JP2002516116A

JP2002516116A - 遺伝子のコピー数を変化させることによりポリペプチドを生産するための方法

Info

Publication number: JP2002516116A
Application number: JP2000551031A
Authority: JP
Inventors: エス．ヤバー，デビー
Original assignee: ノボザイムスバイオテック，インコーポレイティド
Priority date: 1998-05-27
Filing date: 1999-05-27
Publication date: 2002-06-04
Also published as: EP1080210A2; CN1307642A; WO1999061651A2; AU4213999A; WO1999061651A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、ポリペプチドを生産するための方法であって、（ａ）変異体細胞を前記ポリペプチドの生産のために資する条件下で培養し、ここで（ｉ）前記変異体細胞は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列の少くとも２の縦列コピー又は前記ポリペプチドをコードする核酸配列であって該核酸配列の５’及び３’端に反復配列を含むものを含む親細胞に、前記核酸配列内又はそれ以外の座で前記親細胞のゲノムに核酸構成物を導入することにより関係し、ここで前記核酸構成物の前記座への導入が前記核酸配列のコピー数を変化させ、そしてそのコピー数の変化が選択圧の結果でなく；及び（ii）前記変異体細胞は両方の細胞を同じ条件下で培養した時に親細胞より多い又は少いポリペプチドを生産し；そしてその培養培地からポリペプチドを回収することを含む方法に関する。本発明は、変異体細胞を得るための方法及び変異体細胞にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、遺伝子のコピー数を変化させることによりポリペプチドを生産する
ための方法に関する。本発明は、変異体細胞及びその変異体細胞を得るための方
法にも関する。

【０００２】関連技術の記載新しい遺伝子操作技術の継続的な発達は、タンパク質をコードする遺伝子の発
現の操作を可能にしている。しかしながら、遺伝子のコーディング領域又は転写
調節領域の操作は、頻繁に、その遺伝子の単離、その遺伝子の発現を増加又は減
少させるための遺伝子内に含まれる核酸の操作、及び好適な発現宿主へのその操
作された遺伝子の導入に関連している。

【０００３】ポリペプチドの生産を増加させるための広く用いられる方法は、増幅と呼ばれ
る方法を介してそのポリペプチドをコードする遺伝子の複数のコピーを有する株
を得ることである。米国特許第５，５７８，４６１号は、遺伝子と縦列した増幅可能な選択マーカ
ー遺伝子の相同的組換えを介する包含を開示する。ここでは、遺伝子の多重コピ
ーと縦列して選択マーカーの増幅されたコピーを含む細胞は、好適な選択剤の増
加量の存在下で細胞を培養することにより選択することができる。

【０００４】特定のポリペプチドの生産の減少は、そのポリペプチドをコードする遺伝子の
組換えにより破壊し、不活性化し、又は損失を強いることにより行うことができ
る。本発明の目的は、ポリペプチドを生産するための新規方法を供することである
。

【０００５】発明の要約本発明は、ポリペプチドを生産するための方法であって、（ａ）変異体細胞をポリペプチドの生産のために資する条件下で培養し、ここ
で、（ｉ）前記変異体細胞は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列の少くとも
２の縦列コピーを含む親細胞に、前記親細胞のゲノムへの、前記核酸配列のコピ
ー内以外の座での核酸構成物の導入により前記変異体細胞を作り出すことで親細
胞に関係し、ここで前記核酸構成物の前記座への導入が前記核酸配列のコピー数
を変化させ、該コピー数の変化が選択圧の結果でなく；及び（ii）前記変異体細胞が、両方の細胞を前記ポリペプチドの生産のために資す
る同じ条件下で培養した時に前記親細胞より多い又は少い前記ポリペプチドを生
産し；そして（ｂ）その培養培地から前記ポリペプチドを回収することを含む方法に関する。

【０００６】本発明は、ポリペプチドを生産するための方法であって、（ａ）変異体細胞を前記ポリペプチドの生産のために資する条件下で培養し、
ここで、（ｉ）前記変異体細胞は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列の少くとも
２の縦列コピーを含む親細胞に、前記親細胞のゲノムへの、前記核酸配列のコピ
ーのうちの１つ内の座での核酸構成物の導入により前記変異体細胞を作り出すこ
とで親細胞に関係し、ここで前記核酸構成物の前記座への導入が前記核酸配列の
コピー数を変化させ、該コピー数の変化が選択圧の結果でなく；及び（ii）前記変異体細胞が、両方の細胞を前記ポリペプチドの生産のために資す
る同じ条件下で培養した時に前記親細胞より多い又は少い前記ポリペプチドを生
産し；そして（ｂ）その培養培地から前記ポリペプチドを回収することを含む方法にも関する。

【０００７】本発明は、ポリペプチドを生産するための方法であって、（ａ）変異体細胞を前記ポリペプチドの生産のために資する条件下で培養し、
ここで、（ｉ）前記変異体細胞は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列であって該
核酸配列の５’及び３’端に反復配列を含むものを含む親細胞に、前記親細胞の
ゲノムへの、前記核酸配列内以外の座での核酸構成物の導入により前記変異体細
胞を作り出すことで親細胞に関係し、ここで前記核酸構成物の前記座への導入が
前記核酸配列のコピー数を増加させ、該コピー数の変化が選択圧の結果でなく；
及び（ii）前記変異体細胞が、両方の細胞を前記ポリペプチドの生産のために資す
る同じ条件下で培養した時に前記親細胞より多い前記ポリペプチドを生産し；そ
して（ｂ）その培養培地から前記ポリペプチドを回収することを含む方法にも関する。

【０００８】本発明は、変異体細胞及びその変異体細胞を得るための方法にも関する。発明の詳細な説明第１の実施形態において、本発明は、ポリペプチドを生産するための方法であ
って、（ａ）変異体細胞を前記ポリペプチドの生産のために資する条件下で培養し、
ここで、（ｉ）前記変異体細胞は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列の少くとも
２の縦列コピーを含む親細胞に、前記親細胞のゲノムへの、前記核酸配列のコピ
ー内以外の座での核酸構成物の導入により前記変異体細胞を作り出すことで親細
胞に関係し、ここで前記核酸構成物の前記座への導入が前記核酸配列のコピー数
を増加させ、該コピー数の増加が選択圧の結果でなく；及び（ii）前記変異体細胞が、両方の細胞を前記ポリペプチドの生産のために資す
る同じ条件下で培養した時に前記親細胞より多い前記ポリペプチドを生産し；そ
して（ｂ）その培養培地から前記ポリペプチドを回収することを含む方法に関する。

【０００９】用語“ゲノム”は、染色体、人工染色体ＤＮＡ、及び染色体外ＤＮＡ、即ち自
己複製遺伝子要素を含む細胞のＤＮＡの完全なセットとして本明細書で定義され
る。用語“コピー数”は、細胞内に含まれる遺伝子のゲノム当りの分子の数として
本明細書で定義される。

【００１０】用語“選択圧”は、関心のポリペプチドをコードする核酸配列と縦列して連結
した増幅可能な選択マーカー遺伝子を含む発現カセットを含む細胞を、縦列した
選択マーカー遺伝子及び核酸配列のコピー数を増幅させる好適な選択剤の増加量
の存在下で培養することとして定義される。 “多くのポリペプチドを生産する”変異体細胞は、その親細胞に対してより多
くのポリペプチドがそれから回収される細胞として定義される。

【００１１】第２の実施形態において、本発明は、ポリペプチドを生産するための方法であ
って、（ａ）変異体細胞を前記ポリペプチドの生産のために資する条件下で培養し、
ここで、（ｉ）前記変異体細胞は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列の少くとも
２の縦列コピーを含む親細胞に、前記親細胞のゲノムへの、前記核酸配列のコピ
ー内以外の座での核酸構成物の導入により前記変異体細胞を作り出すことで親細
胞に関係し、ここで前記核酸構成物の前記座への導入が前記核酸配列のコピー数
を減少させ、該コピー数の減少が選択圧の結果でなく；及び（ii）前記変異体細胞が、両方の細胞を前記ポリペプチドの生産のために資す
る同じ条件下で培養した時に前記親細胞より少い前記ポリペプチドを生産し；そ
して（ｂ）その培養培地から前記ポリペプチドを回収することを含む方法に関する。

【００１２】 “少いポリペプチドを生産する”変異体細胞は、その親細胞に対してより少な
いポリペプチドがそれから回収される細胞として本明細書で定義される。第３の実施形態において、本発明は、ポリペプチドを生産するための方法であ
って、（ａ）変異体細胞を前記ポリペプチドの生産のために資する条件下で培養し、
ここで、（ｉ）前記変異体細胞は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列の少くとも
２の縦列コピーを含む親細胞に、前記親細胞のゲノムへの、前記核酸配列のコピ
ーのうちの１つ内の座での核酸構成物の導入により前記変異体細胞を作り出すこ
とで親細胞に関係し、ここで前記核酸構成物の前記座への導入が前記核酸配列の
コピー数を増加させ、該コピー数の増加が選択圧の結果でなく；及び（ii）前記変異体細胞が、両方の細胞を前記ポリペプチドの生産のために資す
る同じ条件下で培養した時に前記親細胞より多い前記ポリペプチドを生産し；そ
して（ｂ）その培養培地から前記ポリペプチドを回収することを含む方法に関する。

【００１３】第４の実施形態において、本発明は、ポリペプチドを生産するための方法であ
って、（ａ）変異体細胞を前記ポリペプチドの生産のために資する条件下で培養し、
ここで、（ｉ）前記変異体細胞は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列の少くとも
２の縦列コピーを含む親細胞に、前記親細胞のゲノムへの、前記核酸配列のコピ
ーのうちの１つ内の座での核酸構成物の導入により前記変異体細胞を作り出すこ
とで親細胞に関係し、ここで前記核酸構成物の前記座への導入が前記核酸配列の
コピー数を減少させ、該コピー数の変化が選択圧の結果でなく；及び（ii）前記変異体細胞が、両方の細胞を前記ポリペプチドの生産のために資す
る同じ条件下で培養した時に前記親細胞より少い前記ポリペプチドを生産し；そ
して（ｂ）その培養培地から前記ポリペプチドを回収することを含む方法に関する。

【００１４】第５の実施形態において、本発明は、ポリペプチドを生産するための方法であ
って、（ａ）変異体細胞を前記ポリペプチドの生産のために資する条件下で培養し、
ここで、（ｉ）前記変異体細胞は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列であって該
核酸配列の５’及び３’端に反復配列を含むものを含む親細胞に、前記親細胞の
ゲノムへの、前記核酸配列内以外の座での核酸構成物の導入により親細胞に関係
し、ここで前記核酸構成物の前記座への導入が前記核酸配列のコピー数を増加さ
せ、該コピー数の変化が選択圧の結果でなく；及び（ii）前記変異体細胞が、両方の細胞を前記ポリペプチドの生産のために資す
る同じ条件下で培養した時に前記親細胞より多い前記ポリペプチドを生産し；そ
して（ｂ）その培養培地から前記ポリペプチドを回収することを含む方法に関する。

【００１５】用語“核酸配列の少くとも２の縦列コピー”は、関心のポリペプチドをコード
する核酸配列の２又はそれ超のコピーとして本明細書で定義され、ここでその核
酸配列のコピーは介在配列あり又はなしで細胞のゲノム内で逐次的に配置されて
いる。介在配列が存在する場合、その介在配列は１０，０００bp未満、好ましく
は５，０００bp未満、より好ましくは２，０００bp未満、更により好ましくは１
，０００bp未満、そして最も好ましくは１００bp未満の長さであるべきである。
しかしながら、介在配列は、その長さがコピー数の増加又は減少を防がない限り
いずれの長さのものであってもよい。好ましい実施形態において、核酸配列の縦
列コピー間に介在配列は存在しない。

【００１６】用語“核酸配列の５’及び３’端の反復配列”は、関心のポリペプチドをコー
ドする核酸配列の５’端及び３’端の両方に存在するヌクレオチド配列として本
明細書で定義される。反復配列は、互いに対して同じ（同方向反復）又は反対（
逆方向反復）の方向であり得る。反復配列は、いずれの好適な長さのものであっ
てもよいが、好ましくは、約１００〜約１０００bp、より好ましくは約１００〜
約５００bp、そして最も好ましくは約１００〜約３００bpである。

【００１７】ポリペプチド用語“ポリペプチド”は、ペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質を包含
し、それゆえ特定の長さのコードされる産物に限定されない。ポリペプチドは細
胞に対してネイティブであっても異種ポリペプチドであってもよい。好ましくは
、それは異種ポリペプチドである。用語“異種ポリペプチド”は、細胞に対して
ネイティブでないポリペプチドとして定義される。ポリペプチドは、野生型ポリ
ペプチド又はその変異体であってもよい。ポリペプチドは、そのポリペプチドの
生産に関連する、核酸配列に対して外来性である１又は複数の調節配列を含む核
酸配列によりコードされる、細胞に対してネイティブであるポリペプチドである
組換えポリペプチドであってもよい。ポリペプチドをコードする核酸配列は、以
下に記載されるいくつかの様式で操作することができる。本発明は、用語“異種
ポリペプチド”の範囲内に、糸状菌細胞に対してネイティブの内在性ポリペプチ
ドの組換え生産も、このような発現がその細胞に対してネイティブでない遺伝子
要素の使用、又は宿主細胞内で通常おこらない様式で機能するよう操作されてい
るネイティブ要素の使用に関する程度まで包含する。そのポリペプチドは、１又
は複数のポリペプチドはその細胞に対して異種であり得る少くとも２の異なるポ
リペプチドから得られる部分的又は完全なポリペプチドの組合せを含むハイブリ
ッドポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、上述のポリペプチドの天然
の対立遺伝子及び工作された変異体を更に含む。

【００１８】好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、抗体もしくはその部分、抗
原、凝因因子、酵素、ホルモンもしくはその変異体、レセプターもしくはその部
分、調節タンパク質、構造タンパク質、リポーター又は輸送タンパク質である。より好ましい実施形態において、前記酵素は、オキシドレダクターゼ、トラン
スフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、又はリガーゼである。

【００１９】更により好ましい実施形態において、前記酵素は、アミノペプチダーゼ、アミ
ラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ
、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デキストラナーゼ、エ
ステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ
、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベル
ターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、
ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダー
ゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキ
シラナーゼである。

【００２０】別の更により好ましい実施形態において、ポリペプチドはヒトインスリンもし
くはそのアナログ、ヒト成長ホルモン、ヒト第VII 因子、エリトロポエチン、又
はインスリノトロピンである。異種及び組換えポリペプチドをコードする核酸配列異種ポリペプチドをコードする核酸配列は、いずれかの原核生物、真核生物、
又は他のソース、例えば古細菌から得ることができる。本発明の目的のため、所
定のソースと合わせて本明細書に用いられる“から得られる（た）”との用語は
、そのポリペプチドがソースにより又はそのソースからの遺伝子が挿入されてい
る細胞により生産されることを意味する。

【００２１】本発明の方法において、細胞は、その細胞に対してネイティブであるポリペプ
チドの組換え生産のためにも用いることができる。ネイティブポリペプチドは、
例えばそのポリペプチドをコードする遺伝子を異なるプロモーターの制御下に配
置することによりポリペプチドの発現を増強するため、シグナル配列の使用によ
り細胞の外側への関心のネイティブポリペプチドの輸送を促進するために、及び
細胞により通常生産されるポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増加さ
せるために組換え生産することができる。本発明は、このようなネイティブポリ
ペプチドの組換え生産も包含する。

【００２２】ポリペプチドをコードする核酸配列を単離し又はクローン化するために用いる
技術は当該技術分野で周知であり、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調
製、又はそれらの組合せを含む。このようなゲノムＤＮＡからの核酸配列のクロ
ーニングは、例えば、共有する構造的特徴を有するクローン化ＤＮＡフラグメン
トを検出するために公知のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）又は発現ライブラリー
の抗体スクリーニングを用いることによって行うことができる。例えば、Innis
ら、1990, PCR : A Guide to Methods and Application, Academic Press, New
Yorkを参照のこと。他の核酸増幅法、例えばリガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、連結化
活性化転写（ＬＡＴ）及び核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）を用いることが
できる。クローニング手順は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む要求さ
れる核酸フラグメントの切出し及び単離、そのフラグメントのベクター分子への
挿入、及びその組換えベクターの細胞への組込みに関連し得る。核酸配列は、ゲ
ノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成源、又はそれらのいずれかの組合せのも
のであり得る。

【００２３】本明細書に用いる用語“単離された核酸配列”は、他の核酸配列を本質的に含
まない、例えばアガロース電気泳動により測定して少くとも約２０％純度、好ま
しくは少くとも約４０％純度、より好ましくは少くとも約６０％純度、更により
好ましくは少くとも約８０％純度、そして最も好ましくは少くとも約９０％純度
の核酸をいう。

【００２４】異種ポリペプチドをコードする単離された核酸配列は、ポリペプチドの発現を
供するために種々の方法で操作することができる。そのベクターへの挿入前の核
酸配列の操作は、発現ベクターに依存して要求され又は必要であり得る。クロー
ニング法を利用して核酸配列を改変するための技術は当該技術分野で公知である
。

【００２５】ポリペプチドをコードする核酸配列の改変は、そのポリペプチドと実質的に類
似したポリペプチドの合成のために必要であり得る。ポリペプチドに“実質的に
類似”との用語は、そのポリペプチドの非天然形態をいう。これらのポリペプチ
ドは、そのネイティブソースから単離されたポリペプチドからいくつかの操作法
において異なり得る。例えば、それは、ポリペプチドの変異体を合成することに
関心があり得、その変異体は、例えば部位特異的変異誘発を用いて比活性、熱安
定性、pH至適性等において異なる。そのアナログ配列は、そのポリペプチドをコ
ードする核酸配列に基づいて、及び／又はその核酸配列によりコードされるポリ
ペプチドの別のアミノ酸配列を生じないが、その酵素の生産を意図した宿主生物
のコドン用法に対応するヌクレオチド置換の導入により、又は異なるアミノ酸配
列を生じ得るヌクレオチド置換の導入により作製することができる。ヌクレオチ
ド置換の一般的な記載については、例えばFordら、1991, Protein Expression a
nd Purification 2 : 95-107を参照のこと。

【００２６】核酸配列を改変して、その核酸配列が調節配列に適合した条件下で好適な宿主
細胞中でのコーディング配列の発現を指示する１又は複数の調節配列に作用可能
に連結している発現カセットを生産することができる。発現は、これらに限らな
いが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含むポリペプチドの生
産に関連するいずれのステップも含むと理解されよう。

【００２７】 “発現カセット”は、天然の遺伝子から単離されるか、又はさもなければ天然
には存在しないであろうコーディング配列の発現のために要求される全ての調節
配列を含む様式で組み合わされ、並列した核酸のセグメントを含むよう改変され
ている一本鎖又は二本鎖の核酸分子として本明細書で定義される。本明細書で定
義される用語“コーディング配列”は、ｍＲＮＡに転写され、ポリペプチドに翻
訳される配列である。ゲルコーディング配列の境界は、一般に、リボソーム結合
部位（原核生物）により、又はｍＲＮＡの５’端でオープンリーディングフレー
ムのすぐ上流に位置したＡＴＧ開示コドン（真核生物）及びｍＲＮＡの３’でオ
ープンリーディングフレームのすぐ下流に位置した転写ターミネーター配列によ
り決定される。コーディング配列は、これらに限らないが、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、
及び組換え核酸配列を含み得る。

