CN102947447A - 甘油-3-磷酸酰基转移酶同源物及其利用 - Google Patents

甘油-3-磷酸酰基转移酶同源物及其利用 Download PDF

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Abstract

本发明提供甘油-3-磷酸酰基转移酶基因及其利用。本发明的上述课题通过提供具有本发明的序列号1、4或8、序列号3、6或11、或序列号7或12的碱基序列的核酸及其突变体来解决。本发明还提供具有序列号2、5或9的氨基酸序列的蛋白质及其突变体。

Description

甘油-3-磷酸酰基转移酶同源物及其利用
技术领域
本发明涉及新型酰基转移酶基因及其利用。本发明的酰基转移酶基因也可以是甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)基因及/或甘油磷酸O-酰基转移酶(GNPAT)基因。
背景技术
脂肪酸是构成磷脂、三酰甘油等脂质的重要成分。含有2个以上不饱和键的脂肪酸总称为多不饱和脂肪酸(PUFA)。作为具体例子，已知有花生四烯酸、二高-γ-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等，已报道了各种生理活性(非专利文献1)。该多不饱和脂肪酸中，有一些种类是动物不能在体内合成的。因此，对于此种多不饱和脂肪酸，作为必需脂肪酸必须从食物中摄取。
在动物体内，多不饱和脂肪酸存在于多种多样的脏器和组织中。例如，花生四烯酸是从提取自动物的肾上腺或肝脏的脂质中分离的。但是，在动物脏器中只含有少量的多不饱和脂肪酸，因此仅靠从动物脏器提取·分离的多不饱和脂肪酸，无法得到足够的供给量。为此，开发出了培养各种微生物来获得多不饱和脂肪酸的方法。其中，被孢霉属(Mortierella)微生物是众所周知的有效地生产含有花生四烯酸等多不饱和脂肪酸的脂质的微生物。而且，还进行了利用植物来生产多不饱和脂肪酸的尝试。已知多不饱和脂肪酸构成三酰甘油等储存脂质，蓄积在微生物的菌体内或植物种子中。
作为储存脂质的三酰甘油在生物体内如下生成。通过甘油-3-磷酸酰基转移酶向甘油-3-磷酸转移酰基而生成溶血磷脂酸。而后，通过溶血磷脂酸酰基转移酶向溶血磷脂酸转移酰基而生成磷脂酸。而后，磷脂酸通过磷脂酸磷酸酶脱磷酸化而生成二酰甘油。最后，通过二酰甘油酰基转移酶向二酰甘油中转移酰基而生成三酰甘油。
上述三酰甘油生物合成途径、磷脂生物合成途径中，在通过甘油-3-磷酸的酰化来生成溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid)的反应中，已知有甘油-3-磷酸酰基转移酶(以下也有时记为“GPAT”。：EC 2.3.1.15)的参与。
至今为止已报道了一些生物中存在GPAT基因。作为来自哺乳动物的GPAT基因，已被克隆的有内质网型(膜结合型)和线粒体型(膜结合型)这2种(非专利文献2)。此外，作为来自植物的GPAT基因，已被克隆的有内质网型(膜结合型)、线粒体型(膜结合型)和叶绿体型(游离型)这3种(非专利文献3)。
作为来自作为真菌的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的GPAT基因，已被克隆的有内质网型(膜结合型)的GPT2/GAT1(YKR067w)和SCT1/GAT2(YBL011w)这2种，已知如果使它们同时缺失的话会致死(非专利文献4)。在此，表明相对于GPT2具有以从棕榈酸(16:0)至油酸(18:1)的大范围的脂肪酸为底物的活性，而SCT1则具有将棕榈酸(16:0)、棕榈油酸(16:1)等碳原子数为16的脂肪酸作为底物的强选择性(非专利文献4)。
除上述以外，还从大量生物种克隆了GPAT基因。特别是关于来自作为脂质生产菌的被孢霉属(Mortierella)微生物的GPAT，有如下报道。
关于来自拉曼被孢霉(Mortierella ramanniana)的GPAT，已分离出内质网型GPAT，其显示出了以高于棕榈酸(16:0)5.4倍的高选择性将油酸(18:1)用作酰基供体(非专利文献5)。关于来自高山被孢霉(以下也有时记为“M.alpina”或“高山被孢霉”)的GPAT，已报道微粒体组分具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性(非专利文献6)。
若使存在于M.alpina的微粒体中的GPAT(与膜结合的状态)和各种酰基CoA在体外反应，则显示出了GPAT在维持高活性的状态下，将油酸(18:1)、亚油酸(18:2)、二高-γ-亚麻酸(DGLA)(20:3)、花生四烯酸(20:4)等多不饱和脂肪酸作为底物广泛利用(专利文献1)。
使从M.alpina(ATCC #16266)克隆得到的GPAT(以下，在本说明书中记为MaGPAT1(ATCC#16266))在以可生物合成二十碳五烯酸(EPA)的方式转化的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)内表达后，发现总脂肪酸中二高-γ-亚麻酸(DGLA)(20:3)的组成增加，油酸(18:1)的组成减少。该结果表明长链且不饱和度高的多不饱和脂肪酸更能被选择性利用(专利文献2)。
近年，从M.alpina(1S-4株)分离出作为GPAT同源物的MaGPAT2，据报道其显示出与MaGPAT1不同的底物特异性(专利文献3)。即，在酵母中表达时，相对于MaGPAT1使酵母生产的脂质中的棕榈酸含有比率增加，MaGPAT2会使酵母生产的脂质中的油酸含有比率增加。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第WO2004/087902号公报
专利文献2：美国专利申请公开第2006/0094091号说明书
专利文献3：国际公开第WO2008/156026号公报
非专利文献
非专利文献1：Lipids，39，1147-1161，2004
非专利文献2：Biochimica et Biophysica Acta，1348，17-26，1997
非专利文献3：Biochimica et Biophysica Acta，1348，10-16，1997
非专利文献4：The Journal of Biological Chemistry，276(45)，41710-41716.2001
非专利文献5：The Biochemical Journal，355，315-322，2001
非专利文献6：Biochemical Society Transactions，28，707-709，2000
发明内容
至今为止已报道的GPAT基因即使导入宿主细胞进行了表达，由于其底物特异性，宿主产生的脂质组合物也会受到限制。期望通过将其导入宿主细胞或使其表达，而鉴定出可产生具有所需组成的脂肪酸组合物的新型基因。
本发明的目的在于提供如下蛋白质及核酸，通过使其在宿主细胞中表达或将其导入宿主细胞，而可制造具有目标脂肪酸组成的油脂、或可使目标脂肪酸含量增加或可使作为储存脂质的三酰甘油(TG)量增加。
本发明者为解决上述课题进行了深入研究。首先，分析脂质生产菌高山被孢霉(Mortierella alpina)的基因组，从中提取与已知的甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)基因同一性高的序列。进而为获得编码GPAT的开放阅读框(ORF)全长，进行cDNA文库的筛选或通过PCR来克隆全长cDNA。发明者进行了将其导入酵母等具有高增殖能力的宿主细胞中以产生脂肪酸组合物的尝试，成功地克隆了可生成与以往GPAT表达的宿主所产生的脂肪酸组合物相比不同的脂肪酸组合物的底物特异性不同的新型GPAT所涉及的基因，从而完成了本发明。即本发明如下。
