SK279854B6 - Mikroorganizmy na produkciu tryptofánu, spôsob ich - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka mikroorganizmov na produkciu tryptofánu, spôsobu ich výroby a ich použitia na výrobu tryptotanú.

Doterajší stav techniky

Je známe, že látková premena tryptotänu vo všetkých doteraz skúšaných mikroorganizmoch prebieha cez jednotnú biosyntéznu cestu (Somerville, R.L., Herman, K.M., 1983, Aminoacids, Biosynthesis and Genetic Regulation, Adelison - Wesley Publishing Company, USA: 301 - 322 a 351 - 378; Aida a kol., 1986, Biotechnology of amino acid production, progress in industríal microbiology Vol. 24, Elsevier Science Publisher, Amsterdam: 188 - 206). Látková premena tryptofánu, ich spojenie s látkovou premenou serínu, ako i gény, kódované pre najdôležitejšie enzýmy, sú znázornené na obr. 1.

Známe spôsoby produkcie tryptofánu spočívajú v tom, že je mutovaný trpE-gén, ktorý je kódovaný pre tryptofán - intenzívnu antranilátsyntetázu, exprimovaný spoločne s inými génmi trp-operónu na vhodnom autonómnom replikovateľnom vektore. Väčším množstvám kópií génu dochádza k zvýšenej expresii trp-génu a v súlade s tým k zvýšenému množstvu jednotlivých enzýmov látkovej premeny tryptofánu. Dôsledkom toho je nadprodukcia tryptofánu.

Príklady takýchto postupov sú opísané pre rad organizmov, napríklad pre Escherichia coli (EP 0 293 207, US 4 371 614), pre Bacillus (US 4 588 687) a pre Corynebakterium a Brevibakterium (EP 0 338 474). Pri týchto spôsoboch dochádza k radu problémov vo vedení procesu. Môže dochádzať k nestabilite a k stratám vektora alebo k predĺženiu rastu produkčného kmeňa.

EP-A-0 401 735 (prihlasovateľ: Kyowa Hakko Kogyo Co.) opisuje spôsob produkcie L-tryptofánu s pomocou kmeňov Corynebakterium alebo Brevibakterium, ktoré obsahujú rekombinantné plazmidy. Tieto plazmidy nesú genetické informácie pre syntézu enzýmov DAHP-syntetázy, antranilátsyntetázy, indol-3-glycerol-P-syntetázy, tryptofánsyntetázy a fosfoglycerátdehydrogenázy. Používajú sa antranilsyntetázové alely, rezistentné proti spätnému ovplyvňovaniu (feedbackrezistentné).

Ďalej je známe zvyšovanie produkcie tryptofánu v kmeňoch s deregulovanou látkovou premenou tryptofánu vnesením viacerých divokých typov génov serA alebo serA, B, C. Chemical Abstracts CA 111 (1989) 16 86 88q a CA 11 (1989) 16 86 89r opisujú napríklad použitie kmeňov Bacillus, ktoré divoký typ alely serA, prípadne všetky typy divokých génov látkovej premeny serínu (serA, serB a serC) preexprimujú na plazmidy pre produkciu tryptofánu.

Zvýšenie výťažku tryptofánu znížením odbúravania serínu v bunke je známe z EP-A-0 149 539 (prihlasovateľ: Sauffer Chemical Company). Táto patentová prihláška opisuje K12-mutanty E. coli, v ktorých je serín odbúravajúci enzým seríndeamináza (sda) rozrušovaný. Opisuje tiež použitie takýchto kmeňov na produkciu aminokyselín. Príklad VIII opisuje využitie takéhoto kmeňa na nadprodukciu tryptofánu z antranilátu. Výťažky tryptofánu, zlepšené v porovnaní s kmeňom s intaktnou seríndeminázou sa v tejto európskej patentovej prihláške vysvetľuje tým, že v mikroorganizmoch, v ktorých je zásoba predstupňov tryptofánu veľmi vysoká, je serín, pripadne kapacita biosyntézy serínu parciálne limitujúca pre produkciu tryptofánu.

Podstata vynálezu

Úlohou predloženého vynálezu je dať k dispozícii mikroorganizmus, ktorý by vo vyššej miere produkoval tryptofán a vypracovať spôsob, ktorý by umožnil výrobu takéhoto mikroorganizmu.

Uvedená úloha bola vyriešená pomocou kmeňov mikroorganizmov, ktoré sa vyznačujú tým, že majú deregulovanú látkovú premenu tryptofánu a aspoň proti spätnému pôsobeniu rezistentnú (feedbackresistent) serA-alelovú deregulovanú látkovú premenu serínu.

V zmysle predloženého vynálezu sa pod pojmom proti spätnému pôsobeniu rezistentné serA-alely chápu mutanty serA-génu, ktoré pre fosfoglycerátdehydrogenázu kódujú v porovnaní so zodpovedajúcim divokým typom fosfoglycerátdehydrogenázy zodpovedajúceho mikroorganizmu so zníženou senzitivitou serínu.

Kombináciou podľa predloženého vynálezu aspoň jednej proti spätnému pôsobeniu rezistentnej serA-alely s mikroorganizmom s deregulovanou látkovou premenou tryptofánu sa zvýši nezvyčajne a neočakávane o až 2,6-násobok v porovnaní s výťažkami, ktoré sa môžu dosiahnuť s rovnakým mikroorganizmom bez proti spätnému pôsobeniu rezistentnej serA-alely pri inak rovnakých kultivačných podmienkach.

To, že kmene podľa predloženého vynálezu produkujú vo zvýšenej miere tryptofán, je neočakávané a prekvapujúce, lebo proti spätnému pôsobeniu rezistentné serA-alely majú efekt iba pri vysokej intracelulámej hladine serínu (Tosa T., Pizer L.J., 1971, Joumal of Bacteriology Vol. 106: 972 - 982; Winicov J., Pizer L.J., 1974: Joumal of Biological Chemistry vol. 249: 1348 - 1355). Podľa stavu techniky (napríklad EP-A-0 149 539) majú mikroorganizmy s deregulovanou látkovou premenou tryptofánu však nízku hladinu serínu. Preto nie je možné očakávať pri vnesení proti spätnému pôsobeniu rezistentnej serA-alely podľa predloženého vynálezu do mikroorganizmov s deregulovanou látkovou premenou tryptofánu zvýšenie produkcie tryptofánu.

Vzhľadom na to, že pri všetkých známych mikroorganizmoch prebieha látková premena tryptofánu mechanizmom, znázorneným na obr. 1 a techniky, použité na výrobu kmeňov podľa predloženého vynálezu, sú v princípe známe a použiteľné na všetky mikroorganizmy, sú kmene podľa predloženého vynálezu vyrobiteľné z ľubovoľných mikroorganizmov.

Na výrobu kmeňov podľa predloženého vynálezu sú najvhodnejšie baktérie. Obzvlášť vhodné sú gramnegatívne baktérie, predovšetkým E. coli.

Kmene podľa predloženého vynálezu sa môžu získať tak, že sa v ľubovoľnom tryptofán-prototrofnom východiskovom kmeni celkom alebo čiastočne zruší látková premena tryptofánu a do tohto kmeňa sa zavedie proti spätnému pôsobeniu rezistentná serA-alela.

Kmene podľa predloženého vynálezu sa môžu tiež získať tak, že sa pri trypto fán-auxotrothých východiskových kmeňoch obnoví schopnosť syntetizovať tryptofán, pričom je rekonštruovaná látková premena tryptotänu deregulova

SK 279854 Β6 ná a do takých kmeňov sa vnesie proti spätnému pôsobeniu rezistentná serA-alela.

Deregulácia látkovej premeny tryptofánu v mikroorganizmoch sa môže vykonávať pomocou radu rôznych postupov, ktoré sú známe zo stavu techniky.

Jedna možnosť deregulácie látkovej premeny tryptofánu spočíva v tom, že sa zmení enzým antraililátsyntetáza. Tento enzým katalyzujú pri všetkých mikroorganizmoch prvý krok tryptofánšpecifíckej biosyntéznej cesty. Tryptofán je vo svojej aktivite potláčaný, a tým je regulovaný, v závislosti od množstva tryptofánu, prúd metabolitov tryptofánovou biosyntéznou cestou. Enzým je kódovaný pomocou génu trpE.

Modifikované trpE-gény, ktoré kódujú antranilásyntetázy so zníženou selektivitou proti tryptofánu v porovnaní so zodpovedajúcim divokým typom antranilátsyntetázy, označované v nasledujúcom ako proti spätnému účinku rezistentnej (feedbackresistent) trpE-alely, sa môžu získať mutagenézou a nasledujúcou selekciou tryptofán-pro to trefného východiskového kmeňa. K tomu sa zodpovedajúci kmeň podrobí mutácii indukujúcemu spracovaniu (Miller J.H., 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, USA: 113 - 185).

Spracovávaný kmeň sa nanesie na živné médium, ktoré obsahuje aspoň jedného antagonistu tryptofánu v množstve, ktoré stačí na to, aby bol rast kmeňa potlačený. Ako príklady vhodných antagonistov tryptofánu je možné uviesť 4-metyltryptofán, 5-metyltryptofán, 6-metyltryptotän, halogénované tryptofány, tryptazán, indol a kyselinu indol-akrylovú.

