RU2514655C2 - Гены диацилглицерол-ацилтрансферазы и их использование - Google Patents
Гены диацилглицерол-ацилтрансферазы и их использование Download PDFInfo
- Publication number
- RU2514655C2 RU2514655C2 RU2012131283/10A RU2012131283A RU2514655C2 RU 2514655 C2 RU2514655 C2 RU 2514655C2 RU 2012131283/10 A RU2012131283/10 A RU 2012131283/10A RU 2012131283 A RU2012131283 A RU 2012131283A RU 2514655 C2 RU2514655 C2 RU 2514655C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- polynucleotide
- amino acid
- malro1
- transformant
- Prior art date
Links
- 108010001348 Diacylglycerol O-acyltransferase Proteins 0.000 title claims abstract description 39
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 claims abstract description 74
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims abstract description 57
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims abstract description 57
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims abstract description 57
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 57
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 57
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims abstract description 56
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 46
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 43
- 102000002148 Diacylglycerol O-acyltransferase Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 34
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims abstract description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 84
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 claims description 75
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 57
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 44
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 41
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 41
- 241000907999 Mortierella alpina Species 0.000 claims description 39
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 claims description 38
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 claims description 35
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 28
- HOBAELRKJCKHQD-UHFFFAOYSA-N (8Z,11Z,14Z)-8,11,14-eicosatrienoic acid Natural products CCCCCC=CCC=CCC=CCCCCCCC(O)=O HOBAELRKJCKHQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- HOBAELRKJCKHQD-QNEBEIHSSA-N dihomo-γ-linolenic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCC(O)=O HOBAELRKJCKHQD-QNEBEIHSSA-N 0.000 claims description 18
- 235000021298 Dihomo-γ-linolenic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N tristearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 83
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 53
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 39
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 37
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 36
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 31
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 30
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 24
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 16
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 15
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 14
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 13
- 101100351254 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) LRO1 gene Proteins 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 10
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 10
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 10
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101710133727 Phospholipid:diacylglycerol acyltransferase Proteins 0.000 description 9
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 9
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 9
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 8
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 8
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 7
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 6
- 102100036869 Diacylglycerol O-acyltransferase 1 Human genes 0.000 description 6
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 6
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 6
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 6
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 6
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 6
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- -1 phosphatidylcholine Chemical class 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 101150023395 DGA1 gene Proteins 0.000 description 5
- 108050004099 Diacylglycerol O-acyltransferase 1 Proteins 0.000 description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 5
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 5
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 5
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- MKPCNMXYTMQZBE-UHFFFAOYSA-N 7h-purin-6-amine;sulfuric acid;dihydrate Chemical compound O.O.OS(O)(=O)=O.NC1=NC=NC2=C1NC=N2.NC1=NC=NC2=C1NC=N2 MKPCNMXYTMQZBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YDIKCZBMBPOGFT-PWUSVEHZSA-N Malvidin 3-galactoside Chemical compound [Cl-].COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2C(=CC=3C(O)=CC(O)=CC=3[O+]=2)O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)=C1 YDIKCZBMBPOGFT-PWUSVEHZSA-N 0.000 description 4
- PXUQTDZNOHRWLI-QOPOCTTISA-O Primulin Natural products O(C)c1c(O)c(OC)cc(-c2c(O[C@H]3[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O3)cc3c(O)cc(O)cc3[o+]2)c1 PXUQTDZNOHRWLI-QOPOCTTISA-O 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010087894 Fatty acid desaturases Proteins 0.000 description 3
- 102000009114 Fatty acid desaturases Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000930020 Homo sapiens Diacylglycerol O-acyltransferase 2 Proteins 0.000 description 3
- 241000235575 Mortierella Species 0.000 description 3
- 108030002650 Phospholipid:diacylglycerol acyltransferases Proteins 0.000 description 3
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 235000012970 cakes Nutrition 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 3
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000006455 gy-medium Substances 0.000 description 3
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 3
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 2,4-diaminobutyric acid Chemical compound NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010073542 Delta-5 Fatty Acid Desaturase Proteins 0.000 description 2
- 102100035762 Diacylglycerol O-acyltransferase 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710088335 Diacylglycerol acyltransferase/mycolyltransferase Ag85A Proteins 0.000 description 2
- 101710088334 Diacylglycerol acyltransferase/mycolyltransferase Ag85B Proteins 0.000 description 2
- 101710088427 Diacylglycerol acyltransferase/mycolyltransferase Ag85C Proteins 0.000 description 2
- 101000927974 Homo sapiens Diacylglycerol O-acyltransferase 1 Proteins 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 101150066244 LRO1 gene Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 description 2
- 101100170395 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) DGA1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 235000013527 bean curd Nutrition 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000015895 biscuits Nutrition 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 2
- 108010005155 delta-12 fatty acid desaturase Proteins 0.000 description 2
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000014105 formulated food Nutrition 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- VZCCETWTMQHEPK-UHFFFAOYSA-N gamma-Linolensaeure Natural products CCCCCC=CCC=CCC=CCCCCC(O)=O VZCCETWTMQHEPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N gamma-linolenic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC(O)=O VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N 0.000 description 2
- 235000020664 gamma-linolenic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960002733 gamolenic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 2
- 235000001497 healthy food Nutrition 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000012149 noodles Nutrition 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 235000019992 sake Nutrition 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 235000012184 tortilla Nutrition 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- XEZVDURJDFGERA-UHFFFAOYSA-N tricosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O XEZVDURJDFGERA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BJBUEDPLEOHJGE-UHFFFAOYSA-N (2R,3S)-3-Hydroxy-2-pyrolidinecarboxylic acid Natural products OC1CCNC1C(O)=O BJBUEDPLEOHJGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOFPFYYTUIARDI-ZCFIWIBFSA-N (2r)-2-aminooctanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCCCC(O)=O YOFPFYYTUIARDI-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 1
- BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-(cyclohexylazaniumyl)propanoate Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC1CCCCC1 BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- LPBSHGLDBQBSPI-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-amino-4,4-dimethylpentanoic acid Chemical compound CC(C)(C)C[C@H](N)C(O)=O LPBSHGLDBQBSPI-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 1
- TXHAHOVNFDVCCC-UHFFFAOYSA-N 2-(tert-butylazaniumyl)acetate Chemical compound CC(C)(C)NCC(O)=O TXHAHOVNFDVCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIDXCONKKJTLDX-UHFFFAOYSA-N 3,5-dimethylcyclopentane-1,2-dione Chemical compound CC1CC(C)C(=O)C1=O MIDXCONKKJTLDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150069620 ARE2 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000007173 Abies balsamea Nutrition 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 101100433757 Arabidopsis thaliana ABCG32 gene Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004857 Balsam Substances 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- 101100327917 Caenorhabditis elegans chup-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010010737 Ceruletide Proteins 0.000 description 1
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001840 Dandruff Diseases 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108010058732 Fatty Acid Elongases Proteins 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 1
- 101710194321 Histone H4.1 Proteins 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 101000955959 Homo sapiens Vacuolar protein sorting-associated protein 52 homolog Proteins 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 244000018716 Impatiens biflora Species 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108010037138 Linoleoyl-CoA Desaturase Proteins 0.000 description 1
- 244000294411 Mirabilis expansa Species 0.000 description 1
- 235000015429 Mirabilis expansa Nutrition 0.000 description 1
- YBHQCJILTOVLHD-YVMONPNESA-N Mirin Chemical compound S1C(N)=NC(=O)\C1=C\C1=CC=C(O)C=C1 YBHQCJILTOVLHD-YVMONPNESA-N 0.000 description 1
- 241001219224 Mortierella elongata Species 0.000 description 1
- 241000048020 Mortierella exigua Species 0.000 description 1
- KNTFCRCCPLEUQZ-VKHMYHEASA-N O-methylserine Chemical compound COC[C@H](N)C(O)=O KNTFCRCCPLEUQZ-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100054296 Oryza sativa subsp. japonica ABCG37 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100107593 Oryza sativa subsp. japonica ABCG40 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241001674048 Phthiraptera Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100491255 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) YAP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 101150044776 URA5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000306282 Umbelopsis isabellina Species 0.000 description 1
- 241000907980 Umbelopsis nana Species 0.000 description 1
- 241000134363 Umbelopsis ramanniana Species 0.000 description 1
- 244000301083 Ustilago maydis Species 0.000 description 1
- 235000015919 Ustilago maydis Nutrition 0.000 description 1
- 102100038937 Vacuolar protein sorting-associated protein 52 homolog Human genes 0.000 description 1
- 206010048218 Xeroderma Diseases 0.000 description 1
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 235000013334 alcoholic beverage Nutrition 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000058 anti acne agent Substances 0.000 description 1
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 1
- 230000001166 anti-perspirative effect Effects 0.000 description 1
- 229940124340 antiacne agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000003213 antiperspirant Substances 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 235000008452 baby food Nutrition 0.000 description 1
- 235000015241 bacon Nutrition 0.000 description 1
- 235000015173 baked goods and baking mixes Nutrition 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 235000013736 caramel Nutrition 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- YRALAIOMGQZKOW-HYAOXDFASA-N ceruletide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 YRALAIOMGQZKOW-HYAOXDFASA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229940112822 chewing gum Drugs 0.000 description 1
- 235000015218 chewing gum Nutrition 0.000 description 1
- 235000019219 chocolate Nutrition 0.000 description 1
- 150000001840 cholesterol esters Chemical class 0.000 description 1
- BJBUEDPLEOHJGE-IUYQGCFVSA-N cis-3-hydroxy-D-proline zwitterion Chemical compound O[C@H]1CCN[C@H]1C(O)=O BJBUEDPLEOHJGE-IUYQGCFVSA-N 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 235000014510 cooky Nutrition 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000002781 deodorant agent Substances 0.000 description 1
- 125000003374 diacylglycerol group Chemical group 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 235000012489 doughnuts Nutrition 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 235000013410 fast food Nutrition 0.000 description 1
- 235000021107 fermented food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 125000005519 fluorenylmethyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 235000020627 health maintaining nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 235000004280 healthy diet Nutrition 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 1
- FUKUFMFMCZIRNT-UHFFFAOYSA-N hydron;methanol;chloride Chemical compound Cl.OC FUKUFMFMCZIRNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 description 1
- 206010021198 ichthyosis Diseases 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012770 industrial material Substances 0.000 description 1
- 235000021125 infant nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 235000008446 instant noodles Nutrition 0.000 description 1
- BBJIPMIXTXKYLZ-UHFFFAOYSA-N isoglutamic acid Chemical compound OC(=O)CC(N)CC(O)=O BBJIPMIXTXKYLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020888 liquid diet Nutrition 0.000 description 1
- 235000021056 liquid food Nutrition 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 235000011475 lollipops Nutrition 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 235000013310 margarine Nutrition 0.000 description 1
- 239000003264 margarine Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000008268 mayonnaise Substances 0.000 description 1
- 235000010746 mayonnaise Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013536 miso Nutrition 0.000 description 1
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000016236 parenteral nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 235000010603 pastilles Nutrition 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 235000019685 rice crackers Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 description 1
- 235000013580 sausages Nutrition 0.000 description 1
- 235000014102 seafood Nutrition 0.000 description 1
- 239000011265 semifinished product Substances 0.000 description 1
- 239000002453 shampoo Substances 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000005808 skin problem Effects 0.000 description 1
- 235000014214 soft drink Nutrition 0.000 description 1
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 1
- 235000013555 soy sauce Nutrition 0.000 description 1
- 235000011496 sports drink Nutrition 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- YRALAIOMGQZKOW-UHFFFAOYSA-N sulfated caerulein Natural products C=1C=CC=CC=1CC(C(N)=O)NC(=O)C(CC(O)=O)NC(=O)C(CCSC)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CNC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(O)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 YRALAIOMGQZKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001256 tonic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000606 toothpaste Substances 0.000 description 1
- 229940034610 toothpaste Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002966 varnish Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 1
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 235000014101 wine Nutrition 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
- A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
- A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
- A61K31/202—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids having three or more double bonds, e.g. linolenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
- A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
- A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
- A61K31/23—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms
- A61K31/232—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms having three or more double bonds, e.g. etretinate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/33—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing oxygen
- A61K8/36—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
- A61K8/361—Carboxylic acids having more than seven carbon atoms in an unbroken chain; Salts or anhydrides thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/33—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing oxygen
- A61K8/37—Esters of carboxylic acids
- A61K8/375—Esters of carboxylic acids the alcohol moiety containing more than one hydroxy group
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/60—Sugars; Derivatives thereof
- A61K8/606—Nucleosides; Nucleotides; Nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
- A61K8/66—Enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/18—Antioxidants, e.g. antiradicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/6445—Glycerides
- C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/6445—Glycerides
- C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/0102—Diacylglycerol O-acyltransferase (2.3.1.20)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Birds (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новую диацилглицерол-ацилтрансферазу. Изобретение относится также к полинуклеотиду, кодирующему диацилглицерол-ацилтрансферазу, вектору экспрессии и трансформанту, такому как дрожжи или грибок, а также к способу получения композиции липидов или жирных кислот с использованием трансформанта. Изобретение позволяет получить новый фермент, пригодный для эффективной продукции липидов и жирных кислот. 6 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 1 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему новую диацилглицерол-ацилтрансферазу, и способ его использования.
