KR20100041777A

KR20100041777A - 포스파티딘산포스파타아제 동족체 및 그 이용

Info

Publication number: KR20100041777A
Application number: KR1020107001459A
Authority: KR
Inventors: 미사 오치아이; 히사노리 도쿠다
Original assignee: 산토리 홀딩스 가부시키가이샤
Priority date: 2007-07-11
Filing date: 2008-07-10
Publication date: 2010-04-22
Also published as: EP2172548A4; AU2008273264B2; US20100196579A1; AU2008273264A1; CA2692813A1; RU2507264C2; CN101595216A; RU2010104678A; BRPI0814699A2; DK2172548T3; WO2009008466A1; EP2172548B1; JP5180960B2; CN101595216B; KR101519678B1; JPWO2009008466A1; CA2692813C; EP2172548A1

Abstract

신규 포스파티딘산포스파타아제 유전자의 제공. 서열번호 1 또는 4로 표시되는 염기 서열 또는 그 단편을 포함하는 핵산.

Description

포스파티딘산포스파타아제 동족체 및 그 이용{PHOSPHATIDATE PHOSPHATASE HOMOLOG AND USE OF THE SAME}

본 명세서는 2007년 7월11일에 출원된 일본 특허 출원 2007-181899에 기초하는 우선권을 주장한다.

본 발명은 신규 포스파티딘산포스파타아제 유전자에 관한 것이다.

지방산은, 인지질이나 트리아실글리세롤 등 지질을 구성하는 중요한 성분이다. 불포화 결합을 2곳 이상 함유하는 지방산은, 고도 불포화지방산(PUFA)으로 총칭되며, 아라키돈산이나 디호모감마리놀렌산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산 등이 알려져 있다. 이 고도 불포화지방산은, 동물 체내에서 합성할 수 없는 것도 포함되고 있어, 이러한 고도 불포화지방산은 필수지방산으로서 음식물로부터 섭취해야 한다. 고도 불포화지방산은 널리 분포하고 있으며, 예를 들어, 아라키돈산은 동물의 부신선이나 간장으로부터 추출한 지질로부터 분리된다. 그러나, 동물 장기에 포함되는 고도 불포화지방산은 소량으로, 동물 장기로부터 고도 불포화지방산을 추출하거나 분리하는 것만으로는, 대량으로 공급하기에는 충분하지 않았다. 그 때문에, 다양한 미생물을 배양하여 고도 불포화지방산을 획득하는 방법이 개발되어 왔다. 그 중에서도 모티에렐라(Mortierella)속 미생물은, 아라키돈산 등의 고도 불포화지방산 함유 지질을 생산하는 미생물로서 알려져 있다.

또, 식물에서 생산시키는 것도 시도되고 있다. 고도 불포화지방산은, 트리아실글리세롤 등의 저장 지질을 구성하며, 미생물의 균체내 또는 식물 종자중에 축적되는 것이 알려져 있다.

저장 지질인 트리아실글리세롤은, 생체내에서 이하와 같이 생성된다. 글리세롤 3인산에 글리세롤 3-인산아실기 전이 효소에 의해 아실기가 전이되어 리소(lyso)포스파티딘산이 생성되고, 리소포스파티딘산에 리소포스파티딘산아실기 전이 효소에 의해 아실기가 전이되어 포스파티딘산이 생성되고, 포스파티딘산이 포스파티딘산포스파타아제에 의해 탈인산화되어 디아실글리세롤이 생성되고, 디아실글리세롤에 디아실글리세롤아실기 전이 효소에 의해 아실기가 전이되어 트리아실글리세롤이 생성된다.

상기 계로 중에서, 포스파티딘산(phosphatidic acid, 이하 「PA」라고 기재하는 경우도 있다. 또, 1,2-디아실-sn-글리세롤-3-인산이라고 하는 경우도 있다.)은, 트리아실글리세롤의 전구체이며, 디아실형 글리세롤인지질의 생합성 전구체이다. 효모 등에서는 PA와 시티딘 5'-3인산(CTP)으로부터 포스파티딘산시티딜트랜스퍼라아제에 의해 CDP 디아실글리세롤(CDP-DG)이 합성되어, 다양한 인지질로 생합성된다.

상술한 바와 같이, PA를 탈인산화하여 디아실글리세롤(diacylglycerol, 이하 「DG」로 기재하는 경우도 있다.)을 생합성하는 반응은, 포스파티딘산포스파타아제(E.C.3.1.3.4, phosphatidic acid phosphatase, 이하 「PAP」로 기재하는 경우도 있다.)가 촉매하는 것이 알려져 있다. 이 PAP는 세균부터 척추 동물까지 모든 생물에 존재하는 것이 알려져 있다. 또, 균류에서는, PAP는 PA를 저장 지질인 트리아실글리세롤로 생합성하는 열쇠가 되는 효소이다.

진균류인 효모(Saccharomyces cerevisiae)에서는, 2개 타입의 PAP가 알려져 있다(비특허문헌 1). 하나는 Mg²⁺의존성의 PAP(PAP1)이고, 다른 하나는 Mg²⁺비의존성의 PAP(PAP2)이다. 전자를 코드하는 유전자로는, PAH1 유전자가 알려져 있지만, pah1Δ 변이주는 PAP1 활성을 갖고 있기 때문에, 그 밖에도 PAP1 활성을 담당하는 유전자가 있다고 생각되고 있다. 한편, 후자를 코드하는 유전자로는, DPP1 유전자와 LPP1 유전자가 알려져 있고, 이들이 효모의 PAP2 활성을 거의 담당하고 있다. 이러한 유전자가 코드하는 효소는 기질 특이성이 넓어, 디아실글리세롤피로포스페이트(DGPP), 리소포스파티딘산, 스핑고이드 베이스 포스페이트나 이소프레노이드포스페이트 등에도 작용하며, 탈인산화하는 것이 알려져 있다.

그 밖의 균류에서도 이들의 동족체가 존재하는 것은 확인되고 있지만, 기능 등에 관한 보고는 없다.

지질 생산균 Mortierella alpina에서는, 마이크로솜 획분에 PAP 활성이 있는 것이 알려져 있다(비특허문헌 2).

비특허문헌 1 : Trends Biochem. Sci., 31(12), 694-699, 2006 비특허문헌 2 : Biochemical Society Transactions, 28, 707-709, 2000

그러나, 지금까지 보고되어 있는 PAP 유전자는, 숙주 세포에 도입하여 발현시킨 경우에 그 숙주가 생성하는 지방산 조성물의 지방산 조성을 변화시킬 수 있는 것에 관해서는 검토되지 않았다. 숙주 세포에 도입 또는 발현시킴으로써, 목적으로 하는 지방산 조성의 유지를 제조하거나, 목적으로 하는 지방산의 함유량을 증가시킬 수 있는 신규 유전자를 확인하는 것이 요구되고 있다.

본 발명의 목적은, 숙주 세포에 발현 또는 도입함으로써, 목적으로 하는 지방산 조성의 유지를 제조하거나, 목적으로 하는 지방산의 함유량을 증가시킬 수 있는 단백질 및 핵산을 제공하는 것이다.

본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 했다. 우선, 지질 생산균 Mortierella alpina의 EST 해석을 행하여, 그 중에서 기지의 PAP 유전자와 동일성이 높은 서열을 추출했다. 또한, PAP를 코드하는 오픈 리딩 프레임(ORF)의 전체 길이를 취득하기 위해, cDNA 라이브러리의 스크리닝 또는 PCR에 의해 유전자를 클로닝했다. 그 유전자를 효모 등의 고증식능을 갖는 숙주 세포에 도입하여 원하는 지방산 조성물의 생성을 시도한 발명자는, 그것을 도입하지 않은 숙주가 생성하는 지방산 조성물과 비교하여, 상이한 지방산 조성물을 생성할 수 있는 신규 PAP에 관한 유전자의 클로닝에 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 이하의 (a)∼(e) 중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산.

(a) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 포스파티딘산포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

(b) 서열번호 4로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 포스파티딘산포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

(c) 서열번호 4로 이루어진 염기 서열과 동일성이 70% 이상인 염기 서열로 이루어지고, 포스파티딘산포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

(d) 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 포스파티딘산포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

(e) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 포스파티딘산포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

(2) 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나인 염기 서열을 포함하는 (1)에 기재된 핵산.

(a) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 포스파티딘산포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

(b) 서열번호 4로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건하에서 하이브리드화하고, 포스파티딘산포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

(c) 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 포스파티딘산포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

(3) 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나에 기재된 염기 서열 또는 그 단편을 포함하는 핵산.

(a) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열

(b) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열

(c) 서열번호 1로 표시되는 염기 서열

(4) 이하의 (a)∼(e) 중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산.

(a) 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열

서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 단백질이 발현되어 있는 숙주의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼vi) 중의 적어도 하나 이상이, 상기 단백질이 발현되지 않은 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질

i) 올레인산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율

iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율

iv) 팔미트산 함유량에 대한 스테아르산 및 올레인산의 합계 함유량의 비율

v) 탄소수 16의 지방산의 함유량에 대한 탄소수 18의 지방산의 함유량의 비율, 및

vi) 아라키돈산, 디호모감마리놀렌산 및/또는 감마리놀렌산의 함유량의 비율

(b) 서열번호 4로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열

상기 단백질이 발현되어 있는 숙주의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼vi) 중의 적어도 하나 이상이, 상기 단백질이 발현되지 않은 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질

i) 올레인산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율

iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율

(c) 서열번호 4로 이루어진 염기 서열과 동일성이 70% 이상인 염기 서열로 이루어지고, 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열

i) 올레인산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율

iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율

(d) 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열

서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 단백질이 발현되어 있는 숙주의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼vi) 중의 적어도 하나 이상이, 상기 단백질이 발현되지 않은 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질

i) 올레인산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율

iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율

(e) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열

i) 올레인산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율

iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율

(5) 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나인 염기 서열을 포함하는 (4)에 기재된 핵산.

(a) 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열

서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 단백질이 발현되어 있는 숙주의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼vi) 중의 적어도 하나 이상이, 상기 단백질이 발현되지 않은 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질

i) 올레인산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율

iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율

(b) 서열번호 4로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건하에서 하이브리드화하고, 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열

i) 올레인산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율

iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율

(c) 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열

서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 단백질이 발현되어 있는 숙주의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼vi) 중의 적어도 하나 이상이, 상기 단백질이 발현되지 않은 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질

i) 올레인산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율

iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율

(6) 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 하나에 기재된 단백질.

(a) 서열번호 2에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 포스파티딘산포스파타아제 활성을 갖는 단백질

(b) 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열로 이루어진 단백질이고, 포스파티딘산포스파타아제 활성을 갖는 단백질

(7) 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 하나에 기재된 단백질.

(a) 서열번호 2에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 아미노산 서열로 이루어진 단백질이 발현되어 있는 숙주의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼vi) 중의 적어도 하나 이상이, 상기 단백질이 발현되지 않은 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질

i) 올레인산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율

iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율

(b) 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 아미노산 서열로 이루어진 단백질이 발현되어 있는 숙주의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼vi) 중의 적어도 하나 이상이, 상기 단백질이 발현되지 않은 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질

i) 올레인산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율

iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율

(8) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질.

(9) (1)∼(5) 중 어느 하나에 기재된 핵산을 함유하는 재조합 벡터.

(10) (9)에 기재된 재조합 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환체.

(11) (10)에 기재된 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 지방산 조성물로서, 상기 지방산 조성물의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼vi) 중의 적어도 하나 이상이, (9)의 재조합 벡터에 의해 형질 전환되지 않은 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물의 상기 비율보다 높은 것을 특징으로 하는 상기 지방산 조성물.

i) 올레인산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율

iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율

(12) (10)에 기재된 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터 (11)에 기재된 지방산 조성물을 채취하는 것을 특징으로 하는 상기 지방산 조성물의 제조방법.

(13) (11)에 기재된 지방산 조성물을 포함하는 식품.

본 발명의 PAP는, PAP를 도입하지 않은 숙주가 생성하는 지방산 조성물과 비교하여, 조성이 상이한 지방산 조성물을 숙주 중에 생성할 수 있다. 이것에 의해, 원하는 특성이나 효과를 갖는 지질을 제공할 수 있기 때문에, 식품, 화장료, 의약품, 비누 등에 적용할 수 있는 것으로서 유용하다.

또, 본 발명의 PAP는 지방산이나 저장 지질의 생산능의 향상을 도모할 수 있기 때문에, 미생물이나 식물 중에서의 고도 불포화지방산의 생산성을 향상시키는 것으로서 바람직하다.

도 1은, 본 발명의 MaPAP1의 cDNA 서열과 추정 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는, MaPAP1p의 추정 아미노산 서열(서열번호 2)과, PAP2 패밀리 단백질의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다. 도면 중, 이중 밑줄로 표시된 3개의 부분은 PAP2 패밀리 효소의 보존 영역을 나타내고, *는 PAP 활성에 필수인 아미노산 잔기를 나타낸다.

본 발명은, 포스파티딘산을 탈인산화하여 디아실글리세롤을 생성하는 것을 특징으로 하는 Mortierella속 유래의 신규 포스파티딘산포스파타아제 유전자에 관한 것이다.

본 발명의 포스파티딘산포스파타아제(PAP)는, 포스파티딘산을 탈인산화하여 디아실글리세롤을 생성하는 반응을 촉매하는 효소이다. 본 발명의 PAP의 기질은 통상 포스파티딘산이지만, 이것에 한정되지 않는다.

본 발명의 포스파티딘산포스파타아제를 코드하는 핵산

본 발명의 포스파티딘산포스파타아제(PAP)에는, MaPAP1이 포함된다. MaPAP1을 코드하는 핵산의 cDNA, CDS, ORF 및 아미노산 서열의 대응 관계를 이하의 표 1에 정리하여 기재했다.

[표 1]

즉, 본 발명의 PAP와 관련된 서열로는, MaPAP1의 아미노산 서열인 서열번호 2, MaPAP1의 ORF의 영역을 나타내는 서열인 서열번호 4, 그리고, 그 CDS의 영역을 나타내는 서열인 서열번호 3 및 그 cDNA의 염기 서열인 서열번호 1을 들 수 있다. 이 중, 서열번호 3은 서열번호 1의 제105-1223번째 염기 서열에 해당하고, 서열번호 4는 서열번호 1의 제105-1220번째 염기 서열 및 서열번호 3의 제1-1116번째 염기 서열에 해당한다.

본 발명의 핵산은, 단일쇄 및 이중쇄의 DNA 외에, 그 RNA 상보체도 포함하며, 천연 유래인 것이어도 되고, 인공적으로 제작한 것이어도 된다. DNA에는, 예를 들어, 게놈 DNA나, 상기 게놈 DNA에 대응하는 cDNA, 화학적으로 합성된 DNA, PCR에 의해 증폭된 DNA 및 이들의 조합이나, DNA와 RNA의 하이브리드를 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 핵산의 바람직한 형태로는, (a) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열, (b) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열, (c) 서열번호 1로 표시되는 염기 서열 등을 들 수 있다.

서열번호 4로 표시되는 염기 서열 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열 및 서열번호 1로 표시되는 염기 서열은, 표 1에 기재한 바와 같다.

상기 염기 서열을 얻기 위해서는, PAP 활성을 갖는 생물의 EST나 게놈 DNA의 염기 서열 데이터로부터, 기지의 PAP 활성을 갖는 단백질과 동일성이 높은 단백질을 코드하는 염기 서열을 탐색할 수도 있다. PAP 활성을 갖는 생물로는, 지질 생산균이 바람직하고, 지질 생산균으로는 M.alpina를 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.

