａの
タンパク質バンドを切り出し、Ｎ末端タンパク質の配列
決定に付した（Ｗａｉｔｅ−Ｒｅｅｓ等，上掲）。６７
ｋＤａタンパク質の最初の７残基はＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番号４）
に相当し、これはズブチリシン切断部位がＡｌａ２８９
〜Ａｌａ２９０の間に位置することを示している（図２
Ａ、２Ｂ、２Ｃ）。大断片のＮ末端アミノ酸配列は、ク
ローニングしたＢｓｔ Ｐｏｌ Ｉ遺伝子から推定され
るアミノ酸配列に適合する（図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ）。
【００１８】この配列に基づいて、ＦｓｐＩ制限酵素部
位を含むプライマー（プライマーＣ）を、Ｂｓｔ Ｌ．
Ｆ．の開始部に相当する８６８〜８９０位の部位でＢｓ
ｔＰｏｌ Ｉ遺伝子にアニーリングするように設計する
（図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ）。ＸｂａＩ部位を有する他のプ
ライマー（プライマーＤ）を、前記遺伝子の３’末端に
アニーリングするように設計する。ＰＣＲを実施して、
Ｂｓｔ大断片をコードする５’末端−切頭型Ｂｓｔ Ｐ
ｏｌ Ｉ遺伝子を増幅させる。Ｂｓｔ大断片の予想され
る寸法に相当する１．８ｋｂのＤＮＡ断片を増幅させ
る。１．８ｋｂの断片をＦｓｐＩ（ブラント末端）及び
ＸｂａＩによって切断し、次いでＸｍｎＩ（ブラント末
端）及びＸｂａＩで切断したｐＭＡＬ−ｃ２ベクター
（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅ
ｒｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）内にクローニ
ングする。クローニングした遺伝子を、マルトース結合
タンパク質（ＭＢＰ）をコードする（Ｅ． ｃｏｌｉ由
来の）ｐＭＡＬ−ｃ２ ｍａｌＥ遺伝子のすぐ下流に導
入すると、ＭＢＰ−Ｂｓｔ Ｌ．Ｆ．融合タンパク質が
発現される（図３）。組換えプラスミドをＥ． ｃｏｌ
ｉ ＲＲＩ細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔ
ｓ）内に形質転換する。このプラスミドを含む細胞を超
音波処理し、遠心分離にかける。ここでも６５℃で好熱
性のＤＮＡポリメラーゼ活性（約１３０，０００ｕ／ｇ
宿主細胞）が中温好性宿主で観察され、このことはＭＢ
Ｐ−Ｂｓｔ融合タンパク質が６５℃で活性を有すること
を示している。
位を含むプライマー（プライマーＣ）を、Ｂｓｔ Ｌ．
Ｆ．の開始部に相当する８６８〜８９０位の部位でＢｓ
ｔＰｏｌ Ｉ遺伝子にアニーリングするように設計する
（図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ）。ＸｂａＩ部位を有する他のプ
ライマー（プライマーＤ）を、前記遺伝子の３’末端に
アニーリングするように設計する。ＰＣＲを実施して、
Ｂｓｔ大断片をコードする５’末端−切頭型Ｂｓｔ Ｐ
ｏｌ Ｉ遺伝子を増幅させる。Ｂｓｔ大断片の予想され
る寸法に相当する１．８ｋｂのＤＮＡ断片を増幅させ
る。１．８ｋｂの断片をＦｓｐＩ（ブラント末端）及び
ＸｂａＩによって切断し、次いでＸｍｎＩ（ブラント末
端）及びＸｂａＩで切断したｐＭＡＬ−ｃ２ベクター
（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅ
ｒｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）内にクローニ
ングする。クローニングした遺伝子を、マルトース結合
タンパク質（ＭＢＰ）をコードする（Ｅ． ｃｏｌｉ由
来の）ｐＭＡＬ−ｃ２ ｍａｌＥ遺伝子のすぐ下流に導
入すると、ＭＢＰ−Ｂｓｔ Ｌ．Ｆ．融合タンパク質が
発現される（図３）。組換えプラスミドをＥ． ｃｏｌ
ｉ ＲＲＩ細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔ
ｓ）内に形質転換する。このプラスミドを含む細胞を超
音波処理し、遠心分離にかける。ここでも６５℃で好熱
性のＤＮＡポリメラーゼ活性（約１３０，０００ｕ／ｇ
宿主細胞）が中温好性宿主で観察され、このことはＭＢ
Ｐ−Ｂｓｔ融合タンパク質が６５℃で活性を有すること
を示している。
【００１９】７． ステップ６の上清を（実施例ＶＩで
詳述する）アミロース親和性カラムに添加する。核酸及
び他の全ての宿主細胞タンパク質（ＭＢＰ−Ｂｓｔ融合
タンパク質は除く）をカラムに通し、カラムをカラム容
量の数倍の緩衝液Ｃ（２００ｍＭ ＮａＣｌ；２０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１ｍ
Ｍ ＤＴＴ）で洗浄して除去する。ＭＢＰ−Ｂｓｔ
Ｌ．Ｆ．融合タンパク質を緩衝液Ｃ中の１０ｍＭマルト
ースで溶離する。溶離した融合タンパク質をＳ−１００
サイズ排除カラムで更に精製して、遊離ＭＢＰを排除す
る。
詳述する）アミロース親和性カラムに添加する。核酸及
び他の全ての宿主細胞タンパク質（ＭＢＰ−Ｂｓｔ融合
タンパク質は除く）をカラムに通し、カラムをカラム容
量の数倍の緩衝液Ｃ（２００ｍＭ ＮａＣｌ；２０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１ｍ
Ｍ ＤＴＴ）で洗浄して除去する。ＭＢＰ−Ｂｓｔ
Ｌ．Ｆ．融合タンパク質を緩衝液Ｃ中の１０ｍＭマルト
ースで溶離する。溶離した融合タンパク質をＳ−１００
サイズ排除カラムで更に精製して、遊離ＭＢＰを排除す
る。
【００２０】８． 精製したＭＢＰ−Ｂｓｔ融合タンパ
ク質を因子Ｘａプロテアーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ ＃８００−１０）で切断することがで
きる。因子Ｘａの切断後、１１０ｋＤａのＭＢＰ−Ｂｓ
ｔ Ｌ．Ｆ．融合タンパク質が分解し、予想される６７
ｋＤａのＢｓｔ Ｌ．Ｆ．及び４０ｋＤａのＭＢＰが得
られた（図３）。ＭＢＰ−Ｂｓｔ Ｌ．Ｆ．融合タンパ
ク質及び因子Ｘａで切断したＢｓｔ Ｌ．Ｆ．は共に活
性を有するが、因子Ｘａで切断したＢｓｔ Ｌ．Ｆ．
（４５，３００ｕ／ｍｇ）は融合タンパク質（６，３０
０ｕ／ｍｇ）の約７倍の比活性を有する。融合体の比活
性が低いために、ＭＢＰ−Ｂｓｔ融合タンパク質中の耐
中温性ＭＢＰが６５℃で熱変性を起こし得る。切断した
Ｂｓｔ Ｌ．Ｆ．は耐熱性があり比活性もより高いの
で、産生のための好ましい酵素となるはずである。
ク質を因子Ｘａプロテアーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ ＃８００−１０）で切断することがで
きる。因子Ｘａの切断後、１１０ｋＤａのＭＢＰ−Ｂｓ
ｔ Ｌ．Ｆ．融合タンパク質が分解し、予想される６７
ｋＤａのＢｓｔ Ｌ．Ｆ．及び４０ｋＤａのＭＢＰが得
られた（図３）。ＭＢＰ−Ｂｓｔ Ｌ．Ｆ．融合タンパ
ク質及び因子Ｘａで切断したＢｓｔ Ｌ．Ｆ．は共に活
性を有するが、因子Ｘａで切断したＢｓｔ Ｌ．Ｆ．
（４５，３００ｕ／ｍｇ）は融合タンパク質（６，３０
０ｕ／ｍｇ）の約７倍の比活性を有する。融合体の比活
性が低いために、ＭＢＰ−Ｂｓｔ融合タンパク質中の耐
中温性ＭＢＰが６５℃で熱変性を起こし得る。切断した
Ｂｓｔ Ｌ．Ｆ．は耐熱性があり比活性もより高いの
で、産生のための好ましい酵素となるはずである。
【００２１】９． 因子Ｘａ及び切断した遊離ＭＢＰを
除去するために、６５℃で２０分間インキュベートして
因子Ｘａ消化体に熱負荷を加え、次いで緩衝液Ｅ（５０
ｍＭＮａＣｌ；２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．
８；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１ｍＭ ＤＴＴ）に平衡化
したＳｏｕｒｃｅ−Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ）カラムに添加する。酵素を緩衝液Ｄ中５０ｍＭ
→６００ｍＭ ＮａＣｌの直線勾配で溶離する。Ｂｓｔ
Ｌ．Ｆ．を７倍容量の緩衝液Ｆ（２０ｍＭ ＫＰ
Ｏ4，ｐＨ６．９；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１ｍＭ Ｄ
ＴＴ）で希釈し、緩衝液Ｇ（５０ｍＭ ＮａＣｌ， ２
０ｍＭ ＫＰＯ4，ｐＨ６．９；０．１ｍＭＥＤＴＡ；
１ｍＭ ＤＴＴ）に平衡化した１ｃｍ×１０ｃｍのヘパ
リン−ＴＳＫ５ＰＷガード樹脂カラムに添加する。酵素
を緩衝液Ｆ中５０ｍＭ→６００ｍＭＮａＣｌの直線勾配
で溶離する。酵素含有画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べる
と、予想分子量が６７，０００で純度が９０％以上であ
ることが判明した（図４）。この組換えＢｓｔ Ｌ．
Ｆ．の比活性は１００，８００ｕ／ｍｇである。
除去するために、６５℃で２０分間インキュベートして
因子Ｘａ消化体に熱負荷を加え、次いで緩衝液Ｅ（５０
ｍＭＮａＣｌ；２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．
８；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１ｍＭ ＤＴＴ）に平衡化
したＳｏｕｒｃｅ−Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ）カラムに添加する。酵素を緩衝液Ｄ中５０ｍＭ
→６００ｍＭ ＮａＣｌの直線勾配で溶離する。Ｂｓｔ
Ｌ．Ｆ．を７倍容量の緩衝液Ｆ（２０ｍＭ ＫＰ
Ｏ4，ｐＨ６．９；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１ｍＭ Ｄ
ＴＴ）で希釈し、緩衝液Ｇ（５０ｍＭ ＮａＣｌ， ２
０ｍＭ ＫＰＯ4，ｐＨ６．９；０．１ｍＭＥＤＴＡ；
１ｍＭ ＤＴＴ）に平衡化した１ｃｍ×１０ｃｍのヘパ
リン−ＴＳＫ５ＰＷガード樹脂カラムに添加する。酵素
を緩衝液Ｆ中５０ｍＭ→６００ｍＭＮａＣｌの直線勾配
で溶離する。酵素含有画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べる
と、予想分子量が６７，０００で純度が９０％以上であ
ることが判明した（図４）。この組換えＢｓｔ Ｌ．
Ｆ．の比活性は１００，８００ｕ／ｍｇである。
【００２２】本明細書に記載する組換えＢｓｔ Ｌ．
Ｆ．は複製中に鎖置換することが可能で、５’→３’及
び３’→５’のいずれのエキソヌクレアーゼ活性も有さ
ない（図６）。これは、Ｂｓｔ Ｐｏｌ Ｉが３’→
５’エキソヌクレアーゼ活性を有することを示すＥｐｉ
ｃｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉ
ｎ）のカタログに記載のものとは異なる。
Ｆ．は複製中に鎖置換することが可能で、５’→３’及
び３’→５’のいずれのエキソヌクレアーゼ活性も有さ
ない（図６）。これは、Ｂｓｔ Ｐｏｌ Ｉが３’→
５’エキソヌクレアーゼ活性を有することを示すＥｐｉ
ｃｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉ
ｎ）のカタログに記載のものとは異なる。
【００２３】１０． エキソヌクレアーゼ活性アッセイ
を実施して、本発明のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩと
関連するエキソヌクレアーゼ活性の方向性を決定する。
５’−32Ｐ及び３’−3Ｈ末端ラベルを用いて線状ＰＵ
Ｃ１９ ＤＮＡ基質を調製し、ＢｓｔポリメラーゼＩと
共に、また対照としてＶｅｎｔ、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｐｏ
ｌ Ｉ及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いてインキ
ュベートする間の２つのラベルの可溶化を監視する。Ｖ
ｅｎｔは３’→５’エキソヌクレアーゼを有し、結果と
して3Ｈラベルを可溶化する。Ｔａｑは５’→３’エキ
ソヌクレアーゼを有し、従って32Ｐラベルを可溶化す
る。Ｅ． ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉは５’→３’及び３’
→５’の両方のエキソヌクレアーゼを有し、従ってＥ．
ｃｏｌｉＰｏｌ Ｉと共にインキュベートする間に32
Ｐ及び3Ｈの両方のラベルが可溶化する。Ｂｓｔ Ｐｏ
ｌ Ｉと共にインキュベートすると、Ｔａｑと同様に32
Ｐラベルだけが可溶化し、このことはＢｓｔ Ｐｏｌ
Ｉが５’→３’エキソヌクレアーゼを有するが、３’→
５’エキソヌクレアーゼ活性は欠如していることを示し
ている（図５）。配列データは、Ｂｓｔ Ｐｏｌ Ｉが
３’→５’エキソヌクレアーゼドメイン中に「ＤＸＥ」
ｅｘｏＩモチーフを持たないことを示しており、これは
本発明のエキソヌクレアーゼアッセイデータと一致して
いた。
を実施して、本発明のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩと
関連するエキソヌクレアーゼ活性の方向性を決定する。
５’−32Ｐ及び３’−3Ｈ末端ラベルを用いて線状ＰＵ
Ｃ１９ ＤＮＡ基質を調製し、ＢｓｔポリメラーゼＩと
共に、また対照としてＶｅｎｔ、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｐｏ
ｌ Ｉ及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いてインキ
ュベートする間の２つのラベルの可溶化を監視する。Ｖ
ｅｎｔは３’→５’エキソヌクレアーゼを有し、結果と
して3Ｈラベルを可溶化する。Ｔａｑは５’→３’エキ
ソヌクレアーゼを有し、従って32Ｐラベルを可溶化す
る。Ｅ． ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉは５’→３’及び３’
→５’の両方のエキソヌクレアーゼを有し、従ってＥ．
ｃｏｌｉＰｏｌ Ｉと共にインキュベートする間に32
Ｐ及び3Ｈの両方のラベルが可溶化する。Ｂｓｔ Ｐｏ
ｌ Ｉと共にインキュベートすると、Ｔａｑと同様に32
Ｐラベルだけが可溶化し、このことはＢｓｔ Ｐｏｌ
Ｉが５’→３’エキソヌクレアーゼを有するが、３’→
５’エキソヌクレアーゼ活性は欠如していることを示し
ている（図５）。配列データは、Ｂｓｔ Ｐｏｌ Ｉが
３’→５’エキソヌクレアーゼドメイン中に「ＤＸＥ」
ｅｘｏＩモチーフを持たないことを示しており、これは
本発明のエキソヌクレアーゼアッセイデータと一致して