Предпосылки изобретения
Триацилглицеролы, представляющие собой запасные липиды, получаются путем переноса ацильных групп на диацилглицеролы. Ферменты, переносящие ацильную группу на диацилглицерол, называются диацилглицерол-ацилтрансферазами (DGAT). Известна ацил-CoA:диацилглицерол-ацилтрансфераза (EC 2.3.1.20), относящаяся к типу, для которого ацильным донором ацила служит ацил-CoA, и фосфолипид:диацилглицерол-ацилтрансфераза PDAT (EC 2.3.1.158), относящаяся к типу, для которого донором ацила служит фосфолипид.
DGAT, использующие в качестве донора ацила ацил-CoA, разделяются на 2 семейства DGAT1 и DGAT2 на основании разницы в первичной структуре (непатентные документы 1 и 2). Клонированы гены DGAT дрожжей, растений и т.д. (патентный документ 1 и непатентные документы 3 и 4). Известно, что среди этих DGAT, DGAT, полученная из Arabidopsis, использует в качестве доноров ацила различные фосфолипиды, включая фосфатидную кислоту, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и т.п., и может переносить ацильные группы в пределах C10-C22 (непатентный документ 5).
DGAT дрожжей Saccharomyces cerevisiae изучены лучше по сравнению с DGAT грибков. Известны гены дрожжей, кодирующие DGAT, DGA1 (YOR245C), принадлежащую к семейству DGAT2 (непатентный документ 6) и LRO1 (YNR008W), представляющую собой PDAT. Фермент, кодируемый этими двумя генами, обеспечивает большую часть активности DGAT в дрожжах, но даже при одновременной деструкции этих генов некоторая активность DGAT сохраняется. Известно, что в этой оставшейся активности участвует DGAT-активность фермента, кодируемого генами ARE1 и ARE2, которые представляют собой гены ацил-CoA:стерол-ацилтрансферазы (непатентный документ 7).
У Mortierella alpina (M. alpina), представляющей собой грибок, продуцирующий липиды, известны 4 типа DGAT, использующих ацил-CoA в качестве донора ацила, и их гены (два типа генов семейства DGAT1 и два типа генов семейства DGAT2) (патентные документы 2 и 3 и непатентный документ 8).
Однако у M. alpina не было обнаружено гомологов PDAT, использующих фосфолипид в качестве донора ацила. Десатураза жирных кислот Δ5 представляет собой фермент, катализирующий окисление дигомо-γ-линоленовой кислоты (DGLA) до арахидоновой кислоты (ARA). Известно, что, поскольку у M. alpina фермент воздействует главным образом на DGLA, находящуюся в виде ацильных остатков на фосфатидилхолине, арахидоновая кислота образуется в виде ацильных остатков фосфатидилхолина (непатентный документ 9). Таким образом, для образования триацилглицеролов, содержащих арахидоновую кислоту, требуются ферменты, синтезирующие триацилглицеролы, содержащие арахидоновую кислоту, из арахидоновой кислоты, находящейся в виде ацильных остатков фосфолипидов, таких как фосфатидилхолин и т.п.
Патентные документы
Патентный документ 1: нерассмотренная публикация заявки на японский патент № 2002-541783.
Патентный документ 2: патент США № 2006/0094086.
Патентный документ 3: патент США № 2006/0091087.
Непатентные документы
Непатентный документ 1: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 13018-13023, 1998.
Непатентный документ 2: J.B.C., 276 (42) 38862-38869, 2001.
Непатентный документ 3: J.B.C., 275 (21), 15609-15612, 2000.
Непатентный документ 4: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(12), 6487-6492.
Непатентный документ 5: Plany Physiology, 135, 1324-1335.
Непатентный документ 6: J. Bacteriol., 184, 519-524, 2002.
Непатентный документ 7: J.B.C., 277 (8), 6478-6482, 2002.
Непатентный документ 8: Collected Abstract of the 2003 Annual Meeting of the Japan Society for Agricultural and Biological Chemistry.
Непатентный документ 9: J.B.C., 278(37), 35115-35126, 2003.
Раскрытие изобретения
В сложившихся обстоятельствах, в области техники существует потребность в новом ферменте, пригодном для продукции триацилглицеролов, содержащих арахидоновую кислоту, в M. alpina.
В результате всесторонних исследований авторам настоящего изобретения удалось клонировать ген, кодирующий гомолог PDAT (MaLRO1) у M. alpina, представляющего собой грибок, продуцирующий липиды. На этом основании выполнено настоящее изобретение. В частности, в настоящем изобретении представлены следующие полинуклеотиды, белки, векторы экспрессии, трансформанты, способ получения композиций липидов или жирных кислот, а также пищевых продуктов с использованием трансформантов, пищевые продукты и т.п., полученные с помощью способа и т.д.
Таким образом, в настоящем изобретении представлено следующее:
[1] Полинуклеотид, согласно любому, выбираемому из группы, состоящей из (а)-(е) ниже:
(а) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или 4;
(b) полинуклеотид, кодирующий белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2;
(с) полинуклеотид, кодирующий белок, состоящий из аминокислотной последовательности, в которой от 1 до 100 аминокислот делетированы, заменены, вставлены и/или добавлены к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающий диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью;
(d) полинуклеотид, кодирующий белок, чья аминокислотная последовательность гомологична по меньшей мере на 60% аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и который обладает диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью; и
(е) полинуклеотид, гибридизующийся в жестких условиях с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 или 4, и кодирующий белок, обладающий диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью.
[2] Полинуклеотид по вышеприведенному п.[1], представляющий собой полипептид, определенный в (g) или (f) ниже:
(f) полинуклеотид, кодирующий белок, состоящий из аминокислотной последовательности, в которой от 1 до 10 аминокислот делетированы, заменены, вставлены и/или добавлены к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающий диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью; и
(g) полинуклеотид, кодирующий белок, у которого аминокислотная последовательность гомологична по меньшей мере на 75% аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и который обладает диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью.
[3] Полинуклеотид по вышеприведенному п.[1], содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или 4.
[4] Полинуклеотид по вышеприведенному п.[1], кодирующий белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
[5] Полинуклеотид по любому из вышеприведенных пп.[1]-[4], представляющий собой ДНК.
[6] Белок, кодируемый полинуклеотидом по любому из вышеприведенных пп.[1]-[5].
[7] Вектор, включающий полинуклеотид по любому из вышеприведенных пп.[1]-[5].
[8] Трансформант-не человек, с введенным полинуклеотидом по любому из вышеприведенных пп.[1]-[5].
[9] Трансформант-не человек, с введенным вектором по вышеприведенному п.[7].
[10] Трансформант по вышеприведенным пп.[8] или [9], где трансформант представляет собой грибок, продуцирующий липиды.
[11] Трансформант по вышеприведенному п.[10], где грибок, продуцирующий липиды, представляет собой Mortierella alpina.
[12] Способ получения композиции липидов или жирных кислот, включающей сбор композиции липидов или жирных кислот из культуры трансформанта по любому из вышеприведенных пп.[8]-[11].
[13] Способ по вышеприведенному п.[12], где липид представляет собой триацилглицерол.
[14] Способ по вышеприведенному п.[12], где жирная кислота представляет собой арахидоновую кислоту или дигомо-γ-линоленовую кислоту.
[15] Пищевой продукт, лекарственный препарат, косметический продукт или мыло, включающие композицию липидов или жирных кислот, собранных с помощью способа получения по вышеприведенному п.[12].
Полинуклеотид согласно настоящему изобретению можно использовать для трансформации грибка, продуцирующего липиды (например, M. alpina), дрожжей, растений и т.д. Таким образом, полинуклеотид согласно настоящему изобретению вводят в соответствующую клетку-хозяина для получения трансформанта, экспрессирующего вышеописанный полинуклеотид и, как следствие, эффективно продуцирующего триацилглицеролы, богатые DGLA или ARA. Трансформант (грибок, продуцирующий липиды, дрожжи, растения и т.д.), полученный таким образом, может использоваться для продукции композиций жирных кислот, пищевых продуктов, косметических продуктов, лекарственных препаратов, мыл и т.д.
В частности, для трансформанта согласно настоящему изобретению характерна чрезвычайно высокая эффективность продукции липидов и жирных кислот. Соответственно, настоящее изобретение может эффективно использоваться для производства медикаментов или продуктов здорового питания, требующих большого количества липидов или жирных кислот.
Краткое описание фигур
На фиг.1А представлено выравнивание геномной последовательности и кодирующей последовательности MaLRO1.
На фиг.1В представлено выравнивание геномной последовательности и кодирующей последовательности MaLRO1, продолженное с фиг.1А.
На фиг.2А приведена кодирующая последовательность MaLRO1 и его предполагаемая аминокислотная последовательность.
На фиг.2В приведена кодирующая последовательность MaLRO1 и его предполагаемая аминокислотная последовательность, продолженная с фиг.2А.
На фиг.3 приведено выравнивание аминокислотных последовательностей гомологичных белков PDAT различных грибков. Аминокислотные остатки, помеченные «*», важны для активности PDAT и являются консервативными у разных видов грибков и не только.
На фиг.4 приведено содержание жирных кислот в липидной фракции, экстрагированной из клеток дрожжей.
На фиг.5 приведена композиция жирных кислот в липидной фракции, экстрагированной из клеток дрожжей.
Лучший вариант осуществления изобретения
Далее настоящее изобретение описывается детально. Воплощения, приведенные ниже, приведены для описания изобретения с помощью примеров, однако изобретение не ограничено только этими воплощениями. Настоящее изобретение можно осуществлять различными способами без отхода от сущности изобретения.
Все публикации, опубликованные заявки на патенты, патенты и другие патентные документы, процитированные в настоящей заявке, включены в нее полностью путем ссылки. Таким образом, в настоящую заявку включено путем ссылки содержание описания изобретения и чертежей заявки на японский патент (№ 2009-289287), поданной 21 декабря 2009 года, на приоритет которой претендует настоящая заявка.
Авторам настоящего изобретения впервые удалось клонировать ген полноразмерной кДНК гена (MaLRO1) гомологов PDAT, полученных из грибка M. alpina, продуцирующего липиды, что будет более подробно описано ниже в примерах. Авторы настоящего изобретения также определили нуклеотидную последовательность геномной ДНК MaLRO1 M. alpina и его предполагаемую аминокислотную последовательность. Последовательность открытой рамки считывания (ORF MaLRO1), предполагаемая аминокислотная последовательность MaLRO1, кодирующая последовательность MaLRO1, последовательность кДНК MaLRO1 и геномная последовательность MaLRO1 приведены в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5 соответственно. Эти полинуклеотиды и ферменты можно получить с помощью способов, описанных в примерах ниже, известных генно-инженерных техник, известных способов синтеза и т.д.
1. Полинуклеотид по изобретению
В настоящем изобретении представлен полинуклеотид, выбираемый из группы, состоящей из (а)-(е) ниже:
(а) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или 4;
(b) полинуклеотид, кодирующий белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2;
(с) полинуклеотид, кодирующий белок, состоящий из аминокислотной последовательности, в которой от 1 до 100 аминокислот делетированы, заменены, вставлены и/или добавлены к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающий диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью;
(d) полинуклеотид, кодирующий белок, у которого аминокислотная последовательность гомологична по меньшей мере на 85% аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и который обладает диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью; и
(е) полинуклеотид, гибридизующийся в жестких условиях с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, комплементарной SEQ ID NO:1 или 4, и кодирующий белок, обладающий диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью.
Термин «полинуклеотид», используемый в настоящей заявке, означает ДНК или РНК.
Термин «полинуклеотид, гибридизующийся в жестких условиях», используемый в настоящей заявке, означает полинуклеотид, получаемый способом гибридизации колоний, способом гибридизации бляшек, способом гибридизации по Саузерну и т.п., с использованием в качестве зонда, например, полинуклеотида, состоящего из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 или 4, или целого или части полинуклеотида, состоящего из нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2. Использованные способы гибридизации описаны, например, в «Sambook & Russel, Molecular Cloning; A Laboratory Manual», vol.3, Cold Spring Harbor Laboratory press, 2001» и «Ausubel Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons», 1987-1997, и т.п.