【００２８】用語“調節配列”は、ポリペプチドの発現のために必要又は有利である全ての
成分を含むとして本明細書で定義される。各々の調節配列は、そのポリペプチド
をコードする核酸配列に対してネイティブであっても外来的であってもよい。こ
のような調節配列には、これらに限らないが、リーダー、ポリアデニル化配列、
プロペプチド配列、プロモーター、シグナル配列及び転写ターミネーターがある
。最小で、調節配列は、プロモーター、並びに転写及び翻訳終止シグナルを含む
。調節配列には、ポリペプチドをコードする核酸配列のコーディング領域との調
節配列の連結を容易にする特定の制限部位を導入する目的のためのリンカーを供
することができる。用語“作用可能に結合（連結）”とは、調節配列がポリペプ
チドの生産を指示するように、そのＤＮＡ配列のコーディング配列に対する位置
に適切におかれる配置として本明細書で定義される。

【００２９】調節配列は、発現カセットの発現のために宿主細胞により認識される核酸配列
である好適なプロモーター配列であってもよい。プロモーター配列は、ポリペプ
チドの発現を媒介する転写調節配列を含む。プロモーターは、変異体、トランケ
ート化、及びハイブリッドプロモーターを含む選択された宿主細胞内で転写活性
を示すいずれの核酸配列であってもよく、宿主細胞に対して同種又は異種である
細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。

【００３０】細菌宿主細胞内で発現カセットの転写を指示するための好適なプロモーターの
例は、大腸菌ｌａｃオペロン、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガロース遺伝子（ｄａｇＡ）、バチ
ルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺
伝子（ｓａｃＢ）、バチルス・リケニホルシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅ
ｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・ステアロサ
ーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マ
ルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、バチルス・アミロリクエファシ
エンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラ
ーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルス・リケニホルミスペニシリナーゼ遺伝子（ｐ
ｅｎＰ）、バチルス・サブチリスｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子、及び原核生物β
−ラクタマーゼ遺伝子（Villa-Kamaroffら、1978, Proceedings of the Nationa
l Academy of Sciences USA 75 : 3727-3731）から得られるプロモーター、並び
にｔａｃプロモーター（DeBoerら、1983, Proceedings of the National Academ
y of Sciences USA 80 : 21-25）である。更なるプロモーターは、“Vseful pro
teins from recombinant bacteria”in Scientific American, 1980, 242 : 72-
94；及びSapbrookら、1989、前掲に記載される。

【００３１】糸状菌宿主細胞において発現カセットの転写を指示するための好適なプロモー
ターの例は、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａ
ｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉ
ｅｈｅｉ）アスパラチックプロテイナーゼ、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニゲル酸
安定α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニゲル又はアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、リ
ゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ゛、アス
ペルギルス・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペルギルスオリザエトリオー
スホスフェートイソメラーゼ、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓｎｉｇｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、フサリウム・オシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（米国特許
４，２８８，６２７号）をコードする遺伝子から得られるプロモーター及びそれ
らの変異体、トランケート化及びバイブリッドプロモーター、並びにＮＡ２−ｔ
ｐｉプロモーター（アスペルギルス・ニゲル中性α−アミラーゼ及びアスペルギ
ルス・オリザエトリオースホスフェートイソメラーゼをコードする遺伝子からの
プロモーターのハイブリッド）である。

【００３２】イースト宿主において、有用なプロモーターは、サッカロマイセス・セレビシ
アエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮ
Ｏ−１）遺伝子、サッカロマイセス・セレビシアエガラクトキナーゼ遺伝子（Ｇ
ＡＬ１）、サッカロマイセス・セレビシアエアルコールデヒドロゲナーゼ／グリ
セルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨＩ／ＧＡＰ
）、及びサッカロマイセス・セレビシアエ３−ホスホグリセレートキナーゼ遺伝
子から得られる、イースト宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Romano
s ら、1992, Yeast 8 : 423-488 により記載される。哺乳動物細胞において、有
用なプロモーターには、ウイルスプロモーター、例えばＳｉｍｉａｎＶｉｒｕ
ｓ４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス、ウシ
パピローマウイルス（ＢＰＶ）、及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）から
のものがある。

【００３３】調節配列は、転写を終了させるために宿主細胞により認識される配列である好
適な転写ターミネーター配列であってもよい。ターミネーター配列は、そのポリ
ペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作用可能に連結される。選択した宿
主細胞内で機能的であるいずれのターミネーターも本発明に用いることができる
。

【００３４】糸状菌宿主細胞のための好ましいターミネーターは、アスペルギルス・オリザ
エＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニゲルグルコアミラーゼ、アスペルギ
ルス・ニジュランスアントラニレートシンターゼ、アスペルギルス・ニゲルα−
グルコシダーゼ、及びフサリウム・オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼを
コードする遺伝子から得られる。

【００３５】イースト宿主細胞のための好ましいターミネーターは、サッカロマイセス・セ
レビシアエエノラーゼ、サッカロマイセス・セレビシアエシトクロムＣ（ＣＹＣ
１）、又はサッカロマイセス・セレビシアエグリセルアルデヒド−３−ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子から得られる。イースト宿主のための
他の有用なターミネーターは、Romanos ら、1992、前掲により記載される。ター
ミネーター配列は哺乳動物宿主細胞について当該技術分野で公知である。

【００３６】調節配列は、宿主細胞による転写のために重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域で
ある好適なリーダー配列でもあり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコード
する核酸配列の５’末端に作用可能に結合される。選択した宿主細胞において機
能的であるいずれのリーダー配列も本発明に用いることができる。糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリザエＴＡ
ＫＡアミラーゼ及びアスペルギルス・ニジュランストリオースリン酸イソメラー
ゼをコードする遺伝子が得られる。

【００３７】イースト宿主細胞のための好適なリーダーは、サッカロマイセス・セレビシア
エエノラーゼ（ＥＮＯ−１）遺伝子、サッカロマイセス・セレビシアエ３−ホス
ホグリセレートキナーゼ遺伝子、サッカロマイセス・セレビシアエα−因子、及
びサッカロマイセス・セレビシアエアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアル
デヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨＩ／ＧＡＰ）から得
られる。

【００３８】調節配列は、核酸配列の３’末端に作用可能に結合し、転写された時に転写さ
れたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を加えるためのシグナルとして糸状菌細胞に
より認識される配列であるポリアデニル化配列でもあり得る。選択した宿主細胞
内で機能的であるいずれのポリアデニル化配列も用いることができる。糸状菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・オ
リザエＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニゲルグルコアミラーゼ、アスペ
ルギルス・ニジュランスアントラニレートシンターゼ、及びアスペルギルス・ニ
ゲルα−グルコシダーゼから得られる。

【００３９】イースト宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、Guo 及びSherman, 1
995, Molecular Cellular Biology 15 : 5983-5990により記載される。ポリアデ
ニル化配列は哺乳動物宿主細胞のために当該技術分野で公知である。調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結したアミノ酸配列をコードし、
細胞の分泌経路にそのコードされたポリペプチドを方向づけるシグナルペプチド
コーディング領域であってもよい。核酸配列のコーディング配列の５’端は、固
有的に、分泌されるポリペプチドをコードするコーディング領域のセグメントに
翻訳読み枠内で天然で連結しているシグナルペプチドコーディング領域を含み得
る。あるいは、コーディング配列の５’端は、そのコーディング配列に対して外
来性であるシグナルペプチドコーディング領域を含み得る。外来シグナルペプチ
ドコーディング領域は、そのコーディング配列がシグナルペプチドコーディング
領域を通常、含まない場合に要求され得る。あるいは、外来シグナルペプチドコ
ーディング領域は、ポリペプチドの分泌を増強するために天然のシグナルペプチ
ドコーディング領域に単におきかわることができる。シグナルペプチドコーディ
ング領域は、アスペルギルス種からのグルコアミラーゼ又はアミラーゼ遺伝子、
リゾムコル（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）種からのリパーゼ又はプロテイナーゼ遺伝
子、サッカロマイセス・セレビシアエからのα−因子のための遺伝子、バチルス
種からのアミラーゼ又はプロテアーゼ遺伝子、又はウシプレプロキモシン遺伝子
から得ることができる。しかしながら、発現された異種ポリペプチドを選択した
宿主細胞の分泌経路に向かわせるいすれのシグナルペプチドコーディング領域も
本発明に用いることができる。

【００４０】細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコーディング領域は、バチルス
ＮＣＩＢ１１８３７からのマルトジェニックアミラーゼ遺伝子、バチルス・ステ
アロサーモフィルスα−アミラーゼ遺伝子、バチルス・リケニオールシスサブチ
リシン遺伝子、バチルス・リケニホルシスβ−ラクタマーゼ遺伝子、バチルス・
ステアロサーモフィルス中性プロテアーゼ遺伝子（ｎｐｒＴ，ｎｐｒＳ，ｎｐｒ
Ｍ）、又はバチルス・サブチリスＰｒｓＡ遺伝子から得られるシグナルペプチド
コーディング領域である。更なるシグナルペプチドはSimonen 及びPalua, 1993,
Microbiologyical Reviews 57 : 109-137により記載される。

【００４１】糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコーディング領域は、アスペ
ルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ遺伝子、アスペルギルス・ニゲル中世ア
ミラーゼ遺伝子、リゾムコル・ミエヘイアスパラチックプロテイナーゼ遺伝子、
ヒュミコラ・ラヌギノサセルラーゼ遺伝子、及びヒュミコラ・ラヌギノサリパー
ゼ遺伝子から得られるシグナルペプチドコーディング領域である。

【００４２】イースト宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、サッカロマイセス・セ
レビシアエα−因子及びサッカロマイセス・セレビシアエインベルターゼから得
られる。他の有用なシグナルペプチドコーディング領域はRomanos ら、1992、前
掲に記載される。調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置したアミノ酸配列をコードする
プロペプチドコーディング領域でもあり得る。得られたポリペプチドは、プロ酵
素又はプロポリペプチド（又は特定の場合、チモーゲン）として知られる。プロ
ポリペプチドは一般に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触
媒又は自己触媒開裂により成熟な活性ポリペプチドに変換することができる。プ
ロペプチドコーディング領域は、バチルス・サブチリスアルカリプロテアーゼ遺
伝子（ａｐｒＥ）、バチルス・サブチリス中性プロテアーゼ遺伝子（ｎｐｒＴ）
サッカロマイセス・セレビシアエα−因子遺伝子、リゾムコル・ミエヘイアスパ
ラチックプロテイナーゼ遺伝子、又はマイセリオフトラ・サーモフィララッカー
ゼ遺伝子から得ることができる（ＷＯ９５／３３８３６）。

【００４３】シグナルペプチド及びプロペプチド領域の両方が、ポリペプチドのアミノ酸端
に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の次に位置し
、シグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。ポリペプチドをコードする発現カセットは、ポリペプチドの発現を指示するた
めに有利である１又は複数の因子をコードする１又は複数の他の核酸配列、例え
ば転写アクティベーター（例えばトランス作用因子）、シャペロン、及びプロセ
ッシングプロテアーゼも含み得る。選択した宿主細胞において機能的であるいず
れの因子も本発明に用いることができる。１又は複数のこれらの因子をコードす
る核酸は、ポリペプチドをコードする核酸配列と縦列している必要はない。

【００４４】転写アクティベーターは、ポリペプチドをコードする核酸配列の転写を活性化
するタンパク質である（Kudla ら、1990, EMBO Journal 9 : 1355-1364 ; Jarai
及びBoxion, 1994, Currcnt, Genetics 26 : 2238-244 ; Vardier, 1990, Yeast
6 : 271-297）。アクティベーターをコードする核酸配列は、バチルス・ステア
ロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｃｅｓｓｔｅａｒｏｔｈｃｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ）ＮｐａＡ（ｎｐｒＡ）、サッカロマイセス・セレビシアエヘムアクティベー
タータンパク質１（ｈａｐ１）、サッカロマイセス・セレビシアエガラクトース
代謝タンパク質４（ｇａｌ４）、アスペルギスル・ニジュランスアンモニア調節
タンパク質（ａｒｅ４）、及びアスペルギルス・オリザエα−アミラーゼアクテ
ィベーター（ａｍｙＲ）をコードする遺伝子から得ることができる。更なる例に
ついては、Verdier, 1990、前掲及びMackenzieら、1993, Journal of Gentral M
icrobiology 139 : 2295-2307を参照のこと。

【００４５】シャペロンは別のポリペプチドが正確にホールディングするのを助けるタンパ
ク質である（Hartl ら、1994, TIBS 19 : 20-25 ; Bergeronら、1994, TIBS 19
: 124-128 ; Demolderら、1994, Journal of Biotechnology 32 : 179-189 ; Cr
aig, 1993, Science 260 : 1902-1903 ; Gething及びSambrook, 1992, Nature 3
55 : 33-45 ; Puig及びGilbert, 1994, Journal of Biological Chemistry 269
: 7764-7771 ; Wang及びTsou, 1993, The FASEB Journal 7 : 1515-11157 ; Rob
insonら、1994, Bio/Technology 1 : 381-384 ; Jacodsら、1993, Molecular Mi
crobilogy 8 : 957-966）。シャペロンをコードする核酸配列は、バチルス・サ
ブチリスＧｒｏＥタンパク質、バチルス・サブチリスＰｒｓＡ、アスペルギルス
・オリザエタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、サッカロマイセス・セレビシ
アエカルネキシン、サッカロマイセス・セレビシアエＢｉＰ／ＧＲＰ７８、及び
サッカロマイセス・セレビシアエＨｓｐ７０をコードする遺伝子から得ることが
できる。更なる例については、Gething及びSambrook, 1992、前掲及びHartlら、
1994、前掲を参照のこと。

【００４６】プロセッシングプロテアーゼは成熟した生化学的に活性なポリペプチドを作り
出すためにプロペプチドを開裂するプロテアーゼである（Enderlin及びOgrydzia
k, 1994, Yeast 10 : 67-79 ; Fullerら、1989, Proceedings of the National
Academy of Sciences USA 86 : 1434-1438 ; Juliusら、1984, Cell 37 : 1075-
1089 ; Juliusら、1983, Cell 32 : 839-852 ; 米国特許 5,702,934）。プロセ
ッシングプロテアーゼをコードする核酸配列は、サッカロマイセス・セレビシア
エジペプチジルアミノペプチダーゼ、サッカロマイセス・セレビシアエＫｅｘ２
、ヤロビア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）二塩基性
プロセッシングエンドプロテアーゼ（Ｘｐｒ６）、及びフサリウム・オキシスポ
ルムメタロプロテアーゼ（ｐ４５遺伝子）から得ることができる。

【００４７】宿主細胞の増殖に関連してポリペプチドの発現の制御を許容する制御配列を加
えることも要求され得る。制御システムの例は、制御化合物の存在を含む、化学
的又は物理的刺激に対する応答において遺伝子の発現をターン・オン又はオフに
するものである。原核生物システムにおける制御システムの例には、ｌａｃ，ｔ
ａｃ、及びｔｒｐオペレーターシステムがあるであろう。イーストにおいては、
ＡＤＨ２システム又はＧＡＬ１システムを用いることができる。糸状菌において
、ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモーター、アスペルギルス・ニゲルグルコアミラ
ーゼプロモーター、及びアスペルギルス・オリザエグルコアミラーゼプロモータ
ーを制御配列として用いることができる。制御配列の他の例は、遺伝子増幅を許
容するものである。真核生物システムにおいて、これらには、メトトレキセート
の存在下で増幅されるジヒドロホレートレダクターゼ遺伝子、及び重金属で増幅
されるメタロチオネイン遺伝子がある。これらの場合、ポリペプチドをコードす
る核酸配列は、制御配列に作用可能に連結されよう。

【００４８】上述の種々の核酸及び調節配列を一緒に連結させて、その部位にポリペプチド
をコードする核酸配列の挿入又は置換を許容する１又は複数の便利な制限部位を
含み得る組換え発現ベクターを作り出すことができる。あるいは、その核酸配列
は、上述の核酸配列又は発現カセットを、発現のための好適なベクターに挿入す
ることにより発現させることができる。組換え発現ベクターを形成することにお
いて、コーディング配列は、そのコーディング配列が発現のための好適な調節配
列に作用可能に結合されるようにベクター内に位置する。

【００４９】組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に便利にかけることができ、核酸配列
の発現をもたらし得るいずれのベクターであってもよい。ベクターの選択は、典
型的には、ベクターを導入すべき宿主細胞とのそのベクターの適合性に依存する
であろう。ベクターは、直鎖又は閉環状プラスミドであってよい。ベクターは、
自己複製ベクター、即ちその複製が染色体複製と独立している染色体外存在物と
して存在するベクター、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニクロソーム、又
は人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製を確実にするためのいずれかの
手段を含み得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入した時に、ゲノム内に
組み込まれ、それが組み込まれている染色体と一緒に複製されるものであり得る
。ベクターシステムは、宿主細胞のゲノム内に導入される全ＤＮＡ、又はトラン
スポゾンを一緒に含む単一ベクターもしくはプラスミド又は２もしくはそれ超の
ベクターもしくはプラスミドであり得る。

【００５０】ベクターは、好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を許容する１又は
複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、その産物が殺生物又はウイルス耐
性、重金属に対する耐性、栄養要求体への原栄養性等を供する遺伝子である。細
菌の選択マーカーの例はバチルス・サブチリス又はバチルス・リケニホルミスか
らのｄａｌ遺伝子、又はアンピシリン（ａｍｐ）、カナマイシン（ｋａｎ）、ク
ロランフェニコール（ｃａｍ）、又はテトラサイクリン（ｔｅｔ）耐性のような
抗生物質耐性を与えるマーカーである。哺乳動物細胞のための好適なマーカーは
、ジヒドロレダクターゼ（ｄｆｈｒ）、ヒグロマイシンホスホトランスフェラー
ゼ（ｈｙｇＢ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼII及びフレオマイ
シン耐性遺伝子である。イースト細胞のための好適なマーカーは、ＡＤＥ２，Ｈ
ＩＳ３，ＬＥＵ２，ＬＹＳ２，ＭＥＴ３，ＴＲＰ１、及びＵＲＡ３である。糸状
菌宿主細胞に用いるための好適な選択マーカーは、これらに限らないが、ａｍｄ
Ｓ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラー
ゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ヒ
グロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（ニトレートレダクターゼ
）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼ）、ｓＣ（
スルフェートアデニルトランスフェラーゼ）、及びｔｒｐｃ（アントラニレート
シンターゼ）、並びに他の種からの等価物を含む群から選択することができる。

【００５１】ベクターは、好ましくは、宿主細胞ゲノムへのベクターの安定な組込み又は細
胞のゲノムと独立した細胞内のベクターの自己複製を許容する要素を含む。宿主細胞のゲノムへの組込みのために、ベクターは、ポリペプチドをコードす
る核酸配列又は相同的又は非相同的組換えによるゲノムへのベクターの組込みの
ためのベクターのいずれかの他の要素に依存し得る。あるいは、ベクターは、宿
主細胞のゲノムへの相同的組換えによる組込みを指示するための更なる核酸配列
を含み得る。その更なる核酸配列は、ベクターが、染色体内の正確な位置で宿主
細胞ゲノムに組み込まれることを可能にする。正確な位置での組込みの可能性を
増加させるために、組込み要素は、好ましくは、相同的組換えの可能性を増加さ
せるために対応する標的配列と高い相同性を有する十分な数の核酸、例えば少く
とも１００〜１０，０００塩基対、好ましくは少くとも４００〜１０，０００塩
基対、及び最も好ましくは８００〜１０，５００塩基対を含むべきである。組込
み要素は、宿主細胞のゲノム内の標的配列と相同であるいずれの配列であっても
よい。更に、組込み要素は、非コーディング又はコーディング核酸配列であり得
る。他方、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに組込むことが
できる。