EST 해석을 행하는 경우에는, 우선 cDNA 라이브러리를 제작한다. cDNA 라이브러리의 제작 방법에 관해서는, 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))를 참조할 수 있다. 또, 시판하는 cDNA 라이브러리 제작 키트를 이용해도 된다. 본 발명에 적합한 cDNA 라이브러리의 제작 방법으로는, 예를 들어 이하와 같은 방법을 들 수 있다. 즉, 지질 생산균인 M.alpina의 적당한 주를 적당한 배지에 식균하여 적당 기간 전(前)배양한다. 이 전배양에 적합한 배양 조건으로는, 예를 들어, 배지 조성으로는, 1.8% 글루코오스, 1% 효모 엑기스, pH 6.0을 들 수 있고, 배양 기간은 3일간, 배양 온도는 28℃인 조건을 들 수 있다. 그 후, 전배양물을 적당한 조건으로 본 배양한다. 본 배양에 적합한 배지 조성으로는, 예를 들어, 1.8% 글루코오스, 1% 대두분, 0.1% 올리브유, 0.01% 아데칸올, 0.3% KH₂PO₄, 0.1% Na₂SO₄, 0.05% CaCl₂ㆍ2H₂O, 0.05% MgCl₂ㆍ6H₂O, pH 6.0을 들 수 있다. 본 배양에 적합한 배양 조건으로는, 예를 들어, 300 rpm, 1 vvm, 26℃에서 8일간 통기 교반 배양하는 조건을 들 수 있다. 배양 기간중에 적당량의 글루코오스를 첨가해도 된다. 본 배양중에 적시에 배양물을 채취하고, 거기에서 균체를 회수하여, 전체 RNA를 조제한다. 전체 RNA의 조제에는, 염산구아니딘/CsCl법 등의 공지의 방법을 이용할 수 있다. 얻어진 전체 RNA로부터 시판하는 키트를 이용하여 poly(A)⁺RNA를 정제할 수 있다. 또한, 시판하는 키트를 이용하여 cDNA 라이브러리를 제작할 수 있다. 그 후, 제작한 cDNA 라이브러리의 임의의 클론의 염기 서열을, 벡터 상에 인서트 부분의 염기 서열을 결정할 수 있도록 설계된 프라이머를 이용하여 결정하여, EST를 얻을 수 있다. 예를 들어, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE)로 cDNA 라이브러리를 제작한 경우는, 다이렉셔널 클로닝을 행할 수 있다.

본 발명의 MaPAP1 유전자를 BLASTX 해석한 결과, 가장 E-value가 낮은, 즉 동일성이 높은 Neurospora crassa 유래의 디아실글리세롤피로포스페이트포스파타아제(DPP1) 동족체(accession No.CAD70721)를 코드하는 염기 서열과의 동일성은 57.4%이고, 그리고, 그 아미노산 서열과의 동일성은 59.3%이다.

본 발명은 또한, 상기 서열번호 4로 표시되는 염기 서열(「본 발명의 염기 서열」로 기재하는 경우도 있다) 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열(「본 발명의 아미노산 서열」로 기재하는 경우도 있다)로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산과 동등한 기능을 갖는 핵산을 포함한다. 「동등한 기능을 갖는다」란, 본 발명의 염기 서열이 코드하는 단백질 및 본 발명의 아미노산 서열로 이루어진 단백질이 PAP 활성을 갖는 것을 의미한다. 또, 이 PAP 활성에 더해, 본 발명의 염기 서열이 코드하는 단백질, 또는 본 발명의 아미노산 서열로 이루어진 단백질이 발현되어 있는 숙주의 지방산 조성에서, 이하의

i) 올레인산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율

iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율

중의 적어도 하나 이상이, 상기 단백질이 발현되지 않은 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질(이하, 「본 발명의 PAP의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질」이라고 하는 경우도 있다)인 경우도 포함된다.

구체적으로는, 상기 본 발명의 염기 서열 등을 발현 벡터 pYE22m(Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995)에 삽입한 것을, 효모 Saccharomyces cerevisiae EH13-15주(Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989)를 숙주로서 형질 전환시켜, 얻어진 형질 전환체를 배양하여 회수한 균체를, 이하의 실시예 6 등에 기재된 방법으로 지방산 해석을 한 경우의 상기 본 발명의 PAP의 지방산 조성이, 구체적으로, 이하의

i) 올레인산 함유량이 46% 이상, 바람직하게는 48% 이상, 50% 이상, 52% 이상, 54% 이상;

ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율이 7.0 이상, 바람직하게는 8.0 이상, 8.5 이상;

iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율이 7.5 이상, 바람직하게는 8.0 이상, 10.0 이상, 12.0 이상, 13.0 이상;

iv) 팔미트산 함유량에 대한 스테아르산 및 올레인산의 함유량의 비율이 8.0 이상, 바람직하게는 10.0 이상, 12.0 이상, 14.0 이상, 14.5 이상;

v) 탄소수 16의 지방산의 함유량에 대한 탄소수 18의 지방산의 함유량의 비율이 1.1 이상, 바람직하게는 1.2 이상, 1.3 이상, 1.4 이상; 및,

vi) 아라키돈산의 함유율이 0.45 이상, 바람직하게는 0.50 이상, 0.53 이상, 0.55 이상, 디호모감마리놀렌산의 함유율이 0.34 이상, 바람직하게는 0.40 이상, 0.42 이상, 0.45 이상 및/또는 감마리놀렌산의 함유율이 0.55 이상, 바람직하게는 0.65 이상, 0.67 이상, 0.70 이상, 0.75 이상(상기 수치는, 아라키돈산 생성 효모에서 본 발명의 PAP 유전자를 발현시킨 경우의 총지방산에 차지하는 비율이다.)

중의 적어도 하나 이상의 수치를 만족하는 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질을 코드하고 있는 염기 서열을 포함하는 핵산이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 염기 서열 등은, PAP 활성 및 상기 본 발명의 PAP의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산이다.

본 발명의 지방산 조성물의 특징 중 하나로서, 아라키돈산 함유율이 높다는 것을 들 수 있다. 아라키돈산은, 화학식 C₂₀H₃₂O₂로 표시되는 분자량 304.47의 물질이고, 4개의 이중 결합을 포함하는 20개의 탄소쇄로 이루어진 카르복실산(〔20:4(n-6)〕)이며, (n-6)계로 분류된다. 아라키돈산은, 동물의 세포막 중의 중요한 인지질(특히 포스파티딜에탄올아민ㆍ포스파티딜콜린ㆍ포스파티딜이노시톨)로서 존재하며, 뇌에 많이 포함된다. 또한 아라키돈산은, 아라키돈산 캐스케이드에 의해 생성되는 프로스타그란딘ㆍ트롬복산ㆍ류코트리엔 등 일련의 에이코사노이드의 출발 물질이며, 세포간 시그널 전달의 세컨드 메신저로서도 중요하다. 한편, 아라키돈산은, 동물에서는 리놀산을 원료로서 체내에서 합성된다. 그러나, 동물의 종 또는 연령 등에 따라서는, 그 기능이 충분하지 않아 필요한 양을 생산할 수 없거나, 또는 생산하는 기능이 전혀 없기 때문에, 음식물로부터 아라키돈산을 섭취해야 하므로, 아라키돈산은 필수지방산이라고 할 수 있다.

본 발명의 지방산 조성물 중의 아라키돈산 함유율은, 예를 들어, 이하와 같이 측정할 수 있다. 즉, 본 발명의 PAP의 플러스미드를, 예를 들어, 실시예 8에 기재된 방법에 의해 pDuraSC나 pDura5MCS 등의 벡터에 삽입하고, M.alpina 주에 의해 형질 전환하여 얻어진 형질 전환체를 발현시키고, 실시예 8에 기재된 배양 방법 등에 따라서 얻어진 배양 균체를 이용하여 균체내의 지방산 함유율이나 배지당 아라키돈산의 함유량 등을 측정하는 방법이다. 아라키돈산의 함유량 등의 분석 방법으로는, 예를 들어, 얻어진 배양 균체의 지방산을 염산메탄올법에 의해 지방산메틸에스테르로 유도한 후, 헥산으로 추출하고 헥산을 증류 제거하고 나서, 가스 크로마토그래피로 분석하는 방법을 들 수 있다. 이것에 의하면, 본 발명의 PAP를 M.alpina에 의해 형질 전환시킨 경우는, 균체내의 지방산 함유율도 배지당 아라키돈산 생산량도 높다는 것이 나타났다. 이와 같이, 아라키돈산 함유율이 높은 본 발명의 지방산 조성물은, 아라키돈산을 효율적으로 섭취할 수 있기 때문에 바람직하다.

또, 본 발명의 지방산 조성물의 특징 중 하나로서, 디호모감마리놀렌산 함유율이 높다는 것을 들 수 있다. 디호모감마리놀렌산(DGLA)은, 화학식 C₂₀H₃₄O₂로 표시되는 분자량 306.48의 물질이고, 3개의 이중 결합을 포함하는 20개의 탄소쇄로 이루어진 카르복실산(〔20:3(n-6)〕)이며, (n-6)계로 분류된다. DGLA는, 감마리놀렌산(18:3(n-6))이 신장함으로써 얻어진다. DGLA의 이중 결합이 1개 증가하면 아라키돈산이 생성된다.

또한, 본 발명의 지방산 조성물의 특징 중 하나로서, 감마리놀렌산 함유율이 높다는 것을 들 수 있다. 감마리놀렌산은, 화학식 C₁₈H₃₀O₂로 표시되는 분자량 278.436의 물질이고, 3개의 이중 결합을 포함하는 18개의 탄소쇄로 이루어진 카르복실산(〔18:3(n-6)〕)이며, (n-6)계로 분류된다. 인간은, 리놀산(〔18:2(n-6)〕)을 원료로서 Δ6 불포화화 효소에 의한 탈수소 반응에 의해 감마리놀렌산을 생성할 수 있지만, 대부분은 식품으로부터 섭취하고 있다.

이러한 본 발명의 핵산과 동등한 기능을 갖는 핵산으로는, 이하의 (a)∼(e) 중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산을 들 수 있다. 이하의 염기 서열의 기재에서, 「본 발명의 상기 활성」이란, 상기 「PAP 활성 및/또는 상기 본 발명의 PAP의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성」을 의미한다.

(a) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다.

구체적으로는,

(i) 서열번호 2에 나타내는 아미노산 서열 중 1개 또는 복수개(바람직하게는 1개 또는 몇개(예를 들어, 1∼110개, 1∼100개, 1∼75개, 1∼50개, 1∼30개, 1∼25개, 1∼20개, 1∼15개, 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개))의 아미노산이 결실된 아미노산 서열,

(ii) 서열번호 2에 나타내는 아미노산 서열 중 1개 또는 복수개(바람직하게는 1개 또는 몇개(예를 들어 1∼110개, 1∼100개, 1∼75개, 1∼50개, 1∼30개, 1∼25개, 1∼20개, 1∼15개, 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개))의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열,

(iii) 서열번호 2에 나타내는 아미노산 서열에서 1개 또는 복수개(바람직하게는 1개 또는 몇개(예를 들어 1∼110개, 1∼100개, 1∼75개, 1∼50개, 1∼30개, 1∼25개, 1∼20개, 1∼15개, 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개))의 다른 아미노산이 부가된 아미노산 서열, 또는

(iv) 상기 (i)∼(iii)을 조합한 아미노산 서열로 이루어진 단백질이며 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열이다.

상기 중, 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 보존적 치환이란, 특정 아미노산 잔기를 유사한 물리화학적 특징을 갖는 잔기로 치환하는 것이지만, 원래의 서열 구조에 관한 특징을 실질적으로 변화시키지 않는다면 어떠한 치환이어도 되며, 예를 들어, 치환 아미노산이, 원래의 서열에 존재하는 나선을 파괴하거나, 원래의 서열을 특징짓는 다른 종류의 2차 구조를 파괴하지 않는다면 어떠한 치환이어도 된다.

보존적 치환은, 일반적으로는, 생물학적 합성계나 화학적 펩티드 합성에 의해 도입되지만, 화학적 펩티드 합성에 의한 것이 바람직하다. 이 경우, 치환기에는, 비천연 아미노산 잔기가 포함되어 있어도 되고, 펩티드 모방체나, 아미노산 서열 중, 치환되어 있지 않은 영역이 역전되어 있는 역전형 또는 동영역이 반전되어 있는 반전형도 포함된다.

이하에, 아미노산 잔기를 치환 가능한 잔기별로 분류하여 예시하지만, 치환 가능한 아미노산 잔기는 이하에 기재되어 있는 것에 한정되지 않는다.

A군 : 루신, 아이소루신, 노르루신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, O-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌 및 시클로헥실알라닌

B군 : 아스파라긴산, 글루타민산, 이소아스파라긴산, 이소글루타민산, 2-아미노아디프산 및 2-아미노수베린산

C군 : 아스파라진 및 글루타민

D군 : 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산 및 2,3-디아미노프로피온산

E군 : 프롤린, 3-히드록시프롤린 및 4-히드록시프롤린

F 군 : 세린, 트레오닌 및 호모세린

G군 : 페닐알라닌 및 티로신

비보존적 치환의 경우는, 상기 종류 중 어떤 하나의 멤버와 다른 종류의 멤버를 교환할 수 있지만, 이 경우는, 본 발명의 단백질의 생물학적 기능을 유지하기 위해서, 아미노산의 수치요법 지수(hydropathic index)(수치요법 아미노산 지수)를 고려하는 것이 바람직하다(Kyte등, J.Mol.Biol., 157 : 105-131(1982)).

또, 비보존적 치환의 경우는, 친수성에 기초하여 아미노산의 치환을 행할 수 있다.

본 명세서 및 도면에서, 염기나 아미노산 및 그 약어는, IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature에 따르거나, 또는, 예를 들어 Immunology--A Synthesis(제2판, E.S.Golub 및 D.R.Gren 감수, Sinauer Associates, 매사추세츠주 선더랜드(1991)) 등에 기재되어 있는 당업계에서 관용되고 있는 약어에 기초한다. 또, 아미노산에 관하여 광학 이성체가 있을 수 있는 경우는, 특별히 명시하지 않으면 L체를 나타낸다.

D-아미노산 등의 상기 아미노산의 입체 이성체, α,α-2치환 아미노산 등의 비천연 아미노산, N-알킬아미노산, 젖산 및 그 밖의 비관용적인 아미노산도 또한 본 발명의 단백질을 구성하는 요소가 될 수 있다.

본 명세서에서 이용하는 단백질의 표기법은, 표준적 용법 및 당업계에서 관용되고 있는 표기법에 기초하여, 좌측 방향은 아미노 말단 방향이고, 우측 방향은 카르복시 말단 방향이다.

마찬가지로, 일반적으로는 특별히 언급하지 않는 한, 단일쇄 폴리뉴클레오티드 서열의 좌단(左端)은 5'단이고, 이중쇄 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 방향을 5' 방향으로 한다.

당업자라면, 당업계에서 공지의 기술을 이용하여, 본 명세서에 기재한 단백질의 적당한 변이체를 설계하여 제작할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성에 그다지 중요하지 않다고 생각되는 영역을 타게팅함으로써, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성을 손상하지 않고 그 구조를 변화시킬 수 있는 단백질 분자 중의 적절한 영역을 확인할 수 있다. 또, 유사 단백질 사이에 보존되어 있는 분자의 잔기 및 영역을 확인할 수도 있다. 또한, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성 또는 구조에 중요하다고 생각되는 영역 중에, 생물학적 활성을 손상하지 않고, 또한 단백질의 폴리펩티드 구조에 악영향을 미치지 않고, 보존적 아미노산 치환을 도입할 수도 있다. 특히, 본 발명에서는, 도 2 중에 이중 밑줄로 나타낸 바와 같이, 본 발명의 MaPAP1의 아미노산 서열(서열번호 2) 중의 제146∼154 잔기, 제202∼205 잔기 및 제260∼264 잔기에, Mg² ⁺ 비의존성의 포스파티딘산포스파타아제 2형(PAP2) 패밀리 효소의 3개의 보존 영역이 존재한다. 또, PAP2 패밀리 효소의 3개의 보존 영역 중, 도메인 1의 아르기닌, 도메인 2 및 3의 히스티딘은, 활성에 필수적인 아미노산으로서 알려져 있고, 본 발명의 MaPAP1에서도 그 아미노산이, 각각 서열번호 2의 제153 잔기의 아르기닌, 제205 잔기의 히스티딘 및 제260 잔기의 히스티딘으로서 보존되어 있다. 상기 보존 영역은, PAP2 패밀리 효소에 필수적인 영역이며, 본 발명의 PAP에서도 중요한 영역이다. 따라서, 본 발명의 변이체는, 상기 보존 영역이 보존되어 있는 한, 어떠한 변이체이어도 된다.