(1)一种核酸，其特征在于，为以下(a)～(g)中任一项所述的核酸：
(a)核酸，其包含编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；
(b)核酸，其包含与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；
(c)核酸，其包含与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列的同一性为70％以上的碱基序列所组成，且编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；
(d)核酸，其包含编码与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为70％以上的氨基酸序列所组成，且具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；
(e)核酸，其包含与编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；
(f)核酸，其包含与由序列号7或序列号12组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且具有编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列；
(g)核酸，其包含与由序列号7或序列号12组成的碱基序列的同一性为70％以上的碱基序列所组成，且具有编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列。
(2)根据(1)中所述的核酸，其特征在于，为以下(a)～(g)中任一项所述的核酸：
(a)核酸，其包含编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列中1～80个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；
(b)核酸，其包含与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；
(c)核酸，其包含与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列所组成，且编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；
(d)核酸，其包含编码与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为90％以上的氨基酸序列所组成，且具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；
(e)核酸，其包含与编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；
(f)核酸，其包含与由序列号7或序列号12组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且具有编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列；
(g)核酸，其包含与由序列号7或序列号12组成的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列所组成，且具有编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列。
(3)一种核酸，其特征在于，为以下(a)～(d)中任一项所述的核酸：
(a)核酸，其包含序列号1、序列号4或序列号8表示的碱基序列或其部分序列；
(b)核酸，其包含编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列或其部分序列；
(c)核酸，其包含序列号3、序列号6或序列号11表示的碱基序列或其部分序列；
(d)核酸，其包含序列号7或序列号12表示的碱基序列或其部分序列。
(4)一种核酸，其特征在于，为以下(a)～(g)中任一项所述的核酸：
(a)核酸，其包含编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列所组成，且具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油(TG)量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酵母(酿酒酵母S.cerevisiae)的甘油-3-磷酸酰基转移酶缺陷(以下也有时记为“GPAT缺陷”)互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(b)核酸，其包含与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油(TG)量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酵母(酿酒酵母S.cerevisiae)的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(c)核酸，其包含与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列的同一性为70％以上的碱基序列所组成，且编码具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油(TG)量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酵母(酿酒酵母S.cerevisiae)的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(d)核酸，其包含编码与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为70％以上的氨基酸序列所组成，且具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油(TG)量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酵母(酿酒酵母S.cerevisiae)的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(e)核酸，其包含与编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油(TG)量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酵母(酿酒酵母S.cerevisiae)的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(f)核酸，其包含与由序列号7或序列号12组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且具有编码具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