【００５２】自己複製のために、ベクターはそのベクターが問題の宿主細胞内で自律的に複
製するのを可能にする複製の起点を更に含み得る。細菌の複製の起点の例は、大
腸菌内で複製を許容する、プラスミド、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ
１７７、及びｐＡＣＹＣ１８４、並びにバチルス内で複製を許容する。ｐＵＢ１
１０、ＰＥ１９４、ｐＴＡ１０６０及びｐＡＢβ１の複製の起点である。イース
ト宿主細胞に用いるための複製の起点の例は、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１及
びＣＥＮ３の組合せ並びにＡＲＳ４及びＣＥＮ６の組合せである。複製の起点は
、宿主細胞内でその機能を温度感受性にする変異を有するものであり得る。（例
えば、Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA
75 : 1433）。

【００５３】本発明の組換え発現ベクターを作製するために上述の要素を連結するのに用い
る手順は当業者に公知である（例えばSambrookら、1989、前掲を参照のこと）。細胞本発明の方法は、原核生物、例えば細菌、又は真菌生物、例えば哺乳動物、昆
虫、植物及び真菌細胞等を含む関心のポリペプチドをコードする核酸配列を含む
いずれかの細胞で用いることができる。その細胞は、野生型であっても変異体細
胞であってもよい。例えば、変異体細胞は、古典的な変異誘発又は遺伝子操作が
行われている細胞であり得る。更に、細胞は、異種ポリペプチドの組換え生産に
有利に用いられる、本明細書に記載される異種ポリペプチドであるポリペプチド
をコードする核酸配列を含む組換え細胞であり得る。

【００５４】有用な原核生物細胞は、細菌細胞、例えばグラム陽性細菌、例えばこれらに限
らないが、Bacillus細胞、例えばBacillus alkalophilus, Bacillus amylolique
faciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacill
us lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium,
Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, and Bacillus thuringien
sis ; 又は a Streptomyces 細胞、例えば Streptomyces lividans 及びStrepto
myces murinus、又はグラム陰性細菌、例えば大腸菌及びPseudomonas種である。
好ましい実施形態において細菌細胞は、Bacillus lentus, Bacillus lichenifor
mis, Bacillus stearothermophilus、又はBacillus subtilis細胞である。

【００５５】好ましい実施形態において、細胞は真菌細胞である。“真菌”は、本明細書に
おいて、子嚢菌門、担子菌門、ツボカビ門、及び接合菌門（Hawksworthら、In,
Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB In
ternational. University Press, Cambridge, UKに定義）並びに卵菌門（Hawksw
orthら、1995、前掲、page 171）及び全ての不完全菌類（Hawksworthら、1995、
前掲）である。子嚢菌門の代表的なグループは、例えばＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ，
Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ（＝Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ），Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌ
ａ（＝Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ），Ｅｕｒｏｔｉｕｍ（＝Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ）、及び真正イーストを含む。担子菌門の例は、マッシュルーム、鎖菌、及び
クロホ菌を含む。ツボカビ間の代表的なグループは、例えば、Ａｌｌｏｍｙｃｅ
ｓ，Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｅｌｌａ，Ｃｏｅｌｏｍｏｍｙｃｅｓ、及び水生菌
を含む。卵菌門の代表的なグループは、例えばＳａｐｒｏｌｅｇｎｉｏｍｙｃｅ
ｅｏｕｓ水生菌（水カビ）、例えばＡｃｈｌｙａである。不完全菌の例は、Ａｌ
ｔｅｒｎａｎｉａ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｃａｎｄｉｄａ及びＰｅｎｉｃｉ
ｌｌｉｕｍを含む。接合菌門の代表的なグループは、例えばＭｕｃｏｒ及びＲｈ
ｉｚｏｐｕｓを含む。

【００５６】好ましい実施形態において、真菌細胞はイースト細胞である。本明細書に用い
る“イースト”は、有子嚢胞子酵母（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、担子胞子
酵母、及び不完全菌類に属する酵母（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）を含む。有
子嚢胞子酵母はＳｐｅｒｍｏｐｈｔｈｏｒａｃｅａｅ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｔａｃｅａｅ科に分けられる。後者は、４つのサブファミリーＳｃｈｉｚｏ
ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ（例えば属Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ）、Ｎａｄｓｏｎｉｏｉｄｅａｅ，Ｌｉｐｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ、及
びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ（例えば属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅ
ｓ，Ｐｉｃｈｉａ、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から構成される。担子胞
子酵母は、属Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ，Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ，Ｌｅ
ｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｍ，Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、及びＳｐｏｒｄｉｏ
ｂｏｌｕｓを含む。不完全菌類に属するイーストは２つの科、Ｓｐｏｒｏｂｏｌ
ｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ（例えば、Ｂｕｌｌｅｒａ及びＳｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙ
ｃｅｓ）及びＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ（例えば属Ｃａｎｄｉｄａ）に分
けられる。イーストの分類は将来的に変化し得るので、本発明の目的のため、イ
ーストは、Biology and Activities of Yeast (Skinnerら、1980, Soc. App. Ba
cteriol. Symposium Series No. 9, 1980）に記載される通り定義する。イース
トの生物学及びイースト遺伝子学の操作は当該技術分野で公知である（例えば、
Biochemistry and Genetics of Yeast, Bacil. M., Horecker, B.J., and Stopa
ni, A.O.M., editors, 2nd edition, 1987 ; The Yeasts (Rose, A.H., and Har
rison, J.S., editors), 2nd edition, 1987 ; 及びThe Molecular Biology of
the Yeast Saccharomyces, Strathern et al., editors, 1981を参照のこと）。

【００５７】より好ましい実施形態において、イースト細胞は、Candida, Hansenula, Kluy
veromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces、又はYarrowiaの種
別の細胞である。最も好ましい実施形態において、イースト細胞は、Saccharomyces carlsberge
nsis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces
douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis、又はSacchar
omyces oviformis細胞である。別の好ましい実施形態において、イースト細胞は
、Ｋｌｕｙｖｅｒｍｏｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ細胞である。別の最も好ましい実
施形態において、イースト細胞はＹａｒｒｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞で
ある。

【００５８】別の好ましい実施形態において、真菌細胞は糸状菌細胞である。“糸状菌”は
、サブディビジョンＥｕｍｙｃｏｔａ及びＯｏｍｙｃｏｔａ（Hawksworthら、19
95、前掲に定義）の全ての繊維状形態を含む。糸状菌は、キチン、セルロース、
グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合ポリサッカライドから構成される
菌糸壁を一般に特徴とする。栄養生長は、菌糸伸長により、炭素代謝は絶体好気
性である。対照的に、イースト、例えばサッカロマイセス・セレビシアエによる
栄養生長は、単細胞タルスの発芽により、炭素代謝は発酵的である、より好まし
い実施形態において、糸状菌は、これらに限らないが、Acremonium, Aspergillu
s, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, S
cytalidium, Thielavia, Tolypocladium、及びTrichodermaの種の細胞である。

【００５９】更により好ましい実施形態において、糸状菌細胞は、Aspergillus, Acremoniu
m, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, T
hielavia, Tolypocladium、又はTrichoderma細胞である。最も好ましい実施形態において、糸状菌細胞は、Aspergillus awamori, Asper
gillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillu
s niger、又はAspergillus oryzae細胞である。別の最も好ましい実施形態にお
いて、糸状菌細胞は、Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium
crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminu
m, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium
reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum. Fusarium sarcochroum
, Fusarium sporotricioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fus
arium trichothecioides、又はFusarium venenatum細胞である。別の最も好まし
い実施形態において、糸状菌細胞は、Humicola insolens, Humicola lanuginose
, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicilli
um purpurogenum、又はThielavia terrestris細胞である。別の最も好ましい実
施形態において、糸状菌細胞は、Trichoderma harzianum, Trichoderma koningi
i, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei、又はTrichoderma viri
de細胞である。

【００６０】有用な哺乳動物細胞は、Ｃｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒ卵巣（ＣＨＯ）細胞
、ＨｅＬａ細胞、ベイビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ＣＯＳ細胞、又は例え
ばAmerican Type Culture Collectionから利用できるいずれかの数の不死化細胞
を含む。核酸構成物本発明の方法において、核酸構成物は、関心のポリペプチドをコードする核酸
配列内以外の座で親細胞のゲノムに導入される。あるいは、核酸構成物は、その
核酸配列の縦列コピーのうちの１つ内又は反復配列を含む核酸配列内の座で親細
胞のゲノムに導入される。

【００６１】核酸構成物は、合成ＤＮＡであり、天然遺伝子から単離され、又はさもなけれ
ば天然には存在しないであろう様式で組み合わされ、並列された核酸のセグメン
トを含むよう改変されている一本鎖又は二本鎖のいずれかの核酸分子であっても
よい。核酸構成物は環状であっても直鎖状であってもよい。更に、核酸構成物は
、ベクターに含まれても、制限酵素により開裂された直鎖化フラグメントであっ
ても、ＰＣＲ増幅化直鎖フラグメントであってもよい。

【００６２】核酸構成物は、いずれかの大きさのいずれの核酸配列を含んでもよい。一実施
形態において、核酸構成物は、約１０〜２０，０００bpの長さ、好ましくは約１
００〜１５，０００bpの長さ、より好ましくは約５００〜１５，０００bpの長さ
、更により好ましくは約１，０００〜１５，０００bpの長さ、そして最も好まし
くは約１，０００〜１０，０００の長さである。

【００６３】核酸構成物は、２又はそれ超の別個のフラグメントとして細胞に導入すること
ができる。２つのフラグメントを用いる場合、その２つのフラグメントは一方の
フラグメントの３’端及び他方の５’端で十分な核酸配列相同性（オーバーラッ
プ）を有し、細胞への導入により、２つのフラグメントは相同的組換えを行って
単一フラグメントを形成することができる。２超のフラグメントが互いに相同的
組換えを行い、細胞の配列との組換えのために適した産物を最終的に形成するよ
うに、それらを用い、デザインすることができる。

【００６４】２又はそれ超の核酸構成物は、本発明の方法において環状又は直鎖状フラグメ
ントとして細胞に導入することができることが理解されるであろう。ここでそれ
らフラグメントは上述のようなオーバーラップ領域を含まない。特定の生物のた
めに、複数の構成物の細胞への導入が同じ座へのそれらの組込みを引きおこすこ
とは公知である。

【００６５】核酸構成物は、コーディング又は非コーディングＤＮＡ配列を含み得る。コー
ディング配列は本明細書に定義される。好ましい実施形態において、核酸構成物は、選択マーカーを含む。このような
選択マーカーの例は上述される。別の好ましい実施形態において、その構成物は、単独で又は選択マーカーと組
み合わせてベクター配列を含み、複数の起点、例えば大腸菌ベクター配列、例え
ばｐＵＣ１９，ｐＢＲ３２２、又はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを含むベクター配列
を含む。例えば、複製の起点を含む大腸菌ベクター配列は、大腸菌の複製の起点
による組込み後の宿主ゲノムからの構成物の回収を容易にすることができる、構
成物は、制限エンドヌクレアーゼでのゲノムＤＮＡの消化、次の回収された構成
物の連結及び大腸菌の形質転換により宿主ゲノムから回収することができる。

【００６６】別の好ましい実施形態において、核酸構成物はポリペプチド又はその部分のた
めの核酸配列のコーディング配列を含まない。別の好ましい実施形態において核
酸構成物は、その核酸配列に組み込み又はそれを破壊することから構成物をブロ
ックするためにポリペプチドをコードする核酸配列と相同でない配列を含む。好ましくは、核酸構成物は関心のポリペプチドをコードする核酸配列と、４０
％未満の相同性、好ましくは３０％未満の相同性、より好ましくは２０％未満の
相同性、更により好ましくは１０％未満の相同性、そして最も好ましくは相同性
がない。本発明の目的のため、２つの核酸配列間の相同性の程度は、アイデンテ
ィティーテーブル及び次のマハチプルアラインメントパラメータ：１０のＧａｐ
ペナルティー及び１０のギャップ長ペナルティーで、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ^TM Ｍ
ＥＧＡＬＩＧＮ^TMソフトウェア（DNASTAR Inc., Madison, WI)を用いてWilbur-L
ipman 法（Wilbur及びLipman, 1983, Proceedings of the National Academy of
Science USA 80 : 726-730)により決定される。対様アラインメントパラメータ
はＫｔｕｐｌｅ＝３、ギャップペナルティー＝３、及びウィンドウ＝２０である
。

【００６７】別の好ましい実施形態において、核酸構成物はポリペプチド又はその部分のた
めの核酸配列の少くとも１のコピーを含む。別の好ましい実施形態において、核
酸構成物は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して相同である配列を含む
。関心のポリペプチドをコードする核酸の１又は複数のコピーを含む核酸構成物
を細胞に導入する場合、コピー数の増加は、その構成物の導入前に細胞中に存在
する核酸配列のコピー数及び細胞に導入された構成物中の核酸配列のコピー数の
合計より大きい。あるいは、関心のポリペプチドをコードする核酸配列の１又は
複数のコピーを含む核酸構成物を細胞に導入する場合、コピー数の減少は構成物
の導入前に細胞内に存在する核酸配列のコピー数及び細胞に導入される構成物内
の核酸配列のコピー数の合計より大きい。しかしながら、細胞のゲノム内に実際
に組み込まれる構成物からの配列のコピーの数を同定することができるように、
その構成物に含まれる核酸を標識することが必要であり得、例えばユニーク制限
部位である。

【００６８】別の好ましい実施形態において、核酸構成物は、転移因子、即ちトランスポゾ
ンを含む。トランスポゾンは同じ細胞内の他のＤＮＡ配列内の多くの異なる部位
にそれ自体を挿入することができるＤＮＡの分離した断片である。トランスポゾ
ン過程のために必要なタンパク質はトランスポゾン内にコードされる。トランス
ポゾンのコピーは、転移後に、もとの部位に保持され得る。トランスポゾンの端
は通常、同一であるが、互いに対して逆方向である。

【００６９】別の好ましい実施形態において、核酸構成物は、１又は複数の調節配列、例え
ば単独で又は選択マーカーと組み合わせてプロモーターを含み得る。ここで、調
節配列は、組込みにより、関心がポリペプチドをコードする核酸配列に作用可能
に連結されない。このような調節配列は、プロモーター、シグナル配列、プロペ
プチド配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、ア
テニュエーター配列、及びイントロンスプライス部位配列であり得る。各々の調
節配列は、その細胞又はポリペプチドコーディング配列に対してネイティブ又は
外来性であり得る。

【００７０】別の好ましい実施形態において、核酸構成物は、プロモーター以外の調節配列
を含む。別の好ましい実施形態において、核酸構成物は、調節配列を含まない。より好ましい実施形態において、核酸構成物は、ｐＤＳＹ８２，ｐＤＳＹ１１
２，ｐＭＴ１６１２，ｐＭＴ１９３６，ｐＬＲＦ２，ｐＤＳＹ１５３又はｐＨＢ
２１８である。

【００７１】核酸構成物の細胞への導入核酸構成物は、これらに限らないが、トランスフェクション又はトランスダク
ション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、マイクロプロジ
ェクティル・ボンバードメント、アルカリ塩、又はプロトプラスト媒介、形質転
換を含む当該技術分野で周知の種々の物理的又は化学的方法によって細胞に導入
することができる。

【００７２】核酸構成物の細菌宿主細胞への導入は、例えば、プロトプラスト形質転換（例
えば、Chang and Cohem, 1979, Molecular General Genetics 168 : 111-115)を
参照により、コンピテント細胞を用いること（例えば、Young and Spizizin, 19
61, Journal of Bacteriology 81 : 823-829、又はDubnau and Davidoff-Abelso
n, 1971, Journal of Molecular Biology 56 : 209-221を参照）により、エレク
トロポレーション（例えば、Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6 : 7
42-751 を参照）により又はコンジュゲーション（例えば、Koehler and Thorne,
1987, Journal of Bacteriology 169 : 5771-5278 を参照）により行うことが
できる。

【００７３】アスペルギルス細胞の形質転換のための好適な手順は、EP 238 023 and Yelto
n et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81 :
1470-1474に記載される。フサリウム種を形質転換するための好適な方法は、Ma
lardier et al., 1989, Gene 78 : 147-156 、及びWO 96/00787 に記載される。イーストは、Becker and Guarente, In Guide to Yeast Genetics and Molecu
lar Biology, Methods of Enzymology 194 : 182-187 ; Ito et al., 1983, Jou
rnal of Bacteriology 153 : 163；及びHinnen et al., 1978, Proceedings of
the National Academy of Sciences USA 75 : 1920に記載される手順を用いて形
質転換することができる。

【００７４】哺乳動物細胞は、Graham及びVan der Eb, 1978, Virology 52 : 546 のリン酸
カルシウム沈降法を用いて直接的取込みにより形質転換することができる。技術
分野で周知である他の方法、例えばエレクトロポレーションを用いることができ
る。核酸構成物がベクターである場合、細胞のゲノムへの組込みは、選択した細胞
に依存して、相同的及び／又は非相同的組換えによりランダムに行われる。

【００７５】核酸構成物は、制限酵素媒介組込み（ＲＥＭＩ）により親細胞に導入すること
ができる。Schiestl及びPetes, 1991, Proceedings of the National Academy o
f Sciences USA 88 : 7585-7589 に記載されるＲＥＭＩは、制限酵素と共に、制
限酵素で消化されたプラスミドＤＮＡを細胞に導入することであり、それは後に
、しばしば加えた制限酵素により特定される部位におけるプラスミドＤＮＡのゲ
ノムへの組込みを導く。ＲＥＭＩの利点は、それが、分子ベースが容易に同定で
きる変異を形成することができることである。

【００７６】別の好ましい実施形態において、核酸構成物は環状化分子として親細胞に導入
される。別の好ましい実施形態において、核酸構成物はベクターの部分として親細胞に
導入される。別の好ましい実施形態において、核酸構成物は直鎖フラグメントとして親細胞
に導入される。

【００７７】変異体細胞のスクリーニング核酸構成物の細胞への導入の後、次のステップは、関心の核酸配列の変化した
コピー数を有する変異体細胞を、変異体細胞と推定される集団から単離すること
である。ここで変異体細胞は、両方の細胞を同じ条件下で培養した時に親細胞よ
り多い又は少いポリペプチドを作り出すものである。変異体細胞の単離は、好ま
しくは、最初に、変異体細胞及び親細胞を同じ条件下で培養した時に親細胞に対
する変異体細胞によるポリペプチドの生産の測定に依存する。変異体細胞の単離
は、そのポリペプチドに特有の当該技術分野で周知のスクリーニング法及び／又
は核酸配列のコピー数を測定するための方法に関連し得る。遺伝子のコピー数を
決定するための方法は当該技術分野で周知であり、サザン分析、定量的ＰＣＲ、
又はリアルタイムＰＣＲを含む。