당업자라면, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성 또는 구조에 중요하고, 동단백질의 펩티드와 유사한 펩티드의 잔기를 확인하여, 이 2개의 펩티드의 아미노산 잔기를 비교하여, 본 발명의 단백질과 유사한 단백질의 어느 잔기가, 생물학적 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 잔기인지를 예측하는, 소위 구조-기능 연구를 할 수 있다. 또한, 이와 같이 예측한 아미노산 잔기의 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택함으로써, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성이 유지되어 있는 변이체를 선택할 수도 있다. 또, 당업자라면, 본 단백질의 변이체의 삼차원 구조 및 아미노산 서열을 해석할 수도 있다. 또한, 얻어진 해석 결과로부터, 단백질의 삼차원 구조에 관한, 아미노산 잔기의 정렬을 예측할 수도 있다. 단백질 표면 상에 있다고 예측되는 아미노산 잔기는, 다른 분자와의 중요한 상호 작용에 관여할 가능성이 있지만, 당업자라면, 상기와 같은 해석 결과에 기초하여, 이러한 단백질 표면 상에 있다고 예측되는 아미노산 잔기를 변화시키지 않는 변이체를 제작할 수 있다. 또한, 당업자라면, 본 발명의 단백질을 구성하는 각각의 아미노산 잔기 중, 하나의 아미노산 잔기만을 치환하는 변이체를 제작할 수도 있다. 이러한 변이체를 공지의 분석 방법에 의해 스크리닝하여, 개개의 변이체의 정보를 수집할 수 있다. 이것에 의해, 어떤 특정한 아미노산 잔기가 치환된 변이체의 생물학적 활성이, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성에 비하여 저하되는 경우, 그와 같은 생물학적 활성을 나타내지 않는 경우, 또는, 본 단백질의 생물학적 활성을 저해하는 부적절한 활성이 발생하는 경우를 비교함으로써, 본 발명의 단백질을 구성하는 개개의 아미노산 잔기의 유용성을 평가할 수 있다. 또, 당업자라면, 이러한 일상적인 실험에서 수집한 정보에 기초하여, 단독으로, 또는 다른 돌연 변이와 조합하여, 본 발명의 단백질의 변이체로서는 바람직하지 않은 아미노산 치환을 용이하게 해석할 수 있다.

상기와 같이, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 단백질은, 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001)), 『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997), Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92, Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6 등에 기재된 부위 특이적 변이 유발법 등의 방법에 따라서 조제할 수 있다. 이러한 아미노산의 결실, 치환 또는 부가 등의 변이가 이루어진 변이체의 제작은, 예를 들어, Kunkel법이나 Gapped duplex법 등의 공지의 방법에 의해, 부위 특이적 돌연변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트, 예를 들어 QuikChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit(스트라타진사 제조), GeneTailor^TM Site-Directed Mutagenesis System(인비트로젠사 제조), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K, Mutan-Super Express Km 등 : 다카라바이오사 제조) 등을 이용하여 행할 수 있다.

단백질의 아미노산 서열에, 그 활성을 유지하면서 하나 또는 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 도입하는 방법으로는, 상기 부위 특이적 변이 유발 외에도, 유전자를 변이원으로 처리하는 방법, 및 유전자를 선택적으로 개열하여 선택된 뉴클레오티드를 제거, 치환 또는 부가한 후에 연결하는 방법을 들 수 있다.

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 바람직하게는, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열이다.

또, 본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열에는, 바람직하게는, 서열번호 2에서 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열도 포함된다.

본 발명의 단백질에서의 아미노산의 변이 또는 수식의 수, 또는 변이 또는 수식의 부위는, PAP 활성, 또는 본 발명의 PAP의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성이 유지되는 한 제한은 없다.

본 발명의 PAP 활성, 또는 본 발명의 PAP의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성은, 공지의 방법을 이용하여 측정하는 것이 가능하다. 예를 들어, 이하의 문헌 : J. Biol. Chem., 273, 14331-14338(1998)을 참조할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 「PAP 활성」은 이하와 같이 측정해도 된다. 본 발명의 PAP를 발현시킨 효모로부터, J. Bacteriology, 173, 2026-2034(1991)에 기재된 방법 등에 의해 마이크로솜 획분을 조제한다. 그리고, 반응액인 0.5 mM 포스파티딘산, 10 mM 2-메르캅토에탄올, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5)에 상기 마이크로솜 획분을 첨가하여, 28℃에서 적당 시간 반응시켜, 클로로포름 : 메탄올을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 지질을 추출하고, 얻어진 지질을 박층 크로마토그래피 등에 의해 분획하여, 생성된 디아실글리세롤량을 정량할 수 있다.

또, 본 발명의 「PAP의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성」은, 예를 들어 이하와 같이 측정해도 된다. 본 발명의 지방산 조성물의 제조방법에 의해 얻어진 동결 건조시킨 균체에, 적당한 비율로 조정한 클로로포름 : 메탄올을 첨가하여 교반한 후, 적당 시간 가열 처리를 한다. 또한 원심 분리에 의해 균체를 분리하고, 용매를 회수하는 것을 수회 반복한다. 그 후, 적당한 방법을 이용하여 지질을 건고시키고 나서, 클로로포름 등의 용매를 첨가하여 지질을 용해한다. 이 시료를 적당량 취하여, 염산메탄올법에 의해 균체의 지방산을 메틸에스테르로 유도한 후에, 헥산으로 추출하고 헥산을 증류 제거하고 나서, 가스 크로마토그래피로 분석한다.

(b) 서열번호 4로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열번호 4로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다. 서열번호 4 및 PAP 활성에 관해서는 상기와 같다.

상기 염기 서열은, 당업자에게 공지인 방법으로 적당한 단편을 이용하여 프로브를 제작하고, 이 프로브를 이용하여 콜로니 하이브리다이제이션, 플라크(plaque) 하이브리다이제이션, 서던 블롯 등의 공지의 하이브리다이제이션법에 의해, cDNA 라이브러리 및 게놈 라이브러리 등으로부터 얻을 수 있다.

하이브리다이제이션법의 상세한 순서에 관해서는, 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001); 특히 Section 6-7), 『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997); 특히 Section6.3-6.4), 『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995); 하이브리다이제이션 조건에 관해서는 특히 Section2.10) 등을 참조할 수 있다.

하이브리다이제이션 조건의 강도는, 주로 하이브리다이제이션 조건, 보다 바람직하게는, 하이브리다이제이션 조건 및 세정 조건에 의해 결정된다. 본 명세서에서의 「엄격한 조건」에는, 중간 정도 또는 고도로 엄격한 조건이 포함된다.

구체적으로는, 중간 정도로 엄격한 조건으로는, 예를 들어 하이브리다이제이션 조건으로서, 1×SSC∼6×SSC, 42℃∼55℃의 조건, 보다 바람직하게는 1×SSC∼3×SSC, 45℃∼50℃의 조건, 가장 바람직하게는 2×SSC, 50℃의 조건을 들 수 있다. 하이브리다이제이션 용액 중에, 예를 들어 약 50%의 포름아미드를 포함하는 경우에는, 상기 온도보다 5 내지 15℃ 낮은 온도를 채택한다. 세정 조건으로는, 0.5×SSC∼6×SSC, 40℃∼60℃를 들 수 있다. 하이브리다이제이션 및 세정시에는, 일반적으로 0.05%∼0.2%, 바람직하게는 약 0.1% SDS를 첨가해도 된다.

고도로 엄격한(고 엄격) 조건으로는, 중간 정도로 엄격한 조건보다 높은 온도 및/또는 낮은 염농도에서의 하이브리다이제이션 및/또는 세정을 포함한다. 예를 들어, 하이브리다이제이션 조건으로서, 0.1×SSC∼2×SSC, 55℃∼65℃의 조건, 보다 바람직하게는 0.1×SSC∼1×SSC, 60℃∼65℃의 조건, 가장 바람직하게는 0.2×SSC, 63℃의 조건을 들 수 있다. 세정 조건으로서, 0.2×SSC∼2×SSC, 50℃∼68℃, 보다 바람직하게는 0.2×SSC, 60∼65℃를 들 수 있다.

특히 본 발명에 이용되는 하이브리다이제이션 조건으로는, 예를 들어, 5×SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5) 및 50% 포름아미드 중 42℃의 조건으로 프리 하이브리다이제이션을 행한 후, 프로브를 첨가하여 하룻밤 42℃로 유지하여 하이브리드 형성하고, 그 후에 0.2×SSC, 0.1% SDS 중, 65℃에서 20분간의 세정을 3회 행한다는 조건을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

또, 프로브에 방사성 물질을 사용하지 않는 시판하는 하이브리다이제이션킷트를 사용할 수도 있다. 구체적으로는, DIG 핵산 검출 키트(로슈ㆍ다이어그노스틱스사), ECL direct labeling & detection system(Amersham사 제조)를 사용한 하이브리다이제이션 등을 들 수 있다.

본 발명에 포함되는 염기 서열로는, 바람직하게는, 서열번호 4로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건하에서 하이브리드화하고, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 들 수 있다.

(c) 서열번호 4로 이루어진 염기 서열과 동일성이 70% 이상인 염기 서열로 이루어지고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열번호 4에 표시되는 핵산 서열에 대하여 적어도 70% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다.

바람직하게는, 서열번호 4에 표시되는 핵산 서열에 대하여 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 80%(예를 들어, 85% 이상, 한층 더 바람직하게는 90% 이상, 나아가 95%, 98% 또는 99%)의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 핵산이고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 들 수 있다.

2개의 핵산 서열의 동일성%는, 시각적 검사나 수학적 계산에 의해 결정할 수 있지만, 컴퓨터 프로그램을 사용하여 2개의 핵산의 서열 정보를 비교함으로써 결정하는 것이 바람직하다. 서열 비교 컴퓨터 프로그램으로는, 예를 들어, 미국 국립 의학 라이브러리의 웹사이트: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html에서 이용할 수 있는 BLASTN 프로그램(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10) : 버젼 2.2.7, 또는 WU-BLAST2.0 알고리즘 등을 들 수 있다. WU-BLAST2.0에 관한 표준적인 디폴트 파라미터의 설정은, 이하의 인터넷사이트: http://blast.wustl.edu에 기재되어 있는 것을 이용할 수 있다.

(d) 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다. 본 발명의 핵산이 코드하는 단백질은, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질과 동등한 기능을 갖는 한, MaPAP1의 아미노산 서열과 동일성이 있는 단백질이어도 된다.

구체적으로는, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%(예를 들어 95%, 나아가 98%) 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 바람직하게는, 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열이다. 더욱 바람직하게는, 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열이다.

2개의 아미노산 서열의 동일성 퍼센트는, 시각적 검사 및 수학적 계산에 의해 결정할 수 있다. 또, 컴퓨터 프로그램을 이용하여 동일성 퍼센트를 결정할 수도 있다. 그와 같은 컴퓨터 프로그램으로는, 예를 들어, BLAST, FASTA(Altschul 등, J. Mol. Biol., 215:403-410(1990)) 및 ClustalW 등을 들 수 있다. 특히, BLAST 프로그램에 의한 동일성 검색의 각종 조건(파라미터)은, Altschul 등(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)에 기재된 것으로, 미국 바이오테크놀로지 정보 센터(NCBI)나 DNA Data Bank of Japan(DDBJ)의 웹사이트에서 공적으로 입수할 수 있다(BLAST메뉴얼, Altschul 등 NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul 등). 또, 유전 정보 처리 소프트웨어 GENETYX Ver.7(제네틱스), DINASIS Pro(히타치소프트), Vector NTI(Infomax) 등의 프로그램을 이용하여 결정할 수도 있다.

복수의 아미노산 서열을 병렬시키는 특정한 정렬 스킴은, 서열 중 특정한 짧은 영역의 매칭도 나타낼 수 있기 때문에, 이용한 서열의 전체 길이 서열 사이에 유의한 관계가 없는 경우라 하더라도, 그와 같은 영역에서, 특정한 서열 동일성이 매우 높은 영역을 검출할 수도 있다. 또한, BLAST 알고리즘은, BLOSUM62 아미노산 스코어를 매긴 매트릭스를 이용할 수 있지만, 선택 파라미터로는, 이하의 것을 이용할 수 있다: (A) 낮은 조성 복잡성을 갖는 쿼리(query) 서열의 세그먼트(Wootton 및 Federhen의 SEG 프로그램(Computers and Chemistry, 1993)에 의해 결정된다 ; Wootton 및 Federhen, 1996 「서열 데이터베이스에서의 조성 편중 영역의 해석(Analysis of compositionally biased regions in sequence databases)」 Methods Enzymol., 266: 544-71도 참조하기 바람) 또는 단주기성의 내부 리피트로 이루어진 세그먼트(Claverie 및 States(Computers and Chemistry, 1993)의 XNU 프로그램에 의해 결정된다)를 마스크하기 위한 필터를 포함하는 것 및 (B) 데이터베이스 서열에 대한 적합을 보고하기 위한 통계학적 유의성의 임계값, 또는 E-스코어(Karlin 및 Altschul, 1990)의 통계학적 모델에 따라서, 단순히 우연에 의해 발견되는 적합의 기대 확률; 어떤 적합에 기인하는 통계학적 유의차가 E-스코어 임계값보다 큰 경우, 이 적합은 보고되지 않는다.

(e) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다.

서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 및 하이브리드화의 조건은 상기와 같다. 본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열로는, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 들 수 있다.

또, 본 발명의 핵산에는, 서열번호 4로 이루어진 염기 서열에서 하나 또는 복수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산도 포함된다. 구체적으로는,

(i) 서열번호 4에 나타내는 염기 서열 중 1개 또는 복수개(바람직하게는 1개 또는 몇개(예를 들어, 1∼330개, 1∼300개, 1∼250개, 1∼200개, 1∼150개, 1∼100개, 1∼50개, 1∼30개, 1∼25개, 1∼20개, 1∼15개, 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개))의 염기가 결실된 염기 서열,

(ii) 서열번호 4에 나타내는 염기 서열 중 1개 또는 복수개(바람직하게는 1개 또는 몇개(예를 들어 1∼330개, 1∼300개, 1∼250개, 1∼200개, 1∼150개, 1∼100개, 1∼50개, 1∼30개, 1∼25개, 1∼20개, 1∼15개, 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개))의 염기가 다른 염기로 치환된 염기 서열,

(iii) 서열번호 4에 나타내는 염기 서열에서 1개 또는 복수개(바람직하게는 1개 또는 몇개(예를 들어 1∼330개, 1∼300개, 1∼250개, 1∼200개, 1∼150개, 1∼100개, 1∼50개, 1∼30개, 1∼25개, 1∼20개, 1∼15개, 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개))의 다른 염기가 부가된 염기 서열, 또는

(iv) 상기 (i)∼(iii)를 조합한 염기 서열이며, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하고 있는 염기 서열을 포함하는 핵산을 이용할 수도 있다.

본 발명의 핵산의 바람직한 형태로는, 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나에 기재된 염기 서열의 단편을 포함하는 핵산도 포함된다.

(a) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열

(c) 서열번호 1로 표시되는 염기 서열

(a) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열, (b) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열, (c) 서열번호 1로 표시되는 염기 서열에 관해서는, 표 1에 기재한 바와 같다. 상기 서열의 단편은, 상기 염기 서열에 포함되는 ORF, CDS, 생물학적 활성을 갖는 영역, 이하에 기재하는 프라이머로서 이용한 영역, 프로브가 될 수 있는 영역이 포함되며, 천연 유래인 것이어도 되고, 인공적으로 제작한 것이어도 된다.

본 발명의 포스파티딘산포스파타아제 단백질

본 발명의 단백질은, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 및 상기 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질을 포함하며, 천연 유래인 것이어도 되고, 인공적으로 제작한 것이어도 된다. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에 관해서는, 상기와 같다. 「동등한 기능을 갖는 단백질」이란, 상기 『본 발명의 포스파티딘산포스파타아제를 코드하는 핵산』의 항에서 설명한 바와 같이 「본 발명의 상기 활성」을 갖는 단백질을 의미한다.

본 발명에서, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질로는, 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 하나에 기재된 단백질을 들 수 있다.

(a) 서열번호 2에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질

(b) 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열로 이루어진 단백질이고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질

상기 중, 서열번호 2에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열 또는 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열에 관해서는, 상기 『본 발명의 포스파티딘산포스파타아제를 코드하는 핵산』의 항에서 설명한 바와 같다. 또, 상기 「본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질」은, 서열번호 4의 염기 서열을 포함하는 핵산에 의해 코드되는 단백질의 변이체 또는 서열번호 2에 표시되는 아미노산 서열에서 1개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가 등의 많은 종류의 수식에 의해 변이한 단백질, 또는 아미노산 측쇄 등이 수식되어 있는 수식 단백질, 다른 단백질과의 융합 단백질이며, PAP 활성을 갖는 단백질 및/또는 본 발명의 PAP의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질도 포함된다.

또, 본 발명의 단백질은, 인공적으로 제작한 것이어도 되고, 그 경우는, Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또, 어드밴스드켐텍사 제조, 퍼킨엘마사 제조, 파마시아사 제조, 프로테인 테크놀로지 인스트루먼트사 제조, 신세셀-베가사 제조, 퍼셉티브사 제조, 시마즈제작소사 제조 등의 펩티드 합성기를 이용하여 화학 합성할 수도 있다.