Rezistentné klony sa skúšajú na tryptofán-senzitivitu svojej antranilásyntetázy. Na stanovenie tryptofán-senzitivity antranilásyntetázy sa môže použiť každá metóda, ktorá dovoľuje zmerať aktivitu tohto enzýmu v prítomnosti tryptofánu. Napríklad sa môže nechať reagovať za enzymatickej katalýzy chorizmat vo vhodnom pufrovacom systéme so svojim reakčným partnerom glutaimnom (Bauerle

R. a kol., 1987, Methods in Enzymology Vol. 142: 366 -

- 386). Testovaná vsádzka sa kinetický alikvotné odoberie a pomocou HPLC - analýzy sa stanovuje množstvo antranilátu ako reakčného produktu, vzniknutého za jednotku času. Množstvo antranilátu, vytvoreného za časovú jednotku, je priamo mierou aktivity antranilátsyntetázy. Test sa vykonáva v prítomnosti a v neprítomnosti tryptofánu, aby sa stanovila senzitivita testovanej antranilátsyntetázy.

Je ale tiež možné pripraviť tryptofán-insenzitívne trpE-alely priamou génovou technickou manipuláciou (Bauerle R. a kol., 1987, Methods in Enzymology Vol. 142: 366 -

- 386). Je opísaný rad mutácií v aminokyselinovej sekvencii antranilátsyntetázy rôznych organizmov, ktoré vedú k zníženiu senzitivity enzýmu proti tryptofánu (napríklad pre Salmonellu: Caliguiri M.G., Bauerle R., 1991, J. of Biol. Chem. Vol. 266: 8328 - 8335; preBrevibacterium a Corynebacteriunr. Matsui K. a kol., 1987, J. bac. Vol. 169: 5330 -5332).

Sú známe metódy, ktoré umožňujú zaviesť mutáciu v DNA-fragmente na špecifickom mieste. Takéto metódy sú okrem iného opísané v nasledujúcich publikáciách: Sakar G., Sommerauer S.S., 1990, Bio Techniques 8: 404 -

- 407, Polymerase chain reaction abhängige site directed mutagcncs;

Aushubel F.M. a kol., 1987,Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, Phage Ml 3 abhängige Method,

Smith M., 1985, Ann. Rev. Genet. 19: 423 - 462, iné metódy.

DNA-fragment, ktorý zahrnuje divoký typ trpE-génu, sa pomocou už opísaných štandardných techník na výrobu rekombinantnej DNA rekombinuje na vektor. Použitím uvedených metód pre site-directed mutagenézu sa jeden alebo niekoľko nukleotidov DNA-sekvencie zmení tak, že teraz génom kódovaná aminokyselinová sekvencia zodpovedá aminokyselinovej sekvencii tryptofán - insenzitívnej antranilsyntctázc.

Pomocou opísaných techník sa dá do ľubovoľného trpE-génu zaviesť jedna alebo viacero mutácií, ktoré spôsobujú, že kódovaná antranilátsyntetáza má aminokyselinovú sekvenciu vedúcu k tryptofán - insenzitivite.

Dodatočne sú v kmeni podľa predloženého vynálezu žiaduce, ale nie nevyhnutne potrebné, nasledujúce vlastnosti: defektný tryptofánrepresorový proteín, defektná atenuačná kontrola expresie trp-operónu a defektná tryptofanáza. Tieto vlastnosti sa dajú v kmeni podľa predloženého vynálezu najjednoduchšie získať voľbou východiskového kmeňa, ktorý môže už získať jednu alebo viacero týchto zodpovedajúcich vlastností. Príprava alebo voľba môže prebiehať kombináciou s nasledujúcimi uvedenými selekčnými metódami.

Tryptofánrepresorový proteín je nadradený regulátorový proteín biosyntézy tryptofánu. Spoločne s tryptofánom ako aporepresorom reprimuje tento proteín expresiu trp-operón-génu. Proteínje kódovaný génom trpR. Tryptofánrepresorové mutanty sa môžu selektovať napríklad pod mutantmi, ktoré sú rezistentné proti antagonistom tryptofánu, ako je napríklad 5-metyltryptofán. Príklady sú opísané v J. Mol. Biol. 44, 1969, 185 - 193 alebo Genetics 52, 1965, 1303 - 1316.

Okrem kontroly pomocou trpR-kódovaného proteínu podlieha trp-operón dodatočnej atenuačnej kontrole. Zodpovedný za túto reguláciu je DNA-región pred prvým génom trp - operónu. Mutácia alebo delécia v tejto oblasti môžu viesť k dereguláci. Takéto mutanty môžu byť selektované pod mutantmi, ktoré sú rezistentné proti antagonistom tryptofánu, ako je napríklad 5 -metyltryptofán. Po druhé môžu byť dosiahnuté takéto mutácie, hlavne ale delécia tak, že sa spôsobom site-directed mutagenese indukuje táto zmena miestne špecificky v atenuačnej oblasti DNA.

Pomocou už opísaných technik miestne špecifickej mutagenézy je možné rekombinovať inaktivovanú atenuačnú oblasť do chromozómu kmeňa podľa predloženého vynálezu na miesto prírodnej atenuačnej oblasti.

Enzým tryptofanáza (tnaA) katalyzuje odbúravanie tryptofánu na indol, pyruvát a amoniak. Je žiaduce, aby tento enzým bol v tryptofán-produkčných kmeňoch inaktívny. Kmene, v ktorých je tento enzým defektný, sa môžu získať tak, že sa organizmy podrobia mutagénnemu spracovaniu a pod mutantmi sa rozumejú také, ktoré už nie sú schopné využívať tryptofán ako zdroje uhlíka a dusíka. Detailný príklad opisuje J. Bac. 85, 1965, 680 - 685. Alternatívne je tiež možné pomocou uvedených techník zaviesť miestne špecifické delécie do tnaA-génu, čo vedie potom k inaktivácii.

Rad dodatočných mutácií východiskového kmeňa je vhodný na to, aby sa dosiahlo ďalšie zvýšenie produkcie tryptofánu. Je výhodne, keď je okrem tryptotänovej biosyntéznej cesty dodatočne všeobecná biosyntézna cesta aromatických aminokyselín (cesta shikimi kyseliny) regulačné insenzitivna. Preto sú kmene, ktoré majú regulačné inscnzitívnu syntetázu kyseliny dehydroarabinoheptulozónovej a ich tyrozín-represorový proteín (tyrR) je pôsobením mutácie alebo delécie inaktivovaný, vhodné ako východiskové kmene na prípravu kmeňov podľa predloženého vynálezu. Rovnako tak sú výhodné kmene, pri ktorých je porušená látková premena fenylalanínu a tyrozinu. Tým sa zaistí výsledný prechod chorizmatu na tryptofán. Takéto kmene majú napríklad mutácie alebo delécie v génoch pheA a/alebo tyrA.

Je známy rad kmeňov, ktoré sú v jednom alebo viacerých krokoch biosyntézy tryptofánu deregulované a nadprodukujú tryptofán. Ako príklady je možné uviesť Bacillus subtilis FermBP-4 a FermP1483 (DE 3 123 001), Brevibacterium flavum ATCC 21427 (US 3 849 251), Corynebacterium glutamicum ATCC 21842 - 21851 (US 3 594 297 a US 3 849 251), Micrococcus luteus ATCC 21102 (US 3 385 762), Escherichia coli ATCC 31743 (CA 1182409). Tieto kmene sú tiež vhodné ako východiskové kmene na prípravu kmeňov podľa predloženého vynálezu. Tým sa ukazuje, že kmene na produkciu tryptofánu podľa predloženého vynálezu je možné získať z najrôznejších skupín organizmov.

Okrem kmeňov s deregulovanou látkovou výmenou tryptofánu, je na výrobu kmeňov podľa predloženého vynálezu potrebný aspoň jeden gén, ktorý kóduje fosfoglycerátdehydrogenázu so zníženou serín - senzitivitou v porovnaní so zodpovedajúcou fosfoglycerátdehydrogenázou divokého typu.

Fosfoglycerátdehydrogenáza (POD) sa kóduje pomocou génu serA. Sekvencia divokého typu serA-génu je známa (Tobey K.L., Grant G.A., 1986, J. Bact. Vol. 261, č. 26: 1279 - 1283). Nadexpresia produktu divokého typu serA-génu cez plazmid-vektor je tiež známa (Schuller a kol., 1989, J. Biol. Chem. Vol. 264: 2645 - 2648).

Výroba proti spätnému účinku rezistentných serA-alel pomocou klasického genetického postupu bola opísaná Tosom T. a Pizerom L.T., 1971, J. Bact. Vol. 106, č. 3: 972 - 982. Selekcia sa pritom vykonáva cez rezistenciu mutantov proti serínovému analógu serínhydroxamátu. Mutácie nie sú v tomto literárnom odkaze bližšie charakterizované; vplyv mutácie na látkovú premenu nebol skúmaný.

Proti spätnému účinku rezistentné serA-alely sú tiež napríklad získateľné tak, že sa mikroorganizmus podrobí mutagenéze. Ako mutagén prichádza do úvahy ultrafialové žiarenie a zvyčajné chemické mutagény, ako je napríklad etylmetánsulfonát alebo N-metyl-N'-nitro-N-nitrózoguanidín. Dávkovanie a čas expozície zvoleného mutagénu sa stanovuje pomocou doterajších postupov (Miller J.H., 1972, Experimente in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, USA: 113 - 143).

Mutagénom spracované populácie organizmov sa podrobia selekcii na klony so serA-génmi, ktoré sa kódujú pre serín-insenzitívne fosfoglycerátdehydrogenázy. Napríklad sa inkubuje mutagénom spracovaná populácia na pevnom rastovom médiu, ktoré obsahuje v dostatočnom množstve serínhydroxamáť aby sa potlačil rast nerezistentných baktérií.