Термин «жесткие условия», используемый в настоящей заявке, может означать условия слабой жесткости, условия средней жесткости и условия сильной жесткости. «Условия слабой жесткости» представляют собой, например, 5×SSC, 5× раствор Денхардта, 0,5% SDS, 50% формамида при 32°С. «Условия средней жесткости» представляют собой, например, 5×SSC, 5× раствор Денхардта, 0,5% SDS, 50% формамида при 42°С или 5×SSC, 1% SDS, 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 50% формамида при 42°С. «Условия сильной жесткости» представляют собой, например, 5×SSC, 5× раствор Денхардта, 0,5% SDS, 50% формамида при 50°С или 0,2×SSC, 0,1% SDS при 65°С. Ожидается, что в этих условиях можно эффективно получить ДНК с более высокой гомологией при более высокой температуре, однако на жесткость условий гибридизации влияет множество факторов, включая температуру, концентрацию зонда, длину зонда, ионную силу, время, концентрацию солей и т.д.; специалист в области техники может рассчитать все эти факторы для достижения сходных по жесткости условий.
При использовании для гибридизации коммерческих наборов реактивов, можно использовать, например, систему прямого мечения и детекции Alkphos Direct Labeling and Detection System (GE Healthcare). В этом случае в соответствии с вложенным протоколом, после инкубации с меченым зондом в течение ночи мембрану отмывают первым промывочным буфером с массовой долей SDS 0,1% при 55°С и таким образом детектируют гибридизованную ДНК. Альтернативно, при получении зонда на основе нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 или 4, или на основе полноразмерной или части нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, гибридизацию можно детектировать с помощью набора реактивов для детекции нуклеиновых кислот DIG Nucleic AcidDetection Kit (Roche Diagnostics), пометив пробу диоксигенином (DIG) и используя коммерческий реактив (например, смесь для мечения PCR Labeling Mix производства Roche Diagnostics) и т.д.
Помимо описанных выше, другие гибридизующиеся полинуклеотиды включают ДНК, идентичную по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 51%, по меньшей мере на 52%, по меньшей мере на 53%, по меньшей мере на 54%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 56%, по меньшей мере на 57%, по меньшей мере на 58%, по меньшей мере на 59%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 61%, по меньшей мере на 62%, по меньшей мере на 63%, по меньшей мере на 64%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 66%, по меньшей мере на 67%, по меньшей мере на 68%, по меньшей мере на 69%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, по меньшей мере на 99,7%, по меньшей мере на 99,8%, по меньшей мере на 99,9% или более последовательности ДНК, приведенной в SEQ ID NO:1 или 4, или ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, рассчитанной с помощью программного обеспечения для поиска гомологии, такого как FASTA и BLAST, с использованием параметров, заданных по умолчанию.
Идентичность аминокислотных последовательностей или нуклеотидных последовательностей можно определить с помощью алгоритма BLAST, разработанного Karlin и Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873, 1993). На основе алгоритма BLAST были разработаны компьютерные программы BLASTN, BLASTX, BLASTP, tBLASTN и tBLASTX (Altschul S.F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403, 1990). При секвенировании нуклеотидной последовательности с использованием BLASTN, значения параметров могут составлять, например, score=100 и wordlength=12. При секвенировании аминокислотной последовательности с использованием BLASTP, значения параметров могут составлять, например, score=50 и wordlength=3. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST используются значения, принятые по умолчанию для каждой программы.
Вышеописанные полинуклеотиды согласно настоящему изобретению можно получать с помощью известных генно-инженерных техник, известных способов синтеза и т.д.
2. Белок по изобретению
В настоящем изобретении представлен нижеописанный белок.
(i) Белок, кодируемый полинуклеотидом по любому из вышеприведенных (а)-(е).
(ii) Белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.
(iii) Белок, включающий аминокислотную последовательность, в которой одна или более аминокислот делетированы, заменены, вставлены и/или добавлены к SEQ ID NO:2, и обладающий диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью.
(iv) Белок с аминокислотной последовательностью, гомологичной по меньшей мере на 60% аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, обладающий диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью.
Белки, описанные выше в (iii) или (iv), обычно представляют собой естественные мутанты белка SEQ ID NO:2 и включают белки, получаемые искусственно с помощью сайт-специфического мутагенеза, описанного, например, в «Sambrook & Russell Molecular Cloning: A Laboratory Manual», vol.3, ColdSpring Harbor Laboratory Press, 2001»; «Ausubel Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987-1997»; Nuc. Acids Res., 10, 6487 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 6409 (1982); Gene, 34, 315 (1985); Nuc. Acids Res., 13, 4431 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) и т.д.
Термин «белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой одна или более аминокислот делетированы, заменены, вставлены и/или добавлены к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающий диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью» включает белки, содержащие аминокислотную последовательность, в которой, например, от 1 до 100, от 1 до 90, от 1 до 80, от 1 до 70, от 1 до 60, от 1 до 50, от 1 до 40, от 1 до 39, от 1 до 38, от 1 до 37, от 1 до 36, от 1 до 35, от 1 до 34, от 1 до 33, от 1 до 32, от 1 до 31, от 1 до 30, от 1 до 29, от 1 до 28, от 1 до 27, от 1 до 26, от 1 до 25, от 1 до 24, от 1 до 23, от 1 до 22, от 1 до 21, от 1 до 20, от 1 до 19, от 1 до 18, от 1 до 17, от 1 до 16, от 1 до 15, от 1 до 14, от 1 до 13, от 1 до 12, от 1 до 11, от 1 до 10, от 1 до 9 (от 1 до нескольких), от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, от 1 до 2 или одна аминокислота делетирована, заменена, вставлена и/или добавлена к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающие диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью. В целом, предпочтительно меньшее число делеций, замен, вставок и/или добавлений.
Такие белки включают белок с аминокислотной последовательностью, гомологичной по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 61%, по меньшей мере на 62%, по меньшей мере на 63%, по меньшей мере на 64%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 66%, по меньшей мере на 67%, по меньшей мере на 68%, по меньшей мере на 69%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, по меньшей мере на 99,7%, по меньшей мере на 99,8%, по меньшей мере на 99,9% или более аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 и обладающий диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью. В целом, предпочтителен белок с более высокой степенью гомологии.
Диацилглицерол-ацилтрансферазную активность можно оценить, например, с помощью способа, описанного в Stahl et al., Plant Physiology 135, 1324-1335 (2004).
Наличие диацилглицерол-ацилтрансферазной активности также можно подтвердить с помощью эксперимента с использованием штаммов дрожжей Δdga1, Δrol1 с пониженной продукцией триацилглицеролов. Если при экспрессии полинуклеотида, кодирующего фермент, в штаммах Δdga1, Δrol1 продукция триацилглициролов повышается, белок или пептид, кодируемый полинуклеотидом, обладает диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью. В примерах описано фракционирование липидов на фракцию триацилглицеролов (TG) и фракцию фосфолипидов (PL) и подтверждение повышения уровня продуцируемых триацилглицеролов. Однако изменения уровня продуцируемых фосфолипидов не наблюдалось (фиг.4).
В настоящем изобретении диацилглицерол-ацилтрансферазная активность может представлять собой ацил-CoA:диацилглицерол-ацилтрансферазную активность или фосфолипид:диацилглицерол-ацилтрансферазную активность, предпочтительно, фосфолипид:диацилглицерол-ацилтрансферазную активность.
Делеция, замена, вставка и/или добавление одного или более аминокислотных остатков к аминокислотной последовательности белка согласно изобретению означает, что один или множество аминокислотных остатков делетируют, заменяют, вставляют и/или добавляют в одном или нескольких положениях одной и той же аминокислотной последовательности. Одновременно могут иметь место два или более типа делеций, замен, вставок и добавлений.
Примеры взаимозаменяемых аминокислотных остатков приведены ниже. Аминокислотные остатки одной и той же группы являются взаимозаменяемыми. Группа А: лейцин, изолейцин, норлейцин, валин, норвалин, аланин, 2-аминобутановая кислота, метионин, о-метилсерин, трет-бутилглицин, трет-бутилаланин и циклогексилаланин; группа В: аспартат, глутамат, изоаспартат, изоглутамат, 2-аминоадипиновая кислота и 2-аминосубериновая кислота; группа С: аспарагин и глутамин; группа D: лизин, аргинин, орнитин, 2,4-диаминобутановая кислота и 2,3-аминопропионовая кислота; группа Е: пролин, 3-гидроксипролин и 4-гидроксипролин; группа F: серин, треонин и гомосерин; и группа G: фенилаланин и тирозин.
Белок согласно настоящему изобретению также можно получать способами химического синтеза, такими как способ Fmoc (флуоренилметилоксикарбониловый способ), способ t-Boc (трет-бутилоксикарбониловый способ) и т.д. Кроме того, для химического синтеза могут применяться синтезаторы пептидов производства Advanced Automation Peptide Protein Technologies, Perkin Elmer, Protein Technology Instrument, PerSeptive, Applied Biosystems, SHIMADZU Corp. и т.д.
3. Вектор по изобретению и трансформанты, индуцированные вектором
В другом воплощении в настоящем изобретении также представлен вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по изобретению.
Вектор согласно изобретению конструируют так, чтобы он содержал кассету экспрессии, включающую:
(i) промотор, транскрибируемый в клетке-хозяине;
(ii) любой из полинуклеотидов, описанный в (a)-(g) выше, связанный с промотором; и
(iii) кассету экспрессии, включающую в качестве компонента сигнал, функционирующий в клетке-хозяине как сигнал терминации транскрипции и полиаденилирования молекулы РНК.
Вектор, сконструированный таким образом, вводят в клетку-хозяина. Примеры клеток-хозяев, которые могут использоваться в настоящем изобретении, включают грибки, продуцирующие липиды, дрожжи и т.п.
Грибки, продуцирующие липиды, которые могут использоваться в настоящем изобретении, представляют собой штаммы, описанные, например, в MYCOTAXON, т. XLIV, № 2, стр. 257-265 (1992). Конкретные примеры включают микроорганизмы, принадлежащие к роду Mortierella, включая микроорганизмы, принадлежащие к подроду Mortierella, например Mortierella elongata IFO8570, Mortierella exigua IFO 8571, Mortierella hydrophila IFO5941, Mortierella alpina IFO8568, ATCC 16266, ATCC 32221, ATCC 42430, CBS219.35, CBS224.37, CBS250.53, CBS343.66, CBS527.72, CBS528.72, CBS529.72, CBS608.70 и CBS754.68 и т.д., или микроорганизмы, принадлежащие к подроду Micromucor, например, Mortierella isabellina CBS194.28, IFO6336, IFO7824, IFO7873, IFO7874, IFO8286, IFO8308 и IFO7884, Mortierella nana IFO8190, Mortierella ramanniana IFO5426, IFO8186, CBS112.08, CBS212.72, IFO7825, IFO8184, IFO8185 и IFO8287, Mortierella vinacea CBS236.82 и т.д. Из этих грибков предпочтительна Mortierella alpina.
Примерами дрожжей могут служить Saccharomyces cerevisiae NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953, NBRC1954 и т.д.
При введении вектора согласно изобретению в дрожжи и оценке диацилглицерол-трансферазной активности белка, кодируемого вектором, отсутствие у дрожжей, используемых в качестве хозяев, генов диацилглицерол-трансферазы (DGA1 и LRO1) дает возможность оценивать только ферментативную активность белка. Соответственно, в воплощении настоящего изобретения у предпочтительных дрожжевых клеток-хозяев отсутствуют гены DGA1 и LRO1.
Эти клетки-хозяева, трансформированные вектором согласно изобретению, продуцируют большее количество липидов, предпочтительно триацилглицеролов (также называемых «триглицериды»), более предпочтительно, триглицеролов, содержащих арахидоновую кислоту или DGLA, и наиболее предпочтительно, триглицеролов, содержащих арахидоновую кислоту, по сравнению с клетками-хозяевами, не трансформированными вектором согласно изобретению.
Векторы для введения в грибки, продуцирующие липиды, включают, но не ограничиваются, например, pDura5 (Appl. Microbiol. Biotechnol., 65, 419-425, (2004)).
Выбор вектора для введения в грибки, продуцирующие липиды, не сильно ограничен, можно использовать любой вектор, способный экспрессировать вставку в клетках дрожжей, включая, например, pYE22m (Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995). Выбор вектора для введения в Mortierella alpina не сильно ограничен, можно использовать любой вектор, способный экспрессировать вставку в клетках Mortierella alpina, включая, например, pDuraMCS для экспрессии в M. alpina.
Промоторы/терминаторы, регулирующие экспрессию в клетках-хозяевах, могут представлять собой произвольную комбинацию, функционирующую в клетках-хозяевах. Например, может использоваться промотор гена гистона H4.1, промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и т.д.
В качестве селективного маркера для трансформации могут использовать ауксотрофные маркеры (ura5, niaD), маркеры химической устойчивости (гигромицин, зеоцин), ген устойчивости к генетицину (G418r), ген устойчивости к меди (CUP1) (Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337, 1984), ген устойчивости к церулеину (fas2m, PDR4) (Junji Inokoshi et al., Biochemistry, 64, 660, 1992; и Hussain et al., Gene, 101: 149, 1991 соответственно).