PAP 의 핵산의 클로닝

본 발명의 PAP의 핵산은, 예를 들어, 적절한 프로브를 이용하여 cDNA 라이브러리로부터 스크리닝함으로써, 클로닝할 수 있다. 또, 적절한 프라이머를 이용하여 PCR 반응에 의해 증폭시켜, 적절한 벡터에 연결함으로써 클로닝할 수 있다. 또한, 별도의 벡터에 서브 클로닝할 수도 있다.

예를 들어, pBlue-Script^TM SK(+)(Stratagene), pGEM-T(Promega), pAmp(TM : Gibco-BRL), p-Direct(Clontech), pCR2.1-TOPO(Invitrogene) 등의 시판하는 플러스미드 벡터를 이용할 수 있다. 또, PCR 반응으로 증폭시키는 경우, 프라이머는, 상기 서열번호 1 등에 표시되는 염기 서열의 어느 부분이라도 이용할 수 있지만, 예를 들어, 서열번호 1에 대해서는,

상류측용 프라이머로서, D-1 : 5'-CATGGGTTGCTTCGCGCGCAAGACG-3' (서열번호 5),

하류측용 프라이머로서, D-2 : 5'-CGAAGCCGGCAAAGGCGGCAGTC-3' (서열번호 6),

등을 이용할 수 있다. 그리고, M.alpina 균체로부터 조제한 cDNA에, 상기 프라이머 및 DNA 폴리머라아제 등을 작용시켜 PCR 반응을 행한다. 상기 방법은, 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001)) 등에 따라서, 당업자라면 용이하게 행할 수 있지만, 본 발명의 PCR 반응의 조건으로는, 예를 들어 이하의 조건을 들 수 있다.

변성 온도 : 90∼95℃

어닐링 온도 : 40∼60℃

신장 온도 : 60∼75℃

사이클수 : 10회 이상

얻어진 PCR 산물의 정제에는 공지의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, GENECLEAN(일본 Funakoshi Co., Ltd.), QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN), ExoSAP-IT(GE 헬스케어 바이오사이언스) 등의 키트를 이용하는 방법, DEAE-셀룰로오스 여과지를 이용하는 방법, 투석 튜브를 이용하는 방법 등이 있다. 아가로스겔을 이용하는 경우에는, 아가로스겔 전기 영동을 행하여, 염기 서열 단편을 아가로스겔로부터 잘라내어, GENECLEAN(일본 Funakoshi Co., Ltd.), QIAquick Gel extraction Kits(QIAGEN), 프리즈&스퀴즈법(freeze-squeeze) 등으로 정제할 수 있다.

클로닝한 핵산의 염기 서열은, 염기 서열 시퀀서를 이용하여 결정할 수 있다.

PAP 발현용 벡터 구축 및 형질 전환체의 제작

본 발명은 또한, 본 발명의 PAP를 코드하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환체도 제공한다.

이러한 재조합 벡터 및 형질 전환체는 이하와 같이 하여 얻을 수 있다. 즉, 본 발명의 PAP를 코드하는 핵산을 갖는 플러스미드를 제한 효소를 이용하여 소화한다. 이용하는 제한 효소로는, 예를 들어, EcoRI, KpnI, BamHI 및 SalI 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 말단을 T4 폴리머라아제 처리함으로써 평활화해도 된다. 소화후의 염기 서열 단편을 아가로스겔 전기 영동에 의해 정제한다. 이 염기 서열 단편을, 발현용 벡터에 공지의 방법을 이용하여 삽입함으로써, PAP 발현용 벡터를 얻을 수 있다. 이 발현 벡터를 숙주에 도입하여 형질 전환체를 제작하여, 목적으로 하는 단백질의 발현에 이용한다.

이 때, 발현 벡터 및 숙주는, 목적으로 하는 단백질을 발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 숙주로서, 진균이나 세균, 식물, 동물 또는 그들의 세포 등을 들 수 있다. 진균으로서, 지질 생산균인 M.alpina 등의 사상균, 사카로마이시스ㆍ세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 등의 효모 등을 들 수 있다. 또 세균으로서, 대장균(Escherichia coli)이나 바실러스ㆍ섭틸리스(Bacillus subtilis) 등을 들 수 있다. 또한 식물로는, 유채씨, 대두, 목화, 홍화, 아마 등의 유량(油糧) 식물을 들 수 있다.

지질 생산균으로는, 예를 들어, MYCOTAXON, Vol.XLIV, NO.2, pp.257-265(1992)에 기재되어 있는 균주를 사용할 수 있고, 구체적으로는, 모티에렐라(Mortierella)속에 속하는 미생물, 예를 들어 모티에렐라ㆍ엘롱가타(Mortierella elongata) IFO8570, 모티에렐라ㆍ엑시구아(Mortierella exigua) IFO8571, 모티에렐라ㆍ하이그로필라(Mortierella hygrophila) IFO5941, 모티에렐라ㆍ알피나(Mortierella alpina) IFO8568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS 219.35, CBS224.37, CBS250.53, CBS343.66, CBS527.72, CBS528.72, CBS529.72, CBS608.70, CBS754.68 등의 모티에렐라아속(subgenus Mortierella)에 속하는 미생물, 또는 모티에렐라ㆍ이사벨리나(Mortierella isabellina) CBS194.28, IFO6336, IFO7824, IFO7873, IFO7874, IFO8286, IFO8308, IFO7884, 모티에렐라ㆍ나나(Mortierella nana) IFO8190, 모티에렐라ㆍ라마니아나(Mortierella ramanniana) IFO5426, IFO8186, CBS112.08, CBS212.72, IFO7825, IFO8184, IFO8185, IFO8287, 모티에렐라ㆍ비나세아(Mortierella vinacea) CBS236.82 등의 마이크로뮤코속(subgenus Micromucor)에 속하는 미생물 등을 들 수 있다. 특히, 모티에렐라ㆍ알피나(Mortierella alpina)가 바람직하다.

진균류를 숙주로서 이용하는 경우는, 본 발명의 핵산이 숙주 중에서 자립 복제 가능하거나, 또는 그 균의 염색체 상에 삽입될 수 있는 구조인 것이 바람직하다. 그리고 동시에, 프로모터, 터미네이터를 포함하는 구성인 것이 바람직하다. 숙주로서 M.alpina를 사용하는 경우, 발현 벡터로서, 예를 들어, pD4, pDuraSC, pDura5 등을 들 수 있다. 프로모터로는, 숙주 중에서 발현시킬 수 있는 것이라면 어떠한 프로모터를 이용해도 되고, 예를 들어, histonH4.1 유전자 프로모터, GAPDH(글리세르알데히드-3-인산데히드로게나아제) 유전자 프로모터, TEF(Translation elongation factor) 유전자 프로모터와 같은 M.alpina에 유래하는 프로모터가 이용된다.

M.alpina 등의 사상균을 재조합 벡터에 도입하는 방법으로는, 예를 들어, 일렉트로포레이션법, 스페로플라스트법, 파티클딜리버리법 및 핵내에서의 DNA의 직접 마이크로인젝션 등을 들 수 있다. 영양 요구성의 호스트주를 이용하는 경우는, 그 영양소가 결여된 선택 배지 상에서 생육하는 주를 선택함으로써, 형질 전환주를 취득할 수 있다. 또, 형질 전환에 약제 내성 마커 유전자를 이용하는 경우에는, 그 약제를 포함하는 선택 배지에서 배양하여, 약제 내성을 나타내는 세포 콜로니를 얻을 수 있다.

효모를 숙주로서 이용하는 경우는, 발현 벡터로서, 예를 들어, pYE22m 등을 들 수 있다. 또, pYES(Invitrogen), pESC(STRATAGENE) 등의 시판하는 효모 발현용 벡터를 이용해도 된다. 또 본 발명에 적합한 숙주로는, Saccharomyces cerevisiae EH13-15주(trp1, MATα) 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 프로모터로는, 예를 들어, GAPDH 프로모터, gal1 프로모터, gal10 프로모터 등의 효모 등에 유래하는 프로모터가 이용된다.

효모에 재조합 벡터를 도입하는 방법으로는, 예를 들어, 아세트산리튬법, 일렉트로포레이션법, 스페로플라스트법, 덱스트란 중개 트랜스펙션, 인산칼슘 침전, 폴르브렌 중개 트랜스펙션, 프로토플라스트 융합, 리포솜 중의 폴리뉴클레오티드(단수 또는 복수)의 피포 및 핵내에서의 DNA의 직접 마이크로인젝션 등을 들 수 있다.

대장균 등의 세균을 숙주로서 이용하는 경우는, 발현 벡터로는, 예를 들어 파마시아사의 pGEX, pUC18 등을 들 수 있다. 프로모터로는, 예를 들어, trp 프로모터, lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터 등의 대장균이나 파아지 등에 유래하는 프로모터가 이용된다. 세균에 재조합 벡터를 도입하는 방법으로는, 예를 들어 일렉트로포레이션법이나 염화칼슘법을 이용할 수 있다.

본 발명의 지방산 조성물의 제조방법

본 발명은, 상기 형질 전환체로부터 지방산 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 즉, 상기 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터 지방산 조성물을 제조하는 방법이다. 구체적으로는, 이하의 방법으로 제조할 수 있다. 그러나, 본 제조방법에 관해서는, 이 방법에 한정되지 않고, 일반적인 공지의 다른 방법을 이용하여 행할 수도 있다.

PAP를 발현시킨 생물의 배양에 이용하는 배지는, 적당한 pH 및 침투압을 가지며, 각 숙주의 증식에 필요한 영양소, 미량 성분, 혈청이나 항생 물질 등의 생물 재료를 포함하고 있는 배양액(배지)이라면, 어떠한 배양액도 이용할 수 있다. 예를 들어, 효모를 형질 전환하여 PAP를 발현시킨 경우는, SC-Trp 배지, YPD 배지, YPD5 배지 등을 이용할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 구체적인 배지의 조성으로서 SC-Trp 배지를 예시한다 : 1 ℓ당 Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 루신 1.8 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g, 유라실 0.6 g을 혼합한 것) 1.3 g).

배양 조건은, 숙주의 증식에 적합하며, 생성된 효소가 안정적으로 유지되기에 적당한 조건이라면 어떠한 조건이어도 되지만, 구체적으로는, 혐기도, 배양 시간, 온도, 습도, 정치 배양 또는 진탕 배양 등의 개개의 조건을 조절할 수 있다. 배양 방법은, 동일 조건에서의 배양(1단계 배양)이어도 되고, 2 이상의 상이한 배양 조건을 이용하는, 소위 2단계 배양 또는 3단계 배양이어도 되지만, 대량 배양을 하는 경우에는, 배양 효율이 좋은 2단계 배양 등이 바람직하다.

이하에, 본 발명의 지방산 조성물의 구체적인 제조방법으로서, 숙주로서 효모를 이용하여 2단계 배양을 행한 경우를 예시하여 설명한다. 즉, 전배양으로서, 상기에서 얻어진 콜로니를, 예를 들어 상기 SC-Trp 배지 등에 식균하여, 30℃에서 2일간 진탕 배양을 행한다. 그 후, 본 배양으로서, YPD5(2% 효모 엑기스, 1% 폴리펩톤, 5% 글루코오스) 배지 10 ㎖에 전배양액을 500 ㎕ 첨가하여, 30℃에서 2일간 진탕 배양을 행하는 방법이다.

본 발명의 지방산 조성물

본 발명은 또한, 본 발명의 PAP가 발현되어 있는 세포에서의 1 또는 그 이상의 지방산의 집합체인 지방산 조성물을 제공한다. 지방산은, 유리 지방산이어도 되고, 트리글리세리드, 인지질 등이어도 된다. 특히, 본 발명의 지방산 조성물은, 그 지방산 조성에서, 이하의

i) 올레인산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율

iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율

중의 적어도 하나 이상이, 본 발명의 재조합 벡터에 의해 형질 전환되지 않은 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물의 상기 비율보다 높은 것을 특징으로 한다. 여기서, 「본 발명의 재조합 벡터에 의해 형질 전환되지 않은 숙주」란, 예를 들어, 본 명세서 중의 「본 발명의 포스파티딘산포스파타아제를 코드하는 핵산」의 항목에서 기재한 핵산이 삽입되지 않은 벡터(공벡터)에 의해 형질 전환된 숙주다.

본 발명의 지방산 조성물에 포함되는 지방산은, 장쇄 탄수화물의 쇄형 또는 분기형의 모노카르복실산을 말하며, 예를 들어, 미리스틴산(테트라데칸산)(14:0), 미리스트레인산(테트라데센산)(14:1), 팔미트산(헥사데칸산)(16:0), 팔미트레인산(9-헥사데센산)(16:1), 스테아르산(옥타데칸산)(18:0), 올레인산(cis-9-옥타데센산)(18:1(9)), 박센산(11-옥타데센산)(18:1(11)), 리놀산(cis, cis-9,12 옥타데카디엔산)(18:2(9,12)), α-리놀렌산(9,12,15-옥타데칸트리엔산)(18:3(9,12,15)), 감마리놀렌산(6,9,12-옥타데칸트리엔산)(18:3(6,9,12)), 스테아리돈산(6,9,12,15-옥타데칸테트리엔산)(18:4(6,9,12,15)), 아라키딘산(이코산산)(20:0), (8,11-이코사디엔산)(20:2(8,11)), 미드산(5,8,11-이코사트리엔산)(20:3(5,8,11)), 디호모감마리놀렌산(8,11,14-이코사트리엔산)(20:3(8,11,14)), 아라키돈산(5,8,11,14-이코사테트라엔산)(20:4(5,8,11,14)), 에이코사테트라엔산(5,11,14,17-이코사테트라엔산)(20:4(5,11,14,17), 에이코사펜타엔산(5,8,11,14,17-이코사펜타엔산)(20:5(5,8,11,14,17)), 베헨산(도코산산)(22:0), (7,10,13,16-도코사테트라엔산)(22:4(7,10,13,16)), (4,7,13,16,19-도코사펜타엔산)(22:5(4,7,13,16,19)), (4,7,10,13,16-도코사펜타엔산)(22:5(4,7,10,13,16)), (4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산)(22:6(4,7,10, 13,16,19)), 리노글리세린산(테트라도코산산)(24:0), 네르본산(cis-15-테트라도코산산)(24:1), 세로틴산(헥사도코산산)(26:0) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 상기 물질명은 IUPAC 생화학 명명법으로 정의된 관용명이며, 조직명 및, 탄소수와 이중 결합의 위치를 나타내는 수치를, 괄호내에 기재했다.

본 발명의 지방산 조성물은, 상기 지방산 중, 하나 또 그 이상의 지방산의 조합이라면, 어떠한 수의 어떠한 종류의 지방산으로 이루어진 조성물이어도 된다.

이러한 본 발명의 지방산 조성물이 얻어진 것, 즉 본 발명의 PAP가 발현된 것은, 공지의 일반적인 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 효모에서 PAP를 발현시킨 경우는, 지방산 조성의 변화로서 확인할 수 있다. 즉, 상기 본 발명의 지방산 조성물의 제조방법에 의해 얻어진 동결 건조시킨 균체에, 적당한 비율로 조정한 클로로포름 : 메탄올을 첨가하여 교반한 후, 적당한 시간 가열 처리를 한다. 또한 원심 분리에 의해 균체를 분리하여 용매를 회수하는 것을 수회 반복한다. 그 후, 적당한 방법을 이용하여 지질을 건고시키고 나서, 클로로포름 등의 용매를 첨가하여 지질을 용해한다. 이 시료를 적당량 취하여, 염산메탄올법에 의해 균체의 지방산을 메틸에스테르로 유도한 후에, 헥산으로 추출하고 헥산을 증류 제거하고 나서, 가스 크로마토그래피로 분석한다.

그 결과, 상기 지방산 조성을 갖는 지방산 조성물이 얻어진 경우는, 본 발명의 지방산 조성물이 얻어졌다고 판단할 수 있다.

본 발명의 지방산 조성물을 포함하는 식품 등

또, 본 발명은, 상기 지방산 조성물을 포함하는 식품을 제공한다. 본 발명의 지방산 조성물은, 통상의 방법에 따라서, 예를 들어, 유지를 포함하는 식품, 공업 원료(화장료, 의약(예를 들어, 피부외용약), 비누 등의 원료)의 제조 등의 용도로 사용할 수 있다. 화장료(조성물) 또는 의약(조성물)의 제형으로는, 용액형, 페이스트형, 겔형, 고체형, 분말형 등 임의의 제형을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또, 식품의 형태로는, 캡슐 등의 의약 제제의 형태, 또는 단백질, 당류, 지방, 미량 원소, 비타민류, 유화제, 향료 등에 본 발명의 지방산 조성물이 배합된 자연 유동식, 반소화형태 영양식 및 성분 영양식, 드링크제, 경장 영양제 등의 가공 형태를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 식품의 예로는, 영양 보조 식품, 건강 식품, 기능성 식품, 유아용 식품, 유아용 조제유, 미숙아용 조제유, 노인용 식품 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 명세서에서는, 식품이란, 고체, 유동체 및 액체, 그리고 이들의 혼합물로서, 섭식 가능한 것의 총칭이다.