いた。
【００２４】Ｂｓｔ Ｐｏｌ Ｉには３’→５’エキソ
ヌクレアーゼ活性が欠如していることを更に確かめるた
めに、３’末端にＧ：Ａミスマッチを含むプライマーで
アニーリングしたＭ１３ｓｓＤＮＡを用いて、プルーフ
リーディングエキソヌクレアーゼアッセイを実施する。
３’→５’エキソヌクレアーゼを有するＶｅｎｔ ＤＮ
ＡポリメラーゼはミスマッチのＧを効果的に除去し、次
いでプライマーを伸長して、より高い相対的ポリメラー
ゼ活性を得ることができる（図６、Ｖｅｎｔｅｘ
ｏ+）。Ｔａｑポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレ
アーゼを持たず、従ってミスマッチを修正することがで
きず、相対的ポリメラーゼ活性は５分の１である（図
６、Ｔａｑ）。Ｔａｑと同様に、Ｂｓｔの相対的ポリメ
ラーゼ活性も低く、このことはＢｓｔにはミスマッチの
Ｇの除去に必要な３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が
欠如しており、このため３’末端が、伸長されたＤＮＡ
ポリメラーゼとなり得ることを示している。
ヌクレアーゼ活性が欠如していることを更に確かめるた
めに、３’末端にＧ：Ａミスマッチを含むプライマーで
アニーリングしたＭ１３ｓｓＤＮＡを用いて、プルーフ
リーディングエキソヌクレアーゼアッセイを実施する。
３’→５’エキソヌクレアーゼを有するＶｅｎｔ ＤＮ
ＡポリメラーゼはミスマッチのＧを効果的に除去し、次
いでプライマーを伸長して、より高い相対的ポリメラー
ゼ活性を得ることができる（図６、Ｖｅｎｔｅｘ
ｏ+）。Ｔａｑポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレ
アーゼを持たず、従ってミスマッチを修正することがで
きず、相対的ポリメラーゼ活性は５分の１である（図
６、Ｔａｑ）。Ｔａｑと同様に、Ｂｓｔの相対的ポリメ
ラーゼ活性も低く、このことはＢｓｔにはミスマッチの
Ｇの除去に必要な３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が
欠如しており、このため３’末端が、伸長されたＤＮＡ
ポリメラーゼとなり得ることを示している。
【００２５】実施することが好ましい本発明の実施態様
を以下の実施例で説明する。本実施例は例示的であり、
本発明は特許請求の範囲に記載する範囲を除いて以下の
実施例に限定されるものではない。
を以下の実施例で説明する。本実施例は例示的であり、
本発明は特許請求の範囲に記載する範囲を除いて以下の
実施例に限定されるものではない。
【００２６】
【実施例】実施例１ Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ遺伝子のクローニング １． 逆（ｉｎｖｅｒｓｅ）ＰＣＲを用いてのＢｓｔ
Ｐｏｌ Ｉ遺伝子の３′末端の決定 １反応当たり１．２μｇのＢ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムＤＮＡを用いて、複数の個別管
内で制限消化を行なった。前記ＤＮＡを４５μｌのＮＥ
Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｕ３ＡＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ ＮＥＢｕｆｆｅｒ Ｓａｕ３ＡＩ＝
１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭビストリスプロパン−
ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭジチオトレイト
ール；ｐＨ７．０＠２５℃）に加えた混合物に、５０Ｕ
のＳａｕ３ＡＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ， ＃１６９）を添加した。前記ＤＮＡを４５μｌ
のＮＥＢｕｆｆｅｒ ４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ ＮＥＢｕｆｆｅｒ ４＝５０ｍＭ酢酸カ
リウム、２０ｍＭトリス−酢酸塩、１０ｍＭ酢酸マグネ
シウム、１ｍＭジチオトレイトール； ｐＨ７．９＠２
５℃）に加えた混合物には、５０ＵのＮｇｏＭＩ（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，＃５６４）を添
加した。Ｓａｕ３ＡＩ反応混合物には１００μｇ／ｍｌ
のＢＳＡを含有させた。いずれの反応混合物も最終体積
を５０μｌとした。両消化物を３７℃で１時間インキュ
ベートした。消化物から制限酵素を、フェノール（１
回）及びクロロホルム（２回）での抽出によって除去し
た。各消化物に５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム及び１００
μｌの９５％エタノール／５％イソプロパノールを添加
することによってＤＮＡを沈澱させ、これを遠心によっ
て回収した。ＤＮＡを個別管内で５００μｌのＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌ
ａｂｓ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液＝５０ｍＭトリス
−ＨＣｌ ｐＨ７．８、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍ
Ｍジチオトレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、２５μｇ／μ
ｌ ＢＳＡ）中に再懸濁させ、３，０００ＵのＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ， ＃２０２）を添加した。両連結反応混合物を１６
℃で一晩、次いで７２℃で２０分間インキュベートし
た。
ポリメラーゼＩ遺伝子のクローニング １． 逆（ｉｎｖｅｒｓｅ）ＰＣＲを用いてのＢｓｔ
Ｐｏｌ Ｉ遺伝子の３′末端の決定 １反応当たり１．２μｇのＢ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムＤＮＡを用いて、複数の個別管
内で制限消化を行なった。前記ＤＮＡを４５μｌのＮＥ
Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｕ３ＡＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ ＮＥＢｕｆｆｅｒ Ｓａｕ３ＡＩ＝
１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭビストリスプロパン−
ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭジチオトレイト
ール；ｐＨ７．０＠２５℃）に加えた混合物に、５０Ｕ
のＳａｕ３ＡＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ， ＃１６９）を添加した。前記ＤＮＡを４５μｌ
のＮＥＢｕｆｆｅｒ ４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ ＮＥＢｕｆｆｅｒ ４＝５０ｍＭ酢酸カ
リウム、２０ｍＭトリス−酢酸塩、１０ｍＭ酢酸マグネ
シウム、１ｍＭジチオトレイトール； ｐＨ７．９＠２
５℃）に加えた混合物には、５０ＵのＮｇｏＭＩ（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，＃５６４）を添
加した。Ｓａｕ３ＡＩ反応混合物には１００μｇ／ｍｌ
のＢＳＡを含有させた。いずれの反応混合物も最終体積
を５０μｌとした。両消化物を３７℃で１時間インキュ
ベートした。消化物から制限酵素を、フェノール（１
回）及びクロロホルム（２回）での抽出によって除去し
た。各消化物に５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム及び１００
μｌの９５％エタノール／５％イソプロパノールを添加
することによってＤＮＡを沈澱させ、これを遠心によっ
て回収した。ＤＮＡを個別管内で５００μｌのＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌ
ａｂｓ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液＝５０ｍＭトリス
−ＨＣｌ ｐＨ７．８、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍ
Ｍジチオトレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、２５μｇ／μ
ｌ ＢＳＡ）中に再懸濁させ、３，０００ＵのＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ， ＃２０２）を添加した。両連結反応混合物を１６
℃で一晩、次いで７２℃で２０分間インキュベートし
た。
【００２７】次に、自己連結したＢｓｔゲノムＤＮＡ
を、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の３′末端を位置決めす
る逆ＰＣＲ反応において鋳型として用いた。上述のよう
に消化し、かつ自己連結させたＤＮＡ各１０ｎｇ、２０
０μＭ ｄＮＴＰ、５０ｎｇの順方向（ｆｏｒｗａｒ
ｄ）プライマー［５′ＧＡＴＴＴＡＧＣＧＧＣＡＣＧＧ
ＣＴＧＡＡＡＧＡＡ３′（配列番号５）］及び５０ｎｇ
の逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー［５′ＣＴＧＣ
ＡＡＡＡＣＴＧＣＧＧＡＣＧＴＴＧＡ３′（配列番号
６）］を４９．５μｌのＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液（Ｎ
ｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ ＴｈｅｒｍｏＰ
ｏｌ緩衝液＝１０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ ｐＨ８．８＠２５℃、１０ｍＭ （ＮＨ4）2Ｓ
Ｏ4、２ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００）に加えたものを用いて、個別管内でＰＣＲ反
応を生起させた。順方向及び逆方向プライマーはＢｓｔ
ゲノムＤＮＡに、互いから５５塩基対離隔してアニール
し、これらのプライマーはＤＮＡを反対方向へ伸長させ
るように設計してある。
を、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の３′末端を位置決めす
る逆ＰＣＲ反応において鋳型として用いた。上述のよう
に消化し、かつ自己連結させたＤＮＡ各１０ｎｇ、２０
０μＭ ｄＮＴＰ、５０ｎｇの順方向（ｆｏｒｗａｒ
ｄ）プライマー［５′ＧＡＴＴＴＡＧＣＧＧＣＡＣＧＧ
ＣＴＧＡＡＡＧＡＡ３′（配列番号５）］及び５０ｎｇ
の逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー［５′ＣＴＧＣ
ＡＡＡＡＣＴＧＣＧＧＡＣＧＴＴＧＡ３′（配列番号
６）］を４９．５μｌのＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液（Ｎ
ｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ ＴｈｅｒｍｏＰ
ｏｌ緩衝液＝１０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ ｐＨ８．８＠２５℃、１０ｍＭ （ＮＨ4）2Ｓ
Ｏ4、２ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００）に加えたものを用いて、個別管内でＰＣＲ反
応を生起させた。順方向及び逆方向プライマーはＢｓｔ
ゲノムＤＮＡに、互いから５５塩基対離隔してアニール
し、これらのプライマーはＤＮＡを反対方向へ伸長させ
るように設計してある。
【００２８】プライマー設計の基としたＤＮＡ配列はＢ
ｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子の、予めｐＧＥＭ−
Ｔベクター［Ｐｒｏｍｅｇａ， ＃Ａ３６２Ａ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉ
ｎ）］中へクローニングし、かつ配列決定した（Ｓａｎ
ｇｅｒ等， ＰＮＡＳ ７４， ｐｐ．５４６３−５４
６７， １９７７； この開示は本明細書中に参考とし
て含まれる）６４２塩基対断片に由来した。各反応混合
物に２．５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ［Ｐｅｒｋ
ｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｎ８０１−００４６（Ｐｅｒｋｉ
ｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ， Ｎｅｗ Ｊ
ｅｒｓｅｙ）］を添加し、最終体積を５０μｌとした。
上述のものと同じ反応混合物中に各鋳型を１０ｎｇずつ
用いて、付加的な４種のＰＣＲ反応も生起させた。しか
し、これらの反応では、２種のプライマーの各一方を２
種のＤＮＡ鋳型のそれぞれと共にインキュベートした
（４種の反応）。これらの反応の生成物は、２箇所にお
ける同一プライマーアニーリング及び前記２箇所の間の
領域の増幅によって創出されるバックグラウンドを表わ
す。
ｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子の、予めｐＧＥＭ−
Ｔベクター［Ｐｒｏｍｅｇａ， ＃Ａ３６２Ａ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉ
ｎ）］中へクローニングし、かつ配列決定した（Ｓａｎ
ｇｅｒ等， ＰＮＡＳ ７４， ｐｐ．５４６３−５４
６７， １９７７； この開示は本明細書中に参考とし
て含まれる）６４２塩基対断片に由来した。各反応混合
物に２．５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ［Ｐｅｒｋ
ｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｎ８０１−００４６（Ｐｅｒｋｉ
ｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ， Ｎｅｗ Ｊ