Для трансформации клеток-хозяев могут использоваться известные способы. Например, для трансформации грибков, продуцирующих липиды, можно использовать способ электропорации (Mackenzie D.A. et al., Appl. Environ. Microbiol., 66, 4655-4661, 2000) и способ доставки частиц (способ, описанный в заявке на японский патент № 2005-287403 «Способ выведения грибков, продуцирующих липиды»). Для трансформации дрожжей можно использовать способ электропорации, сферопластный способ (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, стр. 1929 (1978)), литий-ацетатный способ (J. Bacteriology, 153, стр. 163 (1983)) и способы, описанные в Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, стр. 1929 (1978), Methods in yeast genetics, изд. Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual (2000) и т.п.
Кроме того, общие техники генетического клонирования описаны по ссылке: Sambrook & Russell, «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», т. 3, изд. Cold Spring Harbor Laboratory Press», 2001, «Methods in yeast genetics: A laboratory manual», изд. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
4. Способ продукции композиции липидов или жирных кислот по изобретению
В другом воплощении в настоящем изобретении далее представлен способ изготовления композиции липидов или жирных кислот, включающей использование вышеописанного трансформанта грибка, продуцирующего липиды, или дрожжей.
Термин «липид», используемый в настоящей заявке, означает простой липид, включая вещество, состоящее из жирной кислоты и спирта, присоединенного с помощью сложноэфирной связи (например, глицерида), или его аналога (например, сложного эфира холестерола) и т.п.; сложный липид, в котором к части простого липида присоединены фосфорная кислота, аминокислота (аминокислоты), или сахарид (сахариды) и т.д.; или производное липида, представляющее собой гидролизат вышеупомянутого липида, нерастворимый в воде.
Термин «масло и жир», используемые в настоящей заявке, означают сложный эфир глицерола и жирной кислоты (глицерид).
Термин «жирная кислота», используемый в настоящей заявке, означает алифатическую монокарбоксикислоту (карбоксикислоту с одной карбоксильной группой и атомами углерода, соединенными в цепочку), в общем случае обозначаемую формулой RCOOH (где R представляет собой алкил). Жирные кислоты включают насыщенные жирные кислоты, не содержащие двойных связей и ненасыщенные кислоты, чья углеводородная цепочка содержит двойную связь (связи).
Композицию липидов или жирных кислот согласно настоящему изобретению можно экстрагировать из клеток, трансформированных согласно настоящему изобретению, следующим образом. Организм-трансформант (например, грибок, продуцирующий липиды, или дрожжи) культивируют и затем обрабатывают стандартным способом, например, с помощью центрифугирования или фильтрации, для получения культивируемых клеток. Клетки тщательно промывают водой и предпочтительно высушивают. Высушивать можно с помощью лиофилизации, высушивания на воздухе и т.д. Высушенные клетки разрушают предпочтительно с помощью дезинтегратора Dynomill или ультрасонификации и далее экстрагируют органическим растворителем предпочтительно в токе азота. Примеры органических растворителей, доступных для использования, включают эфир, гексан, метанол, этанол, хлороформ, дихлорметан, петролейный эфир и т.д. Альтернативно, также хорошие результаты получаются при попеременной экстракции метанолом и петролейным эфиром или экстракцией однофазным растворителем хлорофом-метанол-вода. При дистилляции органического растворителя из экстракта при пониженном давлении получаются липиды, содержащие жирные кислоты. Экстрагированные жирные кислоты можно превратить в метиловые эфиры с помощью соляной кислоты и метанола и т.д.
Кроме того, жирные кислоты можно отделить в виде смеси жирных кислот или смеси сложных эфиров жирных кислот от вышеупомянутых липидов, содержащих жирные кислоты, с помощью стандартных процедур концентрации и сепарации (например, добавления мочевины, сепарации при охлаждении, колоночной хроматографии и т.д.).
Липиды, полученные способом согласно настоящему изобретению, предпочтительно представляют собой триглицеролы, более предпочтительно представляют собой триглицеролы, содержащие арахидоновую или дигомо-γ-линоленовую кислоты, и наиболее предпочтительно представляют собой триацилглицеролы, содержащие арахидоновую кислоту.
Жирные кислоты, полученные способом согласно настоящему изобретению, предпочтительно представляют собой арахидоновую или дигомо-γ-линоленовую кислоты и наиболее предпочтительно представляют собой арахидоновую кислоту. Содержание липидов, полученных способом согласно настоящему изобретению, и состав жирных кислот, содержащихся в липидах, можно подтвердить с помощью способа экстракции липидов или способа сепарации жирных кислот, описанных выше, или их комбинации.
Композиция липидов или жирных кислот, полученных способом продукции согласно настоящему изобретению, может использоваться для продукции, например, продуктов питания, лекарственных препаратов, промышленных материалов (сырья для косметических продуктов, мыла и т.д.), содержащих масла и жиры, и т.п.
Еще в одном воплощении в настоящем изобретении представлен способ получения пищевых продуктов, косметических продуктов, лекарственных препаратов, мыл и т.д. с использованием грибка-трансформанта, продуцирующего липиды, или дрожжей-трансформантов согласно настоящему изобретению. Способ включает стадию образования липидов или жирных кислот с использованием грибка-трансформанта, продуцирующего липиды, или дрожжей-трансформантов согласно настоящему изобретению. Продукты питания, косметические продукты, лекарственные препараты, мыла и т.д., содержащие образованные липид или жирные кислоты, получают стандартными способами. В целом, продукты питания, косметические продукты, лекарственные препараты, мыла и т.д., полученные способом согласно настоящему изобретению, содержат липиды или жирные кислоты, полученные с использованием грибка-трансформанта, продуцирующего липиды, или дрожжей-трансформантов согласно настоящему изобретению. В настоящем изобретении далее представлены продукты питания, косметические продукты, лекарственные препараты, мыла и т.д., полученные с помощью способа.
Форма косметического продукта (композиции) или лекарственного препарата (фармацевтической композиции) согласно настоящему изобретению не ограничена и может представлять собой любую форму, включая вид раствора, пасты, геля, твердого вещества или порошка. Косметическая композиция или фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может использоваться как косметический продукт или местнодействующее средство для кожи, включая масло, лосьон, крем, эмульсию, гель, шампунь, ополаскиватель для волос, кондиционер для волос, лак, основу под макияж, губную помаду, пудру для лица, маску для лица, мазь, парфюмерный продукт, пудру, одеколон, зубную пасту, мыло, аэрозоль, очищающую пенку и т.д., противовозрастное средство для ухода за кожей, противовоспалительное средство для кожи, средство для ванн, лекарственный тоник, эссенцию красоты, средство для защиты от солнца, или защитное и лечебное средство для проблем с кожей, связанных с травмой, обветриванием или растрескиванием и т.д.
Косметическая композиция согласно настоящему изобретению также может при необходимости включать другие масла и жиры и/или красители, ароматические вещества, консерванты, поверхностно-активные вещества, пигменты, антиоксиданты и т.д. Специалист в области техники может определить необходимую долю этих веществ в составе композиции в зависимости от ее использования (например, массовая доля масел и жиров в композиции может составлять от 1 до 99,99%, предпочтительно от 5 до 99,99% и наиболее предпочтительно от 10 до 99,95%). При необходимости фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может также включать другие фармацевтически активные компоненты (например, противовоспалительные компоненты) или вспомогательные компоненты (например, смазка или носитель). Примеры других компонентов, обычно используемых в косметических продуктах или препаратах для обработки кожи для наружного применения, включают средство против угревой сыпи, средство для предотвращения перхоти или зуда, антиперспирант и дезодорант, противоожоговое средство, средство против клещей и вшей, средство, размягчающее кератин, средство против ксеродермы, противовирусное средство, средство, повышающее чрезкожную абсорбцию и т.п.
Пищевые продукты согласно настоящему изобретению включают пищевые добавки, здоровое питание, функциональное питание, пищевые продукты для детей младшего возраста, детское питание, модифицированное молоко для младенцев, модифицированное молоко для недоношенных младенцев, питание для пожилых людей и т.д. При использовании в тексте настоящей заявки, питание или пищевые продукты может означать твердые, текучие и жидкие пищевые продукты, а также их смесь, и в совокупности означает продукты, годные для употребления в пищу.
Термин «пищевая добавка» означает пищевые продукты, обогащенные определенными питательными веществами. Термин «здоровое питание» означает оздоравливающие и полезные для здоровья пищевые продукты и охватывает пищевые добавки, натуральные пищевые продукты и диетические пищевые продукты. Термин «функциональное питание» означает пищевой продукт для восполнения питательных веществ, помогающих телу правильно функционировать. Функциональное питание является синонимом питания для специального использования для оздоровления. Термин «питание для детей младшего возраста» означает пищевые продукты, потребляемые детьми в возрасте примерно до 6 лет. Термин «питание для пожилых людей» означает пищевые продукты, обработанные для облегченного переваривания и всасывания по сравнению с необработанными пищевыми продуктами. Термин «модифицированное молоко для питания младенцев» означает, модифицированное молоко, потребляемое детьми примерно до года. Термин «модифицированное молоко для питания недоношенных младенцев» означает модифицированное молоко, потребляемое недоношенными детьми в возрасте примерно до 6 месяцев после рождения.
Эти пищевые продукты включают натуральные продукты (обработанные жирами и маслами), такие как мясо, рыба и орехи; пищевые продукты с жирами и маслами, добавляемыми в процессе готовки, например продукты китайской кухни, китайская лапша, супы и т.д.; продукты питания, приготовленные с использование жиров и масел в качестве среды нагрева, такие как темпура или жаренные во фритюре рыба или овощи, пищевые продукты, жаренные во фритюре, жареный тофу, китайский жареный рис, пончики, японские жареные лепешки или каринто; пищевые продукты на основе жира или масла или полуфабрикаты с жирами и маслами, добавляемыми в процессе обработки, например масло, маргарин, майонез, соус, шоколад, лапша быстрого приготовления, карамель, галеты, печенья, торт, мороженое; и пищевые продукты, сбрызнутые или покрытые жирами и маслами после приготовления, например рисовые крекеры, твердые галеты, хлеб со сладкой бобовой пастой и т.д. Однако пищевые продукты не ограничиваются пищевыми продуктами, содержащими жиры и масла, - другие примеры включают сельскохозяйственные продукты, такие как хлебобулочные изделия, лапшу, вареный рис, конфеты (например, леденцы, жевательная резинка, мармелад, пастилки, японские сладости), тофу и полуфабрикаты на его основе; ферментированные продукты питания, такие как японское рисовое вино или саке, целебный бальзам, сладкое вино для кулинарии (мирин), уксус, соевый соус и паста из мисо или бобов; продукты животноводства, такие как йогурт, ветчина, бекон, сосиски и т.д.; морепродукты, такие как паровые лепешки из рыбного фарша или камабоко; рыбные лепешки, жаренные во фритюре или агетен; лепешки из мяса акулы или ханпен и т.д.; а также фруктовые напитки, прохладительные напитки, спортивные напитки, алкогольные напитки, чай и т.д.
Пищевые продукты согласно настоящему изобретению также могут быть в виде фармацевтических препаратов, таких, как капсулы и т.д. или в виде полуфабрикатов, таких как натуральные жидкие диеты, диеты с заданной формулой и элементные диеты, составленные с жирами и маслами согласно настоящему изобретению вместе с белками, сахарами, микроэлементами, витаминами, эмульгаторами, ароматическими веществами, и т.д., здоровые напитки, парентеральное питание и т.п.
Как описано выше, липиды, в особенности триацилглицеролы, можно эффективно получать путем экспрессии гена диацилглицерол-ацилтрансферазы согласно настоящему изобретению в клетках-хозяевах.
Кроме того, уровень экспрессии гена можно использовать как индикатор для изучения условий культивирования, контроля культивирования и т.д. для эффективной продукции липидов, в особенности триацилглицеролов.
ПРИМЕРЫ
Далее настоящее изобретение описывается более подробно посредством примеров, однако следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.
Анализ генома M. alpina
Штамм 1S-4 M. alpina рассаживали в 100 мл среды GY2:1 (2% глюкозы и 1% дрожжевого экстракта, pH 6,0) и культивировали с перемешиванием при 28°С в течение 2 дней. Клетки грибков собирали с помощью фильтрации и выделяли геномную ДНК с помощью набора реактивов DNeasy (Quiagen).
Нуклеотидную последовательность вышеописанной геномной ДНК расшифровывали с помощью геномного секвенатора Roche 454 Genome Sequencer FLX Standard. Два раза секвенировали библиотеку фрагментов и три раза - библиотеку спаренных оснований. Полученные нуклеотидные последовательности собирали в 300 суперконтигов.
Поиск гомологов LRO1 S. cerevisiae (ScLRO1)
Проводили поиск tblastn в геномной нуклеотидной последовательности штамма 1S-4 M. alpina, используя в качестве запроса предполагаемую аминокислотную последовательность, кодируемую геном PDAT S. cerevisiae (ScLRO1, номер доступа в GenBank Р40345). Было обнаружено совпадение в суперконтиге, содержащем последовательность, приведенную в SEQ ID NO:5. Ген с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:5 был назван MaLRO1 и его кДНК клонировали следующим образом.