영양 보조 식품이란, 특정한 영양 성분이 강화되어 있는 식품을 말한다. 건강 식품이란, 건강적인 또는 건강에 좋다고 하는 식품을 말하며, 영양 보조 식품, 자연 식품, 다이어트 식품 등이 포함된다. 기능성 식품이란, 몸의 조절 기능을 하는 영양 성분을 보급하기 위한 식품을 말하며, 특정 보건용 식품과 동일한 의미이다. 유아용 식품이란, 약 6세까지의 아이를 위한 식품을 말한다. 노인용 식품이란, 비처리 식품에 비하여 소화 및 흡수가 용이하도록 처리된 식품을 말한다. 유아용 조제유란, 약 1세까지의 아이를 위한 조제유를 말한다. 미숙아용 조제유란, 미숙아가 생후 약 6개월이 될 때까지 주기 위한 조제유를 말한다.

이러한 식품으로는, 고기, 생선, 너츠 등의 천연 식품(유지로 처리한 것); 중화요리, 라면, 스프 등의 조리시에 유지를 첨가하는 식품; 튀김, 후라이, 유부, 볶음밥, 도너츠, 튀긴 과자 등의 열매체로서 유지를 사용한 식품; 버터, 마가린, 마요네즈, 드레싱, 쵸콜렛, 즉석 라면, 캬라멜, 비스킷, 쿠키, 케이크, 아이스크림 등의 유지 식품 또는 가공시에 유지를 첨가한 가공 식품; 카키모찌(살짝 구운 짭짤한 과자), 하드비스킷, 팥빵 등의 가공 마무리시에 유지를 분무 또는 도포한 식품 등을 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 식품은, 유지를 포함하는 식품에 한정되지 않고, 예를 들어, 빵, 면류, 밥, 과자류(캔디, 츄잉껌, 젤리, 정과, 화과자), 두부 및 그 가공품 등의 농산 식품; 청주, 약용주, 맛술, 식초, 간장, 된장 등의 발효 식품; 요구르트, 햄, 베이컨, 소시지 등의 축산 식품; 찐 어묵, 튀긴 어묵, 한펜(상어살 어묵) 등의 수산 식품; 과즙 음료, 청량 음료, 스포츠 음료, 알콜 음료, 차 등을 들 수 있다.

본 발명의 PAP 를 코드하는 핵산 또는 PAP 단백질을 이용한 균주의 평가ㆍ선택 방법

본 발명은 또한, 본 발명의 PAP를 코드하는 핵산 또는 PAP 단백질을 이용하여, 지질 생산균을 평가 또는 선택하는 방법을 제공한다. 구체적으로는 이하와 같다.

(1) 평가 방법

본 발명의 한 형태로서, 본 발명의 PAP를 코드하는 핵산 또는 PAP 단백질을 이용하여, 지질 생산균을 평가하는 방법을 들 수 있다. 본 발명의 상기 평가 방법으로는, 우선 본 발명의 염기 서열에 기초하여 설계한 프라이머 또는 프로브를 이용하여, 피검 균주인 지질 생성 균주의 본 발명의 상기 활성에 관해 평가하는 방법을 들 수 있다. 이러한 평가 방법의 일반적 방법은 공지되어 있고, 예를 들어, 국제 특허 출원 팜플렛 WO01/040514호, 일본 특허 공개 평 8-205900호 공보 등에 기재되어 있다. 이하, 이 평가 방법에 관해 간단히 설명한다.

우선 피검 균주의 게놈을 조제한다. 조제 방법은, Hereford법이나 아세트산칼륨법 등, 공지의 어떠한 방법이라도 이용할 수 있다(예를 들어, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990) 참조).

본 발명의 염기 서열, 바람직하게는, 서열번호 4에 기초하여 프라이머 또는 프로브를 설계한다. 상기 프라이머 또는 프로브는 본 발명의 염기 서열 중 어느 부분이라도 이용하는 수 있고, 또 그 설계는 공지의 방법을 이용하여 행할 수 있다. 프라이머로서 이용하는 폴리뉴클레오티드의 염기수는, 통상 10 염기 이상이며, 15∼25 염기인 것이 바람직하다. 또, 삽입하는 부분의 염기수는, 통상 300∼2000 염기가 적당이다.

상기에서 제작한 프라이머 또는 프로브를 이용하여, 상기 피검 균주의 게놈 중에 본 발명의 염기 서열과 특이적인 서열이 존재하는지의 여부를 조사한다. 본 발명의 염기 서열과 특이적인 서열의 검출은, 공지의 방법을 이용하여 행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 염기 서열에 특이적 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 하나의 프라이머로서 이용하고, 또 하나의 프라이머로서 이 서열보다 상류 또는 하류의 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 이용하며, 예를 들어, PCR법 등에 의해 피검 균주의 핵산을 증폭시켜, 증폭물의 유무, 증폭물의 분자량의 크기 등을 측정할 수 있다.

본 발명의 방법에 적합한 PCR법의 반응 조건은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 이하의 조건을 들 수 있다.

변성 온도 : 90∼95℃

어닐링 온도 : 40∼60℃

신장 온도 : 60∼75℃

사이클수 : 10회 이상

등의 조건이다. 얻어진 반응 생성물은 아가로스겔 등을 이용한 전기 영동법 등에 의해 분리하여, 증폭 산물의 분자량을 측정할 수 있다. 이에 따라, 증폭 산물의 분자량이 본 발명의 염기 서열과 특이적인 영역에 해당하는 핵산 분자를 포함하는 크기인지의 여부를 확인함으로써, 피검 균주의 본 발명의 상기 활성을 예측 또는 평가할 수 있다. 또, 상기 증폭 산물의 염기 서열을 상기 방법 등으로 해석함으로써, 본 발명의 상기 활성을 보다 정확하게 예측 또는 평가할 수 있다. 본 발명의 상기 활성의 평가 방법은 상기와 같다.

또, 본 발명의 상기 평가 방법으로는, 피검 균주를 배양하여, 서열번호 4 등의 본 발명의 염기 서열이 코드하는 PAP의 발현량을 측정함으로써, 피검 균주의 본 발명의 상기 활성을 평가할 수도 있다. PAP의 발현량은, 피검 균주를 적당한 조건으로 배양하여, PAP의 mRNA 또는 단백질을 정량함으로써 측정할 수 있다. mRNA 또는 단백질의 정량은, 공지의 방법을 이용하여 행할 수 있다. mRNA의 정량은, 예를 들어, 노던 하이브리다이제이션이나 정량적 RT-PCR에 의해, 단백질의 정량은, 예를 들어, 웨스턴 블로팅에 의해 행할 수 있다(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003). 또, 상기 활성의 평가 방법으로서, 본 발명의 PAP가 생성하는 지방산 조성물의 조성을 측정하는 방법을 들 수도 있다. 지방산 조성물의 조성의 측정 방법은 상기와 같다.

(2) 선택 방법

본 발명의 다른 형태로서, 본 발명의 PAP를 코드하는 핵산 또는 PAP 단백질을 이용하여, 지질 생산균을 선택하는 방법을 들 수 있다. 본 발명의 상기 선택 방법으로는, 피검 균주를 배양하여, 서열번호 4 등의 본 발명의 염기 서열이 코드하는 PAP의 발현량을 측정하고, 목적으로 하는 발현량의 균주를 선택함으로써, 원하는 활성을 갖는 균주를 선택할 수 있다. 또, 기준이 되는 균주를 설정하여, 이 기준 균주와 피검 균주를 각각 배양하고, 각 균주의 상기 발현량을 측정하여, 기준 균주와 피검 균주의 발현량을 비교하여, 원하는 균주를 선택할 수도 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 기준 균주 및 피검 균주를 적당한 조건으로 배양하고, 각 균주의 발현량을 측정하여, 기준 균주보다 피검 균주가 고발현 또는 저발현인 피검 균주를 선택함으로써, 원하는 활성을 갖는 균주를 선택할 수 있다. 원하는 활성에는, 상기와 같이, PAP의 발현량 및 PAP가 생성하는 지방산 조성물의 조성을 측정하는 방법을 들 수 있다.

또, 본 발명의 상기 선택 방법으로는, 피검 균주를 배양하여, 본 발명의 상기 활성이 높거나 또는 낮은 균주를 선택함으로써, 원하는 활성을 갖는 피검 균주를 선택할 수도 있다. 원하는 활성에는, 상기와 같이, PAP의 발현량 및 PAP가 생성하는 지방산 조성물의 조성을 측정하는 방법을 들 수 있다.

피검 균주 또는 기준 균주로는, 예를 들어, 상기 본 발명의 벡터를 도입한 균주, 상기 본 발명의 핵산의 발현이 억제된 균주, 돌연 변이 처리가 실시된 균주, 자연 변이된 균주 등을 이용할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 PAP 활성 및 PAP의 지방산 조성물을 형성할 수 있는 활성은, 예를 들어 본 명세서 중의 「본 발명의 포스파티딘산포스파타아제를 코드하는 핵산」, 「본 발명의 지방산 조성물」의 항목에서 기재한 방법에 의해 측정하는 것이 가능하다. 돌연 변이 처리로는, 예를 들어, 자외선 조사나 방사선 조사 등의 물리적 방법, EMS(에틸메탄술포네이트), N-메틸-N-니트로소구아니딘 등의 약제 처리에 의한 화학적 방법 등을 들 수 있지만(예를 들어, 오오시마 야스히로 편저, 생물화학 실험법 39 효모 분자 유전학 실험법, p.67-75, 학회출판센터 등 참조), 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 기준 균주, 피검 균주로서 이용하는 균주로는, 상기 지질 생산균 또는 효모 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 구체적으로는, 기준 균주, 피검 균주는, 상이한 속이나 종이나 속하는 어떠한 균주를 조합하여 이용해도 되고, 피검 균주는 하나 또는 그 이상의 균주를 동시에 이용해도 된다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 실시예에 한정되지 않는다.

실시예 1

(1) EST 해석

M.alpina 1S-4주를 100 mL의 배지(1.8% 글루코오스, 1% 효모 엑기스, pH 6.0)에 식균하여, 3일간 28℃에서 전배양했다. 10 ℓ 배양조(Able Co., 도꾜)에 5 ℓ의 배지(1.8% 글루코오스, 1% 대두분, 0.1% 올리브유, 0.01% 아데칸올, 0.3% KH₂PO₄, 0.1% Na₂SO₄, 0.05% CaCl₂ㆍ2H₂O, 0.05% MgCl₂ㆍ6H₂O, pH 6.0)를 넣고, 전배양물을 전량 식균하여, 300 rpm, 1 vvm, 26℃의 조건으로 8일간 통기 교반 배양했다. 배양 1, 2 및 3일째에 각각 2%, 2% 및 1.5% 상당의 글루코오스를 첨가했다. 배양 1, 2, 3, 6 및 8일째의 각 스테이지에 균체를 회수하여, 염산구아니딘/CsCl법으로 total RNA를 조제했다. Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit(다카라바이오)를 이용하여, total RNA로부터 poly(A)⁺RNA를 정제했다. 각 스테이지의 cDNA 라이브러리를, ZAP-cDNA Synthesis Kit(STRATAGENE)를 이용하여 제작하고, cDNA의 5'측으로부터의 원패스 시퀀스 해석(8000 클론×5 스테이지)을 행했다. 얻어진 서열을 클러스터링했다.

(2) PAP 유전자 동족체의 탐색

EST 해석으로 얻어진 염기 서열을 GENBANK에 등록되어 있는 아미노산 서열에 대하여 상동성 검색 프로그램인 BLASTX으로 검색하여, PAP 유전자의 동족체를 추출했다. 그 결과, EST 중에서, Neurospora crassa 유래의 추정 단백질이며, PAP 활성을 갖는 디아실그리셀롤피로포스페이트포스파타아제(DPP) 동족체와 상동성이 높은 서열을 갖는 서열(서열번호 1)을 발견했다. 이 서열번호 1에 관한 EST 해석의 콘티그(contig)는, 상기 (1)의 8일째 라이브러리에 유래하는 서열 9개로 구성되어 있다.

실시예 2

(1) PAP 동족체 (MaPAP1)의 클로닝

PAP 동족체의 전체 길이 ORF를 포함하는 cDNA 단편을 취득하기 위해, 이하의 프라이머를 설계했다.

프라이머 D-1 : CATGGGTTGCTTCGCGCGCAAGACG(서열번호 5)

프라이머 D-2 : CGAAGCCGGCAAAGGCGGCAGTC(서열번호 6)

8일째 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, 상기 각각의 프라이머에 의해, ExTaq(다카라바이오)로 PCR 반응을 행했다. 얻어진 0.64 kbp의 DNA 단편을 TOPO-TA cloning Kit(인비트로젠)를 이용하여 TA 클로닝하고, 인서트 부분의 염기 서열을 결정했다.

그 결과, 서열번호 1의 113번째 내지 744번째 염기 서열을 포함하는 DNA 단편이 각각 클론화된 것을 확인하고, 이 플러스미드를 pCR-2051-P로 했다. 다음으로, 플러스미드 pCR-2051-P를 각각 주형으로 하여, 상기와 동일한 프라이머에 의해 PCR 반응을 행했다. 반응에는 ExTaq(다카라바이오)를 이용했지만, 여기에 첨부된 dNTP 믹스 대신 PCR 라벨링 믹스(로슈ㆍ다이어그노스틱스사)를 이용함으로써, 증폭되는 DNA를 디곡시게닌(DIG) 라벨링하여, cDNA 라이브러리를 스크리닝에 이용하는 프로브를 제작했다. 이 프로브를 이용하여 8일째 cDNA 라이브러리를 스크리닝했다.

하이브리다이제이션의 조건은 다음과 같이 하였다.

버퍼 : 5×SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 50% 포름아미드;

온도 : 42℃(하룻밤);

세정 : 0.2×SSC, 0.1% SDS 용액 중(65℃)에서 20분간×3회.

검출은, DIG 핵산 검출 키트(로슈ㆍ다이어그노스틱스사)에 의해 행했다. 스크리닝에 의해 얻어진 파아지 클론으로부터, in vivo 엑시젼(excision)에 의해 플러스미드를 잘라내어, 플러스미드 DNA를 얻었다.

상술한 바와 같이 cDNA를 스크리닝한 결과, 인서트의 길이가 가장 긴 클론의 염기 서열은 서열번호 1과 일치했다. 이 플러스미드를 pB-PAP1로 했다. 서열번호 1에는, 1119 bp로 이루어진 CDS(서열번호 3)가 포함되고 있어, PAP 동족체의 전체 길이를 코드하고 있는 서열을 얻을 수 있었다고 생각된다(도 1). 이 유전자를 MaPAP1 유전자로 명명했다. 이 유전자에 의해 코드되는 단백질(MaPAP1p)의 추정 아미노산 서열을 서열번호 2에 나타냈다.

(2) 서열 해석

MaPAP1 유전자의 염기 서열 및 이것이 코드하는 추정 아미노산 서열에 관해, BLAST 및 clustalW에 의한 해석으로, 기지의 핵산 서열 및 아미노산 서열에 대한 상동성 검색을 행했다. BLASTX에 의한 GENBANK에 등록되어 있는 아미노산 서열에 대한 상동성 검색으로 히트한 것 중에서, 가장 E-Value가 낮은 서열은, Neurospora crassa 유래의 DPP1 동족체인 추정 단백질(accession No.CAD70721)이었다. 아미노산 서열의 동일성은 59.3%, 이 단백질을 코드하는 핵산 서열과의 동일성은 57.4%였다. 또, 균류, 식물, 동물 유래의 Mg²⁺ 비의존성의 포스파티딘산포스파타아제 2형(PAP2) 패밀리 단백질 모두 히트했다. PAP2 패밀리 효소는 막단백질이며, 6회 막관통형 효소이다. 이들 PAP2 패밀리의 단백질의 아미노산 서열과, 본 연구에서 얻어진 MaPAP1 유전자가 코드하는 추정 아미노산 서열의 정렬을 도 2에 나타냈다. PAP2 패밀리 효소에는 3개의 보존 영역이 있고, 활성에 필수인 아미노산도 알려져 있다. 도 2에 나타낸 바와 같이, MaPAP1p에서도 이들 보존 영역은 보존되어 있고(도 2 중, 이중 밑줄로 나타낸 영역), 활성에 필수인 도메인 1의 아르기닌 잔기, 도메인 2와 도메인 3의 히스티딘 잔기(도 2 중, *로 나타낸 잔기)가 보존되어 있다.