ｅｒｓｅｙ）］を添加し、最終体積を５０μｌとした。
上述のものと同じ反応混合物中に各鋳型を１０ｎｇずつ
用いて、付加的な４種のＰＣＲ反応も生起させた。しか
し、これらの反応では、２種のプライマーの各一方を２
種のＤＮＡ鋳型のそれぞれと共にインキュベートした
（４種の反応）。これらの反応の生成物は、２箇所にお
ける同一プライマーアニーリング及び前記２箇所の間の
領域の増幅によって創出されるバックグラウンドを表わ
す。
【００２９】いずれのＰＣＲ反応でも、最初のセグメン
トは９４℃で２分間のサイクル１回から成った。後続Ｐ
ＣＲセグメントはそれぞれ、９４℃で０．５分間、６２
℃で１分間及び７２℃で２分間のサイクル２０回、並び
に９４℃で０．５分間、６２℃で１分間及び７２℃で４
分間のサイクル１０回から成った。最後のセグメント
は、７２℃で２分間及び２５℃で１０分間のサイクル１
回から成った。各５０μｌ反応混合物から２０μｌを取
り分け、エチジウムブロミド存在下でのアガロースゲル
電気泳動に掛けて増幅が生起したかどうかを判定した。
Ｓａｕ３ＡＩで消化し、かつ自己連結させたＢｓｔ Ｄ
ＮＡを鋳型として用いた反応混合物では、約１．５ｋｂ
の大きさの増幅断片が得られた。ＮｇｏＭＩで消化し、
かつ自己連結させたＢｓｔ ＤＮＡを鋳型として用いた
反応混合物では、約０．９５ｋｂの大きさの増幅断片が
得られた。これら二つの断片は、４種のバックグラウン
ド反応で創出されたいずれの断片にも対応しなかった。
トは９４℃で２分間のサイクル１回から成った。後続Ｐ
ＣＲセグメントはそれぞれ、９４℃で０．５分間、６２
℃で１分間及び７２℃で２分間のサイクル２０回、並び
に９４℃で０．５分間、６２℃で１分間及び７２℃で４
分間のサイクル１０回から成った。最後のセグメント
は、７２℃で２分間及び２５℃で１０分間のサイクル１
回から成った。各５０μｌ反応混合物から２０μｌを取
り分け、エチジウムブロミド存在下でのアガロースゲル
電気泳動に掛けて増幅が生起したかどうかを判定した。
Ｓａｕ３ＡＩで消化し、かつ自己連結させたＢｓｔ Ｄ
ＮＡを鋳型として用いた反応混合物では、約１．５ｋｂ
の大きさの増幅断片が得られた。ＮｇｏＭＩで消化し、
かつ自己連結させたＢｓｔ ＤＮＡを鋳型として用いた
反応混合物では、約０．９５ｋｂの大きさの増幅断片が
得られた。これら二つの断片は、４種のバックグラウン
ド反応で創出されたいずれの断片にも対応しなかった。
【００３０】順方向プライマーと逆方向プライマーとの
両方を用いて２種の鋳型を別個に増幅するＰＣＲ反応を
繰り返した。前回と同じＰＣＲ条件を用いたが、いずれ
の反応も８個の個別管内で、体積５０μｌの反応混合物
中に同等の試薬を用いて生起させた。総量４００μｌの
各反応混合物を、エチジウムブロミド存在下にＴＡＥ緩
衝液（４０ｍＭトリス−酢酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中の
１％低温融解アガロースゲル上で行なうアガロースゲル
電気泳動に掛けた。適当なバンド（Ｓａｕ３ＡＩの場合
１．５ｋｂ、ＮｇｏＭＩの場合０．９５ｋｂ）を切り取
り、別個の管内で６５℃に加熱した。アガロースが融解
した後、５０μｌのβ−アガロースＩ緩衝液（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ β−アガロースＩ緩
衝液＝１０ｍＭビストリス−ＨＣｌ ｐＨ６．５、１ｍ
Ｍ Ｎａ2ＥＤＴＡ）を添加し、管を４０℃に冷却し
た。各反応混合物に４Ｕのβ−アガロースＩ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， ＃３９２）を添加
した。β−アガロースＩ処理は４０℃で１時間行なっ
た。β−アガロース及びＤＮＡポリメラーゼをフェノー
ル（１回）及びクロロホルム（２回）での抽出によって
除去した。５０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム及び１，００
０μｌの９５％エタノール／５％イソプロパノールを添
加することによってＤＮＡを沈澱させ、これを遠心によ
って回収した。各ＤＮＡペレットを５０μｌの１×ＴＥ
（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ）中に再懸濁させ、１μｌ試料をアガロースゲル電
気泳動に掛けてＤＮＡ濃度を測定した。両ＤＮＡ断片
を、ＤＮＡをポリメラーゼ遺伝子の３′末端方向へ伸長
させると考えられる順方向プライマーを用いて配列決定
した（Ｓａｎｇｅｒ等， ＰＮＡＳ ７４， ｐｐ．５
４６３−５４６７， １９７７； この開示は本明細書
中に参考として含まれる）。ＮｇｏＭＩで消化し、かつ
自己連結させた配列中の１８０塩基対の位置に終結コド
ン（ＴＡＡ）を見出した。
両方を用いて２種の鋳型を別個に増幅するＰＣＲ反応を
繰り返した。前回と同じＰＣＲ条件を用いたが、いずれ
の反応も８個の個別管内で、体積５０μｌの反応混合物
中に同等の試薬を用いて生起させた。総量４００μｌの
各反応混合物を、エチジウムブロミド存在下にＴＡＥ緩
衝液（４０ｍＭトリス−酢酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中の
１％低温融解アガロースゲル上で行なうアガロースゲル
電気泳動に掛けた。適当なバンド（Ｓａｕ３ＡＩの場合
１．５ｋｂ、ＮｇｏＭＩの場合０．９５ｋｂ）を切り取
り、別個の管内で６５℃に加熱した。アガロースが融解
した後、５０μｌのβ−アガロースＩ緩衝液（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ β−アガロースＩ緩
衝液＝１０ｍＭビストリス−ＨＣｌ ｐＨ６．５、１ｍ
Ｍ Ｎａ2ＥＤＴＡ）を添加し、管を４０℃に冷却し
た。各反応混合物に４Ｕのβ−アガロースＩ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， ＃３９２）を添加
した。β−アガロースＩ処理は４０℃で１時間行なっ
た。β−アガロース及びＤＮＡポリメラーゼをフェノー
ル（１回）及びクロロホルム（２回）での抽出によって
除去した。５０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム及び１，００
０μｌの９５％エタノール／５％イソプロパノールを添
加することによってＤＮＡを沈澱させ、これを遠心によ
って回収した。各ＤＮＡペレットを５０μｌの１×ＴＥ
（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ）中に再懸濁させ、１μｌ試料をアガロースゲル電
気泳動に掛けてＤＮＡ濃度を測定した。両ＤＮＡ断片
を、ＤＮＡをポリメラーゼ遺伝子の３′末端方向へ伸長
させると考えられる順方向プライマーを用いて配列決定
した（Ｓａｎｇｅｒ等， ＰＮＡＳ ７４， ｐｐ．５
４６３−５４６７， １９７７； この開示は本明細書
中に参考として含まれる）。ＮｇｏＭＩで消化し、かつ
自己連結させた配列中の１８０塩基対の位置に終結コド
ン（ＴＡＡ）を見出した。
【００３１】２． Ｂｓｔ Ｐｏｌ Ｉ遺伝子の増幅 ２μｇのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩをトリス−トリ
シン１０→２０％勾配ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖ
ｅｘ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａ）上での電気泳動に掛け、電気ブロット（ｅｌｅｃｔ
ｒｏｂｌｏｔ）した（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ， Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２， ｐｐ．１００３５
−１００３８， １９８７； この開示は本明細書中に
参考として含まれる）。膜をクーマシーブルーＲ−２５
０で染色し、約９７ｋＤａのタンパク質のバンドを切り
取り、連続的に分解（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｄｅｇｒ
ａｄａｔｉｏｎ）した（Ｗａｉｔｅ−Ｒｅｅｓ等，
Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３， ｐｐ．５２０７
−５２１９， １９９２； この開示は本明細書中に参
考として含まれる）。９７ｋＤａタンパク質の最初の７
残基はＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａ
ｌ−Ｌｅｕ（配列番号７）に対応した。プライマーは、
Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩのＮ末端アミノ酸配列
［５′ＷＴＧＡＡＲＡＡＲＡＡＲＣＴＮＧＴＮＹＴ３′
（配列番号８）］と、逆ＰＣＲから得られた遺伝子の
３′末端の配列［５′ＴＣＴＴＡＴＴＴＮＧＣＡＴＣＡ
ＴＡＣＣＡＴＧＴ３′（配列番号９）］とに基づき設計
した。１５０ｎｇのＢｓｔゲノムＤＮＡと、１００ｐｍ
ｏｌの各プライマーと、２００μＭ ｄＮＴＰとを９８
μｌのＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液に添加した。１μｌ
（５Ｕ）のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及び１μｌ
（０．０５Ｕ）のＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラ
ーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， ＃
２５８）を添加してＰＣＲ反応（９４℃で０．５分間、
４５℃で１分間及び７２℃で３分間のサイクル３５回）
を開始させた。１５μｌを取り分け、エチジウムブロミ
ド存在下でのアガロースゲル電気泳動に掛けた。Ｂｓｔ
ＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子の予測される大きさに対
応する２．６ｋｂの断片が増幅された。残りの８５μｌ
を、エチジウムブロミド存在下にＴＡＥ緩衝液中の１％
低温融解アガロースゲル上で行なうゲル電気泳動に掛
け、２．６ｋｂ断片を切り取った。ＤＮＡを含有する切
片をβ−アガロースＩで処理し、フェノール及びクロロ
ホルムで抽出し、エタノール及び酢酸ナトリウムで沈澱
させ、これらの操作はいずれも先に述べたように行なっ
た。ＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液中に再懸濁させた。
２．６ｋｂ断片の制限マッピングを行なって、完全な断
片のベクター中へのクローニングを可能にするプライマ
ーの設計がそれによって可能となる単一の制限部位の存
在を確認した。ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ及びＸｂａＩがＤＮ
Ａ断片を切断しなかったので、断片の３′末端にアニー
ルする、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ部位を有する第一のプラ
イマー［５′ＴＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＴＡ
ＴＴＴＮＧＣＡＴＣＡＴＡＣＣＡＴＧＴ３′（配列番号
１０）］と、断片の５′末端にアニールする、ＸｂａＩ
部位を有する第二のプライマー［５′ＡＴＴＣＴＡＧＡ
ＧＧＡＡＡＣＡＧＡＣＣＷＴＧＡＡＲＡＡＲＡＡＲＣＴ
ＮＧＴＮＹＴ３′（配列番号１１）］との二つのプライ
マーを設計した。２．６ｋｂ断片の増幅に用いたのとま
さに同じ条件下に、ただし本来のプライマーを上記制限
酵素部位を有するプライマーに置き換えてＰＣＲ反応を
生起させた。総量６００μｌのＰＣＲ反応混合物を収容
した同等の管を６本用いた。
シン１０→２０％勾配ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖ
ｅｘ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａ）上での電気泳動に掛け、電気ブロット（ｅｌｅｃｔ
ｒｏｂｌｏｔ）した（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ， Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２， ｐｐ．１００３５
−１００３８， １９８７； この開示は本明細書中に
参考として含まれる）。膜をクーマシーブルーＲ−２５
０で染色し、約９７ｋＤａのタンパク質のバンドを切り
取り、連続的に分解（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｄｅｇｒ
ａｄａｔｉｏｎ）した（Ｗａｉｔｅ−Ｒｅｅｓ等，
Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３， ｐｐ．５２０７
−５２１９， １９９２； この開示は本明細書中に参
考として含まれる）。９７ｋＤａタンパク質の最初の７
残基はＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａ
ｌ−Ｌｅｕ（配列番号７）に対応した。プライマーは、
Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩのＮ末端アミノ酸配列
［５′ＷＴＧＡＡＲＡＡＲＡＡＲＣＴＮＧＴＮＹＴ３′
（配列番号８）］と、逆ＰＣＲから得られた遺伝子の
３′末端の配列［５′ＴＣＴＴＡＴＴＴＮＧＣＡＴＣＡ
ＴＡＣＣＡＴＧＴ３′（配列番号９）］とに基づき設計
した。１５０ｎｇのＢｓｔゲノムＤＮＡと、１００ｐｍ
ｏｌの各プライマーと、２００μＭ ｄＮＴＰとを９８
μｌのＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液に添加した。１μｌ
（５Ｕ）のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及び１μｌ
（０．０５Ｕ）のＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラ
ーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， ＃
２５８）を添加してＰＣＲ反応（９４℃で０．５分間、
４５℃で１分間及び７２℃で３分間のサイクル３５回）
を開始させた。１５μｌを取り分け、エチジウムブロミ