Rezistentné klony sa testujú na serín-senzitivitu svojou fosfoglycerátdehydrogenázou. Príkladové vyhotovenie tohto postupuje opísané Thosom a Pfizerom, 1971, J. Bact. 100, 3: 972 - 982.

Alely, ktoré kódujú serín-insenzitívnu fosfoglycerátdehydrogenázu, sa môžu tiež pripraviť pomocou techník genetic engineering.

Región fosfoglycerátdehydrogenázy, ktorý umožňuje serín-reguláciu, leží v C-terminálnej oblasti proteínu. Preto sa teda inzercia, substitúcia alebo delécia jednotlivých alebo viacerých aminokyselín zavádza výhodne v C-terminálnych 25 % PGD proteínu, obzvlášť výhodne v 50 C-terminálnych aminokyselinách PGD-proteínu. Toto vedie k zníženej senzitivite PGD proti serínu.

Alely, ktoré kódujú takéto PGD, sa získajú tak, že sa zmení 3'-oblasť serA-génu, ktorý kóduje uvedené C-terminálne oblasti PGD. K tomu sa nemutovaný serA-gén rekombinuje s využitím, technik na výrobu rekombinantnej DNA, ktoré sú odborníkom známe, ako je reštrikcia, ligácia a transformácia (Maniatis T., Fritsch E.F. a Sambrook J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 1982, Cold Spring Harbor Laboratory), na klonovací vektor.

Špecifické zmeny v 3'-oblasti štruktúrneho génu sa môžu napríklad dosiahnuť pomocou techniky site-directed-Mutagenese.

Príklady serín-insenzitívnych fosfoglycerátdehydrogenáz, ktoré sú vhodné na expresiu v mikroorganizmoch s deregulovanou látkovou premenou tryptotánu, sú uvedené znázornením svojich C-terminálnych aminokyselinových sekvencii v nasledujúcej tabuľke 1. Až na znázornenú C-tenninálnu oblasť sa proteínové sekvencie enzýmov nelíšia od sekvencie divokého typu.

Aby sa mohli génové produkty serA-alely vyskúšať na PGD-aktivitu a serín-senzitivitu, využije sa na to nasledujúci test:

PGD-aktivita bola stanovená dôkazom obojsmernej reakcie enzýmu podľa metódy Mc Kitricka J.C. a Lewise J.P., 1980, J. Bact. 141: 235 - 245. Aktivita enzýmu sa pritom merala bez serínu a s rôznymi koncentráciami serínu. Uvedený test je vhodný na stanovenie serín-senzitivity každej fosfoglycerátdehydrogenázy. Môže sa ale použiť každá ďalšia metóda merania PGD-aktivity.

Ako miera serín-senzitivity enzýmu slúži hodnota Kj, čo je koncentrácia serínu, ktorá inhibuje aktivitu enzýmu z 50 %. Kj hodnoty a C-terminálne sekvencie aminokyselín viac proti spätnému pôsobeniu rezistentných serA-alel ako i divoký typ serA-génu (serAWT) sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 1.

Tabuľka 1

C-vax«ináLn* sakvancl· aeirKiKysejr» mutovinjeh s«rX-al«l K|/i»H aac MfT Imqg v_._ _ηιλ aqyl qtsa qhct wid iexo ton txxr. qmik mfc tím ni.ui o,»i sro to i JI a«rá 9 Imqs v___-Hix mtl ars* qhcv wjn rnxr> sen ekxl qmik xrre tira ntxJ e. j iih id nót 3 |I •r* 11 Iakm vesn aiiia aqvi. ctsa q»cv wm isxn novx beal qxmk λιγό rtnx arx.l sa ccq to ho, 4 II «ck xislxtQq v— _xik xoti. οτβλ βηβτ Wio Itxo kdva rkal qkmk mm tik. Iroa srq it> iros 5

Na výrobu kmeňov podľa predloženého vynálezu sú výborne vhodne prekvapujúco serA-alely s hodnotami Kj v rozmedzí 0,1 a 50 mM serínu.

Pre expresiu PGD-proteínov v kmeni podľa predloženého vynálezu sa môže použiť každý rekombínantný vektor, ktorý vedie k expresii serín-insenzitívnych serA-alel. Rekombinantný vektor, vhodný na výrobu kmeňov podľa predloženého vynálezu, zahrnuje aspoň jeden serA-gén, ktorý kóduje PGD, ktorá má proti divokému typu zníženú senzitivitu proti serínu a jeden podiel vektora, ktorý je v kmeni hostiteľa autonómne replikovateľný.

Príklady vektorov, ktoré sú autonómne replikovateľné v Escherichia coli, sú uvedené Pouwelom P.H., Engerem-Valkom a Brammarom W.J., 1985, Cloning Vectors, Elsevier, Amsterdam.

Takéto vektory sú okrem iných:

- plazmidy s vysokým počtom kópii ako je napríklad pBR322 alebo pUC12,

- plazmidy so stredným počtom kópií ako je napríklad pA-CYC184,177,

- plazmidy s nízkym počtom kópií ako je napríklad pSCIOl,

- fágové vektory ako je napríklad Ml 3, gama-vektory.

Porovnateľné vektory sú opísané pre veľký počet baktérií (napríklad EP 0 401 735 pre Corynebacterium a Brevihacterium alebo CA 111 (1989) 168688q).

Obzvlášť výhodné sú vektory so stredným až nízkym počtom kópií, predovšetkým sú výhodné vektory s pl5A-replikónom, ako je napríklad pACYC184 (ATCC 37033) alebo pACYC177 (ATCC 37031).

V literatúre je ďalej opísaný veľký počet vektorov pre iné baktérie (Pouwels a kol., 1985, Cloning Vectors, Elsevier Science Publisher, Amsterdam).

Vhodné rekombinantné vektory sa môžu vyrobiť pomocou štandardných techník na výrobu rekombinantných DNA. Tieto techniky sú vyčerpávajúcim spôsobom uvedené napríklad v publikácii Maniatis T., Fritsch E.F. a Sambrook J., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, USA alebo Aushubel F.M. a kol., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, USA.

Výroba rekombinantných vektorov je napríklad možná tak, že sa DNA darcovského organizmu, ktorý má serA-alelu v chromozóme alebo na rekombinantnom vektore, ktorý kóduje proti serínu insenzitívny fosfoglycerátdehydro-genázu, fragmentuje pomocou reštrikčných enzýmov. Fragmentovaná DNA sa liguje pomocou konvenčných metód, napríklad použitím enzýmu T4-DNA-ligázy, na tiež pomocou reštrikčných enzýmov linearizovanú molekulu vektora. Ligačná zmes sa využije na to, aby sa hostiteľské kmene s deregulovanou látkovou premenou tryptofánu transformovali pomocou známych spôsobov, ako je kalciumchloridový šok alebo elektroporácia. Vektory, ktoré obsahujú požadované serA-alely, sa môžu v hostiteľských kmeňoch získať napríklad pomocou uvedených spôsobov, ako je selekcia na rezistenciu proti antibiotikám alebo komplementácia serA-mutáci í.

V ďalšej forme vyhotovenia kmeňov podľa predloženého vynálezu sú serA-alely integrované ako jednotlivé kópie do chromozómu. Toto sa môže jednak dosiahnuť tým, že sa vykoná opísaná mutagenézna a selekčná stratégia priamo s tryptofán-deregulovaným východiskovým kmeňom. Po druhé je tiež možné serA-alely, ktoré sa nachádzajú na rekombinantných vektoroch, integrovať do chromozómu produkčného kmeňa. Rad metód k takejto integrácii je známy. Opisy takýchto technik sa nachádzajú v nasledujúcich publikáciách:

Integrácia sprostredkovaná fágom lambda: Balakrishnan a Backmann, 1988, Gene 67: 97 - 103; Simons R.W. a kol., 1987, Gene 53: 85 - 89;

Genreplacement závislý od recD: Shervell a kol., 1987, J. Bact. 141: 235 -245;

ďalšie metódy: Silhavy a kol., 1988, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory.

Pri fermentácii kmeňov podľa predloženého vynálezu sa ukázalo celkom prekvapujúco, že kmene, obsahujúce proti spätnému účinku rezistentnú serA-alelu s hodnotou Kj pre serín v rozmedzí 100 μΜ až 50 mM a s deregulovanou látkovou výmenou tryptofánu a obsahujúcu trpE-alelu s hodnotou Kj pre tryptofán v rozmedzí 0,1 mM až 20 mM, poskytujú najvyššie výťažky tryptofánu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujúce príklady vyhotovenia slúžia na ďalšie objasnenie predloženého vynálezu.

Príklad 1

Skréning na proti spätnému pôsobeniu rezistentnej alely a integráciu tejto alely do chromozómu

Na hľadanie proti spätnému pôsobeniu rezistentných trpE-alel sa používa analóg tryptofánu 5-metyltryptofán. Ako mutagénne činidlo slúži N-metyl-N'-nitro-N-nitrózoguanidín (NG). Použitý východiskový kmeň je Escherichia coli K12 YMC9 ATCC 33927. Pracovný postup primutagenéze sa riadi podľa údajov Millera (Miller J.H., 1972, Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.: 125 - 129).