的外显子的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油(TG)量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酵母(酿酒酵母S.cerevisiae)的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(g)核酸，其包含与由序列号7或序列号12组成的碱基序列的同一性为70％以上的碱基序列所组成，且具有编码具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的外显子的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油(TG)量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酵母(酿酒酵母S.cerevisiae)的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(5)根据(4)中所述的核酸，其特征在于，为以下(a)～(g)中任一项所述的核酸：
(a)核酸，其包含具有编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列中1～80个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的外显子的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油(TG)量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酵母(酿酒酵母S.cerevisiae)的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(b)核酸，其包含与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且具有编码具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的外显子的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油(TG)量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酵母(酿酒酵母S.cerevisiae)的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(c)核酸，其包含与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列所组成，且具有编码具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的外显子的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油(TG)量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酵母(酿酒酵母S.cerevisiae)的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(d)核酸，其包含具有编码与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为90％以上的氨基酸序列所组成，且具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的外显子的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油(TG)量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酵母(酿酒酵母S.cerevisiae)的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(e)核酸，其包含与编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且具有编码具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的外显子的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油(TG)量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酵母(酿酒酵母S.cerevisiae)的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(f)核酸，其包含与由序列号7或序列号12组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且具有编码具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的外显子的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油(TG)量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酵母(酿酒酵母S.cerevisiae)的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(g)核酸，其包含与由序列号7或序列号12组成的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列所组成，且具有编码具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的外显子的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油(TG)量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酵母(酿酒酵母S.cerevisiae)的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(6)一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质：
(a)蛋白质，其由序列号2、序列号5或序列号9中1或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性；
(b)蛋白质，其为与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为70％以上的氨基酸序列所组成的蛋白质，且具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性。
(7)一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质：
(a)蛋白质，其由序列号2、序列号5或序列号9中1～80个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性；