ド存在下でのアガロースゲル電気泳動に掛けた。Ｂｓｔ
ＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子の予測される大きさに対
応する２．６ｋｂの断片が増幅された。残りの８５μｌ
を、エチジウムブロミド存在下にＴＡＥ緩衝液中の１％
低温融解アガロースゲル上で行なうゲル電気泳動に掛
け、２．６ｋｂ断片を切り取った。ＤＮＡを含有する切
片をβ−アガロースＩで処理し、フェノール及びクロロ
ホルムで抽出し、エタノール及び酢酸ナトリウムで沈澱
させ、これらの操作はいずれも先に述べたように行なっ
た。ＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液中に再懸濁させた。
２．６ｋｂ断片の制限マッピングを行なって、完全な断
片のベクター中へのクローニングを可能にするプライマ
ーの設計がそれによって可能となる単一の制限部位の存
在を確認した。ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ及びＸｂａＩがＤＮ
Ａ断片を切断しなかったので、断片の３′末端にアニー
ルする、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ部位を有する第一のプラ
イマー［５′ＴＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＴＡ
ＴＴＴＮＧＣＡＴＣＡＴＡＣＣＡＴＧＴ３′（配列番号
１０）］と、断片の５′末端にアニールする、ＸｂａＩ
部位を有する第二のプライマー［５′ＡＴＴＣＴＡＧＡ
ＧＧＡＡＡＣＡＧＡＣＣＷＴＧＡＡＲＡＡＲＡＡＲＣＴ
ＮＧＴＮＹＴ３′（配列番号１１）］との二つのプライ
マーを設計した。２．６ｋｂ断片の増幅に用いたのとま
さに同じ条件下に、ただし本来のプライマーを上記制限
酵素部位を有するプライマーに置き換えてＰＣＲ反応を
生起させた。総量６００μｌのＰＣＲ反応混合物を収容
した同等の管を６本用いた。
【００３２】総ての６００μｌ混合物を１％低温融解ア
ガロースゲル上でのゲル電気泳動に掛け、２．６ｋｂの
増幅ＤＮＡ断片をゲルから切り取った。アガロース中に
埋まったＤＮＡを１ｍｌのＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＮＥＢｕｆｆｅ
ｒ ２＝１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
2、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ； ｐＨ７．
９＠２５℃）に対し、４℃で４５分間透析した。次に、
アガロースを新しい管に入れ、６５℃で１０分間融解さ
せた。融解したアガロースゲルを３７℃に冷却し、７μ
ｌの１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、３．５Ｕのβ−アガロー
スＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂ
ｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）及び１
００ＵのＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ
ａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔ
ｔｓ）を添加した。３７℃で１時間インキュベートした
後、ｐＨ８．０の５Ｍ ＮａＣｌ及び１Ｍトリスを添加
して、ＮａＣｌ及びトリスの最終濃度をそれぞれ１００
ｍＭ及び５０ｍＭとした。その後、ＸｂａＩ消化物に１
００ＵのＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ
ａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔ
ｔｓ）を添加し、３７℃で更に１時間インキュベートし
た。Ｔ７プロモーターを含有するｐＥＴ−２１ａ（Ｎｏ
ｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）
１μｇを４５μｌのＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ，
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中で３７℃で１時間、２
５ＵのＮｏｔＩ及び５０ＵのＸｂａＩで消化した。先に
述べたのと同様に、反応混合物をフェノール及びクロロ
ホルムで抽出し、酢酸ナトリウム及びエタノールで沈澱
させ、６０μｌの１×ＴＥ中に再懸濁させた。４００ｎ
ｇのＸｂａＩ／ＮｏｔＩ消化ＰＣＲ生成物を４５μｌの
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液中で１００ｎｇのＸｂａＩ
／ＮｏｔＩ消化ｐＥＴ−２１ａに連結させた。５，００
０ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加して最終体積を５０
μｌとし、反応混合物を１６℃で４時間インキュベート
した。
ガロースゲル上でのゲル電気泳動に掛け、２．６ｋｂの
増幅ＤＮＡ断片をゲルから切り取った。アガロース中に
埋まったＤＮＡを１ｍｌのＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＮＥＢｕｆｆｅ
ｒ ２＝１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
2、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ； ｐＨ７．
９＠２５℃）に対し、４℃で４５分間透析した。次に、
アガロースを新しい管に入れ、６５℃で１０分間融解さ
せた。融解したアガロースゲルを３７℃に冷却し、７μ
ｌの１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、３．５Ｕのβ−アガロー
スＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂ
ｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）及び１
００ＵのＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ
ａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔ
ｔｓ）を添加した。３７℃で１時間インキュベートした
後、ｐＨ８．０の５Ｍ ＮａＣｌ及び１Ｍトリスを添加
して、ＮａＣｌ及びトリスの最終濃度をそれぞれ１００
ｍＭ及び５０ｍＭとした。その後、ＸｂａＩ消化物に１
００ＵのＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ
ａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔ
ｔｓ）を添加し、３７℃で更に１時間インキュベートし
た。Ｔ７プロモーターを含有するｐＥＴ−２１ａ（Ｎｏ
ｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）
１μｇを４５μｌのＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ，
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中で３７℃で１時間、２
５ＵのＮｏｔＩ及び５０ＵのＸｂａＩで消化した。先に
述べたのと同様に、反応混合物をフェノール及びクロロ
ホルムで抽出し、酢酸ナトリウム及びエタノールで沈澱
させ、６０μｌの１×ＴＥ中に再懸濁させた。４００ｎ
ｇのＸｂａＩ／ＮｏｔＩ消化ＰＣＲ生成物を４５μｌの
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液中で１００ｎｇのＸｂａＩ
／ＮｏｔＩ消化ｐＥＴ−２１ａに連結させた。５，００
０ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加して最終体積を５０
μｌとし、反応混合物を１６℃で４時間インキュベート
した。
【００３３】１００μｌのＣａＣｌ2コンピテント（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ等， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
１９８２； この開示は本明細書中に参考として含まれ
る）ＲＲＩ細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ）を１０μｌの連結混合物で形質転換し、アンピシ
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ（ルリアブロ
ス； １ｌ； トリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、１
７０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭグルコース、０．５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2； ｐＨ７．２）プレート上で３７℃で
一晩インキュベートした。コロニーを採取し、２．６ｋ
ｂ挿入物に関してミニプラスミド調製物（Ｗｉｚａｒｄ
Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ； ＤＮＡ精製系； Ｐｒｏｍｅ
ｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）でスク
リーニングした。スクリーニングした３８個の形質転換
体中５個が適正な挿入物を有し、これら適正な挿入物を
有する形質転換体のうちの１個から得た１μｌのミニプ
レップＤＮＡを用いて、ＩＰＴＧで誘導されるとＴ７
ＲＮＡポリメラーゼを産生し得るＣａＣｌ2コンピテン
トＥＲ２１６９細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅ
ｔｔｓ）５０μｌを形質転換した。細胞をアンピシリン
（１００μｇ／ｍｌ）含有ＬＢプレート上に播種し、３
７℃で一晩インキュベートした。一つのコロニーを採取
し、２０ｍｌのアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）含有
ＬＢ中でＫｌｅｔｔ ２００の読み取りができるまで３
７℃で増殖させた。ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭとな
るように添加し、細胞を３７℃で更に２時間増殖させ
た。細胞を遠心によって回収し、１０ｍｌの音波処理緩
衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス ｐＨ７．
４、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ２−メルカプトエ
タノール）中に再懸濁させ、音波処理によって溶解させ
た。溶解物を遠心によって分離し、かつ６５℃で２０分
間インキュベートして、大腸菌宿主細胞に由来するＤＮ
Ａポリメラーゼを変性させた。変性タンパク質を遠心に
よってペレット化し、上清をＢｓｔ ＤＮＡポリメラー
ゼＩ活性に関して、プライミングされた（ｐｒｉｍｅ
ｄ）Ｍ１３ｍｐ１８（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅ
ｔｔｓ）の一本鎖ＤＮＡ中への3Ｈ ｄＴＴＰの取り込
みを定量することによってアッセイした。５μｌの上清
を、２．８６ｍＭの、プライマー＃１２２４（ＮｅｗＥ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ，
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）をアニールされたＭ１３
一本鎖ＤＮＡ、２００μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、１００μＭ 3Ｈ ｄＴＴＰ、１００μｇ／ｍｌ
ＢＳＡ、２０ｍＭトリス ｐＨ８．８、５０ｍＭ Ｋ
Ｃｌ及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有するＢｓｔポリメ
ラーゼアッセイ混合物４５μｌと共に６５℃で５分間イ
ンキュベートした。４０μｌの反応混合物を濾紙（Ｗｈ
ａｔｍａｎ， ０２４−１０３０）にスポットし、濾紙
を１０％トリクロロ酢酸で３回、１００％イソプロパノ
ールで１回洗浄した。濾紙を乾燥し、3Ｈ ｄＴＴＰの
取り込みを液体シンチレーション計数によって定量し
た。１ｇの誘導ＥＲ２１６９細胞が約３０，０００Ｕの
Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩを産生することが確認さ
れた。
ａｎｉａｔｉｓ等， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
１９８２； この開示は本明細書中に参考として含まれ
る）ＲＲＩ細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ）を１０μｌの連結混合物で形質転換し、アンピシ
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ（ルリアブロ
ス； １ｌ； トリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、１
７０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭグルコース、０．５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2； ｐＨ７．２）プレート上で３７℃で
一晩インキュベートした。コロニーを採取し、２．６ｋ
ｂ挿入物に関してミニプラスミド調製物（Ｗｉｚａｒｄ
Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ； ＤＮＡ精製系； Ｐｒｏｍｅ
ｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）でスク
リーニングした。スクリーニングした３８個の形質転換
体中５個が適正な挿入物を有し、これら適正な挿入物を