Получение библиотеки кДНК
Штамм 1S-4 M. alpina вносили в 100 мл среды (1,8% глюкозы и 1% дрожжевого экстракта, pH 6,0) и прекультивировали в течение 3 дней при 28°С. В культуральный сосуд объемом 10 л (Able Co., Tokyo) помещали 5 л среды (1,8% глюкозы, 1% соевого порошка, 0,1% оливкового масла, 0,01% адеканола, 0,3% KH2PO4, 0,1% Na2SO4, 0,05% CaCl2×2H2O и 0,05% MgCl2×6H2O, pH 6,0), переносили туда весь прекультивированный продукт и спин-культивировали в аэробных условиях при 300 об/мин, аэрации 1 л/л в мин и 26°С в течение 8 дней. На 1, 2 и 3 дни культивирования добавляли глюкозу в количестве, соответствующем 2%, 2% и 1,5%. Клетки собирали на каждой стадии культивирования на 1, 2, 3, 6 и 8 дни и выделяли тотальную РНК с использованием гуанидингидрохлорида и CsCl. Полиаденилированную РНК отделяли от тотальной РНК с использованием набора реактивов для очистки мРНК Oligotex-dT30<Super> mRNA Purification Kit (Takara Bio). Для каждой стадии получали библиотеку кДНК с использованием набора реактивов для клонирования ZAP-cDNA Gigapack III Cloning Kit (Stratagene).
Клонирование кДНК
Для клонирования кДНК MaLRO1 получали следующие праймеры на основе SEQ ID NO:5.
MaLRO1-1F:5'-CCTGGAATCGTATCAACTGGCCTTG-3' (SEQ ID NO:6)
MaLRO1-3R: 5'-CAGGTCCGCCCGCTCCCGCCTCG-3' (SEQ ID NO:7)
Используя полученную библиотеку кДНК в качестве матрицы, проводили амплификацию PCR с использованием праймеров MaLRO1-1F и MaLRO1-3R, ExTaq (Takara Bio) и циклами, описанными ниже.
[94°С, 2 мин]×1 цикл
[94°С, 1 мин, 55°С, 1 мин, 72°С, 1 мин]×30 циклов
[72°С, 10 мин]×1 цикл
Амплифицированный фрагмент ДНК длиной примерно 0,7 тпн очищали и далее клонировали с использованием набора реагентов для клонирования TOPO-TA-Cloning Kit (Invitrogen Corp).
Нуклеотидную последовательность вставки подтверждали с помощью секвенатора ДНК; плазмиду, несущую нуклеотидную последовательность от 814 до 1485 нуклеотида нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:4, назвали pCR-MaLRO1-P. Далее эту плазмиду использовали как матрицу для PCR с праймерами, описанными выше. Для PCR использовали ExTaq (Takara Bio Inc.), но приложенную смесь dNTP заменяли на смесь для мечения PCR (PCR Labeling Kit производства Roche Diagnostics) для получения ДНК, меченной дигоксигенином (DIG) для амплификации.
Вышеописанный зонд использовали для скрининга библиотеки кДНК.
Использовали следующие условия гибридизации:
Буфер: 5×SSC, 1% SDS, 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 50% формамид;
Температура: 42°С (в течение ночи);
Условия отмывки: в растворе 0,2×SSC, 0,1% SDS (65°C) в течение 20 мин, 3 раза.
Детекцию проводили с помощью набора реактивов DIG Nucleic Acid Detection Kit (Roche Diagnostics, Inc.). Из фаговых клонов, полученных в результате скрининга, вырезали плазмиды с помощью эксцизии in vivo для получения соответствующих плазмидных ДНК. Среди плазмид, полученных в результате скрининга, плазмиду с наиболее длинной вставкой назвали pB-MaLRO1-P1.
Сравнивали последовательность вставки и геномную последовательность плазмиды pB-MaLRO1-P1. 5'-конец вставки в плазмиде pB-MaLRO1-P1 обозначен на фиг.1 стрелкой вверх. В геномной последовательности 5'-концевую последовательность, обозначенную стрелкой вверх в геномной последовательности, анализировали от последовательности вставки MaLRO1-P1 по направлению к 5'-концу. Обнаружились два кодона инициации ATG ближе к 3'-концу, чем первый стоп-кодон в рамке считывания, предположительно кодирующей MaLRO1. Далее, получали 5'-праймер MaLRO1-6F, содержащий кодон инициации на 5'-конце, и 3'-праймер MaLRO1-5R.
MaLRO1-5R: 5'-CTCTCCTGGATAGAACTCTTCCTCGG-3' (SEQ ID NO:8)
MaLRO1-6F: 5'-ATGGCTTGGCGAGGGCAACTCAC-3' (SEQ ID NO:9)
Используя в качестве матрицы кДНК, полученную из штамма 1S-4 M. alpina, проводили PCR с использованием праймеров MaLRO1-6F и MaLRO1-5R и ExTaq (Takara Bio). Полученный фрагмент ДНК длиной примерно 0,75 тпн клонировали с использованием набора реактивов для клонирования TOPO-TA Cloning Kit и определяли нуклеотидную последовательность вставки. Вставка содержала нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:4 от 1 до 762 нуклеотида, что позволяло предположить, что первый кодон инициации ATG в SEQ ID NO:4 будет транскрибироваться. Полученную таким образом нуклеотидную последовательность лигировали к нуклеотидной последовательности вставки плазмиды pB-MaLRO1-P1 для получения нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:4; эту нуклеотидную последовательность считали нуклеотидной последовательностью кДНК MaLRO1.
Анализ сиквенса
Последовательность SEQ ID NO:4 содержала кодирующую последовательность (SEQ ID NO:3) в последовательности нуклеотидов от 1 до 2400 и открытую рамку считывания (SEQ ID NO:1) в последовательности нуклеотидов 1-2397. Аминокислотная последовательность, выведенная из SEQ ID NO:1, приведена в SEQ ID NO:2 на фиг.2. Геномную последовательность (SEQ ID NO:5) MaLRO1 сравнивали с последовательностью кДНК (SEQ ID NO:4) MaLRO1 (фиг.1). Из приведенных результатов видно, что геномная последовательность гена MaLRO1 состоит из 5 интронов и 6 экзонов.
С помощью tblastp был проведен поиск аминокислотной последовательности MaLRO1, приведенной в SEQ ID NO:2, против аминокислотной последовательности, зарегистрированной в GenBank. Оказалось, что аминокислотная последовательность MaLRO1, приведенная в SEQ ID NO:2, обладает определенной степенью гомологии гомологу LRO1, полученному из грибка. Наивысшая степень гомологии (35,7%) была обнаружена с предполагаемым белком (ЕАК81307) с неизвестной функцией базидиомицета Ustilago Maydis. MaLRO1 гомологичен на 31,7% LRO1 (XP_504038) Yarrowia lipolytica и на 28,9% LRO1 S. cerevisiae. Также сравнивали SEQ ID NO:2 и аминокислотные последовательности вышеописанных гомологов LRO1, полученных из грибков (фиг.3). Три аминокислотных остатка, вероятно, составляющие активный центр, оказались консервативными у всех гомологов.
Конструирование вектора экспрессии
Конструировали вектор экспрессии со структурой, подходящей для высокой экспрессии гена LRO1 M. alpina в дрожжах S. cerevisiae.
Вначале получали праймер Bam-MaLRO1-F.
Bam-MaLRO1-F: 5'-GGATCCATGGCTTGGCGAGGGCAACTCAC-3' (SEQ ID NO:10)
Используя в качестве матрицы кДНК, полученную из штамма 1S-4 M. alpina, проводили PCR с праймерами Bam-MaLRO1-F и MaLRO1-5R с использованием KOD-plus (Toyobo). Полученный фрагмент ДНК длиной примерно 0,75 тпн клонировали с использованием набора реактивов Zero Blunt TOPO Cloning Kit (Invitrogen) для подтверждения нуклеотидной последовательности. Последовательность сравнивали с последовательностью кДНК MaLRO1; плазмиду с перекрывающимися участками нуклеотидной последовательности назвали pCR-MaLRO1-5'. Плазмиду pCR-MaLRO1-5' разрезали рестрикционными фрагментами BamHI и PstI. Используя набор реактивов для лигирования Qiock Ligation Kit (New England BioLabs), получившийся фрагмент ДНК длиной примерно 0,35 тпн лигировали к фрагменту ДНК длиной примерно 2,05 тпн, полученному путем разрезания плазмиды pB-MaLRO1-P1 рестрикционными ферментами PstI и XhoI, и фрагменту ДНК длиной примерно 8,3 тпн, полученному путем разрезания дрожжевого вектора экспрессии pYE22m рестрикционными ферментами BamHI и SalI. Полученную плазмиду назвали pYEMaLRO1.
Экспрессия в штаммах Δdga1 и Δlro1 дрожжей S. cerevisiae
(1) Получение штаммов Δdga1 и Δlro1 дрожжей S. cerevisiae
(1-1) Клонирование генов S. cerevisiae DGA1 и LRO1
С целью клонирования полноразмерного гена S. cerevisiae DGA1 (YOR245C, далее обозначаемого как ScDGA1), и гена LRO1 (YNR008W, далее обозначаемого как ScLRO1) получали следующие праймеры.
ScDGA1-F1: 5'-GAATTCATGTCAGGAACATTCAATGATATA-3' (SEQ ID NO:11)
ScDGA1-R1: 5'-GTCGACTTACCCAACTATCTTCAATTCTGC-3' (SEQ ID NO:12)
ScLRO1-F1: 5'-GAATTCATGGGCACACTGTTTCGAAGAAAT-3' (SEQ ID NO:13)
ScLRO1-R1: 5'-GTCGACTTACATTGGGAAGGGCATCTGAGA-3' (SEQ ID NO:14)
Одну платиновую петлю дрожжей S. cerevisiae штамма S288C вносили в 10 мл жидкой среды YPD (Difco) и культивировали с перемешиванием при 30°С в течение дня. Клетки собирали с помощью центрифугирования и экстрагировали ДНК с помощью GenTLE Kun (Takara Bio) для дрожжей.
Используя эту ДНК в качестве матрицы, проводили PCR с использованием полимеразы ExTaq (Takara Bio) и пары праймеров ScDGA1-F1 и ScDGA1-R1 или пары праймеров ScLRO1-F1 и ScLRO1-R1. Фрагмент ДНК длиной примерно 1,3 тпн и фрагмент ДНК длиной примерно 2 тпн, полученные с соответствующими парами, клонировали с использованием набора реактивов для клонирования TA-Cloning Kit (Invitrogen) для подтверждения нуклеотидных последовательностей. Плазмиды с правильными нуклеотидными последовательностями назвали pCR-ScDGA1 и pCR-ScLRO1 соответственно.
(1-2) Конструирование плазмиды pCR-Δdga1:URA3-1
Фрагмент ДНК длиной примерно 4,5 тпн, полученный путем разрезания плазмиды pCR-ScDGA1 рестрикционными ферментами HpaI и AatI, лигировали к фрагменту ДНК длиной примерно 1,2 тпн, полученного путем разрезания плазмиды pURA34 (JPA2001-120276) рестрикционным ферментом HindIII и далее получения ДНК с тупыми концами с помощью набора реактивов DNA Blunting Kit (Takara Bio) с использованием Ligation High (Toyobo). Плазмиду, в которой ген URA3 оказался вставлен в той же ориентации, что и ген ScDGA1, назвали CR-Δdga1:URA3-1.
(1-3) конструирование плазмиды pUC-Δlro1:LEU2-1
Фрагмент ДНК длиной примерно 2 тпн, полученный путем разрезания плазмиды pCR-ScLRO1 рестрикционными ферментами EcoRI и SalI, лигировали к продукту рестрикции pUC18 тем же рестрикционным ферментом с использованием Ligation High (Toyobo) для получения плазмиды pUC-ScLRO1. Плазмиду разрезали рестрикционными ферментами XbaI и ApaI и далее получали ДНК с тупыми концами с помощью набора реактивов DNA Blunting Kit (Takara Bio). Полученный фрагмент ДНК длиной примерно 3,8 тпн лигировали к фрагменту ДНК длиной примерно 2,2 тпн, полученному путем разрезания плазмиды YEp13 (номер доступа в GenBank U03498) рестрикционными ферментами SalI и XhoI и далее получения ДНК с тупыми концами, с помощью Ligation High (Toyobo). Плазмиду, в которой ген URA3 оказался вставлен в той же ориентации, что и ген ScDGA1, назвали pUC-Δlro1:LEU2-1.