【００７８】核酸構成物を生物の細胞に導入することにより得られる変異体と仮定される集
団は、最初に、標準的なプレーティング技術、例えば古典的な変異誘発に用いる
もの（例えば、Lawrence, C.W., 1991, In Christine Guthrie and Garald R. F
ink, editors, Methods in Enzymology, Volume 194、ページ273-281, Academic
Precs, Inc., San Diego)、単一胞子単離、又は富化技術を用いて精製される。
標準的なプレーティング技術は、好ましくは、要求されるポリペプチドを検出す
る手段と組み合わせて行われる。しかしながら、関心のポリペプチドに関して変
異体細胞を同定するための手段をプレーティング培地に組み込むことができるに
せよ、精製された予想上の変異体は、好ましくは核酸配列によりコードされるポ
リペプチドの生産の増加又は減少を確認するために更にキャラクタライズされる
。更に、核酸配列のコピー数の決定は、そのポリペプチドの生産の増加又は減少
が核酸配列のコピー数の変化の結果であることを確認するためにも要求される。

【００７９】特定のポリペプチドの生産が増加した変異体細胞は、そのポリペプチドに特異
的である当該技術で周知の検出法を用いることにより同定することができる。ポ
リペプチドのための検出法は、これらに限らないが、特定の抗体の使用、酵素産
物の形成又は酵素基質の消滅を測定することによる酵素活性、酵素基質を含む寒
天プレート上の透明なゾーン、及び生物活性アッセイを含み得る。

【００８０】好ましい実施形態において、ポリペプチドは、親細胞より少くとも２０％、好
ましくは少くとも５０％、より好ましくは少くとも７５％、より好ましくは少く
とも１００％、より好ましくは少くとも１００％〜１０００％、更により好まし
くは少くとも２００％〜１０００％、そして最も好ましくは少くとも５００％〜
１０００％大きい、又はそれより多い量で変異体細胞により生産される。

【００８１】もはや特定のポリペプチドを生産することができない又はその能力が減少した
変異体細胞は、ポリペプチドについて上述される同じ方法を用いて同定すること
ができるが、生産のない又は少いことは親細胞に対して測定される。別の好ましい実施形態において、ポリペプチドは、親細胞より少くとも２０％
、より好ましくは少くとも５０％、更により好ましくは少くとも７５％、そして
最も好ましくは１００％低い量で変異体細胞により生産される。

【００８２】座本発明の方法において、核酸構成物は、その核酸配列がポリペプチドコーディ
ング配列、その調節配列、又は核酸配列のコーディング配列内のいずれかのイン
トロンにも導入されないことを意味する“関心の核酸配列内以外の座”に導入す
ることができる。核酸配列の縦列コピーの間に介在配列が存在する場合、その構
成物はこれらの介在配列に導入することができる。あるいは、本発明の方法にお
いて、核酸構成物は、その核酸構成物がポリペプチドコーディング配列、その調
節配列、又はその核酸配列のコーディング配列内のいずれかのイントロン配列に
導入されることを意味する“関心の核酸配列内の座”に導入することができる。

【００８３】調節配列は、核酸配列に作用可能に連結した、ポリペプチドの生産に関連する
全ての成分を含む。このような調節配列には、これらに限らないが、本明細書に
記載されるようなプロモーター、シグナル配列、プロペプチド配列、転写ターミ
ネーター、リーダー及びポリアデニル化配列がある。調節配列の各々は、コーデ
ィング配列に対してネイティブであっても外来性であってもよい。

【００８４】その座が関心の核酸配列内にある場合、その座は上述の調節配列に隣接してて
もしてなくてもよい。好ましくは、その座は隣接していない。その座は、関心の
核酸配列のものと同じ染色体上でも同じ染色体外因子上でもよく、又は異なる染
色体上でも異なる染色体外因子上でもよい。更に、その座は、細胞に対してネイ
ティブであっても外来性であってもよい。

【００８５】好ましい実施形態において、その座は核酸配列の５’又は３’末端から、少く
とも１００bp又はそれ未満、好ましくは少くとも１，０００bp、より好ましくは
少くとも２，０００bp、更により好ましくは少くとも３，０００bp、更により好
ましくは少くとも４，０００bp、更により好ましくは少くとも５，０００bp、そ
して最も好ましくは少くとも１０，０００bpである。

【００８６】別の好ましい実施形態において、その座は関心のポリペプチドをコードする核
酸配列と異なる染色体上にある。別の好ましい実施形態において、その座は、核酸配列によりコードされるポリ
ペプチドをコードする。別の好ましい実施形態において、その座は、ポリペプチドをコードする核酸配
列である。

【００８７】挿入された核酸構成物での座の救出（ｒｅｓｃｕｅ）及びターゲッティング構
成物の使用本発明は、挿入された核酸構成物で座を救出するための方法であって、同定さ
れた変異体細胞から、（ｉ）核酸構成物及び（ii）その核酸構成物が組み込まれ
ているゲノムの座の３’及び５’隣接領域を単離し；そしてその座の３’及び５
’隣接領域を同定することを含む方法に更に関する。

【００８８】核酸構成物及び隣接領域は、当該技術分野で公知である方法、例えば制限酵素
での開裂及び次の連結並びに大腸菌の形質転換、逆ＰＣＲ、ランダムプライムト
遺伝子歩行ＰＣＲ、又は変異体細胞のライブラリーのプローピングにより単離化
し又は救出することができる。３’及び５’隣接領域の３’及び５’のいずれか
又は両方を有する単離された核酸構成物は“ターゲッティング構成物”と本明細
書で定義する。

【００８９】ターゲッティング構成物は、核酸構成物の組込み部位の上流及び／又は下流に
１００〜９，０００bp、好ましくは２００〜９，０００bp、より好ましくは５０
０〜７，０００bp、更により好ましくは１，０００〜７，０００bp、そして最も
好ましくは１，０００〜３，０００bpを含む。本発明のターゲッティングの構成物は、もとの細胞内の改変されたポリペプチ
ドから類似もしくは同一又は完全に異なるポリペプチドの生産を改変するために
異なる細胞に導入することができる。他の細胞は、もとの細胞と同じ又は異なる
種又は異なる属のものであり得る。もとの細胞が真菌細胞であったなら、他の細
胞は、好ましくは真菌細胞である。もとの細胞が細菌細胞であったなら、他の細
胞は、好ましくは細菌細胞である。もとの細胞が哺乳動物細胞であったなら、他
の細胞は好ましくは哺乳動物細胞である。

【００９０】細胞が異なる細胞である場合、ターゲッティング構成物の組込みは、好ましく
は、そのターゲッティング構成物が得られたもとの細胞の座の配列と相同である
、即ちターゲッティング配列及び細胞ＤＮＡが相同的組換えをおこし要求される
変異を作り出すことができるように、同一又は十分に類似した標的座でおこる。
それゆえ、ターゲッティング構成物の配列は、好ましくは、相同的組換えがおこ
る細胞の染色体ＤＮＡの予め選択された部位と相同である。しかしながら、当業
者は、標的座に再挿入するターゲッティング構成物の可能性が細胞に依存するで
あろうことを理解するであろう。なぜなら相同的組換えの頻度はイーストサッカ
ロマイセス・セレビシアエにおいてほぼ１００％からアスペルギルスで１％程度
の低さの範囲であるからである。ターゲッティング構成物は、非標的座で非相同
的組換えにより組み込まれ、それが関心のポリペプチドをコードする核酸配列の
コピー数を変化させることができる。

【００９１】好ましくは、標的座は、ターゲッティング構成物の隣接配列と、４０％超、好
ましくは６０％超、より好ましくは７０％超、更により好ましくは８０％超、そ
して最も好ましくは９０％超の相同性を有するＤＮＡ配列を含む。２つの核酸配
列の間の相同性の程度は、本明細書に記載のWilbur-Lipman 法により決定される
。

【００９２】ターゲッティング構成物は、単一クロスオーバー又は置換が要求されるか否か
に依存して３’及び５’領域のいずれか又は両方を含み得る。更に、ターゲッテ
ィング構成物は、もとに救出された座での細胞のゲノムへのもとの核酸構成物の
導入及び組込みの間におこったいずれの異常な出来事、例えば再配置、反復配列
、欠失又は挿入も正すよう改変することができる。

【００９３】上述のターゲッティング構成物は、制限酵素で開裂された直鎖ヌクレオチド配
列として用いてもよく、又は環化しもしくは好適なベクターに挿入してもよい。
例えば、環状プラスミド又はＤＮＡフラグメントは、好ましくは、単一ターゲッ
ティング配列を用いる。直鎖プラスミド又はＤＮＡフラグメントは、好ましくは
、２つのターゲッティング配列を用いる。ターゲッティング構成物は、関心のポ
リペプチドをコードする核酸配列を含む細胞への導入により、標的座又は非標的
座で細胞のゲノムに組み込まれるが、好ましくは標的座であり、それは、関心の
ポリペプチドをコードする核酸配列内又はそれ以外であり得る。標的座は、関心
のＤＮＡ配列と同じ染色体もしくは同じ染色体外要素上又は異なる染色体もしく
は異なる染色体外要素上であり得る。組込みは、変異体細胞及び親細胞を同じ条
件下で培養した時に親細胞に対して変異体細胞によるポリペプチドをコードする
核酸配列のコピー数を変化させる。

【００９４】任意に、ターゲッティング構成物は２又はそれ超の分離したフラグメントとし
て細胞に導入することができる。例えば、２つのフラグメントを用いる場合、そ
のフラグメントは一方のフラグメントの３’端及び他方の５’端でＤＮＡ配列相
同性（オーバーラップ）を有し、ここで一方は第１のターゲッティング配列であ
り、他方は第２のターゲッティング配列である。細胞への導入により、２つのフ
ラグメントは相同的組換えをおこし、２つのもとのフラグメント間のオーバーラ
ップの領域に隣接した第１及び第２のターゲッティング配列を伴う単一フラグメ
ントを形成することができる。次に、その産物フラグメントは細胞の標的配列で
の相同的組換えのために適した形態である。２超のフラグメントが互いに相同的
組換えをおこして最終的に細胞の標的配列での相同的組換えのために適した産物
を形成するであろうように、用い、デザインすることができる。

【００９５】ターゲッティング構成物の細胞への導入により、ターゲッティング構成物は、
選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含む細胞が適切な選択マーカーの存在
下で細胞を培養することにより選択することができる特性を有する増幅可能な選
択マーカー遺伝子を含めることにより更に増幅することができる。好ましい実施形態において、１又は複数のターゲッティング構成物が標的座に
導入される。別の好ましい実施形態において、各々のターゲッティング構成物は
異なるポリペプチドをコードする別の核酸配列のコピー数を変化させる。別の好
ましい実施形態において、２又はそれ超のターゲッティング構成物は、標的座に
導入した時に一緒に、付加的に又は共同的に作用して、ポリペプチドをコードす
る核酸配列のコピー数を変化させる。

【００９６】変異体細胞の培養及びポリペプチドの回収のための方法要求されるポリペプチドの生産の増加又は減少について選択された変異体細胞
は、当該技術分野で周知の方法を用いてポリペプチドの生産のために適した栄養
培地中で培養される。例えば、細胞は、振とうフラスコ培養、又は大規模もしく
は小規模発酵（連続、バッチ、フェド・バッチ、又は固相発酵を含む）により培
養することができ、これは、研究所又は工業発酵槽で、ポリペプチドが発現及び
／又は単離されるのを許容する条件下で適切な培地中で行われる。培養は、当該
技術分野で周知の手順を用いて、炭素及び窒素源並びに無機塩を含む適切な栄養
培地中で行われる（例えば、Bennett. J.W.及びLasure, L. editors, More Gene
Manipulations in Fung, Academic Press, CA. 1991）。好適な培地は、商業的
供給元から利用でき、又は公開されている組成に従って調製することができる（
例えばAmerican Type Culture Collectionのカタログ）。ポリペプチドを栄養培
地に分泌するなら、ポリペプチドは培地から直接、回収することができる。ポリ
ペプチドが分泌されないなら、それは細胞ライゼートから回収される。

【００９７】ポリペプチドは、そのポリペプチドに特有である当該技術分野で周知の方法、
例えば上述の方法又は実施例に記載の方法を用いて検出することができる。得られたポリペプチドは、当該技術分野で周知の方法によって回収することが
できる。例えば、ポリペプチドは、これらに限らないが、遠心、ろ過、抽出、噴
霧乾燥、エバポレーション、又は沈降法を含む慣用的な手順により栄養培地から
回収することができる。

【００９８】ポリペプチドは、これらに限らないが、クロマトグラフィー（例えばイオン交
換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電
気泳動法（例えば調製用等電点電気泳動）、溶解度の差（例えば硫酸アンモニウ
ム沈殿）、又は抽出を含む当該技術分野で周知の種々の手順により精製すること
ができる（例えばProtein Purification, J.-C. Janson及びLars Ryden, editor
s, VCH Publisher, New York 1985)。

【００９９】変異体細胞を得るための方法本発明は、変異体細胞を得るための方法にも関する。第１の実施形態は、変異体細胞を得るための方法であって、（ａ）核酸構成物を、ポリペプチドをコードする核酸配列の少くとも２の縦列
コピーを含む親細胞に、前記核酸構成物が前記親細胞のゲノムに前記核酸配列の
コピー内以外の座で組み込まれる条件下で導入して、変異体細胞を生産し、ここ
で前記核酸構成物の前記座への組込みが前記核酸配列のコピー数を増加させ、該
コピー数の変化が選択圧下でなく、及び前記変異体細胞が両方の細胞を同じ条件
下で培養した時に前記親細胞より多い前記ポリペプチドを生産し；そして（ｂ）両方の細胞を同じ条件下で培養した時に前記親細胞より多い前記ポリペ
プチドを生産する変異体細胞を同定することを含む方法である。

【０１００】第２の実施形態は、変異体細胞を得るための方法であって、（ａ）核酸構成物を、ポリペプチドをコードする核酸配列の少くとも２の縦列
コピーを含む親細胞に、前記核酸構成物が前記親細胞のゲノムに前記核酸配列の
コピー内以外の座で組み込まれる条件下で導入して、変異体細胞を生産し、ここ
で前記核酸構成物の前記座への組込みが前記核酸配列のコピー数を減少させ、該
コピー数の変化が選択圧下でなく、及び前記変異体細胞が両方の細胞を同じ条件
下で培養した時に前記親細胞より少い前記ポリペプチドを生産し；そして（ｂ）両方の細胞を同じ条件下で培養した時に前記親細胞より少い前記ポリペ
プチドを生産する変異体細胞を同定することを含む方法である。

【０１０１】第３の実施形態は、変異体細胞を得るための方法であって、（ａ）核酸構成物を、ポリペプチドをコードする核酸配列の少くとも２の縦列
コピーを含む親細胞に、前記核酸構成物が前記親細胞のゲノムに前記核酸配列の
コピーのうちの１つ内の座で組み込まれる条件下で導入して、変異体細胞を生産
し、ここで前記核酸構成物の前記座への組込みが前記核酸配列のコピー数を増加
させ、該コピー数の変化が選択圧下でなく、及び前記変異体細胞が両方の細胞を
同じ条件下で培養した時に前記親細胞より多い前記ポリペプチドを生産し；そし
て（ｂ）両方の細胞を同じ条件下で培養した時に前記親細胞より多い又は少い前
記ポリペプチドを生産する変異体細胞を同定することを含む方法である。

【０１０２】第４の実施形態は、変異体細胞を得るための方法であって、（ａ）核酸構成物を、ポリペプチドをコードする核酸配列の少くとも２の縦列
コピーを含む親細胞に、前記核酸構成物が前記親細胞のゲノムに前記核酸配列の
コピーのうちの１つ内の座で組み込まれる条件下で導入して、変異体細胞を生産
し、ここで前記核酸構成物の前記座への組込みが前記核酸配列のコピー数を減少
させ、該コピー数の変化が選択圧下でなく、及び前記変異体細胞が両方の細胞を
同じ条件下で培養した時に前記親細胞より少い前記ポリペプチドを生産し；そし
て（ｂ）両方の細胞を同じ条件下で培養した時に前記親細胞より少い前記ポリペ
プチドを生産する変異体細胞を同定することを含む方法である。

【０１０３】第５の実施形態は、変異体細胞を得るための方法であって、（ａ）核酸構成物を、ポリペプチドをコードする核酸配列であって該核酸配列
の５’及び３’端に反復配列を含むものを含む親細胞に、前記核酸構成物が前記
親細胞のゲノムに前記核酸配列内以外の座で組み込まれる条件下で導入して、変
異体細胞を生産し、ここで前記核酸構成物の前記座への組込みが前記核酸配列の
コピー数を増加させ、該コピー数の変化が選択圧下でなく、及び前記変異体細胞
が両方の細胞を同じ条件下で培養した時に前記親細胞より多い前記ポリペプチド
を生産し；そして（ｂ）両方の細胞を同じ条件下で培養した時に前記親細胞より多い前記ポリペ
プチドを生産する変異体細胞を同定することを含む方法である。

【０１０４】本発明は、以下の実施例により更に詳述されるが、これらは本発明の範囲を限
定するものとして解釈すべきでない。実施例株及び培地出発株はｐｙｒＧマイナスアスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４２５、アルペ
ルギルス・オリザエＪａＬ２５０、大腸菌ＤＨ５α（GLBCO-BRL, Gaithersburg,
MD)、及び大腸菌ＨＢ１０１（GLBCO-BRL, Gaithersburg, MD)であった。

【０１０５】ＰＤＡプレートは３９ｇ／ＬのＰｏｔａｔｏＤｅｘｔｒｏｓｅＡｇａｒ（
Ｄｉｆｃｏ）を含み、これに特に示さなければｐｙｒＧ栄養要求体のために１０
mMウリジンを補給した。 pH６．５のＭＹ２５培地は、１リッター当り２５ｇのマハトース、２．０ｇの
ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ、１０ｇのＫＨ₂ ＰＯ₄ 、２．０ｇのクエン酸、１０ｇの
イーストエキス、２．０ｇのＫ₂ ＳＯ₄ 、２．０ｇの尿素、及び０．５mlの微量
金属溶液から構成される。ＭＹ２５振とうフラスコ培地はマイクロタイター成長
実験に用いるためにガラス希釈水で１：１００又は１：１０００に希釈した（Ｍ
Ｙ２５／１００又はＭＹ２５／１０００）、培養は３４℃で増殖させた。

【０１０６】２×ＭＹ塩pH６．５溶液は、１リッター当り４ｇのＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ、４
ｇのＫ₂ ＳＯ₄ 、２０ｇのＫＨ₂ ＰＯ₄ 、４ｇのクエン酸、１mlの微量金属、及
び２mlのＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏから構成される（１００ｇ／Ｌストック溶液）。最小培地形質転換プレートは、リッター当り６ｇのＮａＮＯ₃ 、０．５２ｇの
ＫＣｌ、１．５２ｇのＫＨ₂ ＰＯ₄ 、１mlの微量金属溶液、１ｇのグルコース、
５００mgのＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ、３４２．３ｇのスクロース及びリッター当り
２０ｇのＮｏｂｌｅａｇａｒ（pH６．５）から構成される、最小培地転移プレ
ート（pH６．５）は、１リッター当り、６ｇのＮａＮｏ₃ 、０．５２ｇのＫＣｌ
、１．５２ｇのＫＨ₂ ＰＯ₄ 、１mlの微量元素、１ｇのグルコース、５００mgの
ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ、及び２０ｇのＮｏｂｌｅａｇａｒから構成される。