有する形質転換体のうちの１個から得た１μｌのミニプ
レップＤＮＡを用いて、ＩＰＴＧで誘導されるとＴ７
ＲＮＡポリメラーゼを産生し得るＣａＣｌ2コンピテン
トＥＲ２１６９細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅ
ｔｔｓ）５０μｌを形質転換した。細胞をアンピシリン
（１００μｇ／ｍｌ）含有ＬＢプレート上に播種し、３
７℃で一晩インキュベートした。一つのコロニーを採取
し、２０ｍｌのアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）含有
ＬＢ中でＫｌｅｔｔ ２００の読み取りができるまで３
７℃で増殖させた。ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭとな
るように添加し、細胞を３７℃で更に２時間増殖させ
た。細胞を遠心によって回収し、１０ｍｌの音波処理緩
衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス ｐＨ７．
４、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ２−メルカプトエ
タノール）中に再懸濁させ、音波処理によって溶解させ
た。溶解物を遠心によって分離し、かつ６５℃で２０分
間インキュベートして、大腸菌宿主細胞に由来するＤＮ
Ａポリメラーゼを変性させた。変性タンパク質を遠心に
よってペレット化し、上清をＢｓｔ ＤＮＡポリメラー
ゼＩ活性に関して、プライミングされた（ｐｒｉｍｅ
ｄ）Ｍ１３ｍｐ１８（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅ
ｔｔｓ）の一本鎖ＤＮＡ中への3Ｈ ｄＴＴＰの取り込
みを定量することによってアッセイした。５μｌの上清
を、２．８６ｍＭの、プライマー＃１２２４（ＮｅｗＥ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ，
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）をアニールされたＭ１３
一本鎖ＤＮＡ、２００μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、１００μＭ 3Ｈ ｄＴＴＰ、１００μｇ／ｍｌ
ＢＳＡ、２０ｍＭトリス ｐＨ８．８、５０ｍＭ Ｋ
Ｃｌ及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有するＢｓｔポリメ
ラーゼアッセイ混合物４５μｌと共に６５℃で５分間イ
ンキュベートした。４０μｌの反応混合物を濾紙（Ｗｈ
ａｔｍａｎ， ０２４−１０３０）にスポットし、濾紙
を１０％トリクロロ酢酸で３回、１００％イソプロパノ
ールで１回洗浄した。濾紙を乾燥し、3Ｈ ｄＴＴＰの
取り込みを液体シンチレーション計数によって定量し
た。１ｇの誘導ＥＲ２１６９細胞が約３０，０００Ｕの
Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩを産生することが確認さ
れた。
【００３４】実施例２ Ｂｓｔ大断片をコードする５′末端切頭型Ｂｓｔ Ｐｏ
ｌ Ｉ遺伝子のクローニング １． Ｂｓｔ Ｌ． Ｆ．のＮ末端境界（ｂｏｒｄｅ
ｒ）のズブチリシンでの解明 ５０μｇのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩを、１４０ｍ
Ｍ Ｋ2ＰＯ4、３ｍＭβ−メルカプトエタノール、３０
ｍＭ硫酸アンモニウム、及び１２５μｇの仔ウシ胸腺Ｄ
ＮＡの存在下に室温で５分間ズブチリシン（最終濃度７
５ｎｇ／μｌ）で消化した。フェニルメチルスルホニル
フルオリドを２．４ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加するこ
とによって消化を停止した。得られたズブチリシン消化
ＢｓｔＬ． Ｆ．を４→２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ル（Ｄａｉｉｃｈｉ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅｐａ
ｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｎａｔｉｃｋ，Ｍａ
ｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）上での電気泳動によって定量
した。２μｇのズブチリシン消化ＢｓｔポリメラーゼＩ
を、トリス−トリシン１０→２０％勾配ポリアクリルア
ミドゲル（Ｎｏｖｅｘ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉａ）上での電気泳動に掛け、電気ブロッ
トした（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ， Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ． ２６２， ｐｐ．１００３５−１００３
８， １９８７； この開示は本明細書中に参考として
含まれる）。この６７ｋＤａ大断片のＮ末端アミノ酸配
列を先に述べたように決定した。６７ｋＤａタンパク質
の最初の７残基はＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番号１２）に対応し、この
ことはＢｓｔ Ｌ． Ｆ．のＮ末端境界がＡｌａ２８９
とＡｌａ２９０との間であることを示している（図
２）。この情報に基づき、Ｂｓｔ Ｌ． Ｆ．の境界の
下流にアニールするプライマー［５′ＡＡＴＴＴＧＣＧ
ＣＡＧＡＡＧＧＧＧＡＧＡＡＡＣＣＧＣＴＴＧＡ３′
（配列番号１３）］を設計した。このプライマーはＦｓ
ｐＩ切断部位を有するように設計したので、ＦｓｐＩで
消化してｐＭＡＬ−ｃ２ベクターのＸｍｎＩ部位に連結
させることができた。Ｂｓｔ Ｐｏｌ Ｉ遺伝子の３′
末端にアニールする、ＸｂａＩ切断部位を有する別のプ
ライマー［５′ＴＡＴＴＣＴＡＧＡＴＣＴＴＡＴＴＴＧ
ＧＣＡＴＣＡＴＡＣＣＡＴＧＴ３′（配列番号１４）］
も設計した。
ｌ Ｉ遺伝子のクローニング １． Ｂｓｔ Ｌ． Ｆ．のＮ末端境界（ｂｏｒｄｅ
ｒ）のズブチリシンでの解明 ５０μｇのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩを、１４０ｍ
Ｍ Ｋ2ＰＯ4、３ｍＭβ−メルカプトエタノール、３０
ｍＭ硫酸アンモニウム、及び１２５μｇの仔ウシ胸腺Ｄ
ＮＡの存在下に室温で５分間ズブチリシン（最終濃度７
５ｎｇ／μｌ）で消化した。フェニルメチルスルホニル
フルオリドを２．４ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加するこ
とによって消化を停止した。得られたズブチリシン消化
ＢｓｔＬ． Ｆ．を４→２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ル（Ｄａｉｉｃｈｉ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅｐａ
ｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｎａｔｉｃｋ，Ｍａ
ｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）上での電気泳動によって定量
した。２μｇのズブチリシン消化ＢｓｔポリメラーゼＩ
を、トリス−トリシン１０→２０％勾配ポリアクリルア
ミドゲル（Ｎｏｖｅｘ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉａ）上での電気泳動に掛け、電気ブロッ
トした（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ， Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ． ２６２， ｐｐ．１００３５−１００３
８， １９８７； この開示は本明細書中に参考として
含まれる）。この６７ｋＤａ大断片のＮ末端アミノ酸配
列を先に述べたように決定した。６７ｋＤａタンパク質
の最初の７残基はＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番号１２）に対応し、この
ことはＢｓｔ Ｌ． Ｆ．のＮ末端境界がＡｌａ２８９
とＡｌａ２９０との間であることを示している（図
２）。この情報に基づき、Ｂｓｔ Ｌ． Ｆ．の境界の
下流にアニールするプライマー［５′ＡＡＴＴＴＧＣＧ
ＣＡＧＡＡＧＧＧＧＡＧＡＡＡＣＣＧＣＴＴＧＡ３′
（配列番号１３）］を設計した。このプライマーはＦｓ
ｐＩ切断部位を有するように設計したので、ＦｓｐＩで
消化してｐＭＡＬ−ｃ２ベクターのＸｍｎＩ部位に連結
させることができた。Ｂｓｔ Ｐｏｌ Ｉ遺伝子の３′
末端にアニールする、ＸｂａＩ切断部位を有する別のプ
ライマー［５′ＴＡＴＴＣＴＡＧＡＴＣＴＴＡＴＴＴＧ
ＧＣＡＴＣＡＴＡＣＣＡＴＧＴ３′（配列番号１４）］
も設計した。
【００３５】ＰＣＲを生起させて、Ｂｓｔ大断片遺伝子
を増幅した。３９２μｌのＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液に
４００ｎｇの各プライマー及び２００μＭ ｄＮＴＰを
加えたものに１．６μｇのＢｓｔゲノムＤＮＡを添加し
た。反応混合物に、４０ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｂｒａｎｃｈｂｕｒ
ｇ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）及び０．４ＵのＤｅｅｐ
Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａ
ｃｈｕｓｅｔｔｓ）を添加した。ＰＣＲは、９４℃で
０．５分間、５０℃で１分間及び７２℃で３分間生起さ
せるサイクルを１８回実施した。Ｂｓｔ大断片遺伝子の
予測される大きさに対応する１．８ｋｂ断片が増幅され
た。残りのＰＣＲ生成物を精製し、ＦｓｐＩ及びＸｂａ
Ｉで切断した。１９５ｎｇのＦｓｐＩ／ＸｂａＩ消化Ｐ
ＣＲ生成物を４５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖ
ｅｒｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中で７５ｎ
ｇのＸｍｎＩ／ＸｂａＩ消化ｐＭＡＬ−ｃ２に連結させ
た。５，０００ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、反
応混合物を１６℃で４時間インキュベートした。１００
μｌのＣａＣｌ2コンピテント（Ｍａｎｉａｔｉｓ等，
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ， １９８２； この開示
は本明細書中に参考として含まれる）ＲＲＩ細胞（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌ
ｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を１０μｌの連結混
合物で形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）
を含有するＬＢプレート上で３７℃で一晩インキュベー
トした。適正な挿入物をミニプラスミド調製物でスクリ
ーニングした。スクリーニングした１６個の形質転換体
中２個が予測された１．８ｋｂ挿入物を有した。クロー
ニングした遺伝子を、マルトース結合タンパク質（ＭＢ
Ｐ）をコードするｐＭＡＬ−ｃ２ ｍａｌＥ遺伝子（大
腸菌由来）の下流に直接挿入し、それによってＩＰＴＧ
で誘導すればＭＢＰ−Ｂｓｔ Ｌ． Ｆ．融合タンパク
質が発現されるようにした。正しく構築した組み換えプ
ラスミドを用いて、５０μｌのＣａＣｌ2コンピテント
ＴＢ１細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）
を形質転換した。形質転換プレートから得た単一コロニ
ーを２０ｍｌのアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）含有
ＬＢに接種した。培養がＫｌｅｔｔ ２００に到達した
時ＩＰＴＧを濃度０．５ｍＭとなるように添加し、細胞
を３７℃で更に２時間増殖させた。
を増幅した。３９２μｌのＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液に
４００ｎｇの各プライマー及び２００μＭ ｄＮＴＰを
加えたものに１．６μｇのＢｓｔゲノムＤＮＡを添加し
た。反応混合物に、４０ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｂｒａｎｃｈｂｕｒ
ｇ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）及び０．４ＵのＤｅｅｐ
Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａ
ｃｈｕｓｅｔｔｓ）を添加した。ＰＣＲは、９４℃で
０．５分間、５０℃で１分間及び７２℃で３分間生起さ
せるサイクルを１８回実施した。Ｂｓｔ大断片遺伝子の
予測される大きさに対応する１．８ｋｂ断片が増幅され
た。残りのＰＣＲ生成物を精製し、ＦｓｐＩ及びＸｂａ
Ｉで切断した。１９５ｎｇのＦｓｐＩ／ＸｂａＩ消化Ｐ
ＣＲ生成物を４５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖ
ｅｒｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中で７５ｎ
ｇのＸｍｎＩ／ＸｂａＩ消化ｐＭＡＬ−ｃ２に連結させ
た。５，０００ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、反
応混合物を１６℃で４時間インキュベートした。１００
μｌのＣａＣｌ2コンピテント（Ｍａｎｉａｔｉｓ等，
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ， １９８２； この開示
は本明細書中に参考として含まれる）ＲＲＩ細胞（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌ
ｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を１０μｌの連結混