실시예 3

효모 발현 벡터의 구축

MaPAP1을 효모에서 발현시키기 위해, 이하와 같이 효모 발현용 벡터를 구축했다. 우선, pB-PAP1을 주형으로 하여, 프라이머 D-1(서열번호 5)과 프라이머 D-3 : CCACTAAACTATGTTCTCAGGC(서열번호 7)에 의해, ExTaq(다카라바이오)로 PCR 반응을 행했다. 얻어진 1.1 kbp의 DNA 단편을 TOPO-TA clonging Kit(인비트로젠)를 이용하여 TA 클로닝하고, 염기 서열을 확인하여, MaPAP1의 CDS의 정확한 염기 서열(서열번호 3)을 갖는 플러스미드를 pCR-PAP1로 했다. 플러스미드 pCR-PAP1을 제한 효소 EcoRI로 부분 소화했다. 아가로스겔 전기 영동에 의해 약 1.1 kbp의 단편을 잘라내고, GFX DNA purification Kit(GE 헬스케어)로 정제하여, 효모용 발현 벡터 pYE22m(Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995)의 EcoRI 사이트에 연결했다. 삽입한 DNA 단편의 방향을 확인하여, pYE22m의 GAPDH 프로모터로부터 ORF가 전사되도록 삽입된 것을 각각 pYE-MAPAP1로 했다.

실시예 4

효모의 형질 전환

플러스미드 pYE22m, pYE-MAPAP1을 각각 이용하고 아세트산리튬법에 의해, 효모 Saccharomyces cerevisiae EH13-15주(trp1, MATα)(Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989)를 형질 전환했다. 형질 전환주는, SC-Trp(1 ℓ당, Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 루신 1.8 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g, 유라실 0.6 g을 혼합한 것) 1.3 g) 한천 배지(2% 아가) 상에서 생육하는 것으로서 선발했다.

실시예 5

효모의 배양

각각의 벡터에서의 형질 전환주 중 임의의 2주씩(c-1주 및 c-2주, 그리고 MaPAP1-1주 및 MaPAP1-2주)을 선택하여, 이하의 조건으로 배양했다.

즉, 전배양으로서, SC-Trp 배지 10 ㎖에 효모를 플레이트로부터 1 백금이(耳) 식균하여, 30℃에서 2일간 진탕 배양을 했다. 본 배양은, YPD5(효모 엑기스 2%, 폴리펩톤 1%, 글루코오스 5%) 배지 10 ㎖에 전배양액을 500 ㎕ 첨가하여, 30℃에서 2일간 진탕 배양을 했다.

실시예 6

효모의 지방산 분석

효모의 배양액을 원심 분리함으로써 균체를 회수했다. 10 ㎖의 멸균수로 세정하고, 원심 분리에 의해 다시 균체를 회수하여 동결 건조시켰다. 동결 건조 균체에 클로로포름 : 메탄올(2 : 1)을 4 ㎖ 첨가하여 격렬하게 교반한 후, 70℃에서 1시간 처리했다. 원심 분리에 의해 균체를 분리하고 용매를 회수했다. 남은 균체에 다시 클로로포름 : 메탄올(2 : 1)을 4 ㎖ 첨가하고, 마찬가지로 용매를 회수했다. 스피드백으로 지질을 건고시킨 후, 2 ㎖의 클로로포름을 첨가하여 지질을 용해했다. 이 시료 중, 200 ㎕를 취하여, 염산메탄올법에 의해 균체의 지방산을 메틸에스테르로 유도한 후, 헥산으로 추출하고 헥산을 증류 제거하여, 가스 크로마토그래피에 의해 분석했다.

그 결과를 표 2에 나타낸다.

[표 2]

형질 전환주의 지방산 조성(호스트 EH13-15)

MaPAP1을 도입한 효모(MaPAP1-1주, MaPAP1-2주)와, 컨트롤의 효모(C-1주, C 2주)의 지방산 조성을 비교했다. MaPAP1을 도입한 효모에서는, 올레인산의 비율이 컨트롤주에 비하여 2할 이상 상승했다. 팔미트산, 팔미트레인산의 비율은 컨트롤주에 비해 모두 감소하는 한편, 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율은 컨트롤주에 비하여 약간 상승했다. 또, MaPAP1을 도입한 효모에서의 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율 및 팔미트산 함유량에 대한 스테아르산 및 올레인산의 합계 함유량의 비율은, 컨트롤주에 비하여 상승했다. 또, MaPAP1을 도입한 효모에서는, 탄소수 16의 지방산에 대한 탄소수 18의 지방산의 비가 상승하여, 보다 장쇄의 지방산을 생성했다.

즉, MaPAP1 유전자를 발현시킴으로써 지방산 조성을 개변할 수 있다는 것이 나타났다.

실시예 7

아라키돈산 생성 효모에서의 발현 해석

(1) 아라키돈산 생성 효모의 육종

아라키돈산 생성 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 육종하기 위해, 이하의 플러스미드를 구축했다.

우선, M.alpina 1S-4주로부터 조제한 cDNA를 주형으로 하여, Δ12-f와 Δ12-r, Δ6-f와 Δ6-r, GLELO-f와 GLELO-r 또는Δ5-f와 Δ5-r와 같은 프라이머의 조합으로 ExTaq를 이용하여 PCR을 행하고, M.alpina 1S-4주의 Δ12 지방산 불포화화 효소 유전자, Δ6 지방산 불포화화 효소 유전자, GLELO 지방산 쇄장 연장 효소 유전자 및 Δ5 지방산 불포화화 효소 유전자를 증폭시켰다.

Δ12-f : TCTAGAatggcacctcccaacactattg(서열번호 8)

Δ12-r : AAGCTTTTACTTCTTGAAAAAGACCACGTC서열번호 9)

Δ6-f : TCTAGAatggctgctgctcccagtgtgag(서열번호 10)

Δ6-r : AAGCTTTTACTGTGCCTTGCCCATCTTGG(서열번호 11)

GLELO-f : TCTAGAatggagtcgattgcgcaattcc(서열번호 12)

GLELO-r : GAGCTCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC서열번호 13)

Δ5-f : TCTAGAatgggtgcggacacaggaaaaacc서열번호 14)

Δ5-r : AAGCTTTTACTCTTCCTTGGGACGAAGACC서열번호 15)

이들을 TOPO-TA-cloning Kit에 의해 클론화했다. 염기 서열을 확인하여, 서열번호 16-19의 염기 서열을 포함하는 클론을 각각 플러스미드 pCR-MAΔ12DS(서열번호 16의 염기 서열을 포함), pCR-MAΔ6DS(서열번호 17의 염기 서열을 포함), pCR-MAGLELO(서열번호 18의 염기 서열을 포함), pCR- MAΔ5DS(서열번호 19의 염기 서열을 포함)로 했다.

한편, 플러스미드 pURA34(일본 특허 공개 2001-120276)를 제한 효소 HindIII에서 소화하여 얻어진 약 1.2 kb의 DNA 단편을, 벡터 pUC18를 제한 효소 EcoRI와 SphI에서 소화한 후 말단을 평활화하고, 셀프라이게션하여 얻어진 벡터의 HindIII 사이트에 삽입하여, 벡터의 EcoRI 사이트측이 URA3의 5'측인 클론을 pUC-URA3으로 했다. 또, YEp13을 제한 효소 SalI와 XhoI에서 소화하여 얻어진 약 2.2 kb의 DNA 단편을 벡터 pUC18의 SalI 사이트에 삽입하여, 벡터의 EcoRI측이 LUE2의 5'측인 클론을 pUC-LEU2로 했다.

다음으로, 플러스미드 pCR-MAΔ12DS를 제한 효소 HindIII에서 소화한 후 말단을 평활화한 것을 제한 효소 XbaI에서 소화하여 얻어진 약 1.2 kbp의 DNA 단편과, 벡터 pESC-URA(STRATAGENE)를 제한 효소 SacI에서 소화한 후 말단을 평활화한 것을, 제한 효소 SpeI에서 소화한 약 6.6 kbp의 DNA 단편을 연결하여, 플러스미드 pESC-U-Δ12를 얻었다. 플러스미드 pCR-MAΔ6DS를 제한 효소 XbaI에서 소화한 후 말단을 평활화한 것을, 제한 효소 HindIII에서 소화하여 얻어진 약 1.6 kbp의 DNA 단편과, 플러스미드 pESC-U-Δ12를 제한 효소 SalI에서 소화한 후 말단을 평활화한 것을, 제한 효소 HindIII에서 소화한 약 8 kbp의 DNA 단편과 연결하여, 플러스미드 pESC-U-Δ12:Δ6을 얻었다. 이것을 제한 효소 PvuII에서 부분 소화하여 얻어진 약 4.2 kb의 단편을 pUC-URA3의 SmaI 사이트에 삽입하여, 플러스미드 pUC-URA-Δ12:Δ6을 얻었다.

또, 플러스미드 pCR-MAGLELO를 제한 효소 XbaI와 SacI에서 소화하여 얻어진 약 0.95 kbp의 DNA 단편과, 벡터 pESC-LEU(STRATAGENE)를 제한 효소 XbaI와 SacI에서 소화하여 얻어진 약 7.7 kbp의 DNA 단편과 연결하여, 플러스미드 pESC-L-GLELO를 얻었다. 플러스미드 pCR- MAΔ5DS를 제한 효소 XbaI에서 소화한 후 말단을 평활화한 것을, 제한 효소 HindIII에서 소화하여 얻어진 약 1.3 kbp의 DNA 단편과, 플러스미드 pESC-L-GLELO를 제한 효소 ApaI에서 소화한 후 말단을 평활화한 것을, 제한 효소 HindIII에서 소화하여 얻어진 약 8.7 kbp의 DNA 단편을 연결하여, 플러스미드 pESC-L-GLELO:Δ5를 얻었다. 이것을 제한 효소 PvuII에서 소화하여 얻어진 약 3.2 kb 단편을 pUC-LEU2의 SmaI 사이트에 삽입하여, 플러스미드 pUC-LEU-GLELO:Δ5를 얻었다.

S.cerevisiae YPH499주(STRATAGENE)를 플러스미드 pUC-URA-Δ12:Δ6과 플러스미드 pUC-LEU-GLELO:Δ5로 co-transformation했다. 형질 전환주는, SC-Leu, Ura(1 ℓ당, Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g, 트립토판 1.2 g을 혼합한 것) 1.3 g) 한천 배지(2% 아가) 상에서 생육하는 것으로서 선발했다. 이렇게 하여 얻어진 주 중 임의의 1주를 ARA3-1주로 했다.

(2) 아라키돈산 생성 효모의 형질 전환주의 취득과 해석

ARA3-1주를 플러스미드 pYE22m, pYE-MAPAP1에 의해 각각 형질 전환했다. 형질 전환주는, SC-Trp, Leu, Ura(1 ℓ당, Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g을 혼합한 것) 1.3 g) 한천 배지(2% 아가) 상에서 생육하는 것으로서 선발했다. 각 플러스미드를 도입한 주에서, 각각 임의의 4주를 선택했다.

이들 주를 상기 SC-Trp, Leu, Ura 액체 배지 10 ㎖에서 30℃, 1일간 배양하고, 그 중 1 ㎖을 SG-Trp, Leu, Ura(1 ℓ당, Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO) 6.7 g, 갈락토오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g을 혼합한 것) 1.3 g) 액체 배지 10 ㎖에서 15℃, 7일간 배양하여, 균체의 지방산 분석을 했다. 균체의 지방산 조성을 표 3에, 균체내의 유지함유율을 표 4에 나타냈다.

[표 3]

균체내 지방산 함유율(%)

[표 4]

총지방산 중에 차지하는 감마리놀렌산, DGLA, ARA의 비율(%)

이와 같이, 아라키돈산 생성 효모에서, M.alpina 유래의 PAP1 유전자를 고발현시킨 경우, 컨트롤주에 비하여 균체내 지방산 함유율이 높아졌다. 또, 총지방산에 차지하는 감마리놀렌산, DGLA, 아라키돈산의 비율이 모두 높아졌다.

실시예 8

M.alpina 발현용 벡터의 구축

M.alpina 발현용 벡터로서, GAPDH 프로모터로부터 목적 유전자를 발현시키는 pDuraSC와 히스톤 프로모터로부터 목적 유전자를 발현시키는 pDuraMCS를 이용했다.

PAP1를 M.alpina에서 발현시키기 위해, 이하와 같이 벡터를 구축했다. 플러스미드 pCR-PAP1을 제한 효소 PstI에서 소화하고, 이어서, 제한 효소 XhoI에서 부분 분해했다. 얻어진 DNA 단편 중 약 1.1 kb의 것을 잘라내어, 벡터 pDuraSC 또는 벡터 pDura5MCS의 멀티 클로닝 사이트의 PstI 사이트, XhoI 사이트에 삽입하여, 각각 플러스미드 pDuraSC-PAP1, 플러스미드 pDura5MCS-PAP1로 했다.

M. alpina 형질 전환주의 취득

이들 플러스미드에서, M.alpina로부터 특허문헌(WO2005019437 「지질 생산균의 육종 방법」) 방법에 따라 유도한 유라실 요구성 주 Δura-3를 숙주로 하여 파티클 딜리버리법으로 형질 전환을 했다. 형질 전환주의 선택에는, SC 한천 배지(Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate(Difco) 0.5%, 황산암모늄 0.17%, 글루코오스 2%, 아데닌 0.002%, 티로신 0.003%, 메티오닌 0.0001%, 아르기닌 0.0002%, 히스티딘 0.0002%, 리신 0.0004%, 트립토판 0.0004%, 트레오닌 0.0005%, 아이소루신 0.0006%, 루신 0.0006%, 페닐알라닌 0.0006%, 한천 2%)를 이용했다.

형질 전환 M. alpina 의 평가

얻어진 형질 전환주를, GY 배지(글루코오스 2%, 효모 엑기스 1%) 4 ㎖에 식균하여, 28℃에서 3일간 또는 4일간 진탕 배양을 행했다. 균체를 여과에 의해 회수하여, RNeasy plant kit(QIAGEN)를 이용하여 RNA를 추출했다. 슈퍼스크립트 퍼스트 스트랜드 시스템 for RT-PCR(인비트로젠)에 의해 cDNA를 합성했다. 도입한 컨스트럭트로부터의 각 유전자의 발현과, 토털의 각 유전자의 발현을 확인하기 위해, 이하의 프라이머의 조합으로 RT-PCR을 행했다.

○ 플러스미드 pDuraSC-PAP1 도입주

도입 컨스트럭트로부터의 PAP1의 발현 확인에 사용한 프라이머

MaGAPDHpfw : CACACCACACATTCAACATC (서열번호 20)

D2 : CGAAGCCGGCAAAGGCGGCAGTCG (서열번호 21)

토털의 PAP1의 발현 확인에 사용한 프라이머

D1 : CATGGGTTGCTTCGCGCGCAAGACG (서열번호 22)

D2 :

○ 플러스미드 pDura5MCS-PAP1 도입주

PD4P : CGCATCCCGCAAACACACAC (서열번호 23)

D2 :

토털의 PAP1의 발현 확인에 사용한 프라이머

D1 :

D2

상기 RT-PCR의 결과에서, 각 유전자의 도입 컨스트럭트로부터의 발현 및 토털의 발현이 높았던 것으로서, 플러스미드 pDuraSC-PAP1 도입주로부터 Gp-PAP1-49주를, 플러스미드 pDura5MCS-PAP1 도입주로부터 Hp-PAP1-2주를 각각 선발했다.

이들 주를, GY 배지 4 ㎖에 식균하여, 28℃, 125 rpm으로 진탕 배양했다. 배양 4일째에 균체의 전량을 여과에 의해 회수하여, 동결 건조시켰다. 건조 균체의 일부(약 10-20 mg 정도)를 취하여, 염산메탄올법에 의해 균체의 지방산을 메틸에스테르로 유도한 후, 헥산으로 추출하고 헥산을 증류 제거하여, 가스 크로마토그래피에 의해 분석했다. 균체내의 지방산 함유율과, 배지당 아라키돈산 생산량을 이하의 표 5-7에 정리했다.

