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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren durch
Fermentation. L-Aminosäuren
werden verbreitet als Ausgangsmaterialien für Arzneimittel, Gewürze, Nahrungsmittel
und dergleichen eingesetzt.
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Beschreibung des Standes
der Technik
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Herkömmlicherweise
werden L-Aminosäuren
durch Fermentation unter Verwendung coryneformer Bakterien der Gattung
Brevibacterium oder Corynebacterium industriell hergestellt. In
den letzten Jahren sind auch Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter
Verwendung von Bakterien der Gattung Escherichia, wie Escherichia
coli, entwickelt worden. Überdies
werden verschiedene Techniken zum Erhöhen der L-Aminosäureproduktionsfähigkeit
durch Genrekombinationstechniken offenbart (veröffentlichtes japanisches Patent (Kokai)
Nr. 57-71397; U.S. Patent Nr. 4,371,614).
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Es
wurde berichtet, daß wenn
Fructose als Kohlenstoffquelle bei der Massenproduktion von Proteinen eingesetzt
wird, die Produktion von Essigsäure
verringert ist und die mikrobielle Zellausbeute erhöht ist (A. Aristos
et al., Biotechnol. Prog., 15, S. 140–145, 1999). Die Beziehung
zwischen Fructose und deren L-Aminosäureproduktion bleibt jedoch
ungeklärt.
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Offenbarung
der Erfindung
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Wie
vorstehend beschrieben wurde, wurde die Produktivität von L-Aminosäuren durch
Kultivieren von Mikroorganismen und Verbesserung der Produktionsverfahren
deutlich erhöht.
Um jedoch einem erhöhten
Bedarf in der Zukunft gerecht zu werden, ist die Entwicklung weiterer
kostengünstiger
und effizienter Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren wünschenswert.
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Ein
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum
Verbessern der L-Aminosäureproduktivität von Bakterien
der Gattung Escherichia bereitzustellen.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eingehende Untersuchungen
durchgeführt,
um das vorstehend genannte Ziel zu erreichen. Als Ergebnis haben
sie gefunden, daß wenn
Fructose als Kohlenstoffquelle eines Mediums, das für die Kultivierung
eines Bakteriums der Gattung Escherichia eingesetzt wird, verwendet
wird, die L-Aminosäureproduktionsfähigkeit
verbessert wurde, was zur vorliegenden Erfindung geführt hat.
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Das
heißt,
die vorliegende Erfindung stellt folgendes bereit.
- (1) Ein Verfahren zum Herstellen einer Aminosäure, welches
das Kultivieren eines Bakteriums der Gattung Eschericha mit der
Fähigkeit
zur Produktion der Aminosäure
in einem Medium, wobei die Aminosäure in dem Medium produziert
und angehäuft
wird, und das Gewinnen der Aminosäure aus dem Medium umfaßt, wobei
die Kohlenstoffquelle in dem Medium ein Gemisch ist, das aus 30
Gew.-% oder mehr Fructose und 70 Gew.-% oder weniger Glucose besteht.
- (2) Das Verfahren zum Herstellen einer Aminosäure gemäß (1), wobei
das Bakterium der Gattung Escherichia Escherichia coli ist.
- (3) Das Verfahren zum Herstellen einer Aminosäure gemäß (1) oder
(2), wobei die L-Aminosäure
L-Tryptophan ist.
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In
der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck "L-Aminosäureproduktionsfähigkeit" oder "Fähigkeit zur Herstellung einer
Aminosäure" auf die Fähigkeit,
eine signifikante Menge einer L-Aminosäure in einem Medium anzuhäufen oder
den L-Aminosäuregehalt
in mikrobiellen Zellen zu erhöhen,
wenn ein Bakterium der Gattung Escherichia in dem Medium kultiviert
wird.
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In
der vorliegenden Erfindung können
als die L-Aminosäure
L-Tryptophan, L-Phenylalanin, L-Lysin, L-Threonin, L-Valin, L-Leucin,
L-Isoleucin, L-Homoserin, L-Glutaminsäure und dergleichen genannt
werden.
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Bakterien,
die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, sind nicht
besonders eingeschränkt, solange
sie Bak terien der Gattung Escherichia sind und L-Aminosäureproduktionsfähigkeit
haben. Spezifische Beispiele der Bakterien der Gattung Escherichia
umfassen solche, die in den Arbeiten von Neidhardt et al. (Neidhardt,
F. C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American
Society for Microbiology, Washington D. C., 2. Auflage, 1208, 1996,
Tabelle 1) genannt sind, und Derivate, die von diesen Bakterien
abgeleitet sind.