(1-4) Получение трансформанта
Используя штамм YPH499 S. cerevisiae (ura3-52 lys2-801amber ade2-101ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1 a) (Stratagene) в качестве хозяина, получали трансформанты следующим образом. В частности, проводили ко-трансформацию литий-ацетатным способом, с использованием фрагмента ДНК, амплифицированного с помощью PCR с парой праймеров ScDGA1-F1 и Sc-DGA1-R1 и плазмидой pCR-Δdga1:URA3-1 в качестве матрицы, и фрагмента ДНК, амплифицированного PCR с парой праймеров ScLRO1-F1 и ScLRO1-R1 и плазмидой pUC-Δlro1:LEU2-1 в качестве матрицы. Полученных трансформантов скринировали на способность к росту на агаровой среде SC-Leu, Ura (2% агара) (на литр, 6,7 г дрожжевой азотной основы без аминокислот (DIFCO), 20 г глюкозы и 1,3 аминокислот в порошке (смесь 1,25 г аденина сульфата, 0,6 г аргинина, 3 г аспартата, 3 г глутамата, 0,6 г гистидина, 0,9 г лизина, 0,6 г метионина, 1,5 г фенилаланина, 11,25 г серина, 0,9 г тирозина, 4,5 г валина, 6 г треонина и 1,2 г триптофана). Из числа трансформантов, полученных таким образом, из случайных двух клеток выделяли ДНК с помощью GenTLE Kun (Takara Bio) для дрожжей. Используя эти ДНК в качестве матриц, проводили PCR с использованием следующих пар праймеров (1)-(4).
(1) ScDGA1-F1 и ScDGA1-R1
(2) ScDGA1-F1 и ScDGA1-R2
(3) ScLRO1-F1 и ScLRO1-R1
(4) ScLRO1-F1 и ScLRO1-R2
ScDGA1-R2: 5'-GACCAGTGTCATCAGAGAAATAGG-3' (SEQ ID NO:15)
ScLRO1-R2: 5'-GAGCTGGAACTGCCTTTGGAGC-3' (SEQ ID NO:16)
В результате с парой праймеров (1) амплифицировался фрагмент ДНК длиной примерно 1,8 тпн, а с парой праймеров (3) амплифицировался фрагмент ДНК длиной примерно 3,3 тпн, но ни в одном штамме не амплифицировался фрагмент ДНК с парами праймеров (2) и (4). Результаты подтверждают, что эти штаммы представляли собой штаммы Δdga1, Δlro1. Для получения следующих трансформантов использовался один из этих штаммов, выбранный случайным образом.
(2) Трансфекция дрожжей S. cerevisiae штаммов Δdga1, Δlro1 и анализ
(2-1) Получение трансформантов
Штаммы Δdga1 и Δlro1 трансформировали плазмидами pYE22m и pYE-MaLRO1 соответственно с помощью литий-ацетатного способа. Трансформантов скринировали на способность к росту на агаровой среде SC-Trp, Leu, Ura (2% агара) (на литр, 6,7 г дрожжевой азотной основы без аминокислот (DIFCO), 20 г глюкозы, 1,3 аминокислот в порошке (смесь 1,25 г аденина сульфата, 0,6 г аргинина, 3 г аспартата, 3 г глутамата, 0,6 г гистидина, 0,9 г лизина, 0,6 г метионина, 1,5 г фенилаланина, 11,25 г серина, 0,9 г тирозина, 4,5 г валина, 6 г треонина). Из штаммов, трансфицированных плазмидами, выбирали случайным образом по два штамма для дальнейшего культурального анализа. Штаммы, трансформированные pYE22m, назвали C/ΔDG#1 и 2, а штаммы, трансформированные pYE-MaLRO1, назвали MaLRO1/ΔDG#1 и 2.
(2-2) Культивирование трансформантов
Одну платиновую петлю каждого из трансформантов C/ΔDG#1 и 2 и MaLRO1/ΔDG#1 и 2 вносили в 10 мл жидкой среды SC-Trp, Leu, Ura и культивировали с перемешиванием при 30°С в течение ночи. Полученный культуральный раствор в количестве 1 мл вносили в 10 мл жидкой среды YPDA (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% глюкозы и 0,0075% 1-аденина гемисульфата) и культивировали с перемешиванием при 30°С в течение 24 часов. Клетки собирали с помощью центрифугирования, промывали водой и лиофилизировали. Лиофилизированные клетки разрушали с помощью стеклянных бусин и экстрагировали липиды в 8 мл смеси хлороформ:метанол в соотношении 2:1. Проводили тонкослойную хроматографию (TLC) на пластинке Силикагеля 60 (Merck), используя смесь гексан:диэтиловый эфир:уксусная кислота в соотношениях 70:30:1 в качестве проявляющего растворителя для фракционирования липидов. Липиды детектировали путем распыления водного раствора 0,015% примулина и 80% ацетона (раствора примулина) и облучения ультрафиолетовыми лучами для визуализации липидов. Фракцию триацилглицеролов (TG) и фракцию фосфолипидов (PL) помечали карандашом, соскребали силикагель и помещали в соответствующие пробирки. После преобразования жирных кислот в метиловые сложные эфиры с помощью соляной кислоты и метанола проводили анализ жирных кислот с помощью газовой хроматографии. В частности, жирные кислоты преобразовывали в метиловые эфиры путем добавления 1 мл дихлорметана и 2 мл 10% соляной кислоты-метанола и реакции при 50°С в течение 3 часов. Далее к реакционной смеси добавляли 4 мл гексана и 1 мл воды и энергично перемешивали. Затем смесь центрифугировали и фракционировали верхний слой. Растворитель удаляли с помощью дистилляции с использованием концентратора «speed-vac», а осадок растворяли в ацетонитриле. Далее этот раствор подвергали газовой хроматографии для анализа жирных кислот. В реакции метилирования, описанной выше, добавляли трикозаноевую кислоту в качестве внутреннего контроля для определения количества жирных кислот. Результаты приведены на фиг.4.
В штаммах MaLRO1/ΔDG#1 и 2, экспрессировавших MaLRO1 в качестве гомолога PDAT из M. alpina, уровень TG был повышен примерно в 10 раз по сравнению с контрольными штаммами С/ΔDG#1 и 2, что свидетельствует о том, что MaLRO1 обладает активностью синтеза триглицеридов.
Экспрессия в дрожжах, продуцирующих арахидоновую кислоту
(1) Выведение дрожжей, продуцирующих арахидоновую кислоту
Для выведения штамма дрожжей (S. cerevisiae), продуцирующих арахидоновую кислоту, конструировали следующие плазмиды.
Вначале, используя кДНК, полученную из штамма 1S-4 M. alpina в качестве матрицы, проводили PCR с ExTaq и парами праймеров Δ12-f и Δ12-r, Δ6-f и Δ6-r, GLELO-f и GLELO-r, или Δ5-f и Δ5-r для амплификации гена десатуразы жирных кислот Δ12 (номер доступа в GenBank АВ020033), гена десатуразы жирных кислот Δ6 (номер доступа в GenBank АВ020032), гена элонгазы жирных кислот (номер доступа в GenBank АВ193123) и гена десатуразы жирных кислот Δ5 (номер доступа в GenBank АВ188307) в штамме 1S-4 M. alpina.
Δ12-f: TCTAGAATGGCACCTCCCAACACTATTG (SEQ ID NO:17)
Δ12-r: AAGCTTTTACTTCTTGAAAAAGACCACGTC (SEQ ID NO:18)
Δ6-f: TCTAGAATGGCTGCTGCTCCCAGTGTGAG (SEQ ID NO:19)
Δ6-r: AAGCTTTTACTGTGCCTTGCCCATCTTGG (SEQ ID NO:20)
GLELO-f: TCTAGAATGGAGTCGATTGCGCAATTCC (SEQ ID NO:21)
GLELO-r: GAGCTCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC (SEQ ID NO:22)
Δ5-f: TCTAGAATGGGTGCGGACACAGGAAAAACC (SEQ ID NO:23)
Δ5-r: AAGCTTTTACTCTTCCTTGGGACGAAGACC (SEQ ID NO:24)
Эти гены клонировали с использованием набора реактивов для клонирования TOPO-TA-Cloning Kit. Нуклеотидную последовательность клонов подтверждали, и клоны, содержащие нуклеотидные последовательности генов Δ12, Δ6, GLELO и Δ5, называли плазмидами pCR-MAΔ12DS (содержащую нуклеотидную последовательность гена Δ12), pCR-MAΔ6DS (содержащую нуклеотидную последовательность гена Δ6), pCR-MAGLELO (содержащую нуклеотидную последовательность гена GLELO) и pCR-MAΔ5DS (содержащую нуклеотидную последовательность гена Δ5) соответственно.
Также плазмиду pURA34 (JPA2001-120276) разрезали рестрикционным ферментом HindIII. Полученный фрагмент ДНК длиной примерно 1,2 тпн вставляли в сайт HindIII вектора, полученного путем разрезания вектора pUC18 рестрикционными ферментами EcoRI и SphI, далее получения ДНК с тупыми концами и лигирования указанного вектора самого на себя. Клон, в котором сайт EcoRI вектора находился к 5'-концу от URA3, назвали pUC-URA3. Также фрагмент ДНК длиной примерно 2,2 тпн, полученный путем разрезания Yep13 рестрикционными ферментами SalI и XhoI, вставляли в сайт SalI вектора pUC18. Клон, в котором сайт EcoRI вектора находился к 5'-концу от LUE2, назвали pUC-LEU2.
Далее плазмиду pCR-MAΔ12DS разрезали рестрикционным ферментом HindIII, затем получали ДНК с тупыми концами и разрезали рестрикционным ферментом XbaI. Полученный фрагмент ДНК длиной примерно 1,2 тпн лигировали с фрагментом ДНК длиной примерно 6,6 тпн, полученным путем разрезания вектора pESC-URA (Stratagene) рестрикционным ферментом SacI, получения ДНК с тупыми концами и далее разрезания рестрикционным ферментном SpeI, в результате чего получали плазмиду pESC-U-Δ12. Плазмиду pCR-MAΔ6DS разрезали рестрикционным ферментом XbaI, получали ДНК с тупыми концами и далее разрезали рестрикционным ферментом HindIII. Полученный фрагмент ДНК длиной примерно 1,6 тпн лигировали к фрагменту ДНК длиной примерно 8 тпн, полученному при разрезании плазмиды pESC-U-Δ12 рестрикционным ферментом SalI, получения ДНК с тупыми концами и далее разрезания рестрикционным ферментом HindIII, в результате чего получали плазмиду pECS-U-Δ12:Δ6. Эту плазмиду частично разрезали рестрикционным ферментом PvuII. Полученный фрагмент длиной примерно 4,2 тпн вставляли в сайт SmaI pUC-URA3 для получения плазмиды pUC-URA-Δ12:Δ6.
Также плазмиду pCR-MAGLELO разрезали рестрикционными ферментами XbaI и SacI. Полученный фрагмент ДНК длиной примерно 0,95 тпн лигировали к фрагменту ДНК длиной примерно 7,7 тпн, полученному при разрезании вектора pESC-LEU (Stratagene) рестрикционными ферментами XbaI и SacI для получения плазмиды pESC-L-GLELO. Плазмиду pCR-MAΔ5DS разрезали рестрикционным ферментом XbaI, получали ДНК с тупыми концами и далее разрезали рестрикционным ферментом HindIII. Полученный фрагмент ДНК длиной примерно 1,3 тпн лигировали к фрагменту ДНК длиной примерно 8,7 тпн, полученному при разрезании плазмиды pESC-L-GLELO рестрикционным ферментом ApaI, получения ДНК с тупыми концами и далее разрезания рестрикционным ферментом HindIII, для получения плазмиды pESC-L-GLELO:Δ5. Эту плазмиду разрезали рестрикционным ферментом PvuII и полученный фрагмент длиной примерно 3,2 тпн вставляли в сайт SmaI pUC-LEU2 для получения плазмиды pUC-LEU-GLELO:Δ5. Штамм YPH499 Saccharomyces cerevisiae (Stratagene) ко-трансформировали плазмидой pUC-URA-Δ12:Δ6 и плазмидой pUC-LEU-GLELO:Δ5. Трансформантов скринировали на способность к росту на агаровой среде SC-Leu, Ura. Из числа трансформантов, полученных таким образом, один случайный штамм назвали ARA3-1. При культивировании этого штамма в среде с добавлением галактозы, штамм может экспрессировать с промотора GAL1/10 ген десатуразы жирных кислот Δ12, ген десатуразы жирных кислот Δ6, ген GLELO и ген десатуразы жирных кислот Δ5.
(2) Трасформация дрожжей, продуцирующих аразидоновую кислоту и анализ
Штамм ARA3-1 трансформировали плазмидами pYE22m и pYE-MaLRO1. Трансформантов скринировали на способность к росту на агаровой среде SC-Trp, Leu, Ura (2% агара) (на литр, 6,7 г дрожжевой азотной основы без аминокислот (DIFCO), 20 г глюкозы и 1,3 аминокислот в порошке (смесь 1,25 г аденина сульфата, 0,6 г аргинина, 3 г аспартата, 3 г глутамата, 0,6 г гистидина, 0,9 г лизина, 0,6 г метионина, 1,5 г фенилаланина, 11,25 г серина, 0,9 г тирозина, 4,5 г валина и 6 г треонина). Четыре штамма, выбранные случайным образом из соответствующих штаммов, трансфицированных плазмидами, использовали для дальнейшего культивирования.