[표 5]

균체내 지방산 함유율(%)

[표 6]

총지방산 중에 차지하는 아라키돈산의 비율(%)

[표 7]

배지당 아라키돈산 생성량(g/L)

이와 같이, PAP1 유전자를 M.alpina에서 고발현시킴으로써, 균체내의 지방산 함유율이 상승하고, 총지방산에 차지하는 아라키돈산의 비율도 상승했다. 또한, 배지당 아라키돈산 생산량도 증가시킬 수 있었다.

서열표 프리텍스트

서열번호 5 : 프라이머

서열번호 6 : 프라이머

서열번호 7 : 프라이머

서열번호 8 : 프라이머

서열번호 9 : 프라이머

서열번호 10 : 프라이머

서열번호 11 : 프라이머

서열번호 12 : 프라이머

서열번호 13 : 프라이머

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서열번호 16 : 프라이머

서열번호 17 : 프라이머

서열번호 18 : 프라이머

서열번호 19 : 프라이머

서열번호 20 : 프라이머

서열번호 21 : 프라이머

서열번호 22 : 프라이머

서열번호 23 : 프라이머

서열번호 24 : 프라이머

SEQUENCE LISTING <110> Suntory Holdings Ltd. <120> PHOSPHATIDIC ACID PHOSPHATASE HOMOLOGS AND USE THEREOF <130> FA0038-08063 <150> JP 2007-181899 <151> 2007-07-11 <160> 23 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1307 <212> DNA <213> Mortierella alpina <220> <221> CDS <222> (105)..(1223) <400> 1 gcattcactt tactgcttcc tggctattcc catctcctca cagttctttt cgctttactg 60 caatcgcaat cccacaccgc tcgggaactt tttcgcctgc aaac atg ggt tgc ttc 116 Met Gly Cys Phe 1 gcg cgc aag acg cac acc act cca cat cca gac act aat aca act gcc 164 Ala Arg Lys Thr His Thr Thr Pro His Pro Asp Thr Asn Thr Thr Ala 5 10 15 20 gtg aat ggc cac cac aat gta tac tca atg cag acc cgg ccg aag ttt 212 Val Asn Gly His His Asn Val Tyr Ser Met Gln Thr Arg Pro Lys Phe 25 30 35 gga cag tgg ctc aaa tgc aca tgg ctc gat att ctc acc atg gca gtg 260 Gly Gln Trp Leu Lys Cys Thr Trp Leu Asp Ile Leu Thr Met Ala Val 40 45 50 atg ggt gct ctt ggc ctt gga gtc tac atg ttg cgt cct gtg ccg aat 308 Met Gly Ala Leu Gly Leu Gly Val Tyr Met Leu Arg Pro Val Pro Asn 55 60 65 cga tct ttc gcc gtc acc ttc gcc gat ggc gag atc gtc tac cct gag 356 Arg Ser Phe Ala Val Thr Phe Ala Asp Gly Glu Ile Val Tyr Pro Glu 70 75 80 ttt gct tac cct ttg cgc aaa gag att gtt ccc att tgg ctc gcc tcc 404 Phe Ala Tyr Pro Leu Arg Lys Glu Ile Val Pro Ile Trp Leu Ala Ser 85 90 95 100 ttc ctg gcc gtc gtt gta ccc gtt ctg ggt atc ttg ctg atg caa att 452 Phe Leu Ala Val Val Val Pro Val Leu Gly Ile Leu Leu Met Gln Ile 105 110 115 cgc gtc cgc tcc ttc tgg gat gtc aat aac gct atc gtg ggc tta ttg 500 Arg Val Arg Ser Phe Trp Asp Val Asn Asn Ala Ile Val Gly Leu Leu 120 125 130 tac tcg ctc atc acc gcc gct gtc ttc cag gtc ttc atc aag tgg ctc 548 Tyr Ser Leu Ile Thr Ala Ala Val Phe Gln Val Phe Ile Lys Trp Leu 135 140 145 atc gga ggt ctg cgt cct cat ttt ctc gaa gtc tgc aaa cct gat acc 596 Ile Gly Gly Leu Arg Pro His Phe Leu Glu Val Cys Lys Pro Asp Thr 150 155 160 agt ttg gcc acc gac gcc gga tac aac agg aag gga ttc cag cag caa 644 Ser Leu Ala Thr Asp Ala Gly Tyr Asn Arg Lys Gly Phe Gln Gln Gln 165 170 175 180 tac ttc aca aga gag atc tgt acc gga gat gag aag gag atc aac gac 692 Tyr Phe Thr Arg Glu Ile Cys Thr Gly Asp Glu Lys Glu Ile Asn Asp 185 190 195 agt ctc gag tcc ttc ccc agc gga cat tcg act gcc gcc ttt gcc ggc 740 Ser Leu Glu Ser Phe Pro Ser Gly His Ser Thr Ala Ala Phe Ala Gly 200 205 210 ttc gkt ttt ctt tac cta tac ctg aat gca aag ctc aaa gtc ttc tcg 788 Phe Xaa Phe Leu Tyr Leu Tyr Leu Asn Ala Lys Leu Lys Val Phe Ser 215 220 225 aac tac cac ccg gcc atg tgg aag ctc ata gtc att tac act cct atc 836 Asn Tyr His Pro Ala Met Trp Lys Leu Ile Val Ile Tyr Thr Pro Ile 230 235 240 ctc gga gct gtc ctg atc ggc ggt gcc ctc acc atc gac gaa ttc cat 884 Leu Gly Ala Val Leu Ile Gly Gly Ala Leu Thr Ile Asp Glu Phe His 245 250 255 260 aat tgg tac gat gtc gtg gcc gga gcc atc atc gga tcc gtc atg gcg 932 Asn Trp Tyr Asp Val Val Ala Gly Ala Ile Ile Gly Ser Val Met Ala 265 270 275 ttt tca tct tac cgc atg acg tat gcg gcc att tgg gac tgg agg tac 980 Phe Ser Ser Tyr Arg Met Thr Tyr Ala Ala Ile Trp Asp Trp Arg Tyr 280 285 290 aat cac atc ccg ttg aac cgc aat gcg ccg ttc ccc ttc ctc cgc gac 1028 Asn His Ile Pro Leu Asn Arg Asn Ala Pro Phe Pro Phe Leu Arg Asp 295 300 305 agt ggc gat ttg gtg ggc gct gta ttt acg aga aag gcc ggt tgg gga 1076 Ser Gly Asp Leu Val Gly Ala Val Phe Thr Arg Lys Ala Gly Trp Gly 310 315 320 gat gct gcg aaa gta ccc gaa cga gga aac gac tgg aat cac cat ggt 1124 Asp Ala Ala Lys Val Pro Glu Arg Gly Asn Asp Trp Asn His His Gly 325 330 335 340 caa aca cct aat gcg aac caa gac gga tac caa gcc agt tca tca att 1172 Gln Thr Pro Asn Ala Asn Gln Asp Gly Tyr Gln Ala Ser Ser Ser Ile 345 350 355 cca tta aga tcg gtc ggc ggg ggt caa gca cag cct gag aac ata gtt 1220 Pro Leu Arg Ser Val Gly Gly Gly Gln Ala Gln Pro Glu Asn Ile Val 360 365 370 tag tggaacataa aatatgacac acagcttatc aaacaaaaaa ccgttaaatt 1273 tgcacacggg ccacaacata cgtcagaacc gtgt 1307 <210> 2 <211> 372 <212> PRT <213> Mortierella alpina <220> <221> misc_feature <222> (214)..(214) <223> The 'Xaa' at location 214 stands for Gly, or Val. <400> 2 Met Gly Cys Phe Ala Arg Lys Thr His Thr Thr Pro His Pro Asp Thr 1 5 10 15 Asn Thr Thr Ala Val Asn Gly His His Asn Val Tyr Ser Met Gln Thr 20 25 30 Arg Pro Lys Phe Gly Gln Trp Leu Lys Cys Thr Trp Leu Asp Ile Leu 35 40 45 Thr Met Ala Val Met Gly Ala Leu Gly Leu Gly Val Tyr Met Leu Arg 50 55 60 Pro Val Pro Asn Arg Ser Phe Ala Val Thr Phe Ala Asp Gly Glu Ile 65 70 75 80 Val Tyr Pro Glu Phe Ala Tyr Pro Leu Arg Lys Glu Ile Val Pro Ile 85 90 95 Trp Leu Ala Ser Phe Leu Ala Val Val Val Pro Val Leu Gly Ile Leu 100 105 110 Leu Met Gln Ile Arg Val Arg Ser Phe Trp Asp Val Asn Asn Ala Ile 115 120 125 Val Gly Leu Leu Tyr Ser Leu Ile Thr Ala Ala Val Phe Gln Val Phe 130 135 140 Ile Lys Trp Leu Ile Gly Gly Leu Arg Pro His Phe Leu Glu Val Cys 145 150 155 160 Lys Pro Asp Thr Ser Leu Ala Thr Asp Ala Gly Tyr Asn Arg Lys Gly 165 170 175 Phe Gln Gln Gln Tyr Phe Thr Arg Glu Ile Cys Thr Gly Asp Glu Lys 180 185 190 Glu Ile Asn Asp Ser Leu Glu Ser Phe Pro Ser Gly His Ser Thr Ala 195 200 205 Ala Phe Ala Gly Phe Xaa Phe Leu Tyr Leu Tyr Leu Asn Ala Lys Leu 210 215 220 Lys Val Phe Ser Asn Tyr His Pro Ala Met Trp Lys Leu Ile Val Ile 225 230 235 240 Tyr Thr Pro Ile Leu Gly Ala Val Leu Ile Gly Gly Ala Leu Thr Ile 245 250 255 Asp Glu Phe His Asn Trp Tyr Asp Val Val Ala Gly Ala Ile Ile Gly 260 265 270 Ser Val Met Ala Phe Ser Ser Tyr Arg Met Thr Tyr Ala Ala Ile Trp 275 280 285 Asp Trp Arg Tyr Asn His Ile Pro Leu Asn Arg Asn Ala Pro Phe Pro 290 295 300 Phe Leu Arg Asp Ser Gly Asp Leu Val Gly Ala Val Phe Thr Arg Lys 305 310 315 320 Ala Gly Trp Gly Asp Ala Ala Lys Val Pro Glu Arg Gly Asn Asp Trp 325 330 335 Asn His His Gly Gln Thr Pro Asn Ala Asn Gln Asp Gly Tyr Gln Ala 340 345 350 Ser Ser Ser Ile Pro Leu Arg Ser Val Gly Gly Gly Gln Ala Gln Pro 355 360 365 Glu Asn Ile Val 370 <210> 3 <211> 1119 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 3 atgggttgct tcgcgcgcaa gacgcacacc actccacatc cagacactaa tacaactgcc 60 gtgaatggcc accacaatgt atactcaatg cagacccggc cgaagtttgg acagtggctc 120 aaatgcacat ggctcgatat tctcaccatg gcagtgatgg gtgctcttgg ccttggagtc 180 tacatgttgc gtcctgtgcc gaatcgatct ttcgccgtca ccttcgccga tggcgagatc 240 gtctaccctg agtttgctta ccctttgcgc aaagagattg ttcccatttg gctcgcctcc 300 ttcctggccg tcgttgtacc cgttctgggt atcttgctga tgcaaattcg cgtccgctcc 360 ttctgggatg tcaataacgc tatcgtgggc ttattgtact cgctcatcac cgccgctgtc 420 ttccaggtct tcatcaagtg gctcatcgga ggtctgcgtc ctcattttct cgaagtctgc 480 aaacctgata ccagtttggc caccgacgcc ggatacaaca ggaagggatt ccagcagcaa 540 tacttcacaa gagagatctg taccggagat gagaaggaga tcaacgacag tctcgagtcc 600 ttccccagcg gacattcgac tgccgccttt gccggcttcg kttttcttta cctatacctg 660 aatgcaaagc tcaaagtctt ctcgaactac cacccggcca tgtggaagct catagtcatt 720 tacactccta tcctcggagc tgtcctgatc ggcggtgccc tcaccatcga cgaattccat 780 aattggtacg atgtcgtggc cggagccatc atcggatccg tcatggcgtt ttcatcttac 840 cgcatgacgt atgcggccat ttgggactgg aggtacaatc acatcccgtt gaaccgcaat 900 gcgccgttcc ccttcctccg cgacagtggc gatttggtgg gcgctgtatt tacgagaaag 960 gccggttggg gagatgctgc gaaagtaccc gaacgaggaa acgactggaa tcaccatggt 1020 caaacaccta atgcgaacca agacggatac caagccagtt catcaattcc attaagatcg 1080 gtcggcgggg gtcaagcaca gcctgagaac atagtttag 1119 <210> 4 <211> 1116 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 4 atgggttgct tcgcgcgcaa gacgcacacc actccacatc cagacactaa tacaactgcc 60 gtgaatggcc accacaatgt atactcaatg cagacccggc cgaagtttgg acagtggctc 120 aaatgcacat ggctcgatat tctcaccatg gcagtgatgg gtgctcttgg ccttggagtc 180 tacatgttgc gtcctgtgcc gaatcgatct ttcgccgtca ccttcgccga tggcgagatc 240 gtctaccctg agtttgctta ccctttgcgc aaagagattg ttcccatttg gctcgcctcc 300 ttcctggccg tcgttgtacc cgttctgggt atcttgctga tgcaaattcg cgtccgctcc 360 ttctgggatg tcaataacgc tatcgtgggc ttattgtact cgctcatcac cgccgctgtc 420 ttccaggtct tcatcaagtg gctcatcgga ggtctgcgtc ctcattttct cgaagtctgc 480 aaacctgata ccagtttggc caccgacgcc ggatacaaca ggaagggatt ccagcagcaa 540 tacttcacaa gagagatctg taccggagat gagaaggaga tcaacgacag tctcgagtcc 600 ttccccagcg gacattcgac tgccgccttt gccggcttcg kttttcttta cctatacctg 660 aatgcaaagc tcaaagtctt ctcgaactac cacccggcca tgtggaagct catagtcatt 720 tacactccta tcctcggagc tgtcctgatc ggcggtgccc tcaccatcga cgaattccat 780 aattggtacg atgtcgtggc cggagccatc atcggatccg tcatggcgtt ttcatcttac 840 cgcatgacgt atgcggccat ttgggactgg aggtacaatc acatcccgtt gaaccgcaat 900 gcgccgttcc ccttcctccg cgacagtggc gatttggtgg gcgctgtatt tacgagaaag 960 gccggttggg gagatgctgc gaaagtaccc gaacgaggaa acgactggaa tcaccatggt 1020 caaacaccta atgcgaacca agacggatac caagccagtt catcaattcc attaagatcg 1080 gtcggcgggg gtcaagcaca gcctgagaac atagtt 1116 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer D-1 <400> 5 catgggttgc ttcgcgcgca agacg 25 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer D-2 <400> 6 cgaagccggc aaaggcggca gtc 23 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer D-3 <400> 7 ccactaaact atgttctcag gc 22 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 12-f <400> 8 tctagaatgg cacctcccaa cactattg 28 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 12-r <400> 9 aagcttttac ttcttgaaaa agaccacgtc 30 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 6-f <400> 10 tctagaatgg ctgctgctcc cagtgtgag 29 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 6-r <400> 11 aagcttttac tgtgccttgc ccatcttgg 29 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer GLELO-f <400> 12 tctagaatgg agtcgattgc gcaattcc 28 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer GLELO-r <400> 13 gagctcttac tgcaacttcc ttgccttctc 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 5-f <400> 14 tctagaatgg gtgcggacac aggaaaaacc 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 5-r <400> 15 aagcttttac tcttccttgg gacgaagacc 30 <210> 16 <211> 1203 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 16 atggcacctc ccaacactat tgatgccggt ttgacccagc gccatatcag cacctcggcc 60 gccccaacct ctgccaagcc cgccttcgag cgcaactacc agctccctga gttcaccatc 120 aaggagatcc gtgagtgcat ccctgcacac tgctttgagc gctccggtct ccgtggtctt 180 tgccacgttg ctattgatct gacctgggcc tcgctcttgt tcctggctgc gacccagatc 240 gacaagttcg agaacccttt gatccgctac ttggcctggc ctgcgtattg gatcatgcag 300 ggtattgttt gcaccggtat ctgggtattg gcacacgaat gtggtcatca gtccttctcg 360 acctccaaga cccttaacaa cactgtcggc tggatcttgc actcgatgct cttggtccct 420 taccactcct ggagaatctc gcactcgaag caccacaagg ccactggcca catgaccaag 480 gaccaggtct ttgttcccaa gacccgctct caggttggct tgccccccaa ggagaatgtt 540 gcagttgccg ttcaggagga ggatatgtcc gtgcacctgg atgaggaggc ccccattgtg 600 actttgttct ggatggtgat tcagttcctg ttcggatggc ctgcgtacct tattatgaac 660 gcctctggtc aagactatgg ccgctggacc tcgcacttcc acacctactc tcctatcttt 720 gagccccgca actttttcga cattatcatt tcggatctcg gtgtgttggc tgctcttggt 780 accttgatct acgcctccat gcagctctcg ctcttgaccg tgaccaagta ctacattgtc 840 ccctacttgt ttgtcaactt ctggttggtc ctgatcacct tcttgcagca caccgaccct 900 aagctgcccc attaccgtga gggtgcctgg aacttccagc gtggagccct ctgcaccgtt 960 gaccgctcgt tcggcaagtt cttggaccat atgttccacg gcattgtcca tacccatgta 1020 gcccatcact tgttctcgca gatgccgttc taccatgctg aggaagccac ccatcatctc 1080 aagaaactgc tgggagagta ctacgtctat gacccatcgc cgattgttgt tgcggtctgg 1140 aggtcgttcc gtgaatgccg attcgtggaa gaccatggag acgtggtctt tttcaagaag 1200 taa 1203 <210> 17 <211> 1374 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 17 atggctgctg ctcccagtgt gaggacgttt actcgggccg agattttgaa tgccgaggcc 60 ctgaatgagg gcaagaagga tgccgaggca ccctttctga tgatcattga caacaaggtg 120 tacgatgtcc gcgagtttgt ccctgatcat cccggtggaa gtgtgattct cacgcacgtt 180 ggcaaggacg gcactgacgt ctttgacact ttccaccccg aggctgcttg ggagactctt 240 gccaactttt acgttggtga tattgatgag agcgatcgtg ccatcaagaa tgatgacttt 300 gcggccgagg ttcgcaagct gcgcaccttg ttccagtccc ttggctacta cgactcgtcc 360 aaggcatact atgccttcaa ggtctcgttc aacctctgca tctggggctt gtcgactttc 420 attgttgcca agtggggcca gacctcgacc ctcgccaacg tgctctcggc tgcgctcttg 480 ggtctcttct ggcagcagtg cggatggttg gcgcacgact ttttgcacca ccaggtcttc 540 caggaccgtt tctggggtga tcttttcggc gccttcttgg gaggtgtctg ccagggtttc 600 tcgtcctcct ggtggaagga caagcacaac actcaccacg ctgctcccaa cgtccacggc 660 gaggatcccg acattgacac tcaccctctg ttgacctgga gtgagcatgc tctggagatg 720 ttctcggatg ttcctgacga ggagctgacc cgtatgtggt cgcgcttcat ggtcctcaac 780 cagacctggt tctacttccc cattctctcg tttgcccgtc tgtcctggtg cctccagtcc 840 attatgcttg ttctgcccaa cggtcaggcc cacaagccct ctggagcgcg tgtgcccatt 900 tcgttggtcg agcagctgtc tctggctatg cactggacct ggtacctcgc caccatgttc 960 ctgttcatta aggatcccgt caacatgatt gtgtactttt tggtgtcgca ggctgtttgc 1020 ggcaacttgt tggcgattgt gttctcgctc aaccacaacg gcatgcctgt gatctccaag 1080 gaggaagcgg tcgatatgga cttcttcacc aagcagatca tcacgggtcg tgatgttcac 1140 cctggtctgt ttgccaactg gttcacgggt ggattgaact accagattga gcaccacttg 1200 ttcccttcga tgccccgcca caacttttca aagatccagc ctgctgtcga gactttgtgc 1260 aaaaagtacg gtgtccgata ccataccact ggtatgatcg agggaactgc agaggtcttt 1320 agccgtttga acgaggtctc caaggcggcc tccaagatgg gcaaggcaca gtaa 1374 <210> 18 <211> 957 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 18 atggagtcga ttgcgcaatt cctcccctca aagatgccgc aagatctgtt tattgacctt 60 gcaagggcca tcggtgtcca ggccgcaccc tatgtcgacc ctctcgaggc agcgcttgtg 120 gcccaggccg agaagttctt ccccacggtc gttcatcaca cgcgcggctt tttggtcgcg 180 gtcgagtcac ccttggcccg tgagctgccc ttgatgaacc ccttccacgt gctgttgatc 240 gcgctcgctt acttggtcac ggtctttgtg ggcatgcaga tcatgaagaa ctttgaacgg 300 ttcgaggtca agacgttctc gctcttccac aacttttgtc tggtctcgat cagtgcctac 360 atgtgcggcg ggatcttgta cgaggcttac caggccaact atggactgtt tgagaacgcg 420 gccgatcata ccgtccaggg tcttcctatg gccaagatga tctggctctt ctacttctcc 480 aagatcatgg agtttgtcga caccatgatc atggtcctta agaagaacaa ccgccagatc 540 tcgttcttgc acgtctacca ccacagctcc atcttcacca tctggtggtt ggtcaccttt 600 gttgcaccca atggtgaagc ctacttctcg gctgcgttga actcgttcat ccacgtgatc 660 atgtacggct actacttcct gtccgccttg ggcttcaagc aggtgtcgtt catcaagttc 720 tacatcacgc gttcgcagat gacgcagttc tgcatgatgt cgatccagtc ctcctgggac 780 atgtatgcca tgaaggtgct tggccgcccc ggatacccct tcttcatcac cgccctgctt 840 tggttctaca tgtggaccat gctcggactc ttctacaact tctacagaaa gaacgccaag 900 ttggccaagc aggccaagat cgatgctgcc aaggagaagg caaggaagtt gcagtaa 957 <210> 19 <211> 1341 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 19 atgggtgcgg acacaggaaa aaccttcacc tggcaagaac tcgcggcgca taacaccgag 60 gacagcctcc ttttggctat ccgtggcaat gtatacgatg tcacaaagtt cttgagccgt 120 catcctggtg gaacggatac tctcttgctc ggagctggcc gagatgtcac tccggttttt 180 gagatgtacc acgagtttgg agctgcagag gctatcatga agaagtacta tgttggcaca 240 ctggtctcaa atgagttgcc catcttccca gagccaacgg tgttccataa gaccatcaag 300 ggcagagttg aggcatactt taaggaccgg aacatggatt ccaagaacag accagagatc 360 tggggacgat atgctctcat ctttggatcc ttgatcgcct cttactacgc gcagctcttt 420 gtaccgttcg tggtcgaacg tacatggctc caggtggtgt ttgctatcat catgggattt 480 gcgtgcgcgc aagtcggatt gaaccctctt cacgatgcct cccacttttc agtgacccac 540 aaccccaccg tttggaagat tctcggagcc acgcacgact ttttcaacgg agcatcgtat 600 ctcgtgtgga tgtaccaaca tatgctcggc catcatccct ataccaacat tgctggagct 660 gatcccgatg tgtcgacctc tgagcccgat gttcgtcgta tcaagcccaa ccaaaagtgg 720 ttcgtcaacc acatcaacca gcacatgttt gttcctttcc tgtacggact gctggcgttc 780 aaggtgcgca tccaggacat caacatcttg tactttgtca agaccaatga cgccattcgt 840 gtcaacccca tctcgacttg gcacaccgtc atgttctggg gcggaaaggc cttctttgtc 900 tggtaccgct tgatcgttcc tatgcagtat ctgcccctga gcaaggtgtt gctcttgttt 960 accgtcgcag acatggtctc ttcttactgg ctggcgctga ccttccaggc gaaccacgtt 1020 gttgaggagg ttcagtggcc attgcctgat gagaatggaa tcatccaaaa ggattgggca 1080 gccatgcagg tcgagactac tcaggattac gcccacgatt cgcacctctg gaccagcatc 1140 acgggcagct tgaactacca agccgttcat catctgttcc cgaacgtttc ccagcatcac 1200 taccctgata tcctggctat catcaaggac acctgcagcg agtacaaggt gccatacctc 1260 gtcaaggata ccttttggca agcgtttgct tcacatttgg agcacttgcg tgtgcttggt 1320 cttcgtccca aggaagagta a 1341 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer MaGAPDHpfw <400> 20 cacaccacac attcaacatc 20 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer D2 <400> 21 cgaagccggc aaaggcggca gtcg 24 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer D1 <400> 22 catgggttgc ttcgcgcgca agacg 25 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer PD4P <400> 23 cgcatcccgc aaacacacac 20