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Escherichia
coli mit L-Aminosäureproduktionsfähigkeit
kann ein mutierter oder rekombinanter Stamm sein. Als Mutante können Mutanten
mit einer Mutation, welche die Aktivität eines intrazellulären Enzyms
erhöht,
das an der Biosynthese einer L-Aminosäure beteiligt ist, insbesondere
eine Mutation, welche die Expressionsmenge des Enzyms erhöht, oder
eine Mutation, welche die Rückkopplungshemmung
ausschaltet, genannt werden. Außerdem
kann als der rekombinante Stamm ein Stamm mit erhöhter Kopienzahl
eines Gens, das für
ein an der L-Aminosäurebiosynthese
beteiligtes Enzym kodiert, ein Stamm, dessen Expressionskontrollsequenz
modifiziert ist, um die Expressionsmenge des Gens zu erhöhen, ein
Stamm, in dem ein für
ein Enzym, dessen Rückkopplungshemmung
ausgeschaltet ist, kodierendes Gen eingeführt ist, und dergleichen genannt
werden.
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Die
Mutanten können
durch Behandeln von Wildtypstämmen
von Bakterien der Gattung Escherichia und Derivaten davon durch
UV-Bestrahlung oder mit Mutagenisierungsmitteln, die üblicherweise
für eine
Mutagenesebehandlung eingesetzt werden, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
(NTG) und salpetrige Säure, erhalten
werden.
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Um
die Kopienzahl eines Gens zu erhöhen,
können
das Zielgen und ein Vektor, der in einem Bakterium der Gattung Escherichia
funktioniert, unter Herstellung einer rekombinanten DNA ligiert
werden, und das Bakterium der Gattung Escherichia kann mit der rekombinanten
DNA transformiert werden. Außerdem
kann die Transformation durch ein Verfahren von D. A. Morrison (Methods
in Enzymology, 68, S. 326, 2979), durch ein Verfahren, bei dem Empfängerzellen
mit Calciumchlo rid behandelt werden, um die Permeabilität von DNA zu
erhöhen
(Mandel, M. und Higa, A., J. Mol. Biol., 53, S. 159, 1970), und
dergleichen durchgeführt
werden. Als der vorstehend genannte Vektor können pUC 19, pUC19, pUC118,
pUC119, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119,
pMW118, pMW219, pMW218, pSTV28, pSTV29 und dergleichen genannt werden,
wobei zusätzlich
dazu auch Phagenvektoren eingesetzt werden können.
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Die
Kopienzahl eines Gens kann auch durch die Anwesenheit von mehreren
Kopien des Zielgens auf der chromosomalen DNA eines Bakteriums der
Gattung Escherichia erhöht
werden. Um mehrere Kopien des Zielgens in die chromosomale DNA des
Bakteriums der Gattung Escherichia einzuführen, kann die homologe Rekombination
unter Verwendung einer Sequenz, die auf der chromosomalen DNA in
einer Anzahl von mehreren Kopien vorhanden ist, als Zielsequenz
durchgeführt
werden. Als eine Sequenz, die auf der chromosomalen DNA in einer
Anzahl von mehreren Kopien vorhanden ist, können repetitive DNA oder umgekehrte
Wiederholungen eingesetzt werden, die an den Enden von transponierbaren
Elementen vorhanden sind. Alternativ dazu können, wie in der offengelegten
japanischen Patentanmeldung (Kokai) Nr. 2-109985 beschrieben wurde,
mehrere Kopien des Zielgens in chromosomale DNA eingeführt werden,
indem jede auf einem Transposon angebracht wird, um sie zu überführen.
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Die
Aktivität
eines Zielenzyms kann durch Ersetzen einer Expressionskontrollsequenz,
wie einem Promotor eines Gens, das für das Zielenzym kodiert, mit
einem stärkeren
Promotor erhöht
werden (offengelegte japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 1-215280).
Als starke Promotoren sind beispielsweise der lac-Promotor, trp-Promotor,
trc-Promotor, tac-Promotor, PR-Promotor
und PL-Promotor des Phagen Lamda, der tet-Promotor, amyE-Promotor
und dergleichen bekannt.
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Im
folgenden wird ein Verfahren zum Kultivieren von L-Tryptophan reduzierenden
Bakterien als L-Aminosäure
produzie rende Bakterien der Gattung Escherichia und die spezifischen
Bakterienstämme
beispielhaft genannt.
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Beispiele
von Enzymen, die an der L-Tryptophan-Biosynthese beteiligt sind,
umfassen die 3-Deoxy-D-arabino-heptulonat-7-phosphatsynthase des
L-Tryptophan-Biosynthesesystems (offengelegte japanische Patentanmeldung
(Kokai) Nr. 5-236947),
Transketolase (U.S. Patent Nr. 5,906,925), Anthranilatsynthase (WO94/08031
(ungeprüfte
offengelegte internationale Patentanmeldung in Japanisch (Kohyo)
Nr. 7-507693)), Phosphoglyceratdehydrogenase (WO94/08031) und dergleichen.