Эти штаммы культивировали при 30°С в течение дня в 10 мл жидкой среды SC-Trp, Leu, Ura, описанной выше. Далее, по 1 мл культур этих штаммов культивировали при 15°С в течение 6 дней в 10 мл жидкой среды SG-Trp, Leu, Ura (на литр, 6,7 г дрожжевой азотной основы без аминокислот (DIFCO), 20 г галактозы и 1,3 аминокислот в порошке (смесь 1,25 г аденина сульфата, 0,6 г аргинина, 3 г аспартата, 3 г глутамата, 0,6 г гистидина, 0,9 г лизина, 0,6 г метионина, 1,5 г фенилаланина, 11,25 г серина, 0,9 г тирозина, 4,5 г валина и 6 г треонина) с добавлением γ-линоленовой кислоты до 50 мкг/мл. Эксперимент повторяли дважды. Клетки собирали, промывали водой и затем лиофилизировали. К лиофилизированным клеткам добавляли 4 мл смеси хлороформ:метанол в соотношении 2:1 и инкубировали при 70°С в течение часа, затем центрифугировали и собирали супернатант. К клеточному осадку добавляли вторые 4 мл смеси хлороформ:метанол в соотношении 2:1. Смесь центрифугировали, супернатант собирали и объединяли с предыдущим супернатантом. Растворитель удаляли с помощью дистилляции с использованием концентратора «speed-vac», осадок растворяли в небольшом количестве хлороформа. Проводили TLC на пластинке Силикагель 60 (Merck), используя смесь гексан:диэтиловый эфир:уксусная кислота в соотношении 70:30:1 в качестве проявляющего растворителя для фракционирования липидов. Липиды детектировали путем распыления раствора примулина и облучения ультрафиолетовыми лучами. Фракции TG и PL соскребали и каждую фракцию переносили в пробирку. После преобразования жирных кислот в метиловые сложные эфиры с помощью соляной кислоты и метанола, с помощью газовой хроматографии анализировали жирные кислоты.
Соотношения полиненасыщенных жирных кислот (polyunsaturated fatty acids, PUFA) во фракции TG и фракции PL приведены на фиг.5. В штамме, экспрессирующем MaLRO1, доля DGLA в TG и арахидоновой кислоты (ARA) была повышена по сравнению с контролем (фиг.5А). Дрожжевые штаммы, используемые в вышеописанном примере, обладали способностью продуцировать арахидоновую кислот из-за вставленных генов десатуразы жирных кислот Δ12, десатуразы жирных кислот Δ6, GLELO и десатуразы жирных кислот Δ5. Система продукции арахидоновой кислоты у этих штаммов сходна с таковой у M. alpina. У M. alpina GLELO продуцирует DGLA из γ-линоленовой кислоты (DGA), связанной с CoA, и DGLA встраивается в липиды. Далее десатураза жирных кислот Δ5 действует на DGLA, находящуюся в основном в виде ацильных остатков фосфатидилхолина, в результате чего получается ARA. Считается, что в штаммах дрожжей, используемых в вышеописанном примере, DGLA будет связана с CoA или присутствовать в других липидах и далее будет присутствовать в виде ацильных остатков фосфатидилхолина, как и у M. alpina. Кроме того, считается, что ARA продуцируется в основном в виде ацильных остатков фосфатидилхолина. Таким образом, считается, что ген MaLRO1 кодирует «диацилглицерол-ацилтрансферазу фосфолипидов», чьими субстратами являются фосфолипиды.
Из данных по содержанию жирных кислот в фосфолипидах было видно, что DGLA и ARA присутствуют в равных соотношениях в контроле и в штамме, экспрессирующем MaLRO1 (фиг.5В).
Исходя из этих результатов, можно предположить, что MaLRO1 высокоспецифична в отношении DGLA и ARA и что использование MaLRO1 позволит эффективно получать TG с повышенным содержанием DGLA и ARA.
Конструирование вектора экспрессии для M. alpina
Для экспрессии в M. alpina использовали вектор pDuraMCS, в котором ген-мишень экспрессируется с промотора гистона.
Для экспрессии гена MaLRO1 в M. alpina вектор конструировали следующим образом. Плазмиду pCR-MaLRO1-5' разрезали рестрикционными ферментами BamHI и PstI. Полученный фрагмент ДНА длиной примерно 0,35 тпн лигировали к фрагменту ДНК длиной примерно 2,05 тпн, полученному путем разрезания плазмиды pB-MaLRO1-P1 рестрикционными ферментами PstI и XhoI, и фрагмента ДНК длиной примерно 8,3 тпн, полученному путем разрезания вектора pDuraMCS для экспресии в M. alpina рестрикционными ферментами BamHI и SalI, с использованием набора реактивов Quick Ligation Kit (New England Biolabs). Полученную плазмиду назвали pDuraMCS-MaLRO1.
Получение трансформантов M. alpina
Используя в качестве хозяина урацил-ауксотрофный штамм Δura-3, полученный из штамма 1S-4 M. alpina и описанный в брошюре международной публикации PCT WO 2005019437, озаглавленной «Способ выведения грибка, продуцирующего липиды», проводили трансформацию этой плазмидой способом доставки частиц. Для скринига трансформантов использовали агаровую среду SC (0,5% дрожжевой азотной основы без аминокислот и сульфата аммония (Difco), 0,17% сульфата аммония, 2% глюкозы, 0,002% аденина, 0,003% тирозина, 0,0001% метионина, 0,0002% аргинина, 0,0002% гистидина, 0,0004% лизина, 0,0004% триптофана, 0,0005% треонина, 0,0006% изолейцина, 0,0006% лейцина, 0,0006% фенилаланина и 2% агара).
Анализ трансформантов M. alpina
13 полученных трансформантов вносили в 10 мл среды GY (2% глюкозы и 1% дрожжевого экстракта) и культивировали при 28°С и 300 об/мин в течение 10 дней. Трансформанта с наивысшей продукцией арахидоновой кислоты, обнаруженного в результате скрининга, назвали LRO1-1.
13 полученных трансформантов по отдельности вносили в 4 мл среды GY и культивировали с перемешиванием при 28°С в течение 2 дней. Клетки собирали с помощью фильтрации и экстрагировали РНК с использованием набора реактивов RNeasy Plant Kit (Quiagen). Для синтеза кДНК использовали систему SuperScript First Strand System for RT-PCR (Invitrogen). Для подтверждения экспрессии гена MaLRO1 с введенного конструкта проводили RT-PCR со следующими парами праймеров:
Праймер PD4P: 5'-CGCATCCCGCAAACACACAC-3' (SEQ ID NO:25)
Праймер MaLRO1-5R: 5'-CTCTCCTGGATAGAACTCTTCCTCGG-3' (SEQ ID NO:8)
Для подтверждения экспрессии гена MaLRO1, включая эндогенный ген MaLRO1 и ген MaLRO1 во введенном конструкте, проводили PCR с использованием праймеров MaLRO1-1F и MaLRO1-3R и пары праймеров MaLRO1-2F и MaLRO1-4R, приведенных ниже. Амплифицированные фрагменты ДНК подтверждали с помощью электрофореза в агарозном геле. После проведения 20 циклов PCR полоса, соответствующая фрагменту ДНК, амплифицированному в штамме LRO1-1, была темнее, чем полоса контрольного штамма. Результаты подтвердили, что уровень экспрессии гена MaLRO1 был повышен в штамме LRO1-1 по сравнению с контрольным штаммом.
MaLRO1-1F: 5'-CCTGGAATCGTATCAACTGGCCTTG-3' (SEQ ID NO:6)
MaLRO1-3R: 5'-CAGGTCCGCCCGCTCCCGCCTCG-3' (SEQ ID NO:7)
MaLRO1-2F: 5'-GGCGGACCCAACTGGGTGAACGAC-3' (SEQ ID NO:26)
MaLRO1-4R: 5'-TCACAAGTCGACCTTGGCAGAGTAC-3' (SEQ ID NO:27)
Трансформант LRO1-1 и контрольный штамм 1S-4 M. alpina вносили (n=3) в 4 мл среды GY и культивировали при перемешивании при 28°С и 125 об/мин. На 9 день культивирования все клетки собирали путем фильтрации и лиофилизировали. После фракционирования части лиофилизированных клеток (примерно 10-20 мг) жирные кислоты в клетках преобразовывали в метиловые сложные эфиры с помощью соляной кислоты и метанола и экстрагировали гексаном. В осадке, полученном после удаления гексана с помощью дистилляции, определяли долю арахидоновой кислоты («ARA (%)» в таблице 1) в общих жирных кислотах в клетках с использованием газовой хроматографии.
Таблица 1
Доля арахидоновой кислоты в общих жирных кислотах в клетках |
||
LRO1-1 | контроль | |
ARA (%) | 56,77±0,90 | 52,42±2,99 |
среднее ± стандартное отклонение |
Как показано в таблице 1, высокий уровень экспрессии гена MaLRO1 в M. alpina приводит к увеличению доли арахидоновой кислоты в общих жирных кислотах.
К части лиофилизированных клеток (примерно 10-20 мг) добавляли примерно 4 мл смеси хлороформ:метанол в соотношении 2:1. Смесь инкубировали при 70°С в течение часа, центрифугировали и отбирали супернатант. К осадку клетов вновь добавляли 4 мл смеси хлороформ:метанол в соотношении 2:1. Смесь центрифугировали, супернатант отбирали и объединяли с предыдущим супернатантом. Растворитель удаляли путем дистилляции с помощью концентратора «speed-vac», а осадок растворяли в небольшом количестве хлороформа. Проводили TLC на пластинке Силикагель 60 (Merck), используя смесь гексан:диэтиловый эфир:уксусная кислота в соотношении 70:30:1 в качестве проявляющего растворителя для фракционирования липидов. Липиды детектировали путем распыления раствора примулина и облучения ультрафиолетовыми лучами. Фракции TG и PL соскребали и каждую фракцию переносили в пробирку. После преобразования жирных кислот в метиловые сложные эфиры с помощью соляной кислоты и метанола, с помощью газовой хроматографии анализировали жирные кислоты.
Таблица 2
Доля арахидоновой кислоты в жирных кислотах в клетках |
||
LRO1-1 | контроль | |
ARA (%) | 58,82±1,32 | 55,00±3,42 |
среднее ± стандартное отклонение |
Как показано в таблице 2, высокий уровень экспрессии гена MaLRO1 в M. alpina приводит к увеличению доли арахидоновой кислоты в триглицеридах.
Промышленная применимость
Экспрессия полинуклеотида согласно настоящему изобретению в соответствующих клетках-хозяевах приводит к эффективной продукции триацилглицеролов с высоким содержанием DGLA или ARA. Жирные кислоты, продуцируемые в клетках-хозяевах согласно настоящему изобретению, могут использоваться при производстве пищевых продуктов, косметики, лекарственных препаратов, мыл и т.д.
Список последовательностей
SEQ ID NO:6: синтетическая ДНК
SEQ ID NO:7: синтетическая ДНК
SEQ ID NO:8: синтетическая ДНК
SEQ ID NO:9: синтетическая ДНК
SEQ ID NO:10: синтетическая ДНК
SEQ ID NO:11: синтетическая ДНК
SEQ ID NO:12: синтетическая ДНК
SEQ ID NO:13: синтетическая ДНК
SEQ ID NO:14: синтетическая ДНК
SEQ ID NO:15: синтетическая ДНК
SEQ ID NO:16: синтетическая ДНК
SEQ ID NO:17: синтетическая ДНК
SEQ ID NO:18: синтетическая ДНК
SEQ ID NO:19: синтетическая ДНК
SEQ ID NO:20: синтетическая ДНК
SEQ ID NO:21: синтетическая ДНК
SEQ ID NO:22: синтетическая ДНК
SEQ ID NO:23: синтетическая ДНК
SEQ ID NO:24: синтетическая ДНК
SEQ ID NO:25: синтетическая ДНК
SEQ ID NO:24: синтетическая ДНК
SEQ ID NO:25: синтетическая ДНК
Claims (13)
1. Полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из (a)-(e) ниже, который кодирует белок с диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью:
(a) полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 или 4;
(b) полинуклеотид, кодирующий белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2;
(c) полинуклеотид, кодирующий белок, состоящий из аминокислотной последовательности, в которой от 1 до 10 аминокислот делетированы, заменены, вставлены и/или добавлены к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающий диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью;
(d) полинуклеотид, кодирующий белок, у которого аминокислотная последовательность гомологична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 и который обладает диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью; и
(e) полинуклеотид, гибридизующийся в жестких условиях с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 или 4, и кодирующий белок, обладающий диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью.