(b)蛋白质，其为与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为90％以上的氨基酸序列所组成的蛋白质，且具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性。
(8)一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质：
(a)蛋白质，其由序列号2、序列号5或序列号9中1或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有以下i)～v)中任一种活性：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油(TG)量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酵母(酿酒酵母S.cerevisiae)的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(b)蛋白质，其为与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为70％以上的氨基酸序列所组成的蛋白质，且具有以下i)～v)中任一种活性：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油(TG)量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酵母(酿酒酵母S.cerevisiae)的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(9)一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质：
(a)蛋白质，其由序列号2、序列号5或序列号9中1～80个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有以下i)～v)中任一种活性：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油(TG)量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酵母(酿酒酵母S.cerevisiae)的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(b)蛋白质，其为与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为90％以上的氨基酸序列所组成的蛋白质，且具有以下i)～v)中任一种活性：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油(TG)量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酵母(酿酒酵母S.cerevisiae)的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(10)一种蛋白质，其特征在于，由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成。
(11)一种重组载体，其特征在于，含有(1)～(5)中任一项所述的核酸。
(12)一种转化体，其特征在于，由(11)中所述的重组载体转化。
(13)一种脂肪酸组合物，其特征在于，包含培养(12)中所述的转化体而得到的脂肪酸或脂质。
(14)一种脂肪酸组合物的制造方法，其特征在于，从培养(12)中所述的转化体而得到的培养物中提取脂肪酸或脂质。
(15)一种食品，其特征在于，包含(13)中所述的脂肪酸组合物。
本发明的GPAT与以往的GPAT的底物特异性不同，可在宿主中产生与以往的GPAT表达的宿主所产生的脂肪酸组合物组成不同的脂肪酸组合物。由此可提供具有所期望特性、效果的脂质，所以，作为可适用于食品、化妆品、医药品、肥皂等的酶而有用。
此外，因本发明的GPAT可达到提高脂肪酸、储存脂质的生产能力的目的，所以，作为提高微生物、植物中多不饱和脂肪酸的生产率的酶而优选。
附图说明
图1-1为来自M.alpina 1S-4株的MaGPAT4的基因组序列(序列号7)和CDS序列(序列号3)的比较图。
图1-2为图1-1的延续。
图1-3为图1-2的延续。
图2-1表示来自M.alpina 1S-4株的MaGPAT4的CDS序列(序列号3)及由其推导出的推定氨基酸序列(序列号2)的图。双下划线部为作为与pfam的酰基转移酶(accession No.PF01553)的基序具有高同源性的区域而匹配的区域。
图2-2为图2-1的延续。
图3-1为来自M.alpina 1S-4株的MaGPAT5的基因组序列(序列号12)和CDS序列(序列号10)的比较图。
图3-2为图3-1的延续。
图4-1为表示来自M.alpina 1S-4株的MaGPAT5的cDNA序列(序列号11)及由其推导出的推定氨基酸序列(序列号9)的图。
图4-2为图4-1的延续。
图5为来自M.alpina 1S-4株的MaGPAT4的推定氨基酸序列(序列号2)和来自子囊菌(球毛壳菌Chaetomium globosum CBS 148.51)的推定蛋白质的氨基酸序列(序列号21；GenBank accession No.XP 001224211)及来自E.coli的作为GPAT的plsB蛋白质的氨基酸序列(序列号22；GenBank accession No.BAE78043)的比较图。单下划线部为与pfam的酰基转移酶(accession No.PF01553)的基序同源性高的区域。其中，双下划线部为GPAT同源物且十分保守的区域，*表示对酰基转移酶活性重要的氨基酸残基，+表示与G3P的结合时需要的氨基酸残基。
图6-1为来自M.alpina 1S-4株的MaGPAT5的推定氨基酸序列(序列号9)、和来自担子菌(玉蜀黍黑粉菌Ustilago maydis 521)的推定蛋白质UM03369的氨基酸序列(序列号23；GenBank accession No.XP 759516)以及来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的作为GPAT的SCT1(YBL011W)(序列号24)及GPT2(YKR067W)(序列号25W)的氨基酸序列的比较图。双下划线部为GPAT同源物且十分保守的区域，*表示对酰基转移酶活性重要的氨基酸残基，+表示与G3P结合时所需要的氨基酸残基。
图6-2为图6-1的延续。
图7为表示对于用具有与半乳糖诱导型启动子连接的MaGPAT4-long或MaGPAT4的质粒转化的酵母，通过在SG-Trp培养基中培养，而用半乳糖进行表达诱导时的脂质组分的脂肪酸组成的图。
图8为表示对于用具有与半乳糖诱导型的启动子连接的MaGPAT4-long或MaGPAT4的质粒转化的酵母，在不含半乳糖的SC-Trp培养基中培养时的总脂肪酸的组成的图。
图9为表示使GPAT4在M.alpina中超表达时，单位干燥菌体中的花生四烯酸的生产量的经时变化图。
具体实施方式
本发明涉及来自被孢霉属(Mortierella)的新型酰基转移酶基因及其应用。本发明的酰基转移酶可以为以使甘油-3-磷酸酰基化而生成溶血磷脂酸及/或向甘油磷酸的羟基转移酰基为特征的酰基转移酶。
本发明的酰基转移酶为催化向甘油-3-磷酸及/或甘油磷酸转移酰基的反应的酶。本发明的酶的酰基受体通常为甘油-3-磷酸及/或甘油磷酸，但不限于此。