【０１０７】微量金属溶液（１０００×）は、リッター当り２２ｇのＺｎＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ
、１１ｇのＨ₃ ＢＯ₃ 、５ｇのＭｕＣｌ₂ ・４Ｈ₂ Ｏ、５ｇのＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ ₂ Ｏ、１．６ｇのＣｏＣｌ₂ ・５Ｈ₂ Ｏ、１．６ｇの（ＮＨ₄ ）₆ Ｍｏ₇ Ｏ₂₄、
及び５０ｇのＮａ₄ ＥＤＴＡから構成される。ＣＯＶＥプレートは、リッター当り３４３．３ｇのスクロース、２０mlのＣＯ
ＶＥ塩溶液、１０mlの１Ｍアセトアミド、１０mlの３ＭＣｓＣｌ、及び２５ｇ
のＮｏｂｅｌａｇａｒから構成される。ＣＯＶＥ塩（５０×）溶液は、リッタ
ー当り２６ｇのＫＣｌ、２６ｇのＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ、７６ｇのＫＨ₂ ＰＯ₄
、及び５０mlのＣＯＶＥ微量金属溶液から構成される。ＣＯＶＥ微量金属溶液は
、リッター当り０．０４ｇのＮａＢ₄ Ｏ₇ ・１０Ｈ₂ Ｏ、０．０４０ｇのＣｕＳ
Ｏ₄ ・５Ｈ₂ Ｏ、０．７０ｇのＦｅＳＯ₄ ・Ｈ₂ Ｏ、０．８０ｇのＮａ₂ ＭｏＯ ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ、及び１０ｇのＺｎＳＯ₄ から構成される。

【０１０８】ＹＥＧ培地は、リッター当り５ｇのイーストエキス及び２０ｇのデキストロー
スから構成される。ＢＡＳＴＡプレートはリッター当り３４２．３ｇのスクロース、２０mlのＣＯ
ＶＥ塩溶液、１０mlの１Ｍ尿素、２５ｇのＮｏｂｌｅａｇａｒ及び形質転換体
の選択のための５mg／mlの最終ＢＡＳＴ濃度を含む。ＢＡＳＴＡ形質転換のため
のオーバーレイは、上述のＢＡＳＴＡプレートと同じ組成を有した。ＢＡＳＴＡ
転移プレートは上述と同じであるが１０mg／ml ＢＡＳＴＡを含む。実施例１：アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０の作製アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０を、ヒュミコラ・ラヌギノサからの
リパーゼ遺伝子を含むように作製した（ＬＩＰＯＬＡＳＥ^TM遺伝子、Ｎｏｖｏ
ＮｏｒｄｉｓｋＡ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）。

【０１０９】ｐＢＡＮｅ８を、ＴＡＫＡ／ＮＡ２−ｔｒｉリーダーハイブリッドプロモータ
ー、ヒュミコラ・ラヌギノサからのリパーゼ遺伝子、ＡＭＧターミネーター、及
び選択マーカーとしての全長アスペルギルス・ニジュランスａｍｄＳ遺伝子を含
むように以下に記載の通り作製した。ＰＣＲを、以下のプライマー１及び２を用いてｐＴｏＣ９０の全長ａｍｄＳ遺
伝子（Christensen ら、1988, Biotechnology 6 : 1419-1422）に隣接するＮｓ
ｉＩ部位を挿入するため、及び以下のプライマー３及び４を用いてｐＪａＬ２９
２（図１）のＮＡ２−ｔｐｉリーダーハイブリッドプロモーターの５’端にＥｃ
ｏＲＩ及び３’端にＳｗａＩを挿入するために用いた。プライマーは、製造元の
説明に従って、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏｄｅｌ３９４
ＤＮＡ／ＲＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Applied Biosystems, Inc., Foster
City, CA）合成した。

【０１１０】プライマー１：5'-ATGCATCTGGAAACGCAACCCTGA-3' プライマー２：5'-ATGCATTCTACGCCAGGACCGAGC-3' プライマー３：5'-TGGTGTACAGGGGCATAAAAT-3' プライマー４：5'-ATTTAAATCCAGTTGTGTATATAGAGGATTGTGG-3' 増幅反応物（１００μＬ）を、テンプレートとして約０．２μｇのｐＴｏＣ９
０又はｐＪａＬ２９２のいずれかを用いて調製した。各々の反応物は次の成分を
含んだ：０．２μｇのプラスミドＤＮＡ、４８．４pmolの正方向プライマー、４
８．４pmolの逆プライマー、１mMの各々のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ、及び
ｄＴＴＰ，１×ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、及び２．５ＵのＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ）。その反応物をＥｒ
ｉｃｏｍｐＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒでインキュベートし、それは次の通
りプログラムした：９５℃で５分の１サイクル；次に各々９５℃で１分、５５℃
で１分及び７２℃で２分の３０サイクル。

【０１１１】そのＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動して２．７kb ａｍｄＳフラ
グメント及び０．６kb ＮＡ２−ｔｐｉフラグメントの存在を確認した。そのＰＣＲ産物を、次に、製造元の説明に従って、ＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫ
ｉｔ（Invitrogen, San Diego. CA）を用いてｐＣＲIIにサブクローン化した。
次に、形質転換体を、製造元の説明に従ってＱＩＡｗｅｌｌ−８Ｐｌａｓｍｉ
ｄＫｉｔ（Qiagen. Inc., Chatsworth, CA）を用いて形質転換体からプラスミ
ドＤＮＡを抽出し、そしてＮｓｉＩ又はＥｃｏＲＩ／ＳｗａＩのいずれかでプラ
スミドＤＮＡを制限消化することによりスクリーニングし、次にアガロース電気
泳動によりＮｓｉＩ／ａｍｄＳフラグメント及びＳｗａＩ／ＥｃｏＲＩＮＡ２
−ｔｐｉフラグメントについて正確な大きさのフラグメント２．７kb及び０．６
kb各々の存在を確認した。ＰＣＲ産物を確認するために、その産物を、Ｍ１３逆
（−４８）及びＭ１３正（−２０）プライマー（New England Biolabs, Beverly
, MA）及び配列決定するＤＮＡに特有のプライマーを用いて染料ターミネーター
化学（Gieseckeら、1992, Journal of Virol. Methods 38 : 47-60）でのプライ
マー歩行技術を用いて両鎖上でのＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏ
ｄｅｌ３７３ＡＡｕｔｏｍａｔｅｄＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒ（Applie
d Biosystems, Inc. Foster City, CA）で配列決定した。次に、その正確な形質
転換体からのプラスミドをプラスミドを消化した制限酵素で消化し、１％アガロ
ースゲルで分離し、そして製造元の説明に従ってＦＭＣＳｐｉｎＢｉｎｄＫ
ｉｔ（FMC, Rockland, ME）を用いて精製した。

【０１１２】ＴＡＫＡアミラーゼプロモーター、ポリリンカー、ＡＭＧターミネーター及び
アスペルギルス・ニジュランスｐｙｒＧ遺伝子を含むｐＫＳ６（図２）をＥｃｏ
ＲＩ及びＳｗａＩで消化してＴＡＫＡアミラーゼプロモーターの一部分を除去し
た。この領域をＮＡ２−ｔｐｉＰＣＲ産物で置きかえてｐＢＡＮｅ１３（図３
）を作り出した。

【０１１３】ｐＢＡＮｅ１３をＮｓｉＩで消化してアスペルギルス・ニジュランスｐｙｒＧ
遺伝子を除去した。次にこの領域を上述の全長ａｍｄＳ遺伝子ＰＣＲ産物でおき
加えてｐＢＡＮｅ６を作り出した（図４）。ＰＣＲを、以下のプライマー５及び６を用いてｐＭＨａｎ３７（図５）の全長
ヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼ遺伝子上にＳｗａＩ及びＰａｃＩ隣接部位を挿
入するのに用いた。プライマー５及び６は上述の通り合成した。

【０１１４】プライマー５：5'-ATTTAAATGATGAGGAGCTCCCTTGTGCTG-3' プライマー６：5'-TTAATTAACTAGAGTCGACCCAGCCGCGC-3' その増幅反応物（１００μＬ）は次の成分を含んだ：０．２μｇのｐＭＨａｎ
３７、４８．４pmolのプライマー５、４８．４pmolのプライマー６、１mMの各々
のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ，１×ＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼ緩衝液、及び２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ。その反応物を以下の
通りプログラムしたＥｒｉｃｏｍｐＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒでインキュ
ベートした：９５℃で５分の１サイクル；次に各々９５℃で１分、５５℃で１分
、及び７２℃で２分の３０サイクル、２μＬの反応物をアガロースゲルで電気泳
動して約９００bpのリパーゼ遺伝子産物の増幅を確認した。

【０１１５】そのＰＣＲ増幅化リパーゼ遺伝子産物を、次に、ＴＡＣｌｏｎｉｎｓＫｉ
ｔを用いてｐＣＲIIにサブクローニングした。その形質転換体を、ＱＩＡｗｅｌ
ｌ−８ＰｌａｓｍｉｄＫｉｔを用いて形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽
出し、そのプラスミドＤＮＡをＳｗａＩ／ＰａｃＩで制限消化し、そして上述の
方法に従ってＤＮＡを配列決定してＰＣＲ産物を確認することによりスクリーニ
ングした。

【０１１６】そのリパーゼ遺伝子を、ＳｗａＩ及びＰａｃＩで消化することによりｐＣＲII
プラスミドから切り出し、次にＳｗａＩ／ＰａｃＩで消化したｐＢＡＮｅ６にサ
ブクローニングしてｐＢＡＮｅ８を作り出した（図６）。ｐＢＡＮｅ８をＰｍｅＩで消化し、そしてＮＡ２−ｔｐｉプロモーター、ヒュ
ミコラ・ラヌギノサからのリパーゼ遺伝子、及びＡＭＧターミネーターを含む、
直鎖ＰｍｅＩフラグメントを、４０mM Ｔｒｉｓ−アセテート−１mM二ナトリウ
ムＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液を用いて調製用アガロース電気泳動により単離した
。

【０１１７】アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０を、以下の手順に従ってアスペルギ
ルス・オリザエＨｏｗＢ４２５の、直鎖ＰｍｅＩフラグメントでの形質転換によ
り作り出した。アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４２５を、１００mLの１％イーストエキス
−２％ペプトン−１％グルコース中で３２℃で１６〜１８時間、１５０rpm で撹
拌しながら増殖させた。その菌糸体を、フィルター上に約１０mLが残るまで０．
４５mmフィルターを介してのろ過により回収し、２５mLの１．０〜１．２ＭＭ
ｇＳＯ₄ −１０mMリン酸ナトリウムpH６．５で洗い、上述のようにろ過し、上述
のように再び１０mLが残るまで洗い、そして次に１２５mLエーレンマイヤーフラ
スコ中に１．２ＭＭｇＳＯ₄ −１０mMリン酸ナトリウムpH６．５（０．４５μ
ｍろ過）中５mg／mLのＮＯＶＯＺＹＭ２３４^TM（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ
Ａ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）１０mLに再度懸濁した。その懸
濁液を３７℃で約１時間、５０rpm で静かに撹拌しながらインキュベートしてプ
ロトプラストを形成した。１０mLの容量のプロトプラスト／菌糸体調製物を３０
mL Ｃｏｒｅｘ遠心チューブに加え、５mLの０．６Ｍソルビトール−１０mM Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ pH７．５を重層し、そしてスインギングバケットローター中で
１５分、３６００×ｇで遠心してプロトプラストを回収した。プロトプラストを
パスツールピペットで緩衝液界面から回収した。次にプロトプラストを５容量の
ＳＴＬで洗い、遠心し、そして次に上述のように再び洗って遠心した。そのプロ
トプラストをＳＴＬ中に２×１０⁷ プロトプラスト／mLの最終濃度に再懸濁した
。

【０１１８】ａｍｄＳ選択のためのアスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４２５の形質転換を
、mL当り２×１０⁷ プロトプラストの濃度でプロトプラストで行った。１０μｇ
のＤＮＡを１００mLのプロトプラストに加えた。次に、２５０mLの容量のＰＥＧ
溶液（６０％ＰＥＧ４０００−１０mM ＣａＣｌ₂ −１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
，pH８．０）を加え、その混合物を３７℃で３０分、放置した。３mLの１Ｍソル
ビトール−１０mM ＣａＣｌ₂ −１０mM Ｔｒｉｓ pH７．５（ＳＴＬ）を加え
、その混合物を、ａｍｄＳについて選択する１０mMウイジンを補給したＣｏｖｅ
プレートにプレートした。そのプレートを７〜１０日、３４℃でインキュベート
した。形質転換体を同じ培地のプレートに移し、３〜５日、３７℃でインキュベ
ートした。形質転換体を、同じ条件下でスクロースのない同じ培地の同じプレー
トを用いて、胞子をストリーキングして、単離されたコロニーを採取することに
より精製した。

【０１１９】実施例２：プラスミドｐＳＯ１２２，ｐＤＳＹ８１、及びｐＤＳＹ８２の作製ｐＳＯ１２２をアスペルギルス・オリザエｐｙｒＧ遺伝子の１．５kbフラグメ
ントを含むように以下に記載の通り作製した。ｐＳＯ２（図７）を、アスペルギルス・オリザエ１５６０のゲノムライブラリ
ーから作製した。アスペルギルス・オリザエ１５６０のゲノムライブラリーを、
最初にアスペルギルス・オリザエ１５６０ゲノムＤＮＡをＳａｕ３Ａ（New Engl
and Biolabs, Beverly, MA）で部分消化することにより作製した。４ユニットのＳａｕ３Ａを、製造元により推奨された条件を用いて１０μｇのアスペルギルス
・オリザエ１５６０ゲルＤＮＡを消化するのに用いた。その反応物は、６５℃で
行い、サンプルは５分間隔（０〜５０分）で採取した。そのサンプルを氷上にお
き、ＥＤＴＡを１０μＭまで加えることにより停止させた。これらの消化物を、
次に、エチジウムブロマイドで１％アガロースゲル上で行い、３kb〜９kbのＤＮ
Ａを含むゲルの領域を切り出した。次にそのＤＮＡを、製造元（New England Bi
olabs, Beverly, MA）により供されるプロトコルを用いてＢｅｔａ−Ａｇａｒａ
ｓｅＩを用いてゲルスライスから精製した。次にサイズ選択したＤＮＡを、製造
元の説明（Clontech, Palo Alto, CA）に従って、１６℃で一晩、製造元により
推奨される条件を用いてＥＭＢＬ４アームに連結した。その連結反応を、製造元
のプロトコルに従って、Ｇｉｇａｐａｃｋ II ＰａｃｋａｇｉｎｇＫｉｔ（
Stratagene, La Jolla, CA）を用いてパッケージングして滴定した。１６，００
０の組換えプラークの全てを得て、そのライブラリーを製造元により供されるプ
ロトコルを用いて増幅した。

【０１２０】ゲノムライブラリーの適当な希釈物を、ＥＭＢＬ４アームが供されるプロトコ
ルに記載の通り、１５０mmペトリプレート当り７０００のプラークを得るように
作った。そのプラークをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋環状フィルター（Amersham, Clevel
and, OH）に、標準的プロトコル（Sambrookら、1989、前掲）に採取した。その
フィルターをＵＶ架橋を用いて固定し、４２℃（５×ＳＳＰＥ、３５％ホルムア
ミド）でプレハイブリダイズさせた。そのゲノムライブラリーを、ランダムプラ
イムＤＮＡラベリングキッス（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN ）を用
いて³²Ｐで標識したアスペルギルス・ニゲルｐｙｒＧ遺伝子からなる５６０bpフ
ラグメントで、低ストリンジェンシー（３５％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ，４
２℃）でプロービングした。３．８kb ＨｉｎｄIII フラグメントを１つのファ
ージから単離し、ｐＵＣ１１８クローニングベクターにサブクローニングしてｐ
ＳＯ２を作り出した。

【０１２１】以下に示すプライマー７及び８のｐｙｒＧ遺伝子の５’端にＢａｍＨＩ制限部
位を導入することによりｐＳＯ１２２を作り出すためにＰＣＲを用いた。プライ
マー７及び８を、製造元の説明に従ってＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
Ｍｏｄｅｌ３９４ＤＮＡ／ＲＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで合成した。プライマー７：5'-GCGGGATCCCTAGAGTAGGGGGTGGTGG-3' プライマー８：5'-GCGGGATCCCCCCTAAGGATAGGCCCTA-3' その増幅反応物（５０μＬ）は、次の成分を含んだ：２mgのｐＳＯ２、４８．
４ｐモルの正プライマー、４８．４ｐモルの逆プライマー、１mMの各々のｄＡＴ
Ｐ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ，１×ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ緩衝
液、及び２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ。その反応物を、以下の通りプ
ログラムしたＥｒｉｃｏｍｐＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ中でインキュベー
トした：９５℃で５分の１サイクル、次に各々９５℃で１分、５５℃で１分、及
び７２℃で２分の３０サイクル。そのＰＣＲ産物は、１％アガロースゲルでの電
気泳動により単離した。

【０１２２】その単離したＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ−（Stratagene, La Jolla, CA）のＢａｍＨＩ部位にクローン化してｐＳＯ
１２２（図８）を作り出した。アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０及びｐ
ＳＯ１２２のゲノム間の唯一の相同性はｐｙｒＧ挿入物の５’端であった。なぜ
ならｐｙｒＧフラグメントの残りは実施例１に記載される通り、アスペルギルス
・オリザエＨｏｗＢ４３０から削除されたからである。

【０１２３】ゲノム内のこの相同領域へのターゲッティングの頻度を減少させるため及びｐ
ＳＯ１２２は２つのＢａｍＨＩ部位を含むので、ｐＳＯ１２２，ｐＤＳＹ８１及
びｐＤＳＹ８２（図８）の２つの誘導体を、ＢａｍＨＩ部位のうちの一方が破壊
されるよう作製した。プラスミドｐＤＳＹ８１及びｐＤＳＹ８２を、ｐＳＯ１２
２をＢａｍＨＩで部分消化し、５’オーバーハングをクレノウフラグメントでフ
ィル・インし、そのプラスミドを連結により閉じることにより作製し、次に大腸
菌ＤＨ５α（Sambrookら、1989、前掲）に形質転換した。次にその形質転換体を
、ＱＩＡｗｅｌｌ−８ＰｌａｓｍｉｄＫｉｔを用いて形質転換体からプラス
ミドＤＮＡを抽出し、そしてそのプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩで制限消化して
、ＢａｍＨＩ部位の一方が破壊されているか否かを決定することによりスクリー
ニングした。一方のＢａｍＨＩ部位が破壊されたプラスミドをＮｓｉＩ／Ｂａｍ
ＨＩで消化してＢａｍＨＩ部位が破壊されていることを決定した。