合物で形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）
を含有するＬＢプレート上で３７℃で一晩インキュベー
トした。適正な挿入物をミニプラスミド調製物でスクリ
ーニングした。スクリーニングした１６個の形質転換体
中２個が予測された１．８ｋｂ挿入物を有した。クロー
ニングした遺伝子を、マルトース結合タンパク質（ＭＢ
Ｐ）をコードするｐＭＡＬ−ｃ２ ｍａｌＥ遺伝子（大
腸菌由来）の下流に直接挿入し、それによってＩＰＴＧ
で誘導すればＭＢＰ−Ｂｓｔ Ｌ． Ｆ．融合タンパク
質が発現されるようにした。正しく構築した組み換えプ
ラスミドを用いて、５０μｌのＣａＣｌ2コンピテント
ＴＢ１細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）
を形質転換した。形質転換プレートから得た単一コロニ
ーを２０ｍｌのアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）含有
ＬＢに接種した。培養がＫｌｅｔｔ ２００に到達した
時ＩＰＴＧを濃度０．５ｍＭとなるように添加し、細胞
を３７℃で更に２時間増殖させた。
【００３６】細胞を遠心によって回収し、１０ｍｌの音
波処理緩衝液中に再懸濁させ、音波処理によって溶解さ
せた。溶解物を遠心によって分離し、かつ６５℃で２０
分間インキュベートして、宿主細胞に由来するＤＮＡポ
リメラーゼを変性させた。変性タンパク質を遠心によっ
てペレット化し、上清をＢｓｔポリメラーゼ活性に関し
て実施例１に述べたようにアッセイした。１ｇの形質転
換ＴＢ１細胞が約１３０，０００ＵのＢｓｔ大断片を産
生することが確認された。Ｂｓｔ Ｌ． Ｆ．を有する
融合構築物のサンプルを、ブダペスト条約に基づき１９
９５年８月２日付でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、ＡＴＣＣ
受託番号第６９８７７号を付与された。
波処理緩衝液中に再懸濁させ、音波処理によって溶解さ
せた。溶解物を遠心によって分離し、かつ６５℃で２０
分間インキュベートして、宿主細胞に由来するＤＮＡポ
リメラーゼを変性させた。変性タンパク質を遠心によっ
てペレット化し、上清をＢｓｔポリメラーゼ活性に関し
て実施例１に述べたようにアッセイした。１ｇの形質転
換ＴＢ１細胞が約１３０，０００ＵのＢｓｔ大断片を産
生することが確認された。Ｂｓｔ Ｌ． Ｆ．を有する
融合構築物のサンプルを、ブダペスト条約に基づき１９
９５年８月２日付でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、ＡＴＣＣ
受託番号第６９８７７号を付与された。
【００３７】実施例３ Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片の精製 ステップ５以外、いずれのステップも４℃で実施した。
【００３８】ステップ１： 粗抽出物の調製 ６４ｇの酵素保持（ｂｅａｒｉｎｇ）細胞（ＮＥＢ ＃
９５６）を解凍し、緩衝液Ｃ（２００ｍＭ ＮａＣｌ、
２０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１ｍＭＥＤＴ
Ａ、１ｍＭ ＤＴＴ）中に再懸濁させた。細胞を８分間
の音波処理によって破壊した。抽出物を４℃において、
Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１遠心機で１２，０００ｒｐ
ｍで３０分間遠心した。デカンテーションによって上清
を分離した。
９５６）を解凍し、緩衝液Ｃ（２００ｍＭ ＮａＣｌ、
２０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１ｍＭＥＤＴ
Ａ、１ｍＭ ＤＴＴ）中に再懸濁させた。細胞を８分間
の音波処理によって破壊した。抽出物を４℃において、
Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１遠心機で１２，０００ｒｐ
ｍで３０分間遠心した。デカンテーションによって上清
を分離した。
【００３９】ステップ２： アミロースアフィニティー
クロマトグラフィー ステップ１で得た上清を、緩衝液Ｃで平衡させた２００
ｍｌ容アミロース（ＮＥＢ ＃８００−２１）カラムに
添加した。カラムを２，２００ｍｌの緩衝液Ｃで洗浄
し、１０ｍＭのマルトースを含有する緩衝液Ｃ ８００
ｍｌで酵素を溶離した。タンパク質ピーク画分をプール
し、緩衝液Ｄ（５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス
−ＨＣｌ ｐＨ７．４、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ
ＤＴＴ、５０％グリセロール）中への透析で濃縮し
た。
クロマトグラフィー ステップ１で得た上清を、緩衝液Ｃで平衡させた２００
ｍｌ容アミロース（ＮＥＢ ＃８００−２１）カラムに
添加した。カラムを２，２００ｍｌの緩衝液Ｃで洗浄
し、１０ｍＭのマルトースを含有する緩衝液Ｃ ８００
ｍｌで酵素を溶離した。タンパク質ピーク画分をプール
し、緩衝液Ｄ（５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス
−ＨＣｌ ｐＨ７．４、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ
ＤＴＴ、５０％グリセロール）中への透析で濃縮し
た。
【００４０】ステップ３： Ｓ−１００サイズ排除クロ
マトグラフィー 前ステップで得られた貯溜物を、緩衝液Ｄで平衡させた
５ｃｍ×９０ｃｍ Ｓ−１００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ
Ｊｅｒｓｅｙ）カラムに添加した。２，０００ｍｌのＳ
緩衝液の添加によって酵素を溶離した。酵素含有画分を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認し、プールし、緩衝液Ｅ
（５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ
７．８、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）中へ
透析した。
マトグラフィー 前ステップで得られた貯溜物を、緩衝液Ｄで平衡させた
５ｃｍ×９０ｃｍ Ｓ−１００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ
Ｊｅｒｓｅｙ）カラムに添加した。２，０００ｍｌのＳ
緩衝液の添加によって酵素を溶離した。酵素含有画分を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認し、プールし、緩衝液Ｅ
（５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ
７．８、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）中へ
透析した。
【００４１】ステップ４： Ｘａ因子プロテアーゼによ
る融合タンパク質の切断 前ステップで得られた酵素２００ｍｇ（１５０ｍｌ中）
を２ｍｇのＸａ因子（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ ＃８００−１０）と共に４℃で２２時間イン
キュベートした。
る融合タンパク質の切断 前ステップで得られた酵素２００ｍｇ（１５０ｍｌ中）
を２ｍｇのＸａ因子（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ ＃８００−１０）と共に４℃で２２時間イン
キュベートした。
【００４２】ステップ５： Ｘａ因子への熱負荷付与
（ｈｅａｔ−ｓｔｒｅｓｓｉｎｇ） ステップ４で得られた切断生成物１５０ｍｌに、６５℃
で２０分間のインキュベーションと、続く４℃への冷却
とによって熱負荷を付与した。
（ｈｅａｔ−ｓｔｒｅｓｓｉｎｇ） ステップ４で得られた切断生成物１５０ｍｌに、６５℃
で２０分間のインキュベーションと、続く４℃への冷却
とによって熱負荷を付与した。
【００４３】ステップ６： Ｓｏｕｒｃｅ−Ｑイオン交
換クロマトグラフィー 前ステップで得られた貯溜物を、緩衝液Ｅで平衡させた
１．６ｃｍ×１０ｃｍＳｏｕｒｃｅ−Ｑ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，
Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）カラムに添加した。上記と同
じ緩衝液中で、１５０ｍｌの５０→６００ｍＭ直線勾配
ＮａＣｌで酵素を溶離した。酵素含有画分をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで確認し、プールした。
換クロマトグラフィー 前ステップで得られた貯溜物を、緩衝液Ｅで平衡させた
１．６ｃｍ×１０ｃｍＳｏｕｒｃｅ−Ｑ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，
Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）カラムに添加した。上記と同
じ緩衝液中で、１５０ｍｌの５０→６００ｍＭ直線勾配
ＮａＣｌで酵素を溶離した。酵素含有画分をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで確認し、プールした。
【００４４】ステップ７： ヘパリン−ＴＳＫ ５ＰＷ
ガードレジンカラムクロマトグラフィー 前ステップで得られた貯溜物を７倍容量の２０ｍＭ Ｋ
ＰＯ4（ｐＨ６．９）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ
ＤＴＴで稀釈し、緩衝液Ｇ（５０ｍＭ ＮａＣｌ、２
０ｍＭ ＫＰＯ4 ｐＨ６．９、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１ｍＭ ＤＴＴ）で平衡させた１ｃｍ×１０ｃｍヘ
パリン−ＴＳＫ ５ＰＷガードレジンカラムに添加し
た。Ｈ緩衝液中で、１００ｍｌの５０→６００ｍＭ直線
勾配ＮａＣｌで酵素を溶離した。酵素含有画分をＳＤＳ
−ＰＡＧＥ（図４）で確認し、プールし、２０倍容量の
貯蔵緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴ
Ｔ）に対して透析した。５０μｌの反応混合物中の１，
０００単位を最適反応条件下に４時間インキュベートし
て確認したところ、酵素調製物は実質的に純粋で、他の
汚染酵素／タンパク質を含有せず、かつ検出可能なエキ
ソヌクレアーゼ活性を有しなかった。
ガードレジンカラムクロマトグラフィー 前ステップで得られた貯溜物を７倍容量の２０ｍＭ Ｋ
ＰＯ4（ｐＨ６．９）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ
ＤＴＴで稀釈し、緩衝液Ｇ（５０ｍＭ ＮａＣｌ、２
０ｍＭ ＫＰＯ4 ｐＨ６．９、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１ｍＭ ＤＴＴ）で平衡させた１ｃｍ×１０ｃｍヘ
パリン−ＴＳＫ ５ＰＷガードレジンカラムに添加し
た。Ｈ緩衝液中で、１００ｍｌの５０→６００ｍＭ直線
勾配ＮａＣｌで酵素を溶離した。酵素含有画分をＳＤＳ
−ＰＡＧＥ（図４）で確認し、プールし、２０倍容量の
貯蔵緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴ
Ｔ）に対して透析した。５０μｌの反応混合物中の１，
０００単位を最適反応条件下に４時間インキュベートし
て確認したところ、酵素調製物は実質的に純粋で、他の
汚染酵素／タンパク質を含有せず、かつ検出可能なエキ
ソヌクレアーゼ活性を有しなかった。
【００４５】
配列番号：１ 配列の長さ：２６３１ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列の特徴 特徴を表わす記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．２６３１ 配列
【００４６】
【表１】
【００４７】
【表２】
【００４８】
【表３】
【００４９】
【表４】
【００５０】
【表５】
【００５１】
【表６】
【００５２】配列番号：２ 配列の長さ：８７６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【００５３】
【表７】
【００５４】
【表８】
【００５５】
【表９】
【００５６】
【表１０】
【００５７】
【表１１】
【００５８】配列番号：３ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列
【００５９】
【表１２】
【００６０】配列番号：４ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列
【００６１】
【表１３】
【００６２】配列番号：５ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列
【００６３】
【表１４】
【００６４】配列番号：６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列
【００６５】
【表１５】
【００６６】配列番号：７ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列
【００６７】
【表１６】
【００６８】配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列
【００６９】
【表１７】
【００７０】配列番号：９ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列
【００７１】
【表１８】
【００７２】配列番号：１０ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列
【００７３】
【表１９】
【００７４】配列番号：１１ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列
【００７５】
【表２０】
【００７６】配列番号：１２ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列
【００７７】
【表２１】
【００７８】配列番号：１３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列
【００７９】