因此，本发明的酰基转移酶可具有作为甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)及/或甘油磷酸O-酰基转移酶(GNPAT)的活性。但是，对于本说明书中的本发明的酶，不管实际具有的活性如何，从方便上也有时记为“甘油-3-磷酸酰基转移酶”或“GPAT”。
编码本发明的甘油-3-磷酸酰基转移酶的核酸
本发明的甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)中，包含MaGPAT4、MaGPAT4-long、及MaGPAT5。将编码MaGPAT4、MaGPAT4-long及MaGPAT5的cDNA、CDS、ORF及推定氨基酸序列的对应关系整理记载于以下表1中。
表1
作为与本发明的MaGPAT4相关的序列，可列举作为MaGPAT4的氨基酸序列的序列号2、以及作为表示MaGPAT4的ORF区域的序列的序列号1、及作为表示其CDS或cDNA区域的序列的序列号3。其中，序列号1相当于序列号3的第1-2475位的碱基序列。作为与本发明的MaGPAT4-long相关的序列，可列举作为MaGPAT4-long的氨基酸序列的序列号5、以及作为表示MaGPAT4-long的ORF区域的序列的序列号4、及作为表示其CDS或cDNA区域的序列的序列号6。其中，序列号4相当于序列号6的第1-2643位的碱基序列。在此，如上述表中所示，MaGPAT4的氨基酸序列及碱基序列分别构成MaGPAT4-long的氨基酸序列及碱基序列的一部分。此外，作为编码本发明的MaGPAT4及MAGPAT4-long的基因组序列，可列举序列号7。编码MaGPAT4时，序列号7的基因组序列由10个外显子和9个内含子组成，外显子区域为序列号7的第596～744位、第850～924位、第1302～1396位、第1480～1726位、第1854～2279位、第2370～2632位、第2724～3299位、第3390～3471位、第3575～4024位、第4133～4248位。或编码MaGPAT4-long时，序列号7的基因组序列由10个外显子和9个内含子组成，外显子区域为序列号7的第428～744位、第850～924位、第1302～1396位、第1480～1726位、第1854～2279位、第2370～2632位、第2724～3299位、第3390～3471位、第3575～4024位、第4133～4248位。
作为与本发明的MaGPAT5相关的序列，可列举作为MaGPAT5的氨基酸序列的序列号9、以及作为表示MaGPAT5的ORF区域的序列的序列号8、作为表示其CDS区域的序列的序列号10、及作为其cDNA的碱基序列的序列号11。其中，序列号10相当于序列号11的第225-2591位的碱基序列，序列号8相当于序列号11的第225-2588位的碱基序列及序列号10的1-2364位的碱基序列。此外，作为编码本发明的MaGPAT5的基因组序列，可列举序列号12。序列号12的基因组序列由3个外显子和2个内含子组成，外显子区域为序列号12的第1～302位、第457～1676位、第1754～2598位。
本发明的核酸除单链及双链DNA以外，还包括其RNA互补体，可以来自天然，也可以由人工制作。DNA中例如可列举基因组DNA、与上述基因组DNA对应的cDNA、化学合成的DNA、通过PCR扩增的DNA、以及其组合物、DNA和RNA的杂交体，但不限于此。
作为本发明的核酸的优选方式，可列举(a)包含序列号1、序列号4或序列号8表示的碱基序列的核酸，(b)包含编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的核酸，(c)包含序列号3、序列号6或序列号11表示的碱基序列的核酸或(d)包含序列号7或序列号12表示的碱基序列的核酸等。
为了获得上述碱基序列，也可从具有GPAT活性的生物的EST、基因组DNA的碱基序列数据中，搜索编码与已知具有GPAT活性的蛋白质有同源性的蛋白质的碱基序列。作为具有GPAT活性的生物，优选脂质生产菌，作为脂质生产菌，可列举M.alpina，但并不限于此。
进行EST分析时，首先构建cDNA文库。对于cDNA文库的构建方法，可参考“Molecular Cloning，A Laboratory Manual 3rd ed.”(Cold Spring Harbor Press(2001))。且也可用市售的cDNA文库构建试剂盒。作为适用于本发明的cDNA文库的构建方法，例如可列举以下方法。即：将作为脂质生产菌的M.alpina的适合菌株接种到适合的培养基中，预培养适当时间。作为适合该预培养的培养条件，例如作为培养基组成，可列举1.8％葡萄糖、1％酵母膏、pH6.0，培养时间为3～4天，培养温度为28℃的条件。然后将预培养物在适当的条件下进行主培养。作为适合主培养的培养基组成，例如可列举1.8％葡萄糖、1％大豆粉、0.1％橄榄油、0.01％增稠剂(ADEKANOL)、0.3％KH2PO4、0.1％Na2SO4、0.05％CaCl2·2H2O、0.05％MgCl2·6H2O、pH6.0。作为适合主培养的培养条件，例如可列举300rpm、1vvm、26℃下通气搅拌培养8天的条件。培养期间可添加适量的葡萄糖。在主培养中适时采集培养物，从其中回收菌体，制备总RNA。制备总RNA时，可使用盐酸胍/CsCl法等公知的方法。可使用市售的试剂盒从得到的总RNA中纯化poly(A)+RNA。而且还可使用市售的试剂盒构建cDNA文库。然后将构建的cDNA文库的任意克隆的碱基序列使用按照可确定载体上插入部分的碱基序列的方式设计的引物进行确定，可得到EST。例如用ZAP-cDNA GigapackIII GoldCloning Kit(STRATAGENE)构建cDNA文库时，可进行定向克隆。
分析基因组DNA时，培养具有GPAT活性的生物的细胞，从该细胞中制备基因组DNA。确定所得到的基因组DNA的碱基序列，将确定的碱基序列进行拼接。从最终得到的超级重叠群(supercontig)的序列中，搜索编码与已知具有GPAT活性的蛋白质的氨基酸序列有同源性的氨基酸序列的序列。作为编码此种氨基酸序列的序列，从匹配的超级重叠群的序列中制备引物，以上述cDNA文库为模板进行PCR，将所得到的DNA片段整合到质粒中进行克隆。以经过克隆的质粒为模板，通过使用上述引物进行PCR来制备探针。使用制备的探针筛选cDNA文库。
将本发明的MaGPAT4及MaGPAT5的推定氨基酸序列相对于在GenBank注册的氨基酸序列，使用BLASTp程序进行同源性搜索。与MaGPAT4同一性高的氨基酸序列为来自子囊菌(球毛壳菌Chaetomium globosum CBS 148.51)的推定蛋白质的氨基酸序列(GenBank accession No.XP 001224221)，同一性为39.3％。此外，MaGPAT4与来自人的甘油磷酸O-酰基转移酶(GNPAT；GenBank accessionNo.AAH00450)也具有同源性，氨基酸同一性为22.6％。而且，MaGPAT4与作为来自大肠杆菌(E.coli)的GPAT的plsB蛋白质(GenBank accession No.BAE78043)的氨基酸同一性为17.6％。另外，与MaGPAT5的同一性高的氨基酸序列为来自担子菌玉蜀黍黑粉菌Ustilago maydis 521的推定蛋白质的氨基酸序列(GenBankaccession No.XP 759516)，同一性为15.4％。