Asi 2 x 10? buniek AMC9 z exponenciálnej rastovej fázy v LB pestovanej kultúry sa inkubuje v 4 ml 0,1 M Na-citrátového pufra pri pH 5,5 počas 30 minút pri teplote 37 °C s 50 pg/mlNG. Po dvojnásobnom premytí 0,1 N fosfátovým pufrom s pH 7,0 sa 0,1 ml buniek kultivuje cez noc pri teplote 37 °C za trepania v LB. Potom sa 0,1 ml buniek z rôznych zriedení (10*3, 10’4, 109 v 0,9 % NaCl) nanesie na platne s minimálnym médiom s 100 pg/ml 5-metyltryptofánu. Okrem 5-metyltryptofánu obsahuje minimálne médium 5 g/1 glukózy, 5 mg/1 vitamínu BI, 3 g/1 dihydrogénfosforečnanu draselného, 12 g/1 hydrogénfosforečnanu draselného, 0,3 g/1 heptahydrátu síranu horečnatého, 0,1 g/1 chloridu sodného, 5 g/1 síranu amónneho, 17,7 mg/1 dihydrátu chloridu vápenatého, 2 mg/1 heptahydrátu síranu železnatého, 1 g/1 citrátu trojsodného a 15 g/1 agaru. Po 24 až 48 hodinách pri teplote 37 °C sa 5-metyltryptofán-rezistentné klony oddelia na uvedené platne.

Kvôli charakterizácii získaných mutantov sa stanovuje Kj-liodnota trpE-génového produktu pre tryptofán (Bauerle R. a kol., 1987, Methods in Enzymology Vol. 142: 366 - 368). Mutanty by sa mohli pritom rozdeliť do dvoch tried. Mutanty triedy 1 majú proti spätnému pôsobeniu rezistentnej antranilátsyntetázy, mutanty triedy 2 majú enzýmy so zvýšenou aktivitou antranilátsyntetázy pri nezmenenej hodnote Kj.

Kvôli charakterizácii na molekulárnej rovine sa relevantné oblasti DNA rôznych mutantov klonujú a sekvencujú. Na tento účel sa izoluje zodpovedajúca chromozomálna DNA a vo vsádzke sa rozštiepi pomocou reštrikčných enzýmov NheI a Clal. Fragmenty jednej veľkosti asi 5 kb sa izolujú a ligujú sa pomocou 4158 bp veľkého Nhel/Clal-fragmentu pBR322. Ligačná vsádzka sa transformuje do trpE-kmeňa E. coli KB 862 (DSM7196). Selektuje sa na klony, ktoré môžu rásť na minimálnom médiu

SK 279854 Β6 bez tryptofánu. Komplementujúce plazmidy obsahujú všetky 5 kb Nhel/Clal-lragment. Okrem génov DNA atrpD obsahuje tento 5 kb Nhel/Clal-fragment aj DNA-oblasti po smere od trpE (asi 0,8 kb) a po smere od trpD (asi 1 kb). V nasledujúcej tabuľke 2 sú uvedené rozdiely sekvencie aminokyselín a Kj-hodnoty 4 mutantov triedy 1. V neznázornených oblastiach súhlasia sekvencie mutantov so sekvenciou divokého typu.

Tabuľka 2

Sekvencia amlnokyaelí* mutovaných trpE-elel

Κχ/ΜΗ trpB WT trpe a trpí S trpK e trpE

8Λ0Ι nSKD PUtS

I o,Dl ara τη no: c I

I 0,1 3SQ m tla: 1

I 3,1 SfQ ID floi 0

I 7 13 SEQ ID HDI 9 I

I 15 SEQ It) IM: la

Sekvenčná analýza mutantov triedy 2 ukazuje, že mutácie existujú buď v oblasti operátora trp-promótora, alebo v oblasti DNA, ktorá kóduje trp-riadiaci peptid. Mutácie označené ako deltatrpLl, prípadne deltatrpL2, majú 136 bp, prípadne 110 hp veľkú deléciu v oblasti DNA, kódovanej pre riadiaci peptid. Pri deltatrpLl mutáciu zahrnuje delécia oblasť pozície nukleotidov 33 až do pozície 168, pri deltatrpL2 mutácia oblasť od pozície nukleotidov 11 až do 120, v sekvencii uložené v EMBL-databáze pod číslom AC V00372.

Aby sa dosiahla silnejšia expresia proti spätnému pôsobeniu rezistentných trpE-alel, kombinujú sa obidve triedy mutácie. Na to sa použije mutácia deltatrpLl triedy 2. Na obr. 2 je ukázaný rad deltatrpLl mutácií (trieda 2) a mutácie trpF.O, trpE5, trpE6 a trpE8 (trieda 1).

Z plazmidu pdeltatrpL (obr. 2) sa izoluje 1,6 kb Nrul- fragment, ktorý nesie deltatrpLl-mutáciu a vymení sa za zodpovedajúci Nrul-fŕagment divokého typu plazmidov pEO, pE5-pE6, prípadne pE8 (obr. 2). Získané plazmidy sú pomenované ako pIEO, pIE5, pIE6, pripadne pIE8 a použijú sa na chromozomálnu integráciu homológnou rekombináciou. Na to sa z uvedených plazmidov izolujú zodpovedajúce, asi 5 kb veľké chromozomálne NheI (Clal-fragmenty ako je uvedené v príklade 2 z low melting agarózy a v lineárnej forme sa transformujú do recD-kmeňa PD106 (deltatrpLD102).

Ako transfoimačná metóda sa použije CaCL2-metóda podľa Cohena a kol., 1972,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110-2114. Kmeň PD106 je uložený podľa Budapeštianskej zmluvy od 28.07.1992 v Nemeckej zbierke mikroorganizmov (DSM) pod číslom 7195 (DSM7195). Selektujú sa klony, ktoré môžu rásť na minimálnom médiu bez tryptoťánu a ktoré sú ampicilín-senzitívnc, to znamená zbavené plazmidu.

Pl-transdukciou (Miller J.H., 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, N.Y.: 201 - 205) sa trpE-alely, ktoré kódujú rôzne proti spätnému pôsobeniu rezistentné trpE-enzýmy a sú zodpovedajúcim spôsobom kombinované s deltatrpLl-mutáciou, prechádzajú zo zodpovedajúcich kmeňov do KB862. Kmeň KB862 je uložený podľa Budapeštianskej zmluvy od 28.07.1992 v Nemeckej zbierke mikroorganizmov (DSM) pod číslom 7196 (DSM 7196). Selektujú sa klony, ktoré môžu rásť na minimálnom médiu bez tryptofánu. Získané kmene bob označené ako PD103 (tipEO), KB862 (trpE5), SV164 (trpE8) a SV163 (trpE6).

Príklad 2

Výroba serA-génov, ktoré sú kódované pre serín-intenzívne fo sfogly cerátdehydro genázy

Divoký typ serA-génu z Escherichia coli kmeňa E. coli B (ATCC 23226) sa klonuje na plazmidový vektor pUC 18.

Aby sa získala chromozomálna DNA tohto kmeňa, nechá sa na neho cez noc pôsobiť pri teplote 37 °C Luria-Broth. Bakteriálne bunky sa získajú centrifugáciou (4000 g). Lýzia buniek a čistenie DNA sa vykonáva metódou, opísanou Aushubelom a kol., 1987, 2.4.1. - 2.4.2,Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates. Získané množstvo DNA sa stanovuje spektrofotometricky pri vlnovej dĺžke 260 nm. Výťažok je okolo 600 mg/100 ml.

100 pg chromozomálnej DNA sa štiepi pomocou reštrikčného enzýmu Sphl (Boehringer Mannheim GmbH) za podmienok udaných výrobcom. Asi 3 pg zmesi fragmentov sa liguje pomocou 0,2 pg tiež Sphí-štiepeného autonómneho replikovateľného plazmidového vektora pUC18 (firmy Boehringer Mannheim GmbH) pomocou enzýmu T4-ligáza (firmy Boehringer Mannheim GmbH) za podmienok udávaných výrobcom. Ligačná zmes sa použije na to, aby sa serA-mutanty PC1523 (CGSC #:5411) (CGSC: E. coli Genetic Stock Center, Department of Biology 255 OML, Yale University, Postbox 6666, New Haven, CT, USA) transformovali. Ako transformačná metóda sa použije CaCl-metóda podľa Cohena a kol., 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110 - 2115. Transformované baktérie sa nanesú na platne s minimálnym médiom bez serínu. Klony, ktoré bez serínu rastú, obsahujú serA-gén z E. coli na 3,5 kb veľkom Sphl-fragmente. Sekvencia divokého typu serA-génu je uvedená na obr. 3 (SEQ ID NO: 13; SEQIDNO: 14). Rekombinantný vektor so serA-génom je označený ako pGC3 (obr. 4).

SerA-alela serA5 sa vyrobí tak, že sa plazmid pGC3 rozštiepi pomocou reštrikčných enzýmov Sali a KpnI (firmy Boehringer Mannheim GmbH) podľa údajov výrobcu. Získané fragmenty sa rozdelia podľa agarózovej gólovej elektroforézy. Fragment Sall-KpnI s veľkosťou 2,0 kb, ktorý obsahuje úplný scrA-gén až na 8 C-terminálny kodón, sa na géli prečisti. K tomu sa vykonáva elektroforéza na low-melting-agaróze (firmy Boehringer Mannheim GmbH) tak, aby sa mohla DNA pomocou jednoduchého roztavenia agarózy získať späť. 0,2 pg tohto fragmentu sa liguje ekvimolámym množstvom pUC18, štiepeného pomocou Hindin/SalI a synteticky vyrobeného, dvojskrutkovnicového oligonukleotidu pomocou T4-ligázy (firmy Boehringer Mannheim GmbH) podľa údajov výrobcu. Sekvencia nukleotidov tohto oligonukleotidu je nasledujúca:

5' J'

C ATT CCC GCC CCT CTG CTG TAA TA

CTAGG TAA GCG CGG GCA GAC GAC ATT ATT CGA SEQ ID KO : 11 3' 5'

Tento oligonukleotid dopĺňa 7 z 8 posledných C-terminálnych kodónov serA-génov. Namiesto ôsmeho kodónu sa zavádza stoptriplet TAA. Fosfoglycerátdehydrogenáza, kódovaná týmto serA-génom, je tým skrátená o jednu C-terminálnu aminokyselinu. Amínokyselinová sekvencia zmnoženej PGD je ukázaná v tabuľke 1 (serA5). Rekombinantný plazmid sa označuje ako pGH5 (obr. 5). Pomocou ligačnej vsádzky sa transformuje serA-mutantaPC1523.