Unter diesen Enzymen unterliegt die Anthranilatsynthase bekanntlich
einer Rückkopplungshemmung
durch L-Tryptophan, und Phosphoglyceratdehydrogenase unterliegt
bekanntlich einer Rückkopplungshemmung
durch L-Serin.
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Als
L-Tryptophan produzierende Bakterien der Gattung Escherichia, die
in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, sind Bakterien
der Gattung Escherichia bevorzugt, welche unempfindlich gemachte
Anthranilatsynthase, unempfindlich gemachte Phosphoglyceratdehydrogenase
oder beide tragen. Ein Bakterium der Gattung Escherichia mit einer
solchen Fähigkeit
kann beispielsweise durch Mutieren des Anthranilatsynthasegens (trpE)
und/oder des Phosphoglyceratdehydrogenasegens (serA), so daß sie keiner
Rückkopplungshemmung
mehr unterliegen, und durch Einführen
des erhaltenen mutierten Gens in das Bakterium der Gattung Escherichia
erhalten werden. Genauer gesagt kann als solches Bakterium der Gattung
Escherichia ein Transformantenstamm erwähnt werden, der durch Einführen eines
Plasmids pGH5 (WO94/08031), der mutiertes serA enthält, das
für unempfindlich
gemachte Phosphoglyceratdehydrogenase kodiert, in Escherichia coli
SV164, das unempfindlich gemacht Anthranilatsynthase enthält, erwähnt werden.
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Außerdem ist
ein Bakterium der Gattung Escherichia, in das rekombinante DNA,
die ein Tryptophanoperon enthält,
auch ein bevorzugtes L-Tryptophan produzierendes Bakterium. Genauer
gesagt kann Escherichia coli, in das ein Tryptophanoperon eingeführt ist
und das ein für
unempfindlich gemachte Anthranilatsynthase kodierendes Gen enthält, erwähnt werden
(offengelegte japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 57-71397 und
62-244382; U.S. Nr. 4,371,614).
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Außerdem können als
L-Tryptophan produzierende Bakterien Escherichia coli AGX17 (pGX44) [NRRL-B-12263],
welches ein Bakterienstamm mit einem Phänotyp der Auxotrophie für L-Phenylalanin und L-Tyrosin
ist, und der Stamm AGX6(pGX50)aroP [NRRL B-12264], der ein Plasmid
pGX50 mit einem Tryptophanoperon enthält, genannt werden (siehe das
U.S. Patent Nr. 4,371,614 für
beide).
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Außerdem kann
die Fähigkeit
zur Produktion von L-Tryptophan durch Erhöhen der Fähigkeit zur Produktion von
Phosphoenolpyruvat in einer Zelle eines Bakteriums der Gattung Escherichia
mit der Fähigkeit
zur Produktion von L-Tryptophan erhöht werden (WO97/08333).
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Die
vorstehend genannten Gene oder Operons von Enzymen können durch
ein übliches
Genisolationsverfahren, das dem Fachmann gut bekannt ist, erhalten
werden. Beispielsweise kann ein Zielgen durch Synthetisieren von
Primern auf der Grundlage einer bekannten Sequenz und Durchführen der
PCR unter Verwendung chromosomaler DNA eines Bakteriums der Gattung
Escherichia, wie Escherichia coli K-12, als Matrize erhalten werden.
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Als
Verfahren zum Klonieren eines Gens und Einführen von DNA in eine Wirtszelle,
einschließlich
Herstellen der chromosomalen DNA, Herstellen einer chromosomalen
DNA-Bibliothek, Hybridisierung, PCR, Präparation von Plasmid-DNA, Verdauung
und Ligation von DNA, Transformation, Konstruktion von Oligonucleotiden,
die als Primer eingesetzt werden, und dergleichen, können Verfahren
eingesetzt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Solche Verfahren
sind in Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., "Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, 2nd Edition",
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 und dergleichen offenbart.
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Im
folgenden werden andere L-Aminosäure
produzierende Bakterien beispielhaft genannt.
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Als
ein L-Phenylalanin produzierendes Bakterium kann Escherichia coli
AJ12604 (FERM BP-3579) genannt werden (Europäische Patentveröffentlichung
Nr. 488,424).