【表２２】
【００８０】配列番号：１４ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列
【００８１】
【表２３】
【図１】精製したＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩを分子
量標準と共に示す１０→２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルを示す説明図である。
量標準と共に示す１０→２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルを示す説明図である。
【図２Ａ】Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子のヌク
レオチド配列（配列番号１）及び前記遺伝子がコードす
るタンパク質配列（配列番号２）を示す。ズブチリシン
切断部位を「*」によって示し、またＮ末端タンパク質
配列によって確認されたアミノ酸配列は下線を付して示
す。
レオチド配列（配列番号１）及び前記遺伝子がコードす
るタンパク質配列（配列番号２）を示す。ズブチリシン
切断部位を「*」によって示し、またＮ末端タンパク質
配列によって確認されたアミノ酸配列は下線を付して示
す。
【図２Ｂ】Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子のヌク
レオチド配列（配列番号１）及び前記遺伝子がコードす
るタンパク質配列（配列番号２）を示す。ズブチリシン
切断部位を「*」によって示し、またＮ末端タンパク質
配列によって確認されたアミノ酸配列は下線を付して示
す。
レオチド配列（配列番号１）及び前記遺伝子がコードす
るタンパク質配列（配列番号２）を示す。ズブチリシン
切断部位を「*」によって示し、またＮ末端タンパク質
配列によって確認されたアミノ酸配列は下線を付して示
す。
【図２Ｃ】Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子のヌク
レオチド配列（配列番号１）及び前記遺伝子がコードす
るタンパク質配列（配列番号２）を示す。ズブチリシン
切断部位を「*」によって示し、またＮ末端タンパク質
配列によって確認されたアミノ酸配列は下線を付して示
す。
レオチド配列（配列番号１）及び前記遺伝子がコードす
るタンパク質配列（配列番号２）を示す。ズブチリシン
切断部位を「*」によって示し、またＮ末端タンパク質
配列によって確認されたアミノ酸配列は下線を付して示
す。
【図３】Ｘａ因子によるＭＢＰ−Ｂｓｔ Ｌ． Ｆ．融
合タンパク質の切断を示す説明図である。レーン１〜４
は切断されていないＳ−１００貯溜物（それぞれ約２．
７、５．４、１０．７及び２１．４μｇ）を示す。レー
ン５〜８は、Ｘａ因子プロテアーゼ（重量比１％）によ
って４℃で１８時間インキュベートして切断された同量
の融合タンパク質を示す。レーンＭの分子量マーカー
は、２１２、１５８、１１６、９７．２、６６．４、５
５．６、４２．７、３６．５、２６．６、２０．０、１
４．３及び６．５ｋＤａである。融合タンパク質は約１
１０ｋＤａに対応する。Ｘａ因子プロテアーゼは約３９
ｋＤａに対応する。Ｂｓｔポリメラーゼ大断片は約６７
ｋＤａに対応し、ＭＢＰ部分は約４２．７ｋＤａに対応
する。
合タンパク質の切断を示す説明図である。レーン１〜４
は切断されていないＳ−１００貯溜物（それぞれ約２．
７、５．４、１０．７及び２１．４μｇ）を示す。レー
ン５〜８は、Ｘａ因子プロテアーゼ（重量比１％）によ
って４℃で１８時間インキュベートして切断された同量
の融合タンパク質を示す。レーンＭの分子量マーカー
は、２１２、１５８、１１６、９７．２、６６．４、５
５．６、４２．７、３６．５、２６．６、２０．０、１
４．３及び６．５ｋＤａである。融合タンパク質は約１
１０ｋＤａに対応する。Ｘａ因子プロテアーゼは約３９
ｋＤａに対応する。Ｂｓｔポリメラーゼ大断片は約６７
ｋＤａに対応し、ＭＢＰ部分は約４２．７ｋＤａに対応
する。
【図４】Ｘａ因子による切断後の精製Ｂｓｔ Ｌ．
Ｆ．を示す１０→２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示
す説明図である。レーン１は約４μｇの最終精製Ｂｓｔ
ポリメラーゼ大断片タンパク質を示す。レーン８の分子
量マーカーは、２１２、１５８、１１６、９７．２、６
６．４、５５．６、４２．７、３６．５、２６．６、２
０．０、１４．３及び６．５ｋＤａである。Ｂｓｔポリ
メラーゼ大断片は約６７ｋＤａに対応する。
Ｆ．を示す１０→２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示
す説明図である。レーン１は約４μｇの最終精製Ｂｓｔ
ポリメラーゼ大断片タンパク質を示す。レーン８の分子
量マーカーは、２１２、１５８、１１６、９７．２、６
６．４、５５．６、４２．７、３６．５、２６．６、２
０．０、１４．３及び６．５ｋＤａである。Ｂｓｔポリ
メラーゼ大断片は約６７ｋＤａに対応する。
【図５】Ｂｓｔ Ｐｏｌ Ｉエキソヌクレアーゼの方向
性を測定するエキソヌクレアーゼ活性アッセイの結果を
示すグラフである。５′→３′及び３′→５′エキソヌ
クレアーゼ活性を、３′末端を3Ｈで標識し、５′末端
を32Ｐで標識したＥｃｏＲＩ消化ｐＵＣ１９を用いて測
定する。ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩで消化し、４塩基５′
突出部を残す。クレノウ断片によって突出部に3Ｈ ｄ
ＴＴＰを取り込ませ、即ち３′末端を3Ｈで標識する。
５′末端は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより32Ｐ
−γＡＴＰでリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｌａｔｅ）
する。この二重標識基質を、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラー
ゼＩ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴａｑ ＤＮ
Ａポリメラーゼそれぞれと共に６５℃で、また大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩと共に３７℃で様々な時間インキュ
ベートする。ＤＮＡを１０％ＴＣＡの添加によって沈澱
させ、遠心によって回収する。上清中に存在する酸溶解
性の放射能を液体シンチレーションによって定量する。
３′末端からの3Ｈの可溶化は３′→５′エキソヌクレ
アーゼ活性の存在を示す。５′末端からの32Ｐの放出は
５′→３′エキソヌクレアーゼ活性の存在を示す。Ｂｓ
ｔ ＤＮＡポリメラーゼ（◇）は３′末端から3Ｈを除
去せず、従って３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を欠
如するのでＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（〇）に類似す
る。
性を測定するエキソヌクレアーゼ活性アッセイの結果を
示すグラフである。５′→３′及び３′→５′エキソヌ
クレアーゼ活性を、３′末端を3Ｈで標識し、５′末端
を32Ｐで標識したＥｃｏＲＩ消化ｐＵＣ１９を用いて測
定する。ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩで消化し、４塩基５′
突出部を残す。クレノウ断片によって突出部に3Ｈ ｄ
ＴＴＰを取り込ませ、即ち３′末端を3Ｈで標識する。
５′末端は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより32Ｐ
−γＡＴＰでリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｌａｔｅ）
する。この二重標識基質を、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラー
ゼＩ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴａｑ ＤＮ
Ａポリメラーゼそれぞれと共に６５℃で、また大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩと共に３７℃で様々な時間インキュ
ベートする。ＤＮＡを１０％ＴＣＡの添加によって沈澱
させ、遠心によって回収する。上清中に存在する酸溶解
性の放射能を液体シンチレーションによって定量する。
３′末端からの3Ｈの可溶化は３′→５′エキソヌクレ
アーゼ活性の存在を示す。５′末端からの32Ｐの放出は
５′→３′エキソヌクレアーゼ活性の存在を示す。Ｂｓ
ｔ ＤＮＡポリメラーゼ（◇）は３′末端から3Ｈを除
去せず、従って３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を欠
如するのでＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（〇）に類似す
る。
【図６】プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性
アッセイの結果を示すグラフである。Ｍ１３ｍｐ１８一
本鎖ＤＮＡを、３′末端にＧ：Ａミスマッチを有するプ
ライマーとアニールした。３′→５′エキソヌクレアー
ゼを有するＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼはミスマッチ
のＧを効率的に除去してプライマーを伸長させ得、その
結果相対ポリメラーゼ活性が高くなる（図６の「Ｖｅｎ
ｔ（ｅｘｏ＋）」）。Ｔａｑポリメラーゼは３′→５′
エキソヌクレアーゼを有せず、従ってミスマッチを修正
できないので、１／５の低い相対ポリメラーゼ活性しか
有しない（図６の「Ｔａｑ」）。Ｔａｑポリメラーゼ同
様、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼも低い相対ポリメラー
ゼ活性しか有せず、このことは、３′末端が伸長したＤ
ＮＡポリメラーゼであり得るように、ミスマッチのＧを
除去するのに必要な３′→５′エキソヌクレアーゼ活性
を有しないことを示している。
アッセイの結果を示すグラフである。Ｍ１３ｍｐ１８一
本鎖ＤＮＡを、３′末端にＧ：Ａミスマッチを有するプ
ライマーとアニールした。３′→５′エキソヌクレアー
ゼを有するＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼはミスマッチ
のＧを効率的に除去してプライマーを伸長させ得、その
結果相対ポリメラーゼ活性が高くなる（図６の「Ｖｅｎ
ｔ（ｅｘｏ＋）」）。Ｔａｑポリメラーゼは３′→５′
エキソヌクレアーゼを有せず、従ってミスマッチを修正
できないので、１／５の低い相対ポリメラーゼ活性しか
有しない（図６の「Ｔａｑ」）。Ｔａｑポリメラーゼ同
様、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼも低い相対ポリメラー
ゼ活性しか有せず、このことは、３′末端が伸長したＤ
ＮＡポリメラーゼであり得るように、ミスマッチのＧを
除去するのに必要な３′→５′エキソヌクレアーゼ活性
を有しないことを示している。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年１１月１４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】 Ｘａ因子によるＭＢＰ−Ｂｓｔ Ｌ．
Ｆ．融合タンパク質の切断を示す電気泳動写真であ
る。レーン１〜４は切断されていないＳ−１００貯溜物
（それぞれ約２．７、５．４、１０．７及び２１．４μ
ｇ）を示す。レーン５〜８は、Ｘａ因子プロテアーゼ
（重量比１％）によって４℃で１８時間インキュベート
して切断された同量の融合タンパク質を示す。レーンＭ
の分子量マーカーは、２１２、１５８、１１６、９７．
２、６６．４、５５．６、４２．７、３６．５、２６．
６、２０．０、１４．３及び６．５ｋＤａである。融合
タンパク質は約１１０ｋＤａに対応する。Ｘａ因子プロ
テアーゼは約３９ｋＤａに対応する。Ｂｓｔポリメラー
ゼ大断片は約６７ｋＤａに対応し、ＭＢＰ部分は約４
２．７ｋＤａに対応する。
Ｆ．融合タンパク質の切断を示す電気泳動写真であ
る。レーン１〜４は切断されていないＳ−１００貯溜物
（それぞれ約２．７、５．４、１０．７及び２１．４μ
ｇ）を示す。レーン５〜８は、Ｘａ因子プロテアーゼ
（重量比１％）によって４℃で１８時間インキュベート
して切断された同量の融合タンパク質を示す。レーンＭ
の分子量マーカーは、２１２、１５８、１１６、９７．
２、６６．４、５５．６、４２．７、３６．５、２６．
６、２０．０、１４．３及び６．５ｋＤａである。融合
タンパク質は約１１０ｋＤａに対応する。Ｘａ因子プロ
テアーゼは約３９ｋＤａに対応する。Ｂｓｔポリメラー
ゼ大断片は約６７ｋＤａに対応し、ＭＢＰ部分は約４
２．７ｋＤａに対応する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】 Ｘａ因子による切断後の精製Ｂｓｔ
Ｌ． Ｆ．を示す１０→２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルの電気泳動写真である。レーン１は約４μｇの最終精
製Ｂｓｔポリメラーゼ大断片タンパク質を示す。レーン
８の分子量マーカーは、２１２、１５８、１１６、９
７．２、６６．４、５５．６、４２．７、３６．５、２
６．６、２０．０、１４．３及び６．５ｋＤａである。
Ｂｓｔポリメラーゼ大断片は約６７ｋＤａに対応する。
Ｌ． Ｆ．を示す１０→２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルの電気泳動写真である。レーン１は約４μｇの最終精
製Ｂｓｔポリメラーゼ大断片タンパク質を示す。レーン
８の分子量マーカーは、２１２、１５８、１１６、９
７．２、６６．４、５５．６、４２．７、３６．５、２
６．６、２０．０、１４．３及び６．５ｋＤａである。
Ｂｓｔポリメラーゼ大断片は約６７ｋＤａに対応する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ジヨン・ジエイ・ペルチヤー アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 01913、エイムズベリ、ホワイトホール・ ロード・130 (72)発明者 ジエイスン・エム・アリオツタ アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02159、ニユートン、コモンウエルス・ア ベニユー・910