本发明还包含：与包含上述序列号1、序列号4或序列号8表示的碱基序列(也有时记为“本发明的碱基序列”)、以及编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列(也有时记为“本发明的氨基酸序列”)组成的蛋白质的碱基序列的核酸具有同等功能的核酸。“具有同等功能”是指，本发明的碱基序列编码的蛋白质及由本发明的氨基酸序列组成的蛋白质具有甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)活性及/或甘油磷酸O-酰基转移酶(GNPAT)活性。此外，“具有同等功能”还意指在本发明的碱基序列编码的蛋白质或由本发明的氨基酸序列组成的蛋白质所表达的宿主的脂肪酸组成中也可具有以下的任一活性：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油(TG)量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酵母(酿酒酵母S.cerevisiae)的甘油-3-磷酸酰基转移酶缺陷(GPAT缺陷)互补的活性，优选所述GPAT缺陷是由酵母的SCT1基因及GPT2基因两者的缺陷形成的缺陷；及/或
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
作为与此种本发明的核酸具有同等功能的核酸，可列举包含以下(a)～(g)中任一项所述的碱基序列的核酸。且在以下列举的碱基序列的记载中，“本发明的上述活性”意指上述的“选自GPAT活性、GNPAT活性、上述i)～v)的活性中的任一种以上的活性”。
(a)核酸，其包含编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。
本发明的核酸中所包含的碱基序列包含如下碱基序列，编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有本发明的上述活性的蛋白质。
具体地说，为如下碱基序列，编码由以下(i)～(iv)的氨基酸序列组成的蛋白质，且具有本发明的上述活性的蛋白质：
(i)序列号2、序列号5或序列号9所示氨基酸序列中1个或多个(优选为1个或数个(例如，1～250个、1～200个、1～150个、1～100个、1～80个、1～75个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个，进一步优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个))氨基酸发生缺失的氨基酸序列，
(ii)序列号2、序列号5或序列号9所示氨基酸序列中1个或多个(优选为1个或数个(例如，1～250个、1～200个、1～150个、1～100个、1～80个、1～75个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个，进一步优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个))氨基酸用其他氨基酸取代的氨基酸序列，
(iii)序列号2、序列号5或序列号9所示氨基酸序列中附加1个或多个(优选为1个或数个(例如，1～250个、1～200个、1～150个、1～100个、1～80个、1～75个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个，进一步优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个))其他氨基酸的氨基酸序列，或
(iv)组合上述(i)～(iii)的氨基酸序列。
上述中，取代优选为保守性取代。保守性取代是指将特定的氨基酸残基用具有类似的物理化学特征的残基取代，但只要不实质性改变与原来序列的结构相关的特征，可为任何取代，例如，只要取代氨基酸不破坏原序列中存在的螺旋结构，或不破坏赋予原序列特征的其他种类的二级结构，可为任何取代。
保守性取代通常可用生物学体系合成、化学肽合成来导入，但优选通过化学肽合成来进行。此时，取代基中可包含非天然的氨基酸残基，也可包含肽模仿物、氨基酸序列中未被取代的区域发生倒位的倒位型或同区域发生反转的反转型。
以下，将氨基酸残基按可取代的残基分类举例，但可取代的氨基酸残基不限于以下记载的残基：
A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、邻甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；
B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；
C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；
D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸及2，3-二氨基丙酸；
E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸及4-羟基脯氨酸；
F组：丝氨酸、苏氨酸及高丝氨酸；
G组：苯丙氨酸及酪氨酸。
为非保守性取代时，上述种类中的某一种成分可与其他种类的成分互换，此时，为保持本发明的蛋白质的生物学功能，优选参考氨基酸的亲水指数(亲水性氨基酸指数)(Kyte等，J.Mol.Biol.，157：105-131(1982))。
此外，为非保守性取代时，可根据亲水性进行氨基酸的取代。
在保守性取代及非保守性取代的任一种中，期望相当于序列号2中第316位、第319位及第351位的氨基酸的氨基酸残基分别为甘氨酸、丝氨酸及脯氨酸。对于序列号9，期望相当于第430位、第432位及第465位的氨基酸的氨基酸残基分别为甘氨酸、丝氨酸、及脯氨酸。
本说明书及附图中，碱基、氨基酸及其缩写根据IUPAC-IUB Commissionon Biochemical Nomenclature、或例如根据Immunology-A Synthesis(第2版，E.S.Golub及D.R.Gren主编，Sinauer Associates，马萨诸塞州桑德兰(1991))等中所记载的本领域惯用的缩写。此外，氨基酸有光学异构体时，在无特别说明的情况下，均表示L体。
D-氨基酸等上述氨基酸的立体异构体、α，α-二取代氨基酸等的非天然氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸及其他非惯用氨基酸，也可作为构成本发明的蛋白质的要素。
且本说明书中使用的蛋白质的标记法，根据标准用法及本领域中惯用的标记法，左方向为氨基末端方向，且右方向为羧基末端方向。
同样，在通常情况下不特别提及时，单链多核苷酸序列的左端为5’端，双链多核苷酸序列的左方向为5’方向。
只要是本领域技术人员，使用本领域中公知的技术，即可设计、制备本说明书中记载的蛋白质的适当的突变体。例如，通过将认为对本发明蛋白质的生物学活性并不太重要的区域作为靶区，可鉴定不损坏本发明的蛋白质的生物学活性而使其结构改变的蛋白质分子中适当的区域。且也可鉴定在类似的蛋白质间保守的分子的残基及区域。进而，在认为对本发明蛋白质的生物学活性或结构重要的区域中，在不损坏生物学活性且不对蛋白质的多肽结构产生不良影响的情况下，也可导入保守性氨基酸取代。