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Als
L-Lysin produzierendes Bakterium der Gattung Escherichia kann eine
Mutante mit einer Resistenz gegenüber einem L-Lysin-Analogon
beispielhaft genannt werden. Das L-Lysin-Analogon ist ein solches, das das
Wachstum von Bakterien der Gattung Escherichia inhibiert, wobei
jedoch die Inhibition vollständig
oder teilweise ausgeschaltet wird, wenn L-Lysin in einem Medium
gleichzeitig vorhanden ist. Beispiele davon umfassen Oxalysin, Lysinhydroxamat,
(S)-2-Aminoethyl-L-cystein
(AEC), γ-Methyllysin, α-Chlorcaprolactam
und dergleichen. Mutanten mit einer Resistenz gegenüber diesen
Lysinanaloga können
dadurch erhalten werden, daß ein
Mikroorganismus der Gattung Escherichia einer üblichen künstlichen Mutationsbehandlung
unterworfen wird. Spezifische Beispiele für Bakterienstämme, die
für die
Herstellung von L-Lysin eingesetzt werden, umfassen Escherichia
coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; vergl. die offengelegte
japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 56-18596 und das U.S. Patent
Nr. 4,346,170) und Escherichia coli VL611. Der Stamm AJ11442 wurde
beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency
of Industrial Science and Technology (Ministry of International
Trade and Industry (derzeit National Institute of Advanced Industrial
Science and Technology, International Patent Organism Depositary,
1–3 Higashi
1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) am 1. Mai 1981
hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM P-5084. Dann
wurde er unter den Vorgaben des Budapester Abkommens am 29. Oktober
1987 von der vorstehend genannten ursprünglichen Hinterlegung in eine
internationale Hinterlegung überführt und
erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-1543. Die Rückkopplungshemmung
von Aspartokinase durch L-Lysin ist in den vorstehend genannten
Mikroorganismen unempfindlich gemacht worden.
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Zusätzlich können auch
L-Threonin produzierende Bakterien genannt werden. Dies liegt daran,
daß in L-Threonin
produzierenden Bakterien die Inhibition von Aspartokinase durch
L-Lysin im allgemeinen eliminiert ist. Als L-Threonin produzierende
Bakterien von Escherichia coli kann Escherichia coli MG442 genannt
werden (vergl. Gusyatiner et al., Genetika (auf russisch), 14, S.
947–956,
1978).
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Ein
Gen, das für
ein L-Lysin Biosyntheseenzym kodiert, kann in dem vorstehend genannten
L-Lysin produzierenden Bakterium verstärkt sein. Beispiele eines solchen
Gens umfassen ein Gen, das für
Phosphoenolpyruvatcarboxylase kodiert und eine Mutation zur Aufhebung
der Rückkopplungshemmung
durch Asparaginsäure
hat (japanische Patentveröffentlichung
(Kokoku) Nr. 7-83714).
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Als
spezifisches Beispiel für
L-Valin produzierende Bakterien der Gattung Escherichia kann Escherichia
voli VL1970 (VKPM B-4411) genannt werden (Europäische Patentveröffentlichung
Nr. 519,113).
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Andere
Bakterien als die vorstehend genannten sind Bakterien der Gattung
Escherichia, die ein L-Valin-Biosynthesegen enthalten, dessen Kontrollmechanismus
im wesentlichen eliminiert ist. Solche Bakterien der Gattung Escherichia
können
beispielsweise durch Einführen
eines ilvGMEDA-Operons, vorzugsweise eines ilvGMEDA-Operons, das
keine Threonindeaminaseaktivität
exprimiert und worin die Attenuation eliminiert ist, in ein Bakterium
der Gattung Escherichia erhalten werden (vergl. die offengelegte
japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 8-47397).
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Da
die gesamte Nucleotidsequenz des ilvGMEDA-Operons bekannt ist (R.
P. Lawther et al., Nucleic Acid Res., 15 (5), S. 2137, 1987), kann
es aus der chromosmalen DNA von Escherichia coli durch Koloniehybridisierung
oder PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden, die auf der Grundlage
der Sequenz hergestellt wurden, erhalten werden. Ein DNA-Fragment,
welches das ilvGMEDA-Operon enthält,
kann in Escherichia coli durch das vorstehend genannte Verfahren
unter Verwendung eines Plasmids, eines Phagen oder Transposons eingeführt werden.
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Beispiele
von L-Leucin produzierenden Bakterien der Gattung Escherichia umfassen
einen Stamm mit β-2-Thienylalaninresistenz,
einen Stamm mit β-2-Thienylalaninresistenz
und β-Hydroxyleucinresistenz
(japanische Patentveröffentlichung
(Kokoku) Nr. 62-34397) und einen Stamm mit 4-Azaleucinresistenz
oder 5,5,5-Trifluorleucinresistenz (offengelegte japanische Patentanmeldung
(Kokai) NR. 8-70879).
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Als
L-Isoleucin produzierende Bakterien der Gattung Escherichia kann
Escherichia coli KX141 (VKPM B-4781) genannt werden (europäische Patentveröffentlichung
Nr. 519,113).
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Als
L-Threonin produzierende Bakterien der Gattung Escherichia können Escherichia
coli VKPM B-3996 (RIA 1867) (U.S. Patent Nr. 5,175,107) und der
Stamm MG442 genannt werden.
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Als
L-Homoserin produzierende Bakterien der Gattung Escherichia können der
Stamm NZ10 genannt werden, der eine Leu+-Revertante
des Stammes C600 ist (Appleyard R. K., Genetics, 39, S. 440–452, 1954).