SerA-alela serA1508 sa vyrobí nasledujúcim spôsobom. Plazmid pCG3 sa štiepi pomocou Sphl/Sall (firmy

Boehringer Mannheim GmbH) podľa údajov výrobcu. 3 kb-fragment, ktorý nesie úplný serA-gén, sa čistí pomocou gélovej elektroforézy a liguje sa pomocou vektora pUC18, štiepeného pomocou Sphl/Sall. Rezultujúci plazmid je označený ako pKB1321 (obr. 6).

Plazmid pKB13221 sa inkubuje s reštrikčnou endonukleázou HindlI (firmy Boehringer Mannheim) za podmienok, ktoré dovoľujú iba parciálne štiepenie (0,05 U enzýmu pre 1 pg DNA pre 10 minút, zvyčajné reakčné podmienky podľa údajov výrobcu). Tým vznikne okrem iného frakcia fragmentov, ktoré sú štiepené na pozícii 1793 serA-génu HindlI. Na tomto mieste sa ligáciou zavedie DNA-linkér s Xbal-štiepnym miestom. Sekvencia DNA-linkéru je nasledujúca

5' 3'

TGC TCT AGA GCA

ACG AGA TCT CGT SEQ ID NO : 12

3' 5’

Inzercia vedie k polyfosfátodehydrogenáze, ktorá na tomto mieste nesie štyri prídavné aminokyseliny. Ich sekvencia je znázornená v tabuľke 1. Plazmid s touto inzerciou sa označuje ako pKB 1508 (obr. 7). Je transformovaný do serA-mutantu PC 15 23.

SerA-alela serAl 1 sa vyrobí tak, že sa štiepi plazmid pGH5 pomocou Sali a KpnI (firmy Boehringer Mannheim GmbH) podľa údajov výrobcu a 2,8 kb veľký fragment sa zo zmesi fragmentov oddelí pomocou gélovej elektroforézy z low-melting-agarózy. Tento fragment obsahuje podiel vektora z pUC18 a C-terminálnu oblasť serA5. Plazmid pKB 1508 sa tiež štiepi pomocou Sall/KpnI. 2,0 kb veľký fragment DNA sa eluuje z low-melting-agarózového gélu. Tento fragment obsahuje serA-alelu serA15O8 s inzertnou mutáciou, ale chýbajú 8 C-terminálne kodóny. Obidva fragmenty sa spolu ligujú, a tým sa transformuje serA-mutanta PC1523. Výsledný rekombinantný plazmid sa označuje ako pGHll (obr. 8). Kódovaná fosfoglycerátdehydrogenáza spája inzertnú mutáciu serA1508 s delečnou mutáciou serA5. Región s mutáciami v kódovanej sekvencii aminokyselín je znázornený v tabuľke 1.

Kvôli expresii mutovaných serA-alel v produkčných kmeňoch sa tieto preklonujú vo vektore pACYC 184 (ATCC 37033), vektore so stredným počtom kópií. K tomu sa plazmid pGH5 a plazmid pGHll štiepi pomocou Sall/HinhlII a izolujú sa vždy asi 2 kb veľké fragmenty DNA, obsahujúce serA-alely serA5 a serAl 1, z low-meltingagarózového gélu. Fragmenty sa v oddelených vsádzkach spracujú pomocou Klenow-fragmentu DNA-polymerázy I z E. coli (firmy Boehringer Mannheini) podľa predpisu výrobcu, aby sa 5'-previsnuté štiepne konce reštrikčného enzýmu previedli na hladké konce. K tomu sa 1 pg zodpovedajúceho fragmentu v 20 pl reakčnej vsádzky zmieša s 5 U Klenow-enzýmu, 0,5 mM dATP, dGTP, dTTP a dCTT a s výrobcom odporučeným pufrom a zmes sa inkubuje počas 15 minút pri teplote 30 °C.

Fragmenty DNA s hladkým koncom sa ligujú s vektorom pACYC 184, štiepeným pomocou PvuII. Ligačná vsádzka sa využije na to, aby sa transformovali serA-mutanty. Komplementované plazmidy boli nazvané pGII5/II, prípadne pGHll/II (obr. 9, obr. 10). Plazmid pKB1508 sa štiepi pomocou Sall/Sphl. Fragment veľkosti 3,0 kb, ktorý obsahuje serA-alelu serAl508, sa čistí pomocou gélovej elektroforézy. Tento fragment sa opísaným spôsobom prevedie na fragment s hladkým koncom, liguje sa pA

CYC 184, štiepeným pomocou Pvul a ligačná vsádzka sa transformuje do E. coli PC1523. Komplementujúci plazmid bol nazvaný pKB1508/II (obr. 11).

Plazmidy pGH5/II (serA5), pGHll/Π (serAl 1) a pKB 1508/11 sa využijú na to, aby sa transformovali kmene PD103 (tipEO), KB862 (trpE5), SV164 (trpES) a SV163 (trpEÓ).

Príklad 3

Konštrukcia chromozomálne kódovanej, proti spätnému pôsobeniu rezistentnej serA5-alely s pomocou rekombinantného gamaprofágu

Kvôli integrácii do chromozomálnej lambda attachment site (att lambda) sa serA5-alela klonuje do plazmidu pRS551 (Simons a kol., 1987, Gene 53: 85 - 96). K tomu sa izoluje asi 2 kb veľký serA5-nesúci Hindin/SalI-fragment z plazmidu pGH5. 5'-previsnuté konce sa zaplnia pomocou Klenow-fragmentov DNA-polymerázy I (firmy Boehringer Mannheim GmbH) podľa predpisu výrobcu a s pomocou EcoRI-linkérov (Maniatis a kol., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.: 396 - 397) sa 2kb fragment liguje do pomocou EcoRI štiepeného vektora pRS551. Rekombinantný plazmid sa označí ako pRS55.

Vyrobením platňového lyzátu recA⁺ kmeňa, nesúceho pRS5 (napríklad YMC9 ATCC 33927) pomocou lambda RS45-fágu sa vyrobí in vivo homológnou rekombináciou heterogénny lanibda-lyzát, ktorý okrem lambda RS45-fágu obsahuje tiež rekombinačný serA5-nesúci lambda RS45-deriváty (Simons akol., 1987, Gene 53: 85 - 96).

Na selekciu na rekombinantné lambda RS45-deriváty sa použije serA-kmeň PC1523 (CGSC #:5421). K tomu sa PC1523 infikuje heterogénnym lambda-lyzátom (pozri vyššie) a potom sa zaočkuje na kanamycín obsahujúci (25 mg/1) LB-platne. Získané lyzogénne, kanamycín-rezistentné klony sa potom testujú na svoju schopnosť rastu na platniach s minimálnym médiom bez serínu. Zvolí sa serin-prototrofný kmeň a tento sa použije na výrobu homogénneho serA5-lambda-lyzátu (UV-indukciou, Simons a kol., 1987, Gene 53: 85 - 86).

Týmto homogénnym serA5-lambda-lyzátom sa infikuje tryptofán-produkčný kmeň SV164. Získaný kmeň SV164 att-lambda: serA5 sa fermentuje postupom opísaným v príklade 4. Zodpovedajúce médium obsahuje namiesto tetracyklínu ako selekčný agens vždy 25 mg/1 kanamycínu.

Výťažky tiypiolánu sa pohybujú okolo 12,5 g/1, pričom pri použití rovnakého kmeňa bez serA5 sa dosiahne výťažok 3,5 g/1.

Príklad 4

Produkcia tryptofánu Corynebaktériami

Plazmid pGH5 sa rozštiepi pomocou reštrikčných enzýmov Sali a HindlII (firmy Boehringer Mannheim GmbH) a z low melting-agarózového gélu sa izoluje 2 kb veľký, serA5-gén nesúci fragment DNA. Fragment DNA sa rovnako, ako je opísané v príklade 2, spracuje pôsobením Klenow-fragmentu DNA-polymerázy I z E.coli (firmy Boehringer Mannhenn GmbH) na dosiahnutie hladkého konca. Vektor pWSTl sa rozštiepi pomocou reštrikčného enzýmu Smal (firmy Boehringer) a liguje sa fragmentom DNA s hladkým koncom. Vektor pWSTl je univerzálny vektor pre E. coli/Corynebakterium a môže sa replikovať tak v Corynebaktériách, ako v E. coli. Corynebakteriálny replikón tohto vektora pochádza z kmeňa Corynebakterium glutamicum ATCC 19 223. Výroba vektora pWSTl je opísaná v US-A4 965 197. Ligačná vsádzka sa využije na to, aby sa transformoval kmeň E. coli PC 1523. Komplementujúci plazmid bol nazvaný pGH5/III (obr. 12).

Plazmid pGlI5/III sa využije na to, aby sa transformoval tryptofán produkujúci kmeň Corynebakterium glutamicum ATCC 21 851. Transformácia sa vykonáva cez elektroporáciu pomocou techniky, vyčerpávajúcim spôsobom opísanej H. Wolfom a kol., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 30: 283 - 289. Klony, ktoré nesú rekombinantný plazmid pGH5/III, sa selektujú cez plazmid-kódovanú kanamycínovú rezistenciu na agarových platniach s 25 mg/1 kanamycínu.