Claims

이하의 (a)∼(e) 중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산:
(a) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 포스파티딘산포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열,
(b) 서열번호 4로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 포스파티딘산포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열,
(c) 서열번호 4로 이루어진 염기 서열과 동일성이 70% 이상인 염기 서열로 이루어지고, 포스파티딘산포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열,
(d) 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 포스파티딘산포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열,
(e) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 포스파티딘산포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열.
제1항에 있어서, 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나인 염기 서열을 포함하는 핵산:
(a) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 포스파티딘산포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열,
(b) 서열번호 4로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건하에서 하이브리드화하고, 포스파티딘산포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열,
(c) 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 포스파티딘산포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열.
이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나에 기재된 염기 서열 또는 그 단편을 포함하는 핵산:
(a) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열,
(b) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열,
(c) 서열번호 1로 표시되는 염기 서열.
이하의 (a)∼(e) 중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산:
(a) 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열:
서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 단백질이 발현되어 있는 숙주의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼vi) 중의 적어도 하나 이상이, 상기 단백질이 발현되지 않은 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질:
i) 올레인산 함유량,
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율,
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율,
iv) 팔미트산 함유량에 대한 스테아르산 및 올레인산의 합계 함유량의 비율,
v) 탄소수 16의 지방산의 함유량에 대한 탄소수 18의 지방산의 함유량의 비율, 및
vi) 아라키돈산, 디호모감마리놀렌산 및/또는 감마리놀렌산의 함유량의 비율;
(b) 서열번호 4로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열:
상기 단백질이 발현되어 있는 숙주의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼vi) 중의 적어도 하나 이상이, 상기 단백질이 발현되지 않은 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질:
i) 올레인산 함유량,
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율,
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율,
iv) 팔미트산 함유량에 대한 스테아르산 및 올레인산의 합계 함유량의 비율,
v) 탄소수 16의 지방산의 함유량에 대한 탄소수 18의 지방산의 함유량의 비율, 및
vi) 아라키돈산, 디호모감마리놀렌산 및/또는 감마리놀렌산의 함유량의 비율;
(c) 서열번호 4로 이루어진 염기 서열과 동일성이 70% 이상인 염기 서열로 이루어지고, 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열:
상기 단백질이 발현되어 있는 숙주의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼vi) 중의 적어도 하나 이상이, 상기 단백질이 발현되지 않은 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질:
i) 올레인산 함유량,
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율,
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율,
iv) 팔미트산 함유량에 대한 스테아르산 및 올레인산의 합계 함유량의 비율,
v) 탄소수 16의 지방산의 함유량에 대한 탄소수 18의 지방산의 함유량의 비율, 및
vi) 아라키돈산, 디호모감마리놀렌산 및/또는 감마리놀렌산의 함유량의 비율;
(d) 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열:
서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 단백질이 발현되어 있는 숙주의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼vi) 중의 적어도 하나 이상이, 상기 단백질이 발현되지 않은 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질:
i) 올레인산 함유량,
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율,
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율,
iv) 팔미트산 함유량에 대한 스테아르산 및 올레인산의 합계 함유량의 비율,
v) 탄소수 16의 지방산의 함유량에 대한 탄소수 18의 지방산의 함유량의 비율, 및
vi) 아라키돈산, 디호모감마리놀렌산 및/또는 감마리놀렌산의 함유량의 비율;
(e) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열:
상기 단백질이 발현되어 있는 숙주의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼vi) 중의 적어도 하나 이상이, 상기 단백질이 발현되지 않은 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질:
i) 올레인산 함유량,
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율,
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율,
iv) 팔미트산 함유량에 대한 스테아르산 및 올레인산의 합계 함유량의 비율,
v) 탄소수 16의 지방산의 함유량에 대한 탄소수 18의 지방산의 함유량의 비율, 및
vi) 아라키돈산, 디호모감마리놀렌산 및/또는 감마리놀렌산의 함유량의 비율.
제4항에 있어서, 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나인 염기 서열을 포함하는 핵산:
(a) 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열:
서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 단백질이 발현되어 있는 숙주의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼vi) 중의 적어도 하나 이상이, 상기 단백질이 발현되지 않은 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질:
i) 올레인산 함유량,
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율,
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율,
iv) 팔미트산 함유량에 대한 스테아르산 및 올레인산의 합계 함유량의 비율,
v) 탄소수 16의 지방산의 함유량에 대한 탄소수 18의 지방산의 함유량의 비율, 및
vi) 아라키돈산, 디호모감마리놀렌산 및/또는 감마리놀렌산의 함유량의 비율;
(b) 서열번호 4로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건하에서 하이브리드화하고, 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열:
상기 단백질이 발현되어 있는 숙주의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼vi) 중의 적어도 하나 이상이, 상기 단백질이 발현되지 않은 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질:
i) 올레인산 함유량,
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율,
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율,
iv) 팔미트산 함유량에 대한 스테아르산 및 올레인산의 합계 함유량의 비율,
v) 탄소수 16의 지방산의 함유량에 대한 탄소수 18의 지방산의 함유량의 비율, 및
vi) 아라키돈산, 디호모감마리놀렌산 및/또는 감마리놀렌산의 함유량의 비율;
(c) 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열:
서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 단백질이 발현되어 있는 숙주의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼vi) 중의 적어도 하나 이상이, 상기 단백질이 발현되지 않은 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질:
i) 올레인산 함유량,
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율,
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율,
iv) 팔미트산 함유량에 대한 스테아르산 및 올레인산의 합계 함유량의 비율,
v) 탄소수 16의 지방산의 함유량에 대한 탄소수 18의 지방산의 함유량의 비율, 및
vi) 아라키돈산, 디호모감마리놀렌산 및/또는 감마리놀렌산의 함유량의 비율.
이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 하나에 기재된 단백질:
(a) 서열번호 2에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 포스파티딘산포스파타아제 활성을 갖는 단백질,
(b) 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열로 이루어진 단백질이고, 포스파티딘산포스파타아제 활성을 갖는 단백질.
이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 하나에 기재된 단백질:
(a) 서열번호 2에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 아미노산 서열로 이루어진 단백질이 발현되어 있는 숙주의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼vi) 중의 적어도 하나 이상이, 상기 단백질이 발현되지 않은 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질:
i) 올레인산 함유량,
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율,
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율,
iv) 팔미트산 함유량에 대한 스테아르산 및 올레인산의 합계 함유량의 비율,
v) 탄소수 16의 지방산의 함유량에 대한 탄소수 18의 지방산의 함유량의 비율, 및
vi) 아라키돈산, 디호모감마리놀렌산 및/또는 감마리놀렌산의 함유량의 비율;
(b) 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 아미노산 서열로 이루어진 단백질이 발현되어 있는 숙주의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼vi) 중의 적어도 하나 이상이, 상기 단백질이 발현되지 않은 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질:
i) 올레인산 함유량,
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율,
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율,
iv) 팔미트산 함유량에 대한 스테아르산 및 올레인산의 합계 함유량의 비율,
v) 탄소수 16의 지방산의 함유량에 대한 탄소수 18의 지방산의 함유량의 비율, 및
vi) 아라키돈산, 디호모감마리놀렌산 및/또는 감마리놀렌산의 함유량의 비율.
서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 핵산을 함유하는 재조합 벡터.
제9항에 기재된 재조합 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환체.
제10항에 기재된 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 지방산 조성물로서, 상기 지방산 조성물의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼vi) 중의 적어도 하나 이상이, 제9항의 재조합 벡터에 의해 형질 전환되지 않은 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물의 상기 비율보다 높은 것을 특징으로 하는 상기 지방산 조성물:
i) 올레인산 함유량,
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미트레인산 함유량의 비율,
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레인산 함유량의 비율,
iv) 팔미트산 함유량에 대한 스테아르산 및 올레인산의 합계 함유량의 비율,
v) 탄소수 16의 지방산의 함유량에 대한 탄소수 18의 지방산의 함유량의 비율, 및
vi) 아라키돈산, 디호모감마리놀렌산 및/또는 감마리놀렌산의 함유량의 비율.
제10항에 기재된 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터, 제11항에 기재된 지방산 조성물을 채취하는 것을 특징으로 하는 상기 지방산 조성물의 제조방법.
제11항에 기재된 지방산 조성물을 포함하는 식품.