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Als
L-Glutaminsäure
produzierende Bakterien der Gattung Escherichia können L-Valin
resistente Stämme
genannt werden, wie Escherichia coli B11, Escherichia coli K-12
(ATCC 10798), Escherichia coli B (ATCC 11303) und Escherichia coli
W (ATCC 9637).
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In
der vorliegenden Erfindung wird ein Medium, das Fructose als Hauptkohlenstoffquelle
enthält,
eingesetzt, wenn ein Bakterium der Gattung Escherichia mit der Fähigkeit
zur Produktion einer L-Aminsäure
kultiviert wird. Die auf Zucker bezogene Ausbeute und die Produktionsrate
der L-Aminosäuren
werden durch die Verwendung von Fructose als eine Hauptkohlenstoffquelle
verbessert.
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Die
Kohlenstoffquelle, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt
wird, ist ein Gemisch, das aus 30 Gew.-% oder mehr Fructose und
70 Gew.-% oder weniger Glucose besteht. Der Fructosegehalt ist vorzugsweise
etwa 30 bis 95 Gew.-%, stär ker
bevorzugt etwa 30 bis 70 Gew.-%, besonders bevorzugt etwa 50 Gew.-%,
bezogen auf die Gesamtkohlenstoffquelle.
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Andere
Mediumkomponenten als die Kohlenstoffquelle sind übliche Mediumkomponenten,
wie eine Stickstoffquelle, anorganische Ionen und organische Spurennährstoffe,
die nach Bedarf eingesetzt werden.
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Als
Stickstoffquelle können
anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und
Ammoniumphosphat, organischer Stickstoff, wie Sojabohnenhydrolysat,
Ammoniakgas, wäßriges Ammoniak
und dergleichen eingesetzt werden.
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Als
anorganische Ionen oder Quelle dafür können kleine Mengen Kaliumphosphat,
Magnesiumsulfat, Eisenionen, Manganionen und dergleichen zugegeben
werden. Als organische Spurennährstoffe
sind erforderliche Substanzen, wie Vitamin B1,
Hefeextrakt und dergleichen, in geeigneten Mengen nach Bedarf enthalten.
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Die
Kultur kann unter einer Bedingung durchgeführt werden, die in Abhängigkeit
von dem eingesetzten Bakterienstamm ausgewählt wird, die Kultivierung
wird jedoch vorzugsweise unter aeroben Bedingungen während 16–72 Stunden
durchgeführt.
Die Kulturtemperatur wird auf 30–45°C reguliert, und der pH-Wert wird während der
Kultivierung auf 5–7
reguliert. Eine anorganische oder organische, saure oder basische
Substanz und außerdem
Ammoniakgas oder dergleichen können
für die
pH-Wert-Einstellung
eingesetzt werden.
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Das
Gewinnen der L-Aminosäuren
aus der Fermenterflüssigkeit
kann durch geeignetes Kombinieren bekannter Verfahren, wie den Einsatz
eines Ionenaustauscherharzes, Ausfällung und dergleichen, erreicht werden.
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Erfindungsgemäß kann die
auf Zucker bezogene Ausbeute und/oder die Produktionsrate in Verfahren zur
Produktion von L-Aminosäuren,
wie L-Tryptophan, unter Verwendung von Bakterien der Gattung Escherichia
verbessert werden.
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Beste Ausführungsform
der Erfindung
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Im
folgenden wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die
Beispiele eingehender erklärt.
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[1] Konstruktion eines
L-Tryptaphan produzierenden Stammes von Escherichia coli
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Gemäß der Beschreibung
in WO94/08031 (offengelegte internationale Patentanmeldung in Japanisch (Kohyo)
Nr. 7-507693) wurde
der trpE-defiziente Stamm Escherichia coli KB862 (DSM7196) mit einem
mutierten Gen, das für
Anthranilatsynthase kodiert, dessen Rückkopplungshemmung unempfindlich
gemacht wurde (im folgenden auch als "unempfindlich gemachte AS" bezeichnet), versehen,
um Escherichia coli SV164 (trpE8) zu erhalten. In diesen Stamm SV164
wurde das Plasmid PGH5 (beschrieben in WO94/08031) eingeführt, das
ein für
Phosphoglyceratdehydrogenase kodierendes Gen enthält, dessen
Rückkopplungshemmung unempfindlich
gemacht wurde (im folgenden auch als "unempfindlich gemachte PGD" bezeichnet). Diesen Stamm
SV164/pGH5 hatte die Fähigkeit,
Tryptophan und Serin zu produzieren.
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Escherichia
coli KB862 wurde als AJ13828 bezeichnet und beim National Institute
of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science
and Technology (derzeit National Institute of Advanced Industrial
Science and Technology, International Patent Organism Depositary,
1–3 Higashi
1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305–8566, Japan) als internationale
Hinterlegung am 21. Dezember 2000 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer
FERM BP-7405.
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Das
Verfahren zur Konstruktion von SV164/pGH5 wird im folgenden erklärt.