Plazmid pGC3 sa rozštiepi pomocou reštrikčných enzýmov Sphl a Sali. 3 kb fragment DNA, ktorý nesie divoký typ serA-alely, sa prečistí a opísaným spôsobom sa liguje do vektora pWSTl. Získaný vektor pGC3 (obr. 13) sa využije na transformáciu Corynebakterium glutamicum ATCC 21 851.

Analogicky sa vyrobí kmeň Corynebakterium glutamicum ATCC 21 581, ktorý nesie na plazmide serA-alelu 1455.

Pri feimentácii sa ukázalo, že kmeň, ktorý nesie na plazmide serA5-alelu, dosahuje najvyššie výťažky tryptofánu.

Príklad 5

Vplyv rôznych plazmidom kódovaných serA-alel na produkciu tryptofánu pri rôznych trpE-kmeňov

Rôznymi, v tabuľke 3 uvedenými produkčnými kmeňmi tryptofánu, sa v 10 ml erlenmayerových bankách zaočkuje 10 ml LB média (1 % tryptónu, 0,5 % kvasničného extraktu, 0,5 % chloridu sodného), ktoré bolo zmiešané s 15 mg/1 tetracyklínu. Po 8 až 9 hodinovej inkubácii za trepania pri 150 otáčkach za minútu pri teplote 30 °C sa zodpovedajúce predkultúry prevedú do 100 ml SMI-média. SMI-médium obsahuje 5 g/1 glukózy, 3 g/1 dihydrogénfosforečnanu draselného, 12 g/1 hydrogénfosforečnanu draselného, 0,1 g/1 síranu amónneho, 0,3 g/1 heptaliydrátu síranu horečnatého, 15 mg/1 dihydrátu chloridu vápenatého, 2 mg/1 heptahydrátu síranu železnatého, 1 g/1 dihydrátu citrátu troj sodného, 1 ml/1 roztoku stopových prvkov (pozri nižšie), 40 mg/1 L-fenylalanínu, 40 mg/1 L-tyrozrnu, 5 mg/1 vitamínu BI a 15 mg/1 tetracyklínu. Roztok stopových prvkov pozostáva z 0,15 g/1 dihydrátu molybdenanu sodného, 2,5 g/1 kyseliny boritej, 0,7 g/1 hexahydrátu chloridu kobaltnatého, 0,25 g/1 pentahydrátu síranu meďnatého, 1,6 g/1 tetrahydrátu chloridu manganatého a 0,3 g/1 heptahydrátu síranu zinočnatého.

Kultúry sa trepú v jednolitrových erlenmayerových bankách pri teplote 30 °C počas 12 až 16 hodín pri 150 otáčkach za minútu. Po tejto inkubácii je hodnota ODgoo v rozmedzí 2 až 4. Ďalšia fermentácia sa vykonáva vo výskumných fermentoroch BIOSTAT^M firmy Braun Melsungen. Používa sa kultivačná nádoba s celkovým objemom 2 litre.

Médium obsahuje 17,5 g/1 glukózy, 5 g/1 síranu amónneho, 0,5 g/1 chloridu sodného, 0,3 g/1 heptahydrátu síranu horečnatého, 15 mg/1 dihydrátu chloridu vápenatého, 75 mgd heptahydrátu síranu železnatého, 1 g/1 dihydrátu citrátu trojsodného, 1,5 g/1 dihydrogénfosforečnanu draselného, 1 ml roztoku stopových prvkov (pozri vyššie), 5 mg/1 vitamínu BI (tramín), 0,75 g/lL-fenylalanínu, 0,75 g/lL-tyrozínu, 2,5 g/1 kvasničného extraktu (Difco), 2,5 g/1 tryptónu (difco) a 20 mg/1 tetracyklínu.

Koncentrácia glukózy sa vo fermentore udržiava dávkovaním 700 g/1 (w/v) glukózového roztoku (autoklávovaného) na 17,5 g/1. Pred zaočkovaním sa do fermentačného média pridá tetracyklín až na konečnú koncentráciu 20 mg/1. Ďalej sa udržiava hodnota pH privádzaním 25 % roztoku hydroxidu amónneho na 6,7.

100 ml predkultúry sa kvôli zaočkovaniu prečerpá do fermentačnej nádoby. Východiskový objem je asi 1 liter. Kultúry sa najprv miešajú pri 400 otáčkach za minútu a vzdušnia sa 1,5 vvm stlačeného vzduchu, zbaveného zárodkov pomocou sterilného filtra. Fermentácia sa vykonáva pri teplote 30 °C.

Hodnota pH sa udržiava automatickým dávkovaním 25 % hydroxidu amónneho na 6,7. Sýtenie kyslíkom vo fermentačnom médiu sa v žiadnom okamihu lamentácie nenechá poklesnúť pod 20 %. Sýtenie kyslíkom sa pri fermentácii udržiava pomocou rý chlosti miešania.

V dvojhodinových až trojhodinových periódach sa zisťuje obsah glukózy v živnom roztoku, optická hustota a výťažok tryptofánu. Stanovenie glukózy sa vykonáva enzymaticky pomocou glukózového analyzátora firmy Ysi. Koncentrácia glukózy sa nastavuje kontinuálnym živením v rozmedzí 5 až 20 g/1.

Obsah tryptofánu v médiu po fermcntácii sa stanovuje pomocou HPLC. Médium sa rozdeľuje na Nucleosile 100-7/C8 (250/4 mm; Macherey-Nagel). Stĺpec sa prevádzkuje izokraticky s hodnotou toku 2 ml/min. Ako pohyblivá fáza sa používa zmes vody a acetonitrilu (83/17), do ktorej sa pridáva na liter 0,1 ml kyseliny fosforečnej (85 %). Detekuje sa buď pomocou diódového arraydetektora alebo pri pevnej vlnovej dĺžke 215, pripadne 275 nm.

Po 44 až 50 hodinách sa fermentácia skončí. Produkované množstvá tryptofánu v g/1 z týchto fermentácii po 48 hodinách sú zhrnuté v tabuľke 3.

Tabuľka 3 Výťažky tryptofánu s rôznymi kombináciami scrA/trpE

Sekvenčný protokol:

(1) Všeobecné informácie:

(i) Prihlasovateľ:

(A) Meno: Consorcium tur elektrochemische Industrie

GmbH (B) Ulica: Zielstattstr. 20 (C) Miesto: Mníchov (E) Štát: Nemecko (F) PSČ: 81379 (G) Telefón: 089-62792686 (H) Telefax: 089-62792795 (ii) Názov vynálezu: Mikroorganizmy na produkciu tryptofánu a spôsob ich výroby (iii) Počet sekvencii: 14 (iv) Počítačovo čitateľná forma:

(A) Nosič dát: Floppy disk (B) Computer: IBM PC kompatibilný (C) Pracovný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPA) (2) Informácie k SEQ ID NO : 1:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 52 aminokyselín (B) Druh: aminokyseliny (C) Forma reťazca: jednotlivý (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: proteín (iii) Hypoteticky: áno (v) Druh fragmentu: C-terminus (vi) Pôvod (A) Organizmus: Escherichia coli (B) Kmeň: B (vii) Bezprostredný pôvod:

(B) Kloň: pGC3 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO : 1:

Ala

Glu

Gin

Gly

Val

Asn

íle

Ala

Ala

Gin

Tyr

Leu

Gin

Thr

Ser

1

5

10

15

Ala

Gin

Met

Gly

Tyr

Val

Val

Tie

Asp

íle

Glu

Ala

Asp

Glu

Asp

20

25

30

Val

Ala

G1U

Lys

Ala

Leu

Gin

Ala

Met

Lys

Ala

íle

Pro

Gly

Thr

35

40

45

íle

Arg

Ala

Arg

Leu

Leu

Tyr

(2) Informácie k SEQ ID NO : 2:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 51 aminokyselín (B) Druh: aminokyseliny (C) Forma reťazca: jednotlivý (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: proteín (iii) Hypoteticky: áno (v) Druh fragmentu: C-terminus (vi) Pôvod (A) Organizmus: Escherichia coli (B) Kmeň: B (vii) Bezprostredný pôvod:

(B) Kloň: pGH5 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO : 2:

Ala

Glu

Gin

Gly

Val

Asn

íle

Ala

Ala

Gin

Tyr

Leu

Gin

Thr

Ser

1

5

10

15

Ala

Gin

Het

Gly

Tyr

Val

Val

íle

Asp

íle

Glu

Ala

Asp

Glu

Asp

20

25

30

Val

Ala

Glu

Lys

Ala

Leu

Gin

Ala

Met

Lys

Ala

íle

Pro

Gly

Thr

35

40

45

íle

Arg

Ala

Arg

Leu

Leu

(2) Informácie k SEQ ID NO : 3:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 56 aminokyselín (B) Druh: aminokyseliny (C) Forma reťazca: jednotlivý (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: proteín (iii) Hypoteticky: áno (v) Druh fragmentu: C-terminus (vi) Pôvod (A) Organizmus: Escherichia coli (B) Kmeň: B (vii) Bezprostredný pôvod:

(B) Kloň: pKB1508 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO : 3:

Ala

Glu

Gin

Gly

Val

Cys

Ser

Arg

Ala

Asn

11«

Ala

Ala

Glrt

Tyr

1

5

10

15

Leu

Gin

Thr

Ser

Ala

Gin

Met

Gly

Tyr

Val

Val

íle

Asp

íle

Glu

20

25

30

Ala

Asp

Glu

Asp

Val

Ala

Glu

Lys

Ala

Leu

Gin

Ala

Met

Lys

Ala

35

40

45

Ila

Pro

Gly

Thr

íle

Arg

Ala

Arg

Leu

Leu

Tyr

55 (2) Informácie k SEQ ID NO : 4:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 55 aminokyselín (B) Druh: aminokyseliny (C) Forma reťazca: jednotlivý (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: proteín (iii) Hypoteticky: áno (v) Druh fragmentu: C-terminus (vi) Pôvod (A) Organizmus: Escherichia coli (B) Kmeň: B (vii) Bezprostredný pôvod:

(B) Kloň: pGHll (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO : 4:

Ala

Glu

Gin

Gly

Val

Cys

Ser

Arg

Ala

Asn

Tie

Ala

Ala

Gin

Tyr

1

5

10

15

Leu

Gin

Thr

Ser

Ala

Gin

Het

Gly

Tyr

Val

Val

íle

Asp

íle

Glu

20

25

30

Ala

Asp

Glu

Asp

Val

Ala

Glu

Lys

Ala

Leu

Gin

Ala

Met

Lys

Ala

3S

40

45

íle

Pro

Gly

Thr

íle

Arg

Ala

Arg

Leu

Leu

55 (2) Informácie k SEQ ID NO : 5:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 47 aminokyselín (B) Druh: aminokyseliny (C) Forma reťazca: jednotlivý (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: proteín (iii) Hypoteticky: áno (v) Druh fragmentu: C-terminus (vi) Pôvod (A) Organizmus: Escherichia coli (B) Kmeň: B (vii) Bezprostredný pôvod:

(B) Kloň: pKB1455 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO : 5:

Ala

Glu

Gin

Gly

Val

Asn

íle

Ala

Ala

Gin

Tyr

Leu

Gin

Thr

Ser

1

5

10

15

Ala

Gin

Het

Gly

Tyr

Val

Val

íle

Asp

íle

Glu

Ala

Asp

Glu

Asp

20

25

30

val

Ala

Glu

Lys

Ala

Leu

Gin

Ala

Met

Lys

Ala

íle

Pro

Gly

Thr

40 45 íle Arg (2) Informácie k SEQ ID NO : 6:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 32 aminokyselín (B) Druh: aminokyseliny (C) Forma reťazca: jednotlivý (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: proteín (iii) Hypoteticky: áno (v) Druh fragmentu: inertný (vi) Pôvod (A) Organizmus: Escherichia coli (B) Kmeň: YMC9 (xi) Opis sekvencie: SEQ IDNO : 6:

Asn Pro Thr Ala Leu Phe His Gin Leu Cys Gly Asp Arg Pro Ala 15 10 15

Thr Leu Leu Leu Glu Ser Ala Asp íle Asp Ser Lys Asp Asp Leu 20 25 30

Lys Ser (2) Informácie k SEQ ID NO : 7:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 32 aminokyselín (B) Druh: aminokyseliny (C) Forma reťazca: jednotlivý (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: proteín (iii) Hypoteticky: áno (iii) Antisense: nie (v) Druh fragmentu: inertný (vi) Pôvod (A) Organizmus: Escherichia coli (B) Kmeň: PD103 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO : 7:

Asn Pro Thr Ala Leu Phe His Gin Leu cyB Gly Asp Arg Pro Ala 15 10 15

Thr Leu Leu Leu Glu Ser Ala Asp íle Asp Set Lys Asp Asp Leu 20 25 30

Glu Ser (2) Informácie k SEQ ID NO : 8:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 32 aminokyselín (B) Druh: aminokyseliny (C) Forma reťazca: jednotlivý (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: proteín (iii) Hypoteticky: áno (v) Druh fragmentu: inertný (vi) Pôvod (A) Organizmus: Escherichia coli (B) Kmeň: KB862 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO : 8:

Asn Ser Thr Ala Leu Phe His Gin Leu Cys Gly Asp Arg Pro Ala 15 10 15

Thr Leu Leu Leu Glu Ser Ala Asp íle Asp Ser lys Asp Asp Leu 20 25 30

Lys Ser (2) Informácie k SEQ ID NO : 9:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 32 aminokyselín (B) Druh, aminokyseliny (C) Forma reťazca: jednotlivý (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: proteín (iii) Hypoteticky: áno (v) Druh fragmentu: inertný (vi) Pôvod (A) Organizmus: Escherichia coli (B) Kmeň: SV163 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO : 9:

Asn Pro Thr Ala Leu Phe His Gin Leu Cys Gly Asp Arg Pre Ala 15 10 15

Thr Leu Leu Leu Glu Phe Ala Asp íle Asp Ser Lys Asp Asp Leu

25 30

Glu Ser (2) Informácie k SEQ ID NO : 10:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 32 aminokyselín (B) Druh: aminokyseliny (C) Forma reťazca: jednotíivý (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: proteín (iii) Hypoteticky: áno (v) Druh fragmentu: inertný (vi) Pôvod (A) Organizmus: Escherichia coli (B) Kmeň: SV164 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO : 10:

Asn Ser Thr Ala Leu Phe His Gin Leu Cys Gly Asp Arg Pro Ala 15 10 15

Thr Leu Leu Leu Glu Ser Ala Asp íle Asp Ser Lys Asp Asp Leu

25 30

Glu Ser (2) Informácie k SEQ ID NO : 11:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 32 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Forma reťazca: obojaký (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: DNA (iii) Hypoteticky: nie (iii) Antisense: nie (vi) Pôvod (A) Organizmus: in vitro syntetizovaný fragment DNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO : 11:

AGCTTATTAC AGCAGACGGG CGCGAATGGA TC (2) Informácie k SEQ ID NO : 12:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 12 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Forma reťazca: dvojitá (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: DNA (iii) Hypoteticky: nie (iii) Antisense: nie (vi) Pôvod (A) Organizmus: in vitro syntetizovaný fragment DNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO : 12:

TGCTCTAGAG CA (2) Informácie k SEQ ID NO : 13:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 1233 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Forma reťazca: dvojitá (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: DNA (genomická) (iii) Hypoteticky: nie (iii) Antisense: nie

SK 279854 Β6 (vi) Pôvod (A) Organizmus: Escherichia coli (B) Kmeň: B (x) Informácie o zverejnení:

(A) Autori: Tobey K.L.

Grant G.A.

(B) Titul: The nucleotide sequence of the SerA gene of Escherichia coli and the amino acid sequence of the encoded proteín, d-3-phosphoglyccrate (C) Časopis: J. Biol. Chem.

(D) Diel: 261 (E) Strana: 12179-12183 (G) Dátum 1986 (xi) Opis sekvencie: SEQ IDNO : 13:

ATG GCA AAC OTA TCO CTO OAO AAA GAC AAG ATT ΛΑΟ TTT CGT CGT 48

Met Ala Lys Val Ser Leu Glu

Lys Asp Lys

íle Lys

Phe Leu Leu

1

5

10

15

OTA

GAA 96

GGC

CTG

CAC

CAA

AAO

GCO

CTG

GAA

AGC

CTT

CGT

GCA

GCT

Val

Glu

Gly

Val

His 20

Gin

Lys

Ala

Leu

Olu 25

Ser

Leu

Arg

Ala

Ala 30

GGT

TAC

ACC 144

AAC

ATC

GAA

TTT

CAC

AAA

GGC

GCG

CTG

GST

GAT

GAA

Gly

Tyr

Thr

Asn

íle 35

Glu

Phe

His

Lys

Gly 40

Ala

Leu

Asp

Asp

Glu 45

CAA

TAA

AAA

GAA 192

TCC

ATC

CGC

OAT

GCC

CAC

TTC

ATC

GGC

CTG

CCA

Gin

Leu

Lys

Glu

Ser 50

Ilc

Arg

Asp

Ala

His 55

Phe

íle

Gly

Leu

Arg 60

TCC

CGT

ACC

CAT

CTG 240

ACT

GAA

GAC

GTG

ATC

AAC

GCC

GCA

CAA

AAA

Ser

Arg

Thr

His

Leu 65

Thr

Glu

Asp

Val

íle 70

Asn

Ala

Ala

Glu

Lys 75

CTG

CTC

GCT

ATT

GGC

TGT 288

TTC

TOT

ATC

OGA

ACA

AAC

CAO

GTT

GAT

Leu

Val

Ala

íle

Gly 80

Cys

Phe

Cys

Ilc

Cly 85

Thr

Asn

Gin

Val

Asp 90

CTG

OAT

GCC

GCC

GCA

AAC

CGC 336

GGC

ATC

CCG

OTA

TTT

AAC '