【０１２４】実施例３：ｐＳＯ１２２，ｐＤＳＹ８１、又はｐＤＳＹ８２でのアスペルギル
ス・オリザエＨｏｗＢ４３０形質転換体アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０のプロトプラストを実施例１に記載
される通り調製した。ＤＮＡ（環状ｐＳＯ１２２，４〜１２ＵのＥｃｏＲＩで直
鎖化したｐＤＳＹ８１、又は１５ＵのＢａｍＨＩで直鎖化したｐＤＳＹ８２１の
５〜１５μＬアリコートを、１４mL Ｆａｌｃｏｎポリプロピレンチューブ中１
mL当り２×１０プロトプラストの濃度で０．１mLのプロトプラストに加え、次に
、２５０μＬの６０％ＰＥＧ４０００−１０mM ＣａＣｌ₂ −１０mM Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ pH７を加え、静かに混合し、そして３７℃で３０分、インキュベート
した。その形質転換体を、５μＬの環状ｐＳＯ１２２，６μｇの直鎖化ｐＤＳＹ
８１、又は６μｇの直鎖化ｐＤＳＹ８２で作った。次に３mLのＳＰＴＣ（１．２
Ｍソルビトール−１０mM ＣａＣｌ₂ −１０mM Ｔｒｉｓ pH８）を加え、その
懸濁液を静かに混合した。その懸濁液を１２mLの溶解重層寒天（１×ＣＯＶＥ塩
、１％ＮＺアミン、０．８Ｍスクロース、０．６％Ｎｏｂｌｅａｇａｒ）又は３
mLのＳＴＣ培地と混合し、その懸濁液を最小培地プレートに注いだ。そのプレー
トを３７℃で３〜５日、インキュベートした。

【０１２５】環状ｐＳＯ１２２形質転換体の形質転換頻度は約１００〜２００形質転換体／
μｇの範囲であった。アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０の約１２０，０
００形質転換体のライブラリーを得た。ＥｃｏＲＩＲＥＭＩｐＤＳＹ８１形質転換体の形質転換頻度はμｇ当り約
６０〜１００の範囲であった。アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０の約２
８，０００形質転換体のＥｃｏＲＩＲＥＭＩライブラリーを作った。

【０１２６】ＢａｍＨＩＲＥＭＩｐＤＳＹ８２形質転換体の形質転換頻度は、約８０〜
１１０形質転換体／μｇの範囲であった。アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４
３０の約２７，０００のＢａｍＨＩＲＥＭＩライブラリーを得た。アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０のＨｉｎｄIII 及びＳａｌＩＲＥ
ＭＩライブラリーも上述の通りｐＤＳＹ８１を用いて調製した。

【０１２７】ＨｉｎｄIII ＲＥＭＩｐＤＳＹ８１形質転換体の形質転換頻度はμｇ当り約
８０〜１２０の範囲であった。アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０の３５
，０００形質転換体のＨｉｎｄIII ＲＥＭＩライブラリーを作った。ＳａｌＩＲＥＭＩｐＤＳＹ８１形質転換体の形質転換頻度はμｇ当り約８
０〜１２０の範囲であった。アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０の２５，
０００形質転換体のＳａｌＩＲＥＭＩライブラリーを作った。

【０１２８】アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０ライブラリープールをｐＳＯ１２２
について“ｈ”；ＥｃｏＲＩの存在下での後の形質転換を伴うＥｃｏＲＩで消化
したｐＤＳＹ８１について“ｅ”；ＢａｍＨＩの存在下で後の形質転換を伴うＢ
ａｍＨＩで消化したｐＤＳＹ８２について“ｂ”；ＨｉｎｄIII の存在下で後の
形質転換を伴うＨｉｎｄIII で消化したｐＤＳＹ８１について“ｈIII ”；及びＳａｌＩの存在下で後の形質転換を伴うＳａｌＩで消化したｐＤＳＹ８１につい
て“ｓ”で示す。１２３の“ｈ”プール、２８の“ｅ”プール、２３の“ｂ”プ
ール、５５の“ｈIII ”プール及び２５の“ｓ”プールが存在した。

【０１２９】上述のライブラリーを約１０００形質転換体のグループにプールし、−８０℃
で１０％グリセロール中に保存した。実施例４：リパーゼ発現スクリーニング実施例３に記載のアスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０変異体ライブラリ
ー“ｈ”，“ｅ”，“ｂ”，“ｓ”及び“ｈIII ”プールをリパーゼ発現のため
にアッセイした。

【０１３０】９６−ウェルプレートスクリーンのために、ＭＹ２５培地を、等量の滅菌水及
び２×ＭＹ塩、pH６．５溶液から作られた希釈物を用いて１０００倍に希釈した
。２４−ウェルプレート法のために、ＭＹ２５培地を等量の滅菌水及び２×ＭＹ
塩pH６．５溶液を用いて１００倍に希釈した。最初の９６ウェルプレートスクリーンは、５０mLの培地をウェルに分散させた
時にウェル当り平均１の胞子が接種されるように、別個のプールからＭＹ２５／
１０００への胞子の希釈に関係した。接種後、９６−ウェルプレートを７日間、
静止条件下で３４℃で７日、増殖させた。次に培養物を以下に記載のようにリパ
ーゼ活性についてアッセイした。関心の変異体は、ＭＹ２５／１００を含む２４
−ウェルプレートに直接、接種し、３４℃で７日、増殖させた。次に培養物を以
下に記載のようにリパーゼ活性についてアッセイした。次に関心の変異体をＣＯ
ＶＥプレートにプレートして胞子を形成し、ＰＤＡプレートに広げて単一コロニ
ーを形成し、そして次に各々の単離物からの４つの単一コロニーを上述の２４ウ
ェルプレート法でテストした。

【０１３１】リパーゼアッセイ基質を、使用直前にｐ−ニトロフェニルブチレートストック
基質（２１μＬのｐ−ニトロフェニルブチレート／mL ＤＭＳＯ）をＭＣ緩衝液
（４mM ＣａＣｌ₂ −１００mM ＭＯＰＳ pH７．５）に１：５０に希釈するこ
とにより調製した。標準リパーゼ（ＬＩＰＯＬＡＳＥ^TM，ＮｏｖｏＮｏｒｄｉ
ｓｋＡ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、α−オレフィンスル
ホネート（ＡＯＳ）界面活性剤を含む４０LU／mLのＭＣ緩衝液を含むよう調製し
た。その標準を、使用するまで４℃で保存した。標準リパーゼを使用直前にＭＣ
緩衝液中に１／４０に希釈した。ブロスサンプルを０．０２％ＡＯＳ界面活性剤
を含むＭＣ緩衝液に希釈し、２０μＬアリコートを９６ウェルプレート中のウェ
ルに分配し、次に２００μＬの希釈した基質を加えた。プレートリーダーを用い
て、４０５nmの吸光度を、約１分間隔での２つの読みとり値の差として記録した
。リパーゼユニット／mL（LU／mL）をリパーゼ標準に対して計算した。

【０１３２】９６−ウェルスクリーン及び次の２４−ウェルスクリーンの結果は、更なる評
価のために、ｐＳＯ１２２形質転換体から３６０の形質転換体及びｐＤＳＹ８１
又はｐＤＳＹ８２ＲＥＭＩ形質転換体から４４の形質転換体を同定した。これ
らの同定された形質転換体は、対照株アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４２７
及びアスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０より高レベルのリパーゼを作り出
した。

【０１３３】実施例５：振とうフラスコ、発酵、及びリパーゼ遺伝子コピー数評価次に、実施例４に記載される最も高いリパーゼ生産変異体をＣＯＶＥプレート
にプレートして、振とうフラスコ及び発酵評価のための胞子を作った。振とうフラスコ評価を、３００〜５００mLの胞子懸濁液０．０２％Ｔｗｅｅｎ
−８０＋ＣＯＶＥプレートからの胞子）を２５mLのＭＹ２５培地に、１２５mL振
とうフラスコ中pH６．５で接種することにより行った。振とうフラスコを、３４
℃で３時間、２００rpm でインキュベートした。サンプルを２日目及び３日目に
採取し、リパーゼ活性を実施例４に記載の通り測定した。

【０１３４】同じ変異体をＮｕｔｒｉｏｓｅ、イーストエキス、（ＮＨ₄ ）₂ ＨＰＯ₄ 、Ｍ
ｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ、クエン酸、Ｋ₂ ＳＯ₄ 、ＣａＣｌ₂ ・Ｈ₂ Ｏ、及び微量金
属溶液から構成される培地を含む２リッターｌａｂ発酵槽中で、３４℃でpH７、
１０００〜１２００rpm で８日間、成長させた。リパーゼ活性を実施例４に記載
される通り測定した。

【０１３５】アスペルギルス・オリザエ変異体中のリパーゼコピー数を、製造元の説明に従
って、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＰｒｉｓｍＭｏｄｅｌ７７
００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒ（Applied Biosystems, Inc., Fost
er City, CA ）を用いてリアル・タイムＰＣＲ分析により決定した。リアル・タ
イムＰＣＲ反応は、両方のリパーゼ及び単一コピーコントロールｏｌｉＣについ
ての各々のゲノムＤＮＡ調製物で行った。変異体の胞子を５mLのＹＥＧ培地中で
、２４時間、３４℃で、小さなペトリプレートで増殖させた。次に、菌糸体をＷ
ｈａｔｍａｎフィルター紙Ｎｏ．１（Whatman, Springfield Mill, England）を
介してのろ過により各々の培養物から収集し、１．７mL遠心チューブに移した。
菌糸体の調製物を液体窒素中で凍結し、ＳｐｅｅｄＶａｃ（Savant Instrumen
ts, Inc., Farmingdalt. NY ）中で一晩、室温で乾燥させた。ゲノムＤＮＡを、
製造元の説明に従って、ＤＮｅａｓｙＫｉｔ（Qiagen, Chatsworth, CA）を用
いて得た。各々の株についての平均リパーゼコピー数を、ｏｌｉＣアンプリコン
量に対するリパーゼアンプリコン量の比をとることにより計算した。その分析の
ための標準曲線をアスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０からのゲノムＤＮＡ
を用いて作り出した。以下のプライマー及びプローブのセットをリガーゼ遺伝子
のリアルタイム増幅のために用いた：リガーゼ遺伝子プローブ：6FAM-5'-TGGCCAGTCCTATTCGTCGAGAGGTC-3'-TAMRA リガーゼ遺伝子正プライマー（lipo 9F)：5'-CTCCCTTGTGCTGTTCTTTGTCT-3' リガーゼ遺伝子逆プライマー（lipo111R)：5'-CTGTGCAAAGAGATTGAACTGGTTA-3' 以下のプライマー及びプローブのセットをｏｌｉＣのリアルタイム増幅のため
に用いた：ｏｌｉＣプローブ：6FAM-5'-TGGGTATGGGTTCCGCCGCC-3'-TAMRA ｏｌｉＣ正プライマー（oliC4F)：5'-GATGGTCCAGGTCTCCCAGAA-3' ｏｌｉＣ逆プライマー（oliC122R)：5'-CAGGGTTGCGGGAGACA-3' ６ＦＡＭはプローブの５’端に共有結合した蛍光リポーター６−カルボキシフ
ルオレセインについての略語であり、ＴＡＭＲＡは、プローブの３’端にリンカ
ーアームを介して結合したクエンチャーである６−カルボキシテトラメチルロダ
ミンについての略語である。

【０１３６】標準曲線のために、アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０ゲノムＤＮＡを
１：１０，１：１００，１：１０００及び１：１００００に逐次的に希釈し、リ
アルタイムＰＣＲを両方のプライマー／プローブセットについて行った。他の株
の分析のために、ゲルＤＮＡを１：５０及び１：１００又は１：１００及び１：
２００のいずれかに希釈し、リアル・タイム増幅は両方のプライマー／プローブ
セットで行った。リアルタイム増幅反応は、製造元の説明に従ってＴａｑＭａ
ｎＰＣＲＲｅａｇｅｎｔＫｉｔｓ（Applied Biosystems, Inc., Foster C
ity, CA ）を用いてセット・アップした。その反応物は、１×ＴａｑＭａｎ
ＢｕｔｔｅｒＡ，３．５mMのＭｇＣｌ₂ ，２００μＭの各々のｄＡＴＰ，ｄＣ
ＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＵＴＰ，０．０２５Ｕ／mLのＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ
，０．０１Ｕ／mLのＡｍｐＥｒａｓｅ、及び１００mMのリパーゼ遺伝子又はｏｌ
ｉＣプローブのいずれかを含んだ。リパーゼプライマーを、各々０．９μＭの最
終濃度で加えた。ｏｌｉＣプライマーを０．３μＭの最終濃度で加えた。その反
応を、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＰｒｉｓｍＭｏｄｅｌ７７
００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒで以下のサイクルの条件を用いて行
った：５０℃で２分の１サイクル；９５℃で１０分の１サイクル；並びに各々９
５℃で１５秒及び６０℃で１分の４０サイクル。生のデータをＳｅｑｕｅｎｃｅ
ＤｅｔｅｃｔｏｒＶ１．６を用いて分析した。

【０１３７】得られた結果を以下の表Ｉに示す。ここで、対照としてのアスペルギルス・オ
リザエＨｏｗＢ４２７又はアスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０のリパーゼ
収率は、１．０に標準化し、アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０の平均リ
パーゼ遺伝子コピー数を１．０に標準化した。

【０１３８】

【表１】

【０１３９】表Ｉに示す通り、変異体は、振とうフラスコ中で増殖させた場合に、対照株ア
スペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０より約２〜６倍多くのリパーゼを作り出
した。発酵槽中でテストした変異体は、発酵槽中で増殖させた場合に、対照株ア
スペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４２７より約２〜５倍多いリパーゼを生産した
。

【０１４０】実施例６：ｐＭＴ１９３６の作製ｐＭＴ１９３６を、製造元の説明に従ってＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓＭｏｄｅｌ３９４ＤＮＡ／ＲＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで合成し
た以下のプライマーを用いて、ＷＯ９８／１１２０３に記載されるアスペルギル
ス・オリザエＡ１５６０のｐａｌＢ遺伝子の破壊カセットを含むように作製した
。

【０１４１】 100752：5'-GGTTGCATGCTCTAGACTTCGTCACCTTATTAGCCC-3' 100753：5'-TTCGCGCGCATCAGTCTCGAGATCGTGTGTCGCGAGTACG-3' 100754：5'-GATCTCGAGACTAGTGCGCGCGAACAGACATCACAGGAACC-3' 100755：5'-CAACATATGCGGCCGCGAATTCACTTCATTCCCACTGCGTGG-3' アスペルギルス・オリザエｐａｌＢ５’隣接配列及びｐａｌＢ産物のＮ末端部
分をコードする配列を、実施例１に記載の方法に従って得たアスペルギルス・オ
リザエＡ１５６０のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。約０．０５μｇのＤＮＡ
テンプレート及び５ｐモルの各々の２つのプライマー１００７５５及び１０７５
４を用いた。増幅を、製造元（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN ）に記
載される通りポリメラーゼＰｗｏで行った。増幅は、４０サイクルを介して行っ
た。反応産物の部分をフェノール抽出し、エタノール沈殿させ、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ及びＸｈｏＩで消化し、そして約１．０５kbのフラグメントをアガロースゲ
ル電気泳動により単離した。

【０１４２】アスペルギルス・オリザエｐａｌＢ３’隣接配列及びｐａｌＢ遺伝子産物のＣ
末端部分をコードする配列を、増幅のためにプライマー１００７５３及び１００
７５２を用い、電気泳動前にそのＰＣＲ産物を制限酵素ＸｈｏＩ及びＸｂａＩで
消化して約１．５０kbのフラグメントを回収したことを除いて上述と同様に得た
。

【０１４３】上述の２つの消化し、精製したＰＣＲフラグメントを、ベクターｐＪａＬ４０
０（図９）からの精製した２．７kb ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントと、３
部連結において連結させてｐＭＴ１９３５（図１０）を作り出した。ｐＭＴ１９
３５のｐａｌＢ５’及び３’隣接部を、ＰＣＲプライマー１００７５４及び１０
０７５３を介して導入したＢｓｓＨII，ＳｐｅＩ、及びＸｈｏＩ部位により分離
する。

【０１４４】ｐＭＴ１９３５のｐａｌＢ５’隣接部及び３’隣接部の間にアスペルギルス・
オリザエｐｙｒＧ遺伝子を挿入するために、反復隣接ｐｙｒＧ遺伝子を含むｐＪ
ａＬ３９４（図１１）の３．５kb ＨｉｎｄIII フラグメントをＨｉｎｄIII で
切断し、脱リン酸化し、そして精製したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫにクロ
ーン化した。いずれかの方位の挿入物を伴うプラスミドを得た。ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔポリリンカーのＳｐｅＩ部位がｐｙｒＧの下流にあり、ＸｈｏＩ部位がｐｙｒＧ遺伝子の上流にある１つのプラスミドｐＭＴ１９３１（図１２）を選択
した。ｐｙｒＧ遺伝子は、３．５kb ＳｐｅＩ−ＸｈｏＩフラグメントとして単
離し、ＳｐｅＩ及びＸｈｏＩで消化し精製したｐＭＴ１９３５に挿入して破壊プ
ラスミドｐＭＴ１９３６（図１３）を形成した。

【０１４５】ｐｙｒＧ選択ｐａｌＢ破壊カセットは、ｐＭＴ１９３６から、５．５kb Ａｓ
ｅＩ−ＰｖｕＩフラグメント（実際のｐａｌＢ５’及び３’隣接配列内のＡｓｅ
Ｉ及びＰｖｕＩ切断）として単離することができる。実施例７：ｐＭＴ１９３６からのＡｓｅＩ／ＰｖｕＩｐａｌＢ破壊カセット
でのアスペルギルス・オリザエ形質転換及びリパーゼスクリーニングアスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０を、ｐＭＴ１９３６から得た５．５
kb ＡｓｅＩ／ＰｖｕＩフラグメントで、実施例３に記載されるのと同じ形質転
換手順を用いて形質転換した。形質転換のための直鎖フラグメントを、ＡｓｅＩ
／ＰｖｕＩでのｐＭＴ１９３６の消化及び製造元の説明に従うＱＩＡｑｕｉｃｋ
ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いる１％アガロースゲルでのフラ
グメントの分離により単離した。次にその形質転換体を、pH６．５又はpH８．０
での最小培地プレートでの増殖についてテストした。平均リパーゼ遺伝子コピー
数を実施例５に記載される通り決定した。

【０１４６】結果は、テストした１２８の形質転換体のうちの１３が、pH８．０で増殖でき
ないことにより示して、ｐａｌＢマイナス表現型を有した。１３のｐａｌＢマイ
ナス株及びpH８．０で増殖することができる１３の形質転換体を胞子精製し、次
に各々実施例４及び５に記載される方法を用いてリパーゼ生産について振とうフ
ラスコ培養において評価した。平均リパーゼコピー数を、実施例５に記載される
通り決定した。

【０１４７】結果を以下の表２に示す。ここで、アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０
のリパーゼ収率及び平均リパーゼ遺伝子コピー数を１．０に標準化した。アスペ
ルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０より多くのリパーゼを生産しない５のｐａｌ
Ｂマイナス株は、全て、５０％又はそれ超のリパーゼ発現カセットのコピーを失
っていた。