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(1) Screening eines mutierten
Gens, das für
unempfindlich gemachte AS kodiert, und Einverleiben dieses mutierten
Gens in das Chromosom.
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Ein
mutierter Stamm, der gegen Inhibition unempfindlich gemachte AS
enthielt, wurde unter Verwendung von 5-Methyltryptophan, ein Tryptophananalogon,
gescreent.
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E.
coli K12 YMC9 (ATCC 33927) wurde einer Mutagenesebehandlung mit
N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
(NG) gemäß dem Verfahren
von Miller unterworfen (Miller J. H., Experiments in Molecular Genetics, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., S. 125–129, 1972).
Das heißt,
etwa 2 × 109 YMC9-Zellen wurden in 4 ml 0,1 M Natriumcitratpuffer
(pH 5,5), enthaltend 50 μg/ml
NG bei 37°C
während
30 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer
(pH 7,0) gewaschen, und die Zellen wurden in einer Menge von 0,1
ml über
Nacht bei 37°C
in LB-Medium unter Rühren
kultiviert. Danach wurde die Kulturbrühe mit 0,9% NaCl aus Verdünnungen
von 10–3,
10–4 und
10–5 verdünnt, und
0,1 ml jeder verdünnten
Lösung
wurde auf eine Minimalmediumplatte, die 100 μg/ml 5-Methyltryptophan enthielt,
aufgetragen. Die Zusammensetzung des Minimalmediums enthielt 5 g/l
Glucose, 5 mg/l Vitamin B1, 3 g/l KH2PO4, 12 g/l K2HPO4, 0,3 g/l MgSO4·7H2O, 0,1 g/l NaCl, 5 g/l (NH4)
2504, 14,7 mg/l CaCl2·2H2O, 2 mg/l FeSO4·7H2O, 1 g/l Trinatriumcitrat und 15 g/l Agar.
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Nach
der Kultivierung bei 37°C
während
24–48
Stunden wurden 5-Methyltryptophan-resistente Klone auf das vorstehend
genannte Agarmedium geimpft. Um die Eigenschaften des erhaltenen
Stammes zu untersuchen, wurde der Ki-Wert
von AS zu L-Tryptophan
gemessen (Bauerle R. et al., Methods in Enzymology, 142, S. 366–386, 1987).
Dadurch konnten die mutierten Stämme
in zwei Klassen klassifiziert werden. Die mutierten Stämme der
Klasse 1 hatten eine gegen Rückkopplungshemmung
resistente Anthranilatsynthase. Die mutierten Stämme der Klasse 2 hatten eine
hohe Anthranilatsynthaseaktivität,
obwohl ihr Ki-Wert unverändert war. Die AS-Gene dieser
mutierten Stämme
wurden kloniert, und deren Nucleotidsequenzen wurden bestimmt. Die chromosomale
DNA jedes mutierten Stammes wurde isoliert und mit den Restriktionsenzymen
NheI und ClaI verdaut, wobei ein Fragment mit etwa 5 kb isoliert
wurde, und dieses Fragment wurde mit dem NheI/ClaI-Fragment (4158
bp) von pBR322 ligiert.
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E.
coli KB 862 (trpE) (DSM7196) wurde mit dem Ligationsprodukt transformiert.
Ein Klon, der auf einem Minimalmedium wachsen konnte, das kein L-Tryptophan
enthielt, wurde selektiert. Alle Plasmide, welche die trpE-Mutation
komplementierten, enthielten das NheI/ClaI-Fragment von 5 kb. Außerdem enthielt
dieses 5 kb NheI/ClaI-Fragment trpE, trpD, eine Sequenz etwa 0,8
kb stromaufwärts
von trpE, und eine Sequenz etwa 1 kb stromabwärts von trpD. Die Unterschiede
in den Aminosäuresequenzen
der mutierten AS, die von den in den mutierten Stämmen enthaltenen
Plasmiden (pE0, pE5, pE6, pE8) kodiert wurden, und deren Ki-Werte sind in Tabelle 1 gezeigt.
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Die
Sequenzanalyse der mutierten Enzyme der Klasse 2 zeigte, daß die Mutation
sowohl in der Operatorregion des trp-Promotors als auch in der DNA-Region
vorhanden war, die für
das trp-Leaderpeptid kodiert. Die Mutationen, die ΔtrpL1 und ΔtrpL2 genannt
wurden, hatten eine Deletion in einer Größe von 136 bp oder 110 pb in
der DNA-Region, die für
das Leaderpeptid kodiert. In der Sequenz, die in der EMBL-Datenbank
mit der Nr. V00372 registriert war, wurde die Deletion der Region
der Positionen 33–168
in die ΔtrpL1-Mutation eingeführt, während die
Deletion der Region der Positionen 11–120 in die ΔtrpL2-Mutation
eingeführt
wurde.