GCA

CCG

Leu

Asp

Ala

Ala

Ala 95

Lys

Arg

Gly

íle

Pro 100

val

Phe

Asn

Ala

Pro 105

TTC

TCA

AAT

ACO

CGC

TCT

GTT

GCG 384

GAG

CTO

OTO

ATT

GGC

OAA

CTG

Phe

Ser

Asn

Thr

Arg 110

Ser

Val

Ala

Glu

Leu 115

Val

ILe

Gly

Olu

Leu 120

CTC

CTG

CTA

TTG

CGC

GGC

GGT

CCG

OAA 432

GCC

AAT

GCT

AAA

GCG

CAC

Leu

Leu

Leu

Leu

Arg 125

Gly

Val

Pro

Olu

Ala 130

Asn

Ala

Lys

Ala

His 135

CGT

GGC

CTO

TGG

AAC

AAA

CTG

GCG

GCG

GGT 480

TCT

TTT

GAA

GCG

CGC

Arg Gly

Val

Trp

Asn 140

Lys

Leu

Ala

Ala

Gly 145

Ser

Phe

Glu

Ala

Arg 150

GGC

AAA

AAG

CTG

GGT

ATC

ATC

GGC

TAC

GGT

CAT 528

ATT

GGT

ACG

CAA

Oly

Lys

Lys

Leu

Gly 155

íle

Ilc

Oly

Tyr

Oly 160

His

Ilc

Gly

Thr

Gin 165

TTC

GGC

ATT

CTG

GCT

OAA

TCO

CTO

GCA

ATG

TAT

GTT 576

TAC

TTT

TAT

Leu

Oly

Ilc

Leu

Ala 170

Olu

Ser

Leu

Gly

Met 175

Tyr

Val

Tyr

Phe

Tyr 180

OAT

ATT

GAA

AAT

AAA

CTG

OCO

CTG

GGC

AAC

GCC

ACT

CAG 624

CTA

CAG

Asp

íle

Clu

Asn

Lys 185

Leu

Pro

Leu

Gly

Asn 190

Ala

Thr

Oln

Val

Gin 195

CAT

CTT

TCT

CAC

CTG

CTG

AAT

ATC

AGC

GAT

CTG

GTG

AOT

CTO 672

CAT

His Leu Ser Asp Leu Leu Asn Het Ser Asp Vsi Val Ser Leu His 200 205210

OTA CCA GAG AAT OCG TCC ACC AAA AAT ATG ATG GGC GCG AAA GAA

720 Val Pro Glu Asn Pro Ser Thr Lys Asn Met Met Gly Ala LysGlu

215 220225

ATT TCA CTA ATG AAG CCC GGC TCG CTO CTO ATT AAT GCT TCGCGC íle Ser Leu Met Lys Pro Gly Ser Leu Leu íle Asn Ala SerArg

230 235240

GGT ACT GTC GTG GAT ATT CCG GCG CTO TOT OAT OCO CTO OCOAOC

16$

Gly Thr Val Val Asp íle Pro Ala Leu Cys Asp Ala Leu Ala Ser 245 250255

AAA CAT CTG GCG GOG GCG GCA ATC GAC GTÁ TTC CCG ACC CAA CCG

816

Lys His Leu Ala Gly Ala Ala íle Asp Val Phe Pro Thr Glu Pro 260 265270

GCG ACC AAT AGC GAT CCA TTT ACC TCT CCG CTG TOT GAA TTC GAC 864

Ala Thr Asn Ser Asp Pro Phe Thr Ser Pro Leu Cys Glu Phe Asp

275 2802&S

AAC GTC CTT CTO ACO CCA CAC ATT GGC GGT TCO ACT CAG GAA OCG 912

Asn Val Leu Leu Thr Pro His íle Oly Gly Ser Thr Oln Glu Ala 290 295300

CAG GAG AAT ATC GGC CTG GAA CTT GCG OCT AAA TTO ATC ΛΑΟ TAT 960

Gin Glu Asn íle Oly Leu Olu Val Ala Oly Lys Leu íle Lys Tyr 305 310315

TCT CAC AAT GGC TCA ACG CTC TCT GCG GTC AAC TTC CCG GAA CTC 100B

Ser Asp Asn Gly Ser Thr Leu Ser Ala Val Asn Phe Pro Glu Val

320 325330

TCO CTO CCA CTO CAC GCT GGG CGT CGT CTC ATG CAC ATC CAC OAA 1056

Ser Leu Pro Leu His Cly Gly Arg Arg Leu Met His íle His Glu 335 340345

AAC CGT CCG OGC OTO CTA ACT GCC CTG AAC AAA ATC TTC GCC GAG 1104

Asn Arg Pro Gly Val Leu thr Ala Leu Asn Lys íle Phe Ala Glu

350 355360

CAG GGC GTC AAC ATC GCC GCG CAA TAT CTG CAA ACT TCC GCC CAG 1152

Gin Gly Val Asn íle Ala Ala Oln Tyr Leu Gin Thr Ser Ala Oln 365 370375

ATG GGT TAT CTO GIT ATT OAT ATT GAA GCC GAC GAA GAC GTT GCC 1200

Met Gly Tyr Val Val íle Asp íle Glu Ala Asp Glu Asp Val Ala

380 385390

GAA AAA GCO CTG CAG GCA ATG AAA GCT ATT CCG GGT ACC ATT CGC 1233

Glu Lys Ala Leu Oln Ala Met Lys Ala íle Pro Gly Thr íle Arg 395 400405

GCC CGT CTG CTG TAC TA

Ala Arg Leu Leu Tyr

410 (2) Informácie k SEQ ID NO : 14:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 410 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO : 14:

Met Αία Lys Val Ser Leu Glu Lys Asp Lys íle Lys Phe Leu Leu 15 1015

Val Glu Gly Val His Gin Lys Ala Leu Glu Ser Leu Arg Ala Ala 20 2530

Gly Tyr Thr Asn íle Olu Phe His Lys Gly Ala Leu Asp Asp Glu 35 4045

Gin Leu Lys Glu Ser íle Arg Asp Ala His Phe Íle Gly Leu Arg

5560

Ser Arg Thr His Leu Thr Clu Asp Val íle Asn Ala Ala Glu Lys

7075

Leu Val Ala íle Gly Cys Phe Cys íle Gly Thr Asn Gin Val Asp 80 8590

Leu Asp Ala Ala Ala Lys Arg Gly íle Pro Val Phe Asn Ala Pro

100105

Phe Ser Asn Thr Arg Ser Val Ala Glu Leu Val íle Gly Glu Leu

110 115120

Leu Leu Leu Leu Arg Gly Val Pro Glu Ala Asn Ala Lys Ala His

125 130135

Arg Gly Val Trp Asn Lys Leu. Ala Ala 01y Ser Phe Glu Ala Arg

140 145150

2. Kmene podľa nároku 1, vyznačujúce sa t ý m , že serA-alela je integrovaná do chromozómu.

3. Spôsob výroby mikroorganizmov podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa do mikrobiálneho kmeňa zvoleného zo skupiny Escherichia coli a Corynebacterium, s deregulovanou látkovou premenou tryptofánu vnesie proti spätnému pôsobeniu rezistentná serA-alela, pričom deregulácia látkovej premeny tryptofánu je založená na trpE-alele, ktorá je kódovaná pre proteín s hodnotou K; pre tryptoian v rozmedzí 0,1 mM až 20mM.

4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa t ý m , že sa serA-alela vnesie do chromozómu mikroorganizmu s deregulovanou látkovou premenou tryptofánu.

5. Použitie kmeňov podľa nároku 1 alebo 2, na fermantačnú produkciu tryptofánu.

Gly

Ly«

Lys

Leu

Gly

íle

íle

Gly

Tyr

Gly

His

íle

Gly

Thr

Gin

155

160

165

Leu

Gly

íle

Leu

Ala

Glu

Ser

Leu

Gly

Met

Tyr

Val

Tyr

Phe

Tyr

170

175

180

Asp

íle

Glu

Asn

Lys

Leu

Pro

Leu

Gly

Asn

Ala

Thr

Gin

Val

Gin

185

X90

195

His

Leu

Ser

Asp

Leu

Leu

Asn

Met

Ser

Asp

Val

Val

Ser

Leu

His

200

205

210

Val

Pro

Glu

Asn

Pro

Ser

Thr

Lys

Asn

Met

Met

Gly

Ala

Lys

Glu

215

220

225

íle

Ser

Leu

Met

Lys

Pro

Gly

Ser

Leu

Leu

íle

Asn.

Ala

Ser

arg

230

235

240

Gly

Thr

Val

Val

Asp

íle

Pro

Ala

Leu

Cys

Asp

Ala

Leu

Ala

Ser

245

250

255

Lys

His

Leu

Ala

Gly

Ala

Ala

íle

Asp

Val

Phe

Pro

Thr

□lu

Pro

260

265

270

Ala

Thr

Asn

Ser

Asp

Pro

Phe

Thr

Ser

Pro

Leu

Cys

Glu

Phe

Asp

275

280

285

Asn

Val

Leu

Leu

Thr

Pro

His

íle

Gly

Gly

Ser

Thr

Gin

Clu

Ala

290

295

300

Gin

Glu

Asn

íle

Gly

Leu

Glu

Val

Ala

01y

Lys

Leu

Íle

Lys

Tyr

305

310

315

Sar

Asp

Asn

Gly

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Val

Asn

Phe

Pre

Glu

Val

320

325

330

Sex

Leu

FXO

Leu

His

Gly

Gly

Arg

Arg

Leu

Met

His

íle

His

Glu

335

340

345

Asn

Arg

Pre

Gly

Val

Leu

Thr

Ala

Leu

Asn

Lys

íle

Phe

Ala

Glu

350

355

360

Gin

t Gly

Val

Asn

, Íle 365

Ala

Ala

01 n

Tyr

Leu 370

Gin

Thr

Ser

Ala

Gin 375

Het Gly

Tyr

Val Val 380

Jlc

: ASp

Íle

. Glu Ala 385

. Asp

t Clu

. Asp

. Val

. Ala 390

Glu Lys

t Ala Leu Clr 39Ž

t Ala Hel

: Lys Ala Íle 40C

: Pro Gly 1

r Thr

• íle Arg 405

výkresov

Ala Arg Leu Leu Tyr

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kmene mikroorganizmov zvolené zo skupiny Escherichia coli a Corynebacterium, vyznačujúce sa t ý m , že majú deregulovanú látkovú premenu tryptofánu a proti spätnému pôsobeniu rezistentnú serA-alelovú deregulovanú látkovú premenu serinu, pričom serA-alela má hodnotu K; pre serín v rozmedzí 0,1 mM až 50 mM.