只要是本领域技术人员，均可鉴定对本发明蛋白质的生物学活性或结构重要、与该蛋白质的肽类似的肽残基，比较此2种肽的氨基酸残基，预测出与本发明蛋白质类似的蛋白质的哪个残基是与对生物学活性或结构重要的氨基酸残基对应的氨基酸残基，即可进行所谓的结构-功能研究。而且，通过选择与上述预测的氨基酸残基的化学性质类似的氨基酸取代，也可选择保持了本发明蛋白质的生物学活性的突变体。且如果是本领域技术人员，即可对本蛋白质突变体的三维结构及氨基酸序列进行分析。进而从所得到的分析结果来看，也可预测与蛋白质的三维结构有关的氨基酸残基的比对。预测为蛋白质表面上存在的氨基酸残基具有参与和其它分子的重要的相互作用的可能性，因此，如果是本领域技术人员，即可基于上述分析结果，制备不使预测为在此种蛋白质表面上存在的氨基酸残基发生改变的突变体。而且，只要是本领域技术人员，均可制备构成本发明蛋白质的各个氨基酸残基中，只有一个氨基酸残基发生取代的突变体。通过公知的检测方法筛选此种突变体，即可收集各个突变体的信息。由此，通过对以下情况进行比较，即某种特定氨基酸残基发生取代的突变体的生物学活性与本发明蛋白质的生物学活性相比降低时、不表现出此种生物学活性时或产生抑制本蛋白质生物学活性的不适当活性时，可评价构成本发明蛋白质的各种氨基酸残基的有用性。此外，只要是本领域技术人员，即可根据此种从日常实验中收集的信息，单独或与其他突变组合，从而容易地分析作为本发明蛋白质的突变体的不期望的氨基酸取代。
如上所述，由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成的蛋白质，可通过《MolecularCloning，A Laboratory Manual 3rd ed.》(Cold Spring Harbor Press(2001))、《Current Protocols in Molecular Biology》(John Wiley & Sons(1987-1997)、Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-92、Kunkel(1988)Method.Enzymol.85：2763-6)等中记载的定点诱变法等方法制备。发生了此种氨基酸的缺失、取代或附加等突变的突变体的制备，例如可通过Kunkel法、Gapped duplex法等公知手法，使用利用了定点诱变法的突变导入用试剂盒、例如QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司制)、GeneTailorTMSite-Directed Mutagenesis System(Invitrogen公司制)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K、Mutan-Super ExpressKm等：TAKARA BIO公司制)等进行。
且作为在蛋白质的氨基酸序列中既保持了其活性同时又导入1或多个氨基酸的缺失、取代、或附加的方法，除上述定点诱变以外，还可列举为利用使用诱变剂处理基因的方法、及使基因选择性断裂将选择的核苷酸除去、取代或附加后进行连接的方法。
本发明的核酸中包含的碱基序列，优选为编码由序列号2、序列号5或序列号9所示的氨基酸序列中1～80个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有GPAT活性及/或GNPAT活性的蛋白质的碱基序列。
此外，本发明的核酸中包含的碱基序列中，还优选包含编码由序列号2、序列号5或序列号9中1～80个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。
本发明蛋白质中的氨基酸突变或修饰的数量、或突变或修饰的位点，只要保持本发明的上述活性，并无限制。
本发明的以蛋白质的GPAT活性为主的本发明的上述活性可使用公知的方法测定。例如，可参照以下文献：Biochem.J.，355，315-322，2001。
例如，本发明的“GPAT活性”也可如下测定。从表达本发明的GPAT的酵母中，根据J.Bacteriology，173，2026-2034(1991)中所记载的方法等制备微粒体组分。而且，在作为反应液的0.44mM甘油-3-磷酸、0.36mM酰基-CoA、0.5mM DTT、1mg/ml BSA、2mM MgCl2、50mM Tris-HCl(pH7.5)中添加上述微粒体组分，28℃下反应适当时间，添加氯仿∶甲醇使反应终止后进行脂质提取，将所得到的脂质通过薄层色谱法等进行分离，对可生成的溶血磷脂酸量进行定量。
此外，本发明的上述i)、ii)或v)中所示的活性例如也可如下测定，通过测定表达本发明的蛋白质的宿主细胞(例如，酵母、M.alpina)的脂肪酸组成或脂肪酸含有率来测定。在通过本发明的脂肪酸组合物的制造方法得到的冷冻干燥菌体中添加以适当比率调节的氯仿∶甲醇并搅拌后，加热处理适当时间。进而重复数次通过离心分离分离菌体、回收溶剂的过程。其后，使用适当的方法使脂质干固后，添加氯仿等的溶剂溶解脂质。取适当量的该试样，通过盐酸甲醇法将菌体的脂肪酸衍生成甲酯后，用己烷提取，馏去己烷，通过气相色谱法进行分析。
本发明的上述iii)中所示的活性例如也可如下测定，通过测定表达本发明的蛋白质的酵母的三酰甘油(TG)量来测定。如上所述从菌体中提取·回收脂质后，例如进行薄层色谱法(TLC)分离、回收TG组分。而后，对于通过盐酸甲醇法回收的TG组分，在将构成TG的脂肪酸衍生成甲酯后，用己烷提取，馏去己烷后，用气相色谱法定量。
本发明的上述iv)中所示的活性例如也可如下测定，通过确认导入的本发明的蛋白质是否可与酵母(酿酒酵母S.cerevisiae)的GPAT缺陷互补来测定。已知酵母中有作为承担GPAT活性的基因SCT1和GPT2，使这些同时缺失时会致死。即SCT1基因及GPT2基因缺失的酵母通常无法生长繁殖，但与这些基因具有同等功能的基因、即在表达具有GPAT活性的蛋白质时，则可进行互补、生长繁殖。在此，对于本发明的GPAT，作为确认与酵母的GPAT缺陷互补的方法，只要是可确认在酵母的SCT1基因及GPT2基因缺陷的菌株中，本发明的GPAT基因表达时该酵母的GPAT活性得到恢复的方法，也可为任何方法。例如，如以下的实施例8中的具体说明，在Δgpt2纯合2倍体酵母中，制备仅有SCT1基因的1个等位基因缺陷的杂合株，而后，制备在该杂合株上、在与携带SCT1的染色体不同的染色体上插入1个本发明的GPAT基因的表达盒的菌株或制备在该杂合株上插入具有本发明的GPAT基因的表达盒的质粒型载体的菌株。将该菌株涂布在孢子形成培养基上形成子囊孢子。将所得到的菌体通过随机孢子分析或四分子分析，可得到来自孢子的1倍体株。分析如此得到的1倍体酵母的基因型，只要可确认出在原本无法生长繁殖的Δgpt2Δsct1株中，在仅存在本发明的GPAT基因的表达盒时可生长繁殖，即可判断本发明的GPAT在酵母中可与GPAT活性互补。
(b)核酸，其包含与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。
本发明的核酸中所包含的碱基序列包含如下碱基序列，与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。
上述碱基序列可如下获得，用本领域技术人员公知的方法使用适当的片段制备探针，使用该探针通过菌落杂交法、噬菌斑杂交、Southern印迹法等公知的杂交法从cDNA文库及基因组文库等中获得。
对于杂交法的详细步骤，可参照《Molecular Cloning，A Laboratory Manual 3rd ed.》(Cold Spring Harbor Press(2001)；特别是Section 6-7)、《Current Protocols in Molecular Biology》(John Wiley & Sons(1987-1997)；特别是Section6.3-6.4)、《DNA Cloning 1：Core Techniques，A Practical Approach 2nd ed.》(Oxford University(1995)；杂交条件特别参照Section2.10)等。