【０１４８】

【表２】

【０１４９】実施例８：ＮｄｅＩ直鎖化ｐＤＳＹ１３８でのアスペルギルス・オリザエ形質
転換及びリパーゼ発現スクリーニングアスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０を、アスペルギルス・オリザエＤＥ
ＢＹ９３２（ＷＯ９８／１１２０３）から単離したＮｄｅＩ消化ｐＤＳＹ１３８
で形質転換し、その形質転換体を実施例３に記載される方法を用いて回収した。
全体として、１８０の回収した形質転換体を１／１００強度ＭＹ２５中２４ウェ
ルマイクロタイタープレート中で増殖させ、サンプルを実施例４に記載されるよ
うにリパーゼアッセイのために４及び６日目に採取した。上から１１の最も高い
リパーゼ生産形質転換体及び１の平均リパーゼ生産形質転換体を胞子精製し、２
４ウェルマイクロタイター培養物中で再びテストした。これらの精製した形質転
換体を、実施例５に記載されるように、全長ＭＹ２５中で振とうフラスコ中でも
評価した。上から２つの生産体は、実施例５に記載されるように、２リッター発
酵槽でも増殖させた。リパーゼ活性を実施例４に記載される通り決定した。

【０１５０】以下の表３に結果を示す。ここで、アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０
のリパーゼ収率及び平均リパーゼ遺伝子コピー数を１．０に標準化した。上から
２つのリパーゼ生産体は、アスペルギルス・オリザエＤＥＢＹ９３２と本質的に
同量のリパーゼ活性を生産したが、リパーゼ遺伝子のコピー数も増加させた。

【０１５１】

【表３】

【０１５２】実施例９：アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３２の作製アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３２を、ＮＡ２−ｔｐｉプロモーター、
ヒュミコラ・ラヌギノサからのセルラーゼ遺伝子（ＣＡＲＥＺＹＭＥ^TM遺伝子、
ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋＡ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、
及びプラスミドｐＧＡＧ３（図１４）から得られたＡＭＧターミネーターを含む
直鎖フラグメントのアスペルギルス・オリザエＪａＬ２５０の形質転換により作
り出した。

【０１５３】アスペルギルス・オリザエＪａＬ２５０を、中性プロテアーゼ遺伝子（ｎｐＩ
）を削除することによりアスペルギルス・オリザエＪａＬ１４２（Christensen
ら、1988, Bio/Technology 6 : 1419-1422）から作り出した。ｎｐＩ欠失でプラ
スミドを、ｎｐＩ遺伝子をコードする５．５kb ＳａｃＩゲノムフラグメントを
含むプラスミドｐＪａＬ３８９（図１５）中のｎｐＩ遺伝子の中央部分をコード
する１．１kb ＢａｌＩフラグメントを、反復配列に隣接したｐｙｒＧ遺伝子を
含むｐＪａＬ３３５（図１６）からの３．５kb ＨｉｎｄIII フラグメントと交
換することにより作製し、それによりプラスミドｐＪａＬ３９９（図１７）を形
成した。アスペルギルス・オリザエＪａＬ１４２を７．９kb ＳａｃＩフラグメ
ントで形質転換した。形質転換体を、最小培地プレートでのウリジン要求の除去
によって選択した。その形質転換体を、実施例７に記載されるようにサザン分析
により、及び標準的方法に従ってＩＥＦプロテアーゼプロフィール分析により分
析した。

【０１５４】３５の形質転換体のうちの２つは、親株と比較して変化したサザンプロフィー
ルを有し、ＩＥＦにより中性プロテアーゼＩ活性を示した。更に、サザン分析は
、２つの形質転換体のうちの一方がｎｐＩ遺伝子の新しい欠失を有し、アスペル
ギルス・オリザエＪａＬ２２８と名づけた。アスペルギルス・オリザエＪａＬ２２８の全部で２．３×１０⁷ の分生子を、
０．１％５−フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）及び１０mMのウリジンを補給した最
小培地プレート上に広げた。８つのＦＯＡ耐性コロニーを得た。４０１bpのｐｙ
ｒＧ反復領域でプロービングした８のコロニーからのＢａｍＨＩで消化したゲノ
ムＤＮＡのサザンブロットは、ｐｙｒＧ遺伝子が、その反復領域での組換えによ
り切り出されていることを証明した。アスペルギルス・オリザエＪａＬ２２８は
、その反復領域の２つのコピーから得た２．７及び３．１kbの予想サイズの２つ
のバンドを示した。ｐｙｒＧ遺伝子が反復領域間の組換えにより失われているな
ら、３．１kbバンドは消失し、２．７kbのみが残るであろう。全部で８のＦＯＡ
耐性コロニーが、このバンドのパターンを示した。８のコロニーの中に残ったｎ
ｐＩ遺伝子及び４０１bp反復のコピーの間の連結部分をおおうＰＣＲフラグメン
トの配列決定は、ｐｙｒＧ遺伝子が反復配列間での組換えにより切り出されたこ
とを確認した。コロニーのうちの１つをアスペルギルス・オリザエＪａＬ２５０
と名づけた。

【０１５５】ｐＤＭ１７６（図１８）から、ヒュミコラ・ラヌギノサセルラーゼ遺伝子を含
むＳｗａＩ／ＰａｃＩフラグメントを単離し、そのフラグメントをＳｗａＩ／Ｐ
ａｃＩで消化したｐＢＡＮｅ６に連結することによりｐＧＡＧ３を作製した。ｐ
ＤＭ１７６からのＳｗａＩ／ＰａｃＩフラグメント及びＳｗａＩ／ＰａｃＩで消
化したｐＢＡＮｅ６を、１％アガロースゲルで分離し、連結前に製造元の説明に
従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Qiagen I
nc., Chatsworth, CA ）を用いて単離した。連結を用いて大腸菌ＤＨ５α細胞を
形質転換し、次にその形質転換体を、製造元の説明に従ってＱＩＡｗｅｌｌ−８
ＰｌａｓｍｉｄＫｉｔを用いて形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、
正確なサイズのフラグメントの存在を確認するためにプラスミドＤＮＡを制限消
化し、そして実施例１に記載の方法に従ってそのＤＮＡ配列決定することにより
スクリーニングした。

【０１５６】次に、ｐＧＡＧ３をＰｍｅＩで消化し、その直鎖発現カセットをＴＡＥ緩衝液
を用いて調製用アガロースゲル電気泳動により単離した。次にその直鎖カセット
を用いてアスペルギルス・オリザエＪａＬ２５０を形質転換した。ａｍｄＳ選択のためのアスペルギルス・オリザエＪａＬ２５０の形質転換を、
実施例１に記載される通り調製したmL当り２×１０⁷ のプロトプラストの濃度で
プロトプラストで行った。１０μｇの上述の直鎖フラグメントを１００μＬのプ
ロトプラストに加えた。次に２５０μＬの容量のＰＥＧ（６０％ＰＥＧ４００
０−１０mM ＣａＣｌ₂ −１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．０）を加え、その
混合物を３０分、３７℃で放置した。３mLのＳＴＣ培地を加え、その混合物を、ａｍｄＳ選択のために１０mMのウリジンを補給したＣｏｖｏプレートにプレート
した。そのプレートを７〜１０日、３４℃でインキュベートした。次に、形質転
換体を同じ培地のプレートに移し、３７℃で３〜５日、インキュベートした。そ
の形質転換体を、胞子をストリーキングし、スクロースなしの同じ培地のプレー
トを用いて単離されたコロニーを採取することにより精製した。

【０１５７】実施例１０：ＮｄｅＩ直鎖化ｐＤＳＹ１３８でのアスペルギルス・オリザエ形
質転換及びセルラーゼ発現スクリーニングアスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３２を、実施例３に記載の方法を用いて
、ＮｄｅＩで消化したｐＤＳＹ１３８（ＷＯ９８／１１２０３）で形質転換した
。サンプルを３日目及び５日目に採取したことを除いて実施例４に記載される通
り、１／４強度ＭＹ２５中の２４ウェルマイクロタイタープレート中で生長した
全体として２４０の形質転換体を回収し、以下に記載の通りセルラーゼ活性につ
いてアッセイした。

【０１５８】セルラーゼ活性を、以下のプロトコルに従って測定した。２％アゾーカルボキ
シメチルセルロースを含む基質溶液を、その材料を１００mM ＭＯＰＳ pH７．
０緩衝液に８０℃で１０分、溶かすことにより調製した。ＣＡＲＥＺＹＭＥ^TM（
ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋＡ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を
標準として用いた。mL当り２．５〜２５ECU のストック溶液を、１００mM ＭＯ
ＰＳ pH７．０緩衝液中にそれに応じてＣＡＲＥＺＹＭＥ^TMを希釈することによ
り標準曲線を作製するために調製した。標準及びサンプルの５μＬアリコート（
振とうフラスコ及び発酵のために希釈）を９６ウェルプレートの個々のウェルに
ピペットで取った。６５μＬの容量の２％アゾーカルボキシメチルセルロース溶
液を各々のウェルにピペットでとり、混合した。その反応物を、３０分、４５℃
でインキュベートし、次に、２１５μＬの停止溶液を加えることにより停止させ
、次に混合した。その停止試薬は、最初に０．２ｇのＺｎＣｌ₂ を２０mLの２５
０mM ＭＯＰＳ pH７．０に懸濁し、そしてその懸濁液をエタノール１リッター
当り１．１mLの濃ＨＣｌを含む酸性化エタノール８０mLに加えることにより調製
した。その停止した反応物を含むプレートを次に、１０分、３０００rpm で遠心
した。各々の上清の１００μＬアリコートを９６ウェルプレートにピペットで採
取し、６００nmの吸光度を測定した。線形回帰を用いて、傾き、切片及び補正係
数を標準及びサンプルについて決定した。

【０１５９】上から２０のセルロース生産形質転換体を胞子精製し、２４ウェルのマイクロ
タイター培養で再びテストした。上から８のセルラーゼを生産する１回精製され
た形質転換体を２回目の胞子精製を行い、実施例５に記載されるように全長ＭＹ
２５中で振とうフラスコ中でテストした。上から２の生産体は、実施例５に記載
されるのと同じ培地及び条件を用いて２リッターｌａｂ発酵槽でも増殖させた。
セルラーゼ活性を上述の通り測定した。セルラーゼコピー数を、以下のプライマ
ー及び標準のためのアスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３２ゲノムＤＮＡを用
いて実施例５に記載されるのと同じ手順を用いて測定した。各々の株についての
セルラーゼ遺伝子コピー数を、ｏｌｉＣアンプリコン量に対するセルラーゼアン
プリコン量の比をとることにより計算した。

【０１６０】セルラーゼ遺伝子プローブ：6FAM-CAGCCTGTCTTTTCCTGCAACGCC-TAMRA セルラーゼ遺伝子正プライマー（CARE119F）：CCAAGAAGGCTCCCGTGAA セルラーゼ遺伝子逆プライマー（CARE186R）：GAAGTCCGTGATACGCTGGAA アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３４のセルラーゼ収率及び平均セルラー
ゼ遺伝子コピー数を１．０に標準化した以下の表４に示す得られた結果は、アル
ペルギルス・オリザエＣ１３８Ｔ２０５．１．１が、発酵におけるセルラーゼ収
率の５０％増加を伴い補正したアスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３２より５
０％多いセルラーゼ遺伝子のコピーを有した。

【０１６１】

【表４】

【０１６２】実施例１１：グルコーストランスポーター遺伝子過剰発現プラスミドｐＨＢ２
１８及びｐＤＳＹ１５３並びに終止コントロールプラスミドｐＤＳＹ１５２及び
ｐＤＳＹ１５５の作製アスペルギルス・オリザエＤＥＢＹ５９９．３（ＷＯ９８／１１２０３）から
のグルコーストランスポーター遺伝子を過剰発現するためのプラスミドを、グル
コーストランスポーターの過剰発現がヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼ及びセル
ラーゼの収率の増加を導くであろうか否かを決定するために作製した。グルコー
ストランスポーターオープンリーディングフレームをＰＣＲ増幅して、ＯＲＦの
５’及び３’端を各々ＳｗａＩ及びＰａｃＩ部位で置きかえた。製造元の説明に
従ってＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏｄｅｌ３９４ＤＮＡ／
ＲＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで合成した以下のプライマーを、増幅において
０．２mgのｐＤＳＹ１１２（ＷＯ９８／１１２０３）と組み合わせて用いた。

【０１６３】 961176：5'-ATTTAAATGGTCCTCGGTGGATCAAGC-3' 961177：5'-TTAATTAATTAGTCCTGTCTGCGCTGGT-3' 増幅のために用いた条件及びパラメータを実施例１に記載する。１０mlのＰＣ
Ｒ反応物をアガロースゲル電気泳動し、１．５kb産物を予想される通り得た。そ
のＰＣＲ産物をｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ^TM Ｋｉｔ（Stratagene, La Jolla, CA
）を用いて、製造元のプロトコルに従ってクローン化した。その連結反応物を用
いて大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換し、プラスミドＤＮＡをＱＩＡＷｅｌｌ−８
ＰｌａｓｍｉｄＫｉｔを用いていくつかの形質転換体から単離した。そのプ
ラスミドをクローンが１．５kb挿入物を有することを決定するためにＮｏｔＩ及
びＥｃｏＲＩで消化した。分析した１１のクローンのうちの６つがアガロースゲ
ルでの電気泳動により測定して正確な挿入物を有した。クローンの１つ、ｐＤＳ
Ｙ１１９をＰａｃＩ及びＳｗａＩで消化し、その消化物をアガロースゲルに流し
た。その１．５kb ＳｗａＩ／ＰａｃＩバンドをゲルから切り出し、ＤＮＡをそ
のゲルスライスから、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｒｔｒａｃｔｉｏｎＫｉ
ｔを用いて精製した。その１．５kbフラグメントを、標準条件（Sambrookら、19
89、前掲）を用いてＳｗａＩ／ＰａｃＩ切断ｐＢＡＮｅ１３（図１３）に連結し
た。その連結物を用いて大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換し、プラスミドＤＮＡを
いくつかの形質転換体から単離した。そのプラスミドをＳｗａＩ／ＰａｃＩで消
化し、クローンが予想される１．５kb挿入物を有することを決定した。最終的な
プラスミドをｐＨＢ２１８（図１９）と名づけた。

【０１６４】選択マーカーがｂａｒ遺伝子であるｐＨＢ２１８の型を、ｐｙｒＧプラスであ
る株の形質転換のために作製した。ｐＨＢ２１８からのＳｗａＩ／ＰａｃＩ挿入
物を制限消化により単離し、アガロースゲルで電気泳動し、そしてＱＩＡｑｕｉ
ｃｋＧｅｌＥｒｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて精製した。その挿入物を
ｐＳＥ３９（図２０）に連結し、ＳｗａＩ／ＰａｃＩで消化した。その連結反応
物を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、プラスミドＤＮＡを上述のようにコロ
ニーから単離した。そのプラスミドをＳｗａＩ／ＰａｃＩで消化して、コロニー
が予想される１．５kb挿入物を含むことを決定した。そのプラスミドを実施例１
に記載される通り配列決定してｐＤＳＹ１５３（図２１）のアミノ酸９での終止
コドンの欠如を確認した。

【０１６５】実施例１２：ｐＨＢ２１８でのアスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０の形
質転換及びリパーゼスクリーニングアスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０をｐＨＢ２１８で形質転換し、その
形質転換体を実施例３に記載の方法を用いて回収した。１２０のｐＨＢ２１８で
の形質転換体を回収し、実施例５に記載される通りＭＹ２５培地中で振とうフラ
スコ中で増殖させ、そして実施例４に記載されるとおり、２及び３日後にリパー
ゼ活性についてアッセイした。そのリパーゼ遺伝子コピー数を実施例５に記載さ
れる通り測定した。

【０１６６】結果を表５に示す。ここでは、アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０のリ
パーゼ収率及び平均リパーゼ遺伝子コピー数を１．０に標準化した。表５に見ら
れるように、リパーゼ遺伝子コピー数が増加した形質転換体は、振とうフラスコ
中でより高い収率でリパーゼを生産し、リパーゼ遺伝子のコピーを失ったアスペ
ルギルス・オリザエ２１８＋９５はより少いリパーゼしか作り出さなかった。

【０１６７】

【表５】

【０１６８】実施例１３：ｐＤＳＹ１５３でのアスペルギルス・オリザエＤＥＢＹ１０．３
の形質転換及びリパーゼスクリーニングアスペルギルス・オリザエＤＥＢＹ１０．３をｐＤＳＹ１５３で形質転換し、
その形質転換体を、実施例３に記載の方法を用いて回収した。２１６のｐＤＳＹ
１５３での形質転換体を回収し、実施例５に記載される通りＭＹ２５培地中の振
とうフラスコ中で増殖させ、そして実施例４に記載の通り２日及び３日目にリパ
ーゼ活性についてアッセイした。リパーゼコピー数は実施例５に記載の通り決定
した。

【０１６９】アスペルギルス・オリザエＤＥＢＹ１０．３のリパーゼ収率及び平均リパーゼ
遺伝子コピー数を１．０に標準化した表６に示す結果は、コピー数が増加した形
質転換体が振とうフラスコにおけるリパーゼ収率の増加も示したのに対し、リパ
ーゼコピー数が減少した形質転換体がリパーゼ収率の減少を示したことを証明し
た。

【０１７０】

【表６】

【０１７１】実施例１４：ｐＬＲＦ２の作製ｐＭＴ１６１２（ＢＡＳＴＡ耐性）の誘導体であるｐＬＲＦ２を、ｐａｌＢプ
ロモーター、オープン・リーディング・フレーム及びターミネーターを含むよう
作製した。ｐａｌＢ遺伝子のゲノムフラグメントを以下のオリゴヌクレオチドを用いてア
スペルギルス・オリザエゲノムＤＮＡから増幅した。

【０１７２】 5'-CATATGCACAATACTCACACCAGTAGGCGACCAC-3' 5'-CATATGCTGGTTGTGATCACAGCGACTGGGATGG-3' その産物をテンプレートとしてアスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０ゲノ
ムＤＮＡ及びＣｌｏｎｔｅｃｈＡｄｖａｎｔａｇｅＧｅｎｏｍｉｃＰＣＲ
Ｋｉｔ（Clontech, Polo Alto, CA ）を用いて製造元の証明に従って増幅した
。その反応条件は９４℃で１分；各々９４℃で３０分及び６８℃で６分の３５サ
イクル；並びに６８℃で６分の１サイクルであった。約４．７kbの予想産物を得
て、製造元の証明に従ってＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて１０分、７２
℃でＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いてその産物に３’Ａ’ｓを加えた。

【０１７３】その産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴｏｐｏＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ
を用いてｐＣＲ２．１にサブクローニングし、挿入物について大腸菌形質転換体
をスクリーニングした。サブクローンｐＬＲＦ１の３つからのｐａｌＢフラグメ
ントのヌクレオチド配列をプライマー歩行により決定した。全部で３つのサブク
ローンは３塩基対の変換：位置１９１０でのＴからＣ（よろめく（ｗｏｂｂｌｅ
）位置なのでサイレントであろう）、終止コドンから約１１０bpのターミネータ
ー内のＡからＧ、及びアミノ酸残基を変化させるであろう位置３８８５でのＡか
らＴを有した。位置３８８５をＡからＴに補正するために、以下のオリゴヌクレ
オチドは、５’から３’に、製造元の説明に従ってＭｏｒｐｈＳｉｔｅＤｉ
ｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（Five Prime-Three Prime, In
c., Boulder, CO ）を用いて部位特異的変異誘発のために用いた。