Claims (15)
- 【請求項１】 単離ＤＮＡの発現産物が３’→５’エキ
ソヌクレアーゼを実質的にもたないことを特徴とする、
ＢｓｔＩ ＤＮＡポリメラーゼをコードする単離ＤＮ
Ａ。 - 【請求項２】 単離ＤＮＡポリメラーゼの発現産物が
５’→３’エキソヌクレアーゼを実質的にもたないこと
を特徴とする、請求項１に記載の単離ＤＮＡ。 - 【請求項３】 単離ＤＮＡが配列番号１のヌクレオチド
８６８〜２６３１を含むことを特徴とする請求項１に記
載の単離ＤＮＡ。 - 【請求項４】 請求項１から３のいずれか一項に記載の
単離ＤＮＡを含むベクター。 - 【請求項５】 請求項４に記載のベクターによって形質
転換された宿主細胞。 - 【請求項６】 ポリメラーゼが３’→５’エキソヌクレ
アーゼを実質的にもたないことを特徴とする、実質的に
純粋な組換えＢｓｔＩ ＤＮＡポリメラーゼ。 - 【請求項７】 ポリメラーゼが５’→３’エキソヌクレ
アーゼを実質的にもたないことを特徴とする、請求項６
に記載のポリメラーゼ。 - 【請求項８】 融合パートナーと融合した請求項６又は
７に記載の組換えポリメラーゼからなる融合タンパク
質。 - 【請求項９】 融合パートナーが糖結合タンパク質から
なることを特徴とする、請求項８に記載の融合タンパク
質。 - 【請求項１０】 糖結合タンパク質がマルトース結合タ
ンパク質からなることを特徴とする、請求項９に記載の
融合タンパク質。 - 【請求項１１】 （ａ）ＢｓｔＩ ＤＮＡポリメラーゼ
をコードするＤＮＡを単離し、（ｂ）ステップ（ａ）の
単離ＤＮＡをＤＮＡ融合パートナーに融合し、（ｃ）ス
テップ（ｂ）のＤＮＡをクローニングベクター内に挿入
し、（ｄ）宿主細胞をステップ（ｃ）のベクターで形質
転換し、（ｅ）発現に適した条件下でステップ（ｄ）の
宿主細胞を培養し、（ｆ）融合パートナーをコードする
ＤＮＡの発現産物に融合したＢｓｔＩ ＤＮＡポリメラ
ーゼをハイブリッドポリペプチドとして回収する、こと
からなる組換えＢｓｔＩ ＤＮＡポリメラーゼの製造方
法。 - 【請求項１２】 組換えポリメラーゼが３’→５’エキ
ソヌクレアーゼ活性を実質的にもたないことを特徴とす
る、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 組換えポリメラーゼが５’→３’エキ
ソヌクレアーゼ活性を実質的にもたないことを特徴とす
る、請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 融合パートナーが糖結合タンパク質か
らなることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１５】 糖結合タンパク質がマルトース結合タ
ンパク質からなることを特徴とする、請求項１４に記載
の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US510215 | 1995-08-02 | ||
| US08/510,215 US5814506A (en) | 1995-08-02 | 1995-08-02 | Over-expression and purification of a truncated thermostable DNA polymerase by protein fusion |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007064495A Division JP4220557B2 (ja) | 1995-08-02 | 2007-03-14 | タンパク質融合による切頭型耐熱性ｄｎａポリメラーゼの過発現及び精製 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09224681A true JPH09224681A (ja) | 1997-09-02 |
| JP4446498B2 JP4446498B2 (ja) | 2010-04-07 |
Family
ID=24029830
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20512596A Expired - Lifetime JP4446498B2 (ja) | 1995-08-02 | 1996-08-02 | タンパク質融合による切頭型耐熱性ｄｎａポリメラーゼの過発現及び精製 |
| JP2007064495A Expired - Lifetime JP4220557B2 (ja) | 1995-08-02 | 2007-03-14 | タンパク質融合による切頭型耐熱性ｄｎａポリメラーゼの過発現及び精製 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007064495A Expired - Lifetime JP4220557B2 (ja) | 1995-08-02 | 2007-03-14 | タンパク質融合による切頭型耐熱性ｄｎａポリメラーゼの過発現及び精製 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5814506A (ja) |
| EP (1) | EP0757100B1 (ja) |
| JP (2) | JP4446498B2 (ja) |
| DE (1) | DE69627080T2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006521112A (ja) * | 2003-03-25 | 2006-09-21 | ストラタジーン カリフォルニア | Ｄｎａポリメラーゼ融合物およびその使用 |
| WO2009054510A1 (ja) | 2007-10-25 | 2009-04-30 | Riken | 等温増幅方法およびそれに用いるｄｎａポリメラーゼ |
| JP2011217746A (ja) * | 2010-04-12 | 2011-11-04 | F Hoffmann La Roche Ag | 界面活性剤非含有ポリメラーゼ |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5834253A (en) * | 1994-11-17 | 1998-11-10 | Shanghai Institute Of Biochemistry, Chinese Academy Of Sciences | Bacillus stearothermophilus DNA polymerase with proof-reading 3'-5' exonuclease activity |
| US6165765A (en) * | 1995-10-18 | 2000-12-26 | Shanghai Institute Of Biochemistry, Chinese Academy Of Sciences | DNA polymerase having ability to reduce innate selective discrimination against fluorescent dye-labeled dideoxynucleotides |
| SG86311A1 (en) * | 1997-04-10 | 2002-02-19 | Univ Singapore | Bacillus stearothermophilus dna polymerase i (klenow) clones with reduced 3'-to-5' exonuclease activity |
| EP0921196A1 (en) | 1997-12-02 | 1999-06-09 | Roche Diagnostics GmbH | Modified DNA-polymerase from carboxydothermus hydrogenoformans and its use for coupled reverse transcription and polymerase chain reaction |
| US7270951B1 (en) | 1999-03-10 | 2007-09-18 | Asm Scientific, Inc. | Method for direct nucleic acid sequencing |
| US6436677B1 (en) * | 2000-03-02 | 2002-08-20 | Promega Corporation | Method of reverse transcription |
| US7238505B2 (en) | 2000-10-04 | 2007-07-03 | Ahram Biosystems Inc. | Immobilized DNA polymerase |
| US7354742B2 (en) * | 2002-02-22 | 2008-04-08 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Method for generating amplified RNA |
| EP2108048A1 (en) * | 2007-01-17 | 2009-10-14 | Meridian Bioscience, Inc. | Stable reagents and kits useful in loop-mediated isothermal amplification (lamp) |
| US8798776B2 (en) * | 2008-09-30 | 2014-08-05 | Dolby International Ab | Transcoding of audio metadata |
| EP2751264B1 (en) | 2011-09-01 | 2017-12-27 | New England Biolabs, Inc. | Compositions and methods relating to variant dna polymerases and synthetic dna polymerases |
| US8993298B1 (en) | 2012-08-31 | 2015-03-31 | New England Biolabs, Inc. | DNA polymerases |
| TWI487789B (zh) | 2012-12-24 | 2015-06-11 | Ind Tech Res Inst | 單離的脫氧核糖核酸聚合酶、套組與其應用 |
| EP3012326A4 (en) | 2013-03-26 | 2016-12-21 | Nippon Gene Co Ltd | PRIMER AND PROBE SET FOR IDENTIFYING GENPOLYMORPHISM AND USE THEREOF |
| KR101678667B1 (ko) * | 2014-06-18 | 2016-11-23 | 주식회사 이뮤노맥스 | Bst2 유전자의 기능이 상실된 세포주를 이용한 바이러스 항원 단백질의 제조방법 |
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| CN116113713A (zh) | 2020-06-09 | 2023-05-12 | 赛特斯分子诊断股份公司 | 确定样本中柔膜菌纲细菌的预定的核酸序列存在的等温实时pcr方法 |
| KR20230036102A (ko) | 2020-06-09 | 2023-03-14 | 써터스 몰레큘러 다이어그노스틱스 아게 | 인간 샘플내 미리-결정된 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 등온 실시간 pcr 방법 |
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| US20230416845A1 (en) | 2020-11-24 | 2023-12-28 | Day Zero Diagnostics, Inc. | Universal primers for rapid bacterial genome detection |
| EP4276196A1 (en) | 2022-05-10 | 2023-11-15 | Philipps-Universität Marburg | Decoy-oligonucleotides in nucleic acid detection methods |
| CN117187210B (zh) * | 2023-11-02 | 2024-01-23 | 广州达安基因股份有限公司 | 一种突变型Bst DNA聚合酶大片段及其制备方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| US4800159A (en) * | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
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-
1995
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1996
- 1996-07-31 DE DE69627080T patent/DE69627080T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-31 EP EP96202169A patent/EP0757100B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-02 JP JP20512596A patent/JP4446498B2/ja not_active Expired - Lifetime
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2007
- 2007-03-14 JP JP2007064495A patent/JP4220557B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| EP0757100B1 (en) | 2003-04-02 |
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| DE69627080T2 (de) | 2004-01-29 |
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