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Die
zwei Mutantenklassen wurden kombiniert, um das für die unempfindlich gemachte
AS kodierende Gen stark zu exprimie ren. Für den Stamm der Klasse 2 wurde
die ΔtrpL1-Mutation
verwendet. Ein 1,6 kb NruI-Fragment mit der ΔtrpL1-Mutation wurde aus dem
Plasmid pΔtrpL
isoliert und durch ein korrespondierendes NruI-Fragment in dem Plasmid
pE0, pE5, pE6 oder pE8 ersetzt. Die erhaltenen Plasmide wurden als
pIE0, pIE5, pIE6 und pIE8 bezeichnet und für die Einverleibung in das
Chromosom durch homologe Rekombination eingesetzt.
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Ein
etwa 5 kb großes
NheI/ClaI-Fragment wurde aus jedem Plasmid unter Verwendung einer
Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt isoliert und in einem linearen
Zustand eingesetzt, um dem recD-Stamm PD106 [dtrpLD102] zu transformieren.
Als Transformationsverfahren wurde das CaCl2-Verfahren
nach Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2, S. 110–2114, 1972,
eingesetzt. Ein Klon, der auf einem Minimalmedium wachsen konnte,
das L-Tryptophan nicht enthielt, und der empfindlich gegen Ampicillin
war, d.h. der das Plasmid nicht enthielt, wurde selektiert. Das
mutierte trpE-Gen, das für
die unempfindlich gemachte AS kodierte und die ΔtrpL1-Mutation hatte, wurde
aus jedem bakteriellen Stamm in den Stamm KB861 durch P1-Transduktion überführt (Miller
J. H., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, N.
Y., S. 201–205,
1972) und in einem Minimalmedium, das kein Tryptophan enthielt,
selektiert. Die erhaltenen Bakterienstämme wurden PD103 (trpE0), KB862
(trpE5), SV164 (trpE8) und SV163 (trpE6) genannt.
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(2) Präparation eines serA-Gens, das
unempfindlich gemachte PGD kodiert.
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Ein
für PGD
kodierendes serA-Gen wurde aus dem Stamm E. coli B (ATCC 23226)
in den Plasmidvektor pUC18 kloniert. Der B-Stamm wurde bei 37°C über Nacht
in LB kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (4000 × g) gewonnen,
und chromosomale DNA wurde durch das in Ausubel et al., Current
Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates 2.4.1–2.4.2,
1987, hergestellt. Die chromosomale DNA wurde in einer Menge von
10 μg mit
SphI verdaut. Etwa 3 μg
des verdau ten Produkts worden mit 0,2 μg des Plasmids pUC18, das ebenfalls
mit SphI verdaut worden war, ligiert. Die serA-Mutante PC1523 (CGSC
Nr. 5411) (CGSC: E. coli Genetic Stock Center, Department of Biology
255 OML, Yale University, Postbox 6666, New Haven, CT, USA) wurde
mit dem Ligationsreaktionsgemisch durch das vorstehend genannte
Verfahren von Cohen et al. transformiert.
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Die
transformierten Stämme
wurden auf ein Minimalmedium, das kein L-Serin enthielt, aufgetragen. Die
gewachsenen Klone enthielten das E. coli serA-Gen in einem 3,5 kb
großen
SpHI-Fragment. Die
Sequenz des Wildtyp serA-Gens ist in WO94/08031 beschrieben. Der
rekombinante Vektor mit dem serA-Gen wurde pGC3 genannt.
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Durch
Verwendung des Wildtyp serA-Gens wie vorstehend beschrieben wurde
ein serA-Gen hergestellt, das für
unempfindlich gemachte PGD kodiert, deren C-terminale Aminosäure deletiert
war. Das Plasmid pGC3 wurde mit SalI und KpnI verdaut, und das erhaltene
Fragment wurde durch Agarosegel-Elektrophorese abgetrennt.
Ein 2,0 kb SalI-KpnI-Fragment, welches das serA-Gen in vollständiger Länge enthielt,
wurde aus dem Gel gereinigt. Dieses Fragment wurde in einer Menge
von 0,2 μg
zusammen mit einer äquimolaren
Menge des mit HindIII/SalI-verdauten Plasmids pUC18 und einem doppelsträngigen Oligonucleotid
ligiert, das durch Verbinden der Oligonucleotide der Nucleotidsequenzen
der SEQ ID Nr.: 2 und 3 erhalten wurde. Dieses Oligonucleotid komplimentierte
7 der letzten 8 C-terminalen Codons des serA-Gens und führte anstelle
des 8. Codons ein Terminationscodon TAA ein. Deshalb wurde PGD,
die von diesem mutierten serA-Gen kodiert wurde, um einen Aminosäurerest
am C-Terminus verkürzt.