【０１７４】 5'-CCTGGCGACTTCGGAAGATGGAACTCACAG-3' 部位特異的変異誘発のためのテンプレートはｐＬＲＦ２であった。ｐＬＲＦ２
は、ｐＬＲＦ１をＮｄｅＩで消化し、４．６kb ｐａｌＢフラグメントを単離し
、そしてそれを、ＮｄｅＩで消化しシュリンプアルカリホスファターゼを用いて
リン酸化したｐＭＴ１６１２（ＷＯ９８／１１２０３）にサブクローニングする
ことにより作製した。変異誘発の後、いくつかの大腸菌クローンのヌクレオチド
配列を決定して、位置３３８５のＴがＡに変化しているクローンを同定した。更
に、要求されるＴからＡへの変化を含むｐＬＲＦ２の部位特異的変異誘発クロー
ンのうちの１つのｐａｌＢフラグメントのヌクレオチド配列を、もはや変換が導
入されていないことを確実にするためにプライマー歩行により決定した。

【０１７５】実施例１５：ｐａｌＢマイナス表現型の相補性及びリパーゼ生産のための形質
転換体のスクリーニングリパーゼ生産を増加させるためのｐａｌＢマイナス表現型のつながりと、アス
ペルギルス・オリザエ株ＤＥＢＹ１０．３中の野生型ｐａｌＢ遺伝子及び各々実
施例５及び７に記載のアスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０ｐａｌＢ破壊
化形質転換体の１つとのｐａｌＢマイナス表現型の相補性により証明した。この
相補性はリパーゼ生産の減少を導くであろう。

【０１７６】アスペルギルス・オリザエＤＥＢＹ１０．３又はｐａｌＢ破壊化アスペルギル
ス・オリザエＨｏｗＢ４３０株、アスペルギルス・オリザエｐａｌＢ７６−１−
１を、実施例３に記載のプロトコルに従って、ＢＡＳＴＡに対する耐性について
選択するｐＬＲＦ２で形質転換した。その株をちょうどｐＭＴ１６１２でも形質
転換してコントロールとしてＢＡＳＴＡ耐性にした。アスペルギルス・オリザエ
ＤＥＢＹ１０．３において、ｐＬＲＦ２及びｐＭＴ１６１２で各々２６及び１１
の形質転換体を得た。アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０ｐａｌＢ７６
−１−１において、ｐＬＲＦ２及びｐＭＴ１６１２について各々２８及び１４の
形質転換体を得た。

【０１７７】全ての形質転換体を胞子精製し、最小培地pH６．５及びpH８．０プレート上でｐａｌＢ表現型についてテストした。アスペルギルス・オリザエＤＥＢＹ１０．
３及びアスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０ｐａｌＢ７６−１−１につい
ての結果を各々以下の表７及び８に示す。全てのｐＬＲＦ２アスペルギルス・オ
リザエＤＥＢＹ１０．３形質転換体はｐａｌＢマイナスであり、全てのｐＭＴ１
６１２アスペルギルス・オリザエＤＥＢＹ１０．３形質転換体はｐａｌＢマイナ
スであった。アスペルギルス・オリザエＨｏｗＢ４３０ｐａｌＢ７６−１−１
集団において、２８のｐＬＲＦ２形質転換体のうち２７はｐａｌＢプラスミドで
あり、１４のｐＭＴ１６１２形質転換体のうち１３がｐａｌＢマイナスであった
。

【０１７８】形質転換体のリパーゼ生産能力を、実施例４に記載されるように、各々の形質
転換体を、１／１００強度ＭＹ２５ pH６．５培地を含む２４ウェルマイクロタ
イタープレートに接種することにより決定した。各々の形質転換体を各々３つの
ウェルに接種し、そのプレートを１５０rpm で振とうしながら３４℃でインキュ
ベートした。３及び５日目に上清サンプルを採取し、実施例４に記載の通りアッ
セイした。平均リパーゼ遺伝子コピーを実施例５に記載される通り決定した。

【０１７９】結果をアスペルギルス・オリザエＤＥＢＹ１０．３及びアスペルギルス・オリ
ザエＨｏｗＢ４３０ｐａｌＢ７６−１について各々表７及び８に示す。結果は
、これらの株について１．０に標準化する。

【０１８０】

【表７】

【０１８１】

【表８】

【０１８２】リパーゼ遺伝子のコピーを失った又は得たいくつかの株が存在した。コピー数
変化の頻度は４５〜６６％の範囲で全部で４つの集団内で極めて高かった。コピ
ー数の損失又は獲得は、各々リパーゼ発現の減少又は増加に十分に相関した。本明細書に記載され、クレームされる本発明は、本明細書に開示される特定の
実施形態により範囲が限定されるべきでない。なぜならこれらの実施形態は本発
明のいくつかの態様を実例で示すことを意図したものだからである。いずれの等
価な実施形態も本発明の範囲内にあることを意図する。実際、本明細書に示され
、記載されるものに加えて、本発明の種々の改良が先の記載から当業者に明らか
になるであろう。このような改良も添付の請求の範囲内にあることを意図する。

【０１８３】本明細書に言及される全ての出版物は、その出版物が言及される特定の情報を
記載し及び開示する目的のため引用により本明細書に組み込まれる。上述の出版
物は本願の出願日前のそれらの開示についてのみ供される。本発明者らは、先行
技術の発明に関してこのような開示より先んずる権原はないとの認可と解釈され
るべきものはない。

【０１８４】本発明は、種々であり得る開示される特定の方法及び組成物に限定されないこ
とが理解されるはずである。本明細書に用いる用語は、特定の実施形態を記述す
る目的のためだけであり、限定を意図したものではない。なぜなら、本発明の範
囲は、添付の請求の範囲によってのみ限定されるべきだからである。特に示さなければ、本明細書に用いる全ての技術及び科学用語は、本発明の属
する当業者により共通して理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載さ
れるものと同様の又は等価のいずれの材料又は方法も本発明の実施又はテストに
用いることができるが、好ましい方法及び材料が記載される。

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＪａＬ２９２の制限地図である。

【図２】ｐＫＳ６の制限地図である。

【図３】ｐＢＡＮｅ１３の制限地図である。

【図４】ｐＢＡＮｅ６の制限地図である。

【図５】ｐＭＨａｎ３７の制限地図である。

【図６】ｐＢＡＮｅ８の制限地図である。

【図７】ｐＳＯ２の制限地図である。

【図８】ｐＳＯ１２２の制限地図であり、ｐＳＯ１２２からのｐＤＳＹ８１及びｐＤＳ
Ｙ８２の作製を示す。

【図９】ｐＪａＬ４００の制限地図である。

【図１０】ｐＭＴ１９３５の制限地図である。

【図１１】ｐＪａＬ３９４の制限地図である。

【図１２】ｐＭＴ１９３１の制限地図である。

【図１３】ｐＭＴ１９３６の制限地図である。

【図１４】ｐＧＡＧ１３の制限地図である。

【図１５】ｐＪａＬ３８９の制限地図である。

【図１６】ｐＪａＬ３３５の制限地図である。

【図１７】ｐＪａＬ３９９の制限地図である。

【図１８】ｐＤＭ１７６の制限地図である。

【図１９】ｐＨＢ２１８の制限地図である。

【図２０】ｐＳＥ３９の制限地図である。

【図２１】ｐＤＳＹ１５３の制限地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡＦターム(参考） 4B024 AA20 BA11 BA12 CA04 DA02 DA07 DA08 DA09 DA11 DA12 EA04 FA02 GA11 HA12 4B064 AG01 CA05 CA19 CC24 4B065 AA26X AA63X AB01 AC14 BA02 CA29 CA31

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリペプチドを生産するための方法であって、（ａ）変異体細胞を前記ポリペプチドの生産のために資する条件下で培養し、
ここで、（ｉ）前記変異体細胞は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列の少くとも
２の縦列コピーを含む親細胞に、前記親細胞のゲノムへの、前記核酸配列のコピ
ー内以外の座での核酸構成物の導入により前記変異体細胞を作り出すことで親細
胞に関係し、ここで前記核酸構成物の前記座への導入が前記核酸配列のコピー数
を変化させ、該コピー数の変化が選択圧の結果でなく；及び（ii）前記変異体細胞が、両方の細胞を前記ポリペプチドの生産のために資す
る同じ条件下で培養した時に前記親細胞より多い又は少い前記ポリペプチドを生
産し；そして（ｂ）その培養培地から前記ポリペプチドを回収することを含む方法。
【請求項２】前記核酸構成物の前記座への導入が、前記核酸配列のコピー
数を増加させ、前記変異体細胞が、両方の細胞を前記ポリペプチドの生産のため
に資する同じ条件下で培養した時に前記親細胞より多くの前記ポリペプチドを生
産することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記核酸構成物の前記座への導入が、前記核酸配列のコピー
数を減少させ、前記変異体細胞が、両方の細胞を前記ポリペプチドの生産のため
に資する同じ条件下で培養した時に前記親細胞より少い前記ポリペプチドを生産
することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】ポリペプチドを生産するための方法であって、（ａ）変異体細胞を前記ポリペプチドの生産のために資する条件下で培養し、
ここで、（ｉ）前記変異体細胞は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列の少くとも
２の縦列コピーを含む親細胞に、前記親細胞のゲノムへの、前記核酸配列のコピ
ーのうちの１つ内の座での核酸構成物の導入により前記変異体細胞を作り出すこ
とで親細胞に関係し、ここで前記核酸構成物の前記座への導入が前記核酸配列の
コピー数を変化させ、該コピー数の変化が選択圧の結果でなく；及び（ii）前記変異体細胞が、両方の細胞を前記ポリペプチドの生産のために資す
る同じ条件下で培養した時に前記親細胞より多い又は少い前記ポリペプチドを生
産し；そして（ｂ）その培養培地から前記ポリペプチドを回収することを含む方法。
【請求項５】前記核酸構成物の前記座への導入が、前記核酸配列のコピー
数を増加させ、前記変異体細胞が、両方の細胞を前記ポリペプチドの生産のため
に資する同じ条件下で培養した時に前記親細胞より多くの前記ポリペプチドを生
産することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】前記核酸構成物の前記座への導入が、前記核酸配列のコピー
数を減少させ、前記変異体細胞が、両方の細胞を前記ポリペプチドの生産のため
に資する同じ条件下で培養した時に前記親細胞より少い前記ポリペプチドを生産
することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】ポリペプチドを生産するための方法であって、（ａ）変異体細胞を前記ポリペプチドの生産のために資する条件下で培養し、
ここで、（ｉ）前記変異体細胞は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列であって該
核酸配列の５’及び３’端に反復配列を含むものを含む親細胞に、前記親細胞の
ゲノムへの、前記核酸配列内以外の座での核酸構成物の導入により前記変異体細
胞を作り出すことで親細胞に関係し、ここで前記核酸構成物の前記座への導入が
前記核酸配列のコピー数を増加させ、該コピー数の変化が選択圧の結果でなく；
及び（ii）前記変異体細胞が、両方の細胞を前記ポリペプチドの生産のために資す
る同じ条件下で培養した時に前記親細胞より多い前記ポリペプチドを生産し；そ
して（ｂ）その培養培地から前記ポリペプチドを回収することを含む方法。
【請求項８】前記核酸構成物が、前記核酸配列と４０％未満の相同性を有
することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】前記座が、前記核酸配列と異なる染色体上に又は前記核酸配
列と同じ染色体上にあることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法
。
【請求項１０】前記核酸構成物がベクター内に含まれることを特徴とする
請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】前記核酸構成物が環状分子であることを特徴とする請求項
１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】前記核酸構成物が直鎖フラグメントであることを特徴とす
る請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】前記核酸構成物が選択マーカーを含むことを特徴とする請
求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】前記選択マーカーが、ｄａｌ，ａｍｐ，ｋａｎ，ｃａｍ，ｔｅｔ，ｄｆｈｒ，ｈｙｇＢ，ＡＤＥ２，ＨＩＳ３，ＬＥＵ２，ＬＹＳ２，ＭＥ
Ｔ３，ＴＲＰ１，ＵＲＡ３，ａｍｄＳ，ａｒｇＢ，ｂａｒ，ｈｙｇＢ，ｎｉａＤ
，ｐｙｒＧ，ｓＣ、又はｔｒｐＣであることを特徴とする請求項１３に記載の方
法。
【請求項１５】前記親細胞が、原核細胞又は真核細胞であることを特徴と
する請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】前記原核細胞が細菌細胞であることを特徴とする請求項１
５に記載の方法。
【請求項１７】前記細菌細胞が、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレ
プトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ）細胞からなる群から選択されることを特徴とする請求項１６に記
載の方法。
【請求項１８】前記真核細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする請求
項１５に記載の方法。
【請求項１９】前記真核細胞が真菌細胞であることを特徴とする請求項１
５に記載の方法。
【請求項２０】前記真菌細胞が糸状菌細胞であることを特徴とする請求項
１９に記載の方法。
【請求項２１】前記糸状菌細胞が、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕ
ｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉ
ｕｍ）、ヒュミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）、マイセリオ
フトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏ
ｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、シタリジウム（Ｓｃｙｔａ
ｌｉｄｉｕｍ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏ
ｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞
であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】前記真菌細胞がイースト細胞であることを特徴とする請求
項１９に記載の方法。
【請求項２３】前記イースト細胞が、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クル
イベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕ
ｌａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ）、スキゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）
、及びヤロビア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）からなる群から選択されることを特徴とす
る請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】前記ポリペプチドが組換えポリペプチドであることを特徴
とする請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】前記ポリペプチドが異種ポリペプチドであることを特徴と
する請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】前記ポリペプチドが、抗体もしくはその部分、抗原、凝因
因子、酵素、ホルモンもしくはその変異体、レセプターもしくはその部分、調節
タンパク質、構造タンパク質、リポーター又は輸送タンパク質であることを特徴
とする請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】前記酵素が、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ
、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、又はリガーゼであることを特徴とす
る請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】前記酵素が、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒ
ドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、ク
チナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、
β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシ
ダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ
、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェ
ノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、又はキシラナー
ゼであることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】前記核酸構成物が、ｐＤＳＹ８２，ｐＤＳＹ１１２，ｐＭ
Ｔ１６１２，ｐＭＴ１９３６，ｐＬＲＦ２，ｐＤＳＹ１５３、又はｐＨＢ２１８
であることを特徴とする請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】ポリペプチドを生産するための方法であって、（ａ）核酸構成物を、前記ポリペプチドをコードする核酸配列の少くとも２の
縦列コピーを含む親細胞のゲノムに、前記核酸配列のコピー内以外であるか又は
前記核酸配列のコピーのうちの１つ内である座で導入することにより変異体細胞
を形成し、ここで前記核酸構成物の前記座への組込みが、前記核酸配列のコピー
数を変化させ、該コピー数の変化が選択圧下でなく、及び前記変異体細胞が両方
の細胞を前記ポリペプチドの生産のために資する同じ条件下で培養した時に前記
親細胞より多い又は少い前記ポリペプチドを生産し；（ｂ）両方の細胞を前記ポリペプチドの生産のために資する同じ条件下で培養
した時に前記親細胞より多い又は少い前記ポリペプチドを生産する変異体細胞を
単離し；（ｃ）前記核酸構成物が組み込まれている座を同定し；（ｄ）対応する座が破壊されている細胞を生産し；（ｅ）該細胞を、前記ポリペプチドの生産のために資する条件下で培養し；そ
して（ｆ）その培養培地から前記ポリペプチドを回収することを含む方法。
【請求項３１】ポリペプチドを生産するための方法であって、（ａ）核酸構成物を、前記ポリペプチドをコードする核酸配列であって該核酸
配列の５’及び３’端に反復配列を含むものを含む親細胞のゲノムに、前記核酸
配列内以外である座で導入することにより変異体細胞を形成し、ここで前記核酸
構成物の前記座への組込みが、前記核酸配列のコピー数を増加させ、該コピー数
の変化が選択圧下でなく、及び前記変異体細胞が両方の細胞を前記ポリペプチド
の生産のために資する同じ条件下で培養した時に前記親細胞より多い前記ポリペ
プチドを生産し；（ｂ）両方の細胞を前記ポリペプチドの生産のために資する同じ条件下で培養
した時に前記親細胞より多い前記ポリペプチドを生産する変異体細胞を単離し；（ｃ）前記核酸構成物が組み込まれている座を同定し；（ｄ）対応する座が破壊されている細胞を生産し；（ｅ）該細胞を、前記ポリペプチドの生産のために資する条件下で培養し；そ
して（ｆ）その培養培地から前記ポリペプチドを回収することを含む方法。
【請求項３２】変異体細胞を得るための方法であって、（ａ）核酸構成物を、ポリペプチドをコードする核酸配列の少くとも２の縦列
コピーを含む親細胞に、前記核酸構成物が前記親細胞のゲノムに前記核酸配列の
コピー内以外の座で組み込まれる条件下で導入して、変異体細胞を生産し、ここ
で前記核酸構成物の前記座への組込みが前記核酸配列のコピー数を変化させ、該
コピー数の変化が選択圧下でなく、及び前記変異体細胞が両方の細胞を前記ポリ
ペプチドの生産のために資する同じ条件下で培養した時に前記親細胞より多い又
は少い前記ポリペプチドを生産し；そして（ｂ）両方の細胞を前記ポリペプチドの生産のために資する同じ条件下で培養
した時に前記親細胞より多い又は少い前記ポリペプチドを生産する変異体細胞を
同定することを含む方法。
【請求項３３】請求項３２に記載の方法により生産された変異体細胞。
【請求項３４】変異体細胞を得るための方法であって、（ａ）核酸構成物を、ポリペプチドをコードする核酸配列の少くとも２の縦列
コピーを含む親細胞に、前記核酸構成物が前記親細胞のゲノムに前記核酸配列の
コピーのうちの１つ内の座で組み込まれる条件下で導入して、変異体細胞を生産
し、ここで前記核酸構成物の前記座への組込みが前記核酸配列のコピー数を変化
させ、該コピー数の変化が選択圧下でなく、及び前記変異体細胞が両方の細胞を
前記ポリペプチドの生産のために資する同じ条件下で培養した時に前記親細胞よ
り多い又は少い前記ポリペプチドを生産し；そして（ｂ）両方の細胞を前記ポリペプチドの生産のために資する同じ条件下で培養
した時に前記親細胞より多い又は少い前記ポリペプチドを生産する変異体細胞を
同定することを含む方法。
【請求項３５】請求項３４に記載の方法により生産された変異体細胞。
【請求項３６】変異体細胞を得るための方法であって、（ａ）核酸構成物を、ポリペプチドをコードする核酸配列であって該核酸配列
の５’及び３’端に反復配列を含むものを含む親細胞に、前記核酸構成物が前記
親細胞のゲノムに前記核酸配列内以外の座で組み込まれる条件下で導入して、変
異体細胞を生産し、ここで前記核酸構成物の前記座への組込みが前記核酸配列の
コピー数を増加させ、該コピー数の増加が選択圧下でなく、及び前記変異体細胞
が両方の細胞を前記ポリペプチドの生産のために資する同じ条件下で培養した時
に前記親細胞より多い前記ポリペプチドを生産し；そして（ｂ）両方の細胞を前記ポリペプチドの生産のために資する同じ条件下で培養
した時に前記親細胞より多い前記ポリペプチドを生産する変異体細胞を同定する
ことを含む方法。
【請求項３７】請求項３６に記載の方法により得られた変異体細胞。