(a) полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 или 4;
(b) полинуклеотид, кодирующий белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2;
(c) полинуклеотид, кодирующий белок, состоящий из аминокислотной последовательности, в которой от 1 до 10 аминокислот делетированы, заменены, вставлены и/или добавлены к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающий диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью;
(d) полинуклеотид, кодирующий белок, у которого аминокислотная последовательность гомологична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 и который обладает диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью; и
(e) полинуклеотид, гибридизующийся в жестких условиях с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 или 4, и кодирующий белок, обладающий диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью.
2. Полинуклеотид по п.1, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или 4.
3. Полинуклеотид по п.1, кодирующий белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
4. Полинуклеотид по любому из пп.1-3, представляющий собой ДНК.
5. Белок, с диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью, кодируемый полинуклеотидом по любому из пп.1-4, который используют для получения композиции липидов или жирных кислот.
6. Вектор, включающий полинуклеотид по любому из пп.1-4, который используют для экспрессии белка с диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью.
7. Трансформант-не человек, с введенным полинуклеотидом по любому из пп.1-4, который используют для получения композиции липидов или жирных кислот, где трансформант представляет собой дрожжи или грибок, продуцирующий липиды.
8. Трансформант-не человек, с введенным вектором по п.6, который используют для получения композиции липидов или жирных кислот, где трансформант представляет собой дрожжи или грибок, продуцирующий липиды.
9. Трансформант по п.7 или 8, где трансформант представляет собой грибок, продуцирующий липиды.
10. Трансформант по п.9, где грибок, продуцирующий липиды, представляет собой Mortierella alpina.
11. Способ получения композиции липидов или жирных кислот, включающий сбор композиции липидов или жирных кислот из культуры трансформанта по любому из пп.7-10.
12. Способ по п.11, где липид представляет собой триацилглицерол.
13. Способ по п.11, где жирная кислота представляет собой арахидоновую кислоту или дигомо-γ-линоленовую кислоту.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009-289287 | 2009-12-21 | ||
JP2009289287 | 2009-12-21 | ||
PCT/JP2010/072930 WO2011078134A1 (ja) | 2009-12-21 | 2010-12-20 | ジアシルグリセロールアシル基転移酵素遺伝子及びその用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2012131283A RU2012131283A (ru) | 2014-01-27 |
RU2514655C2 true RU2514655C2 (ru) | 2014-04-27 |
Family
ID=44195661
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012131283/10A RU2514655C2 (ru) | 2009-12-21 | 2010-12-20 | Гены диацилглицерол-ацилтрансферазы и их использование |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8765423B2 (ru) |
EP (1) | EP2518147B1 (ru) |
JP (1) | JP5475011B2 (ru) |
KR (1) | KR101438981B1 (ru) |
CN (1) | CN102844431B (ru) |
AU (1) | AU2010336630B2 (ru) |
BR (1) | BR112012015410A2 (ru) |
CA (1) | CA2783543C (ru) |
DK (1) | DK2518147T3 (ru) |
RU (1) | RU2514655C2 (ru) |
WO (1) | WO2011078134A1 (ru) |
Families Citing this family (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5890687B2 (ja) | 2010-02-03 | 2016-03-22 | サントリーホールディングス株式会社 | グリセロール−3−リン酸アシル基転移酵素ホモログとその利用 |
DK2740797T3 (da) * | 2011-08-04 | 2017-02-20 | Suntory Holdings Ltd | Protein med aktivitet til at fremme fedtsyreforlængelse, derfor kodende gen samt anvendelse deraf |
US10307167B2 (en) | 2012-12-14 | 2019-06-04 | Corquest Medical, Inc. | Assembly and method for left atrial appendage occlusion |
US10813630B2 (en) | 2011-08-09 | 2020-10-27 | Corquest Medical, Inc. | Closure system for atrial wall |
US10314594B2 (en) | 2012-12-14 | 2019-06-11 | Corquest Medical, Inc. | Assembly and method for left atrial appendage occlusion |
US20140142689A1 (en) | 2012-11-21 | 2014-05-22 | Didier De Canniere | Device and method of treating heart valve malfunction |
US9566443B2 (en) | 2013-11-26 | 2017-02-14 | Corquest Medical, Inc. | System for treating heart valve malfunction including mitral regurgitation |
KR101582294B1 (ko) | 2014-02-28 | 2016-01-06 | 엠플레어 주식회사 | 사용자 나레이션 기반의 e-book 대여 서비스 시스템 |
US10842626B2 (en) | 2014-12-09 | 2020-11-24 | Didier De Canniere | Intracardiac device to correct mitral regurgitation |
RU2662972C1 (ru) * | 2018-04-26 | 2018-07-31 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий" (ФГБНУ ЦЭЭРБ) | Способ проведения ПЦР с аллель-специфичными зондами для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1 |
KR20200015261A (ko) | 2018-08-03 | 2020-02-12 | 엠플레어 주식회사 | 온라인 콘텐츠 스트리밍 서비스 시스템 |
KR20200015255A (ko) | 2018-08-03 | 2020-02-12 | 엠플레어 주식회사 | 스트리밍 북 플레이어 |
KR20200109881A (ko) | 2019-03-15 | 2020-09-23 | 엠플레어 주식회사 | 온라인 콘텐츠 서비스 방법 |
KR20200109896A (ko) | 2019-03-15 | 2020-09-23 | 엠플레어 주식회사 | 기록매체 |
KR20200109902A (ko) | 2019-03-15 | 2020-09-23 | 엠플레어 주식회사 | 콘텐츠 카드 등록 프로그램이 기록된 기록매체 |
KR20200109901A (ko) | 2019-03-15 | 2020-09-23 | 엠플레어 주식회사 | 콘텐츠 카드 등록 방법을 실행시키기 위한 컴퓨터에서 실행시키기 위한 프로그램 |
KR20200109892A (ko) | 2019-03-15 | 2020-09-23 | 엠플레어 주식회사 | 온라인 콘텐츠 서비스를 위한 컴퓨터 프로그램이 기록된 기록매체 |
KR20200109889A (ko) | 2019-03-15 | 2020-09-23 | 엠플레어 주식회사 | 온라인 콘텐츠 서비스를 위한 컴퓨터 프로그램 |
KR20200109884A (ko) | 2019-03-15 | 2020-09-23 | 엠플레어 주식회사 | 온라인 콘텐츠 서비스 시스템의 콘텐츠 카드 등록방법 |
KR20200109876A (ko) | 2019-03-15 | 2020-09-23 | 엠플레어 주식회사 | 온라인 콘텐츠 서비스 시스템 및 콘텐츠 카드 등록방법 |
KR20200109880A (ko) | 2019-03-15 | 2020-09-23 | 엠플레어 주식회사 | 온라인 콘텐츠 서비스 시스템 |
KR20200109878A (ko) | 2019-03-15 | 2020-09-23 | 엠플레어 주식회사 | 온라인 콘텐츠 서비스 시스템 |
KR20200109882A (ko) | 2019-03-15 | 2020-09-23 | 엠플레어 주식회사 | 온라인 콘텐츠 서비스 시스템의 콘텐츠 카드 등록방법 |
KR20200109893A (ko) | 2019-03-15 | 2020-09-23 | 엠플레어 주식회사 | 컴퓨터 프로그램 |
CN109837256B (zh) * | 2019-03-21 | 2020-12-01 | 江南大学 | 一种二酰甘油酰基转移酶1及其在生产甘油三酯中的应用 |
EP4301162A1 (en) * | 2021-03-03 | 2024-01-10 | Nourish Ingredients Pty Ltd | Production of phospholipids in microbes and uses thereof |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2272073C2 (ru) * | 1999-04-01 | 2006-03-20 | Басф Плант Сайенс Гмбх | Новый класс ферментов в биосинтетическом пути получения триацилглицерина и рекомбинантные молекулы днк, кодирующие эти ферменты |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1098962B1 (en) | 1998-07-02 | 2009-09-09 | Calgene LLC | Diacylglycerol acyl transferase proteins |
JP4231170B2 (ja) | 1999-10-26 | 2009-02-25 | サントリー株式会社 | 酵母の育種方法 |
IL147942A0 (en) * | 2002-01-31 | 2002-08-14 | Enzymotec Ltd | Method of fractionation of phytosterol esters in oil and products obtained thereby |
US20070072275A1 (en) | 2003-08-22 | 2007-03-29 | Misa Ochiai | Method for breeding lipid-producing fungus |
JP4481702B2 (ja) | 2004-03-31 | 2010-06-16 | サントリーホールディングス株式会社 | 脂質生産菌の育種方法およびその利用 |
CA2484964A1 (en) | 2004-10-15 | 2006-04-15 | Patrick Belanger | Footwear rack |
US7273746B2 (en) | 2004-11-04 | 2007-09-25 | E.I. Dupont De Nemours And Company | Diacylglycerol acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms |
US7198937B2 (en) * | 2004-11-04 | 2007-04-03 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Mortierella alpina diacylglycerol acyltransferase for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms |
CA2599112C (en) * | 2005-02-14 | 2013-10-22 | Suntory Limited | Composition comprising dihomo-.gamma.-linolenic acid (dgla) as the active ingredient |
EP2169055B1 (en) | 2007-05-25 | 2015-04-01 | Suntory Holdings Limited | Novel lysophosphatidate acyltransferase gene |
US8652508B2 (en) * | 2007-05-25 | 2014-02-18 | Children's Medical Center Corporation | Dietary formulations and methods for treatment of inflammation and other disorders |
CA2685713C (en) | 2007-06-18 | 2015-03-31 | Suntory Holdings Limited | Glycerol-3-phosphate acyltransferase (gpat) homologs and use thereof |
CN101578372B (zh) | 2007-07-23 | 2013-06-26 | 三得利控股株式会社 | 具有新型脂肪酸组成的脂肪酸组合物 |
BRPI0908694A2 (pt) * | 2008-05-23 | 2019-09-24 | Du Pont | ''sementes de grão de soja transgência e método para aumentar o teor de ácido graxo total de uma semente de grão de soja'' |
BRPI1009810A2 (pt) | 2009-03-26 | 2015-08-25 | Suntory Holdings Ltd | Lisofosfolipídeo aciltransferase. |
JP4760969B2 (ja) | 2009-09-09 | 2011-08-31 | 株式会社日立製作所 | 指認証装置 |
-
2010
- 2010-12-20 US US13/512,109 patent/US8765423B2/en active Active
- 2010-12-20 BR BR112012015410A patent/BR112012015410A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2010-12-20 EP EP10839364.6A patent/EP2518147B1/en not_active Not-in-force
- 2010-12-20 AU AU2010336630A patent/AU2010336630B2/en not_active Ceased
- 2010-12-20 CN CN201080057882.5A patent/CN102844431B/zh active Active
- 2010-12-20 CA CA2783543A patent/CA2783543C/en active Active
- 2010-12-20 KR KR1020127012909A patent/KR101438981B1/ko active IP Right Grant
- 2010-12-20 JP JP2011547547A patent/JP5475011B2/ja active Active
- 2010-12-20 RU RU2012131283/10A patent/RU2514655C2/ru active
- 2010-12-20 DK DK10839364.6T patent/DK2518147T3/en active
- 2010-12-20 WO PCT/JP2010/072930 patent/WO2011078134A1/ja active Application Filing
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2272073C2 (ru) * | 1999-04-01 | 2006-03-20 | Басф Плант Сайенс Гмбх | Новый класс ферментов в биосинтетическом пути получения триацилглицерина и рекомбинантные молекулы днк, кодирующие эти ферменты |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US8765423B2 (en) | 2014-07-01 |
WO2011078134A1 (ja) | 2011-06-30 |
AU2010336630B2 (en) | 2014-04-10 |
CN102844431A (zh) | 2012-12-26 |
JP5475011B2 (ja) | 2014-04-16 |
EP2518147B1 (en) | 2017-10-11 |
EP2518147A1 (en) | 2012-10-31 |
EP2518147A4 (en) | 2013-06-19 |
CA2783543C (en) | 2016-01-26 |
KR101438981B1 (ko) | 2014-09-11 |
RU2012131283A (ru) | 2014-01-27 |
AU2010336630A1 (en) | 2012-06-21 |
CN102844431B (zh) | 2014-10-08 |
KR20120091226A (ko) | 2012-08-17 |
BR112012015410A2 (pt) | 2016-11-29 |
CA2783543A1 (en) | 2011-06-30 |
DK2518147T3 (en) | 2018-01-02 |
JPWO2011078134A1 (ja) | 2013-05-09 |
US20120277451A1 (en) | 2012-11-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2514655C2 (ru) | Гены диацилглицерол-ацилтрансферазы и их использование | |
US9828596B2 (en) | Polynucleotide encoding acyl-CoA synthetase homolog and use thereof | |
US8980591B2 (en) | Protein having activity to promote fatty acid chain elongation, gene encoding same and use thereof | |
RU2499835C1 (ru) | Глицерол-3-фосфатацилтрансфераза | |
AU2014202244B2 (en) | Polynucleotide encoding acyl-coa synthetase homolog and use thereof |