Das Plasmid, das dieses mutierte serA-Gen enthielt, wurde als pGH5
bezeichnet. Die unempfindlich gemachte PGD, die von diesem Gen kodiert
wird, hatte einen Ki-Wert von 0,1–50 μM gegenüber Serin,
und ihre Rückkopplungshemmung
durch Serin war ausgeschaltet worden.
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[2] Produktion von L-Tryptophan
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Das
vorstehend genannte Tryptophan produzierende Bakterium Escherichia
coli SV164/pGH5 wurde in 50 ml LB-Medium (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt,
0,5% Natriumchlorid) in einem konischen Kolben mit einem Volumen
von 500 ml geimpft und unter Rühren
(150 UpM) bei 30°C
während
7–8 Stunden
vorkultiviert.
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Etwa
1 ml der vorstehend genannten Vorkultur wurde in 300 ml des Impfkulturmediums
mit der nachstehend gezeigten Zusammensetzung geimpft. Die Kultivierung
wurde bei 30°C
während
11–15
Stunden bei 800 UpM unter Verwendung eines Fermenters mit 1 l Volumen
durchgeführt. Zusammensetzung
des Impfkulturmediums
Glucose | 5
g/l |
KH2PO4 | 12
g/l |
(NH4)2SO4 | 0,1
g/l |
MgSO4·7H2O | 0,3
g/l |
CaCl2·2H2O | 15
mg/l |
FeSO4·7H2O | 2
mg/l |
Na2 Citrat·2H2O | 1
g/l |
Spurenelementlösung | 1
mg/l |
L-Phenylalanin | 40
mg/l |
L-Tyrosin | 40
mg/l |
Vitamin
B1 | 5
mg/l |
Tetracyclin | 15
mg/l |
Spurenelementlösung
Na3MoO4 | 0,15
g/l |
H3BO3 | 2,5
g/l |
CoCl2·6H2O | 0,7
g/l |
CuSO4·5H2O | 0,25
g/l |
MnCl2·4H2O | 1,5
g/l |
ZnSO4·7H2O | 0,3
g/l |
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30
ml der vorstehend genannten Impfkulturbrühe wurden in 300 ml eines Hauptkulturmediums
mit der nachstehend gezeigten Zusammensetzung geimpft. Unter Verwendung
eines Fermenters mit 1 l Volumen wurde das Medium bei 30°C unter Rühren bei
800 UpM und einer Belüftung
von 1 vvm mit Druckluft, die mit einem Sterilisationsfilter sterilisiert
war, kultiviert. Außerdem
wurde während
der Kultivierung die Temperatur bei 31°C gehalten, und der pH-Wert
wurde mit Ammoniakgas bei 6,7 gehalten. Zusammensetzung
des Hauptkulturmediums
Glucose | 17,5
g/l |
KH2PO4 | 1,5
g/l |
(NH4)2SO4 | 5
g/l |
NaCl | 0,5
g/l |
MgSO4·7H2O | 0,3
g/l |
CaCl2·2H2O | 15
mg/l |
FeSO4·7H2O | 75
mg/l |
Na2 Citrat·2H2O | 1
g/l |
Spurenelementlösung | 1
mg/l |
L-Phenylalanin | 750
mg/l |
L-Tyrosin | 750
mg/l |
Vitamin
B1 | 5
mg/l |
Hefeextrakt | 2,5
g/l |
Trypton | 2,5
g/l |
Tetracyclin | 20
mg/l |
Spurenelementlösung
Na3MoO4 | 0,15
g/l |
H3BO3 | 2,5
g/l |
CoCl2·6H2O | 0,7
g/l |
CuSO4·5H2O | 0,25
g/l |
MnCl2·4H2O | 1,5
g/l |
ZnSO4·7H2O | 0,3
g/l |
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Während der
Kultivierung wurde die Zuckerkonzentration in dem Fermenter durch
Einpumpen von 700 g/l (Gew./Vol.) einer Zuckerlösung mit einer in Tabelle 2
gezeigten Zusammensetzung (durch Autoclavieren sterilisiert) auf
5–20 g/l
eingestellt. Nach 48 Stunden der Kultivierung wurde die L-Tryptophankonzentration
in dem Medium gemessen. Die auf Zucker bezogene Ausbeute und die
Produktionsrate sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 zeigt die Verhältnisse,
wenn der Wert von G100 als 1 angenommen wird. Tabelle
2: Zusammensetzung der Kohlenstoffquelle
Tabelle
3: Produktionsausbeute und Produktionsrate von L-Tryptophan
Der Wert für
G100 wurde als 1 angenommen
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Es
wurde gefunden, daß wenn
Glucose mit Fructose gemischt wird, sowohl die auf Zucker bezogene Ausbeute
als auch die Produktionsrate im Vergleich zu dem Fall, wenn eine
100% Glucoselösung
eingesetzt wurde, verbessert waren. Insbesondere wurde, wenn der
Anteil an Fructose in der Kohlenstoffquelle etwa 50% war, die höchste Produktivität beobachtet.
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