杂交条件的强度主要由杂交条件、更优选由杂交条件及洗涤条件决定。在本说明书中“严谨条件”包括中度或高度严谨条件。
具体来说，作为中度严谨条件，例如杂交条件，可列举1×SSC～6×SSC、42℃～55℃的条件，更优选为1×SSC～3×SSC、45℃～50℃的条件，最优选为2×SSC、50℃的条件。杂交溶液中例如包含约50％甲酰胺时，采用比上述温度低5～15℃的温度。作为洗涤条件，可列举0.5×SSC～6×SSC、40℃～60℃。在杂交及洗涤时，通常可加入0.05％～0.2％SDS、优选为约0.1％SDS。
作为高度严谨(高严谨)的条件，包括在比中度严谨条件高的温度及/或低的盐浓度下的杂交及/或洗涤。例如作为杂交条件，可列举0.1×SSC～2×SSC、55℃～65℃的条件，更优选为0.1×SSC～1×SSC、60℃～65℃的条件，最优选为0.2×SSC、63℃的条件。作为洗涤条件，可列举0.2×SSC～2×SSC、50℃～68℃，更优选为0.2×SSC、60～65℃。
特别是作为本发明使用的杂交条件，例如可列举：在5×SSC、1％SDS、50mMTris-HCl(pH7.5)及50％甲酰胺中在42℃的条件下进行预杂交后，添加探针，在42℃保温过夜形成杂交体，然后在0.2×SSC、0.1％SDS中在65℃下进行3次20分钟的洗涤的条件，但并不限于此条件。
此外，也可使用探针中未使用放射性物质的市售的杂交试剂盒。具体地说，可列举为使用DIG核酸检测试剂盒(Roche Diagnostics公司)、ECL direct labeling & detection system(Amersham公司制)进行的杂交等。
作为本发明中所包含的碱基序列可列举如下碱基序列，优选为与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且编码具有GPAT活性及/或GNPAT活性的蛋白质的碱基序列。
(c)核酸，其包含与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列有70％以上同一性的碱基序列所组成，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。
本发明的核酸中所包含的碱基序列包含如下碱基序列，由与序列号1、序列号4或序列号8所示的碱基序列有至少70％以上同一性的碱基序列组成，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。
可列举优选为包含与序列号1、序列号4或序列号8所示的碱基序列有至少75％以上、进一步优选为80％以上(例如为85％以上，更优选为90％以上，进一步为95％、98％或99％以上)同一性的碱基序列的核酸，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。
2个碱基序列的同一性％可通过视觉检查、数学计算来确定，但优选使用计算机程序、通过比较2组核酸的序列信息来确定。作为序列比较计算机程序，例如可利用美国国立医学图书馆的网站：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html的BLASTN程序(Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10)：2.2.7版或WU-BLAST2.0算法等。关于WU-BLAST2.0的标准默认参数的设定，可使用以下网站：http://blast.wustl.edu中所记载的内容。
(d)核酸，其包含编码与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为70％以上的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。
本发明的核酸中所包含的碱基序列包含编码与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为70％以上的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。本发明的核酸编码的蛋白质只要与具有本发明的上述活性的蛋白质有同等功能，也可以是与MaGPAT4、MaGPAT4-long或MaGPAT5的氨基酸序列具有同一性的蛋白质。
具体地说，可列举与序列号2、序列号5或序列号9所示的氨基酸序列有75％以上、优选为80％以上、更优选为85％、进一步优选为90％(例如95％、进一步为98％)以上同一性的氨基酸序列等。
本发明的核酸中所包含的碱基序列，优选为编码与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为90％以上的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。进一步优选为编码与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为95％以上的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。
2段氨基酸序列的同一性的百分率可通过视觉检查、数学计算确定。此外，也可使用计算机程序来确定同一性百分率。作为此种计算机程序，例如可列举为BLAST、FASTA(Altschul等、J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))、及ClustalW等。特别是通过BLAST程序的同一性检索的各种条件(参数)，已由Altschul等(Nucl.Acids.Res.，25，p.3389-3402，1997)做了记载，可从美国生物技术信息中心(NCBI)、日本DNA数据库(DDBJ)的网站上公开获得(BLAST指南、Altschul等NCB/NLM/NIH Bethesda，MD 20894；Altschul等)。且可使用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7(GENETYX)、DINASIS Pro(日立软件)、Vector NTI(Infomax)等的程序来确定。
使多个氨基酸序列并列的特定的比对图也可显示序列中特定的短的区域的匹配，所以，即使使用的序列的全长序列间无显著相关时，也可在此种区域中检测出特定的序列同一性非常高的区域。且BLAST算法可使用BLOSUM62氨基酸打分矩阵，作为选择参数可使用如下所示的内容：(A)包括将具有低组成复杂性的查询序列的片段(由Wootton及Federhen的SEG程序(Computers and Chemistry，1993)确定；也希望参照Wootton及Federhen，1996《序列数据库中组成偏向性区域的分析》(Analysis of compositionally biased regions in sequence databases)Methods Enzymol.266：544-71)、或由短周期性的内部重复组成的片段(由Claverie及States(Computers and Chemistry，1993)的XNU程序确定))用于屏蔽的过滤，及(B)根据用于报告对数据库序列的一致性的统计学上的显著性阈值、或根据E-score(Karlin及Altschul，1990)的统计学模型，仅由偶然发现的一致性的期望概率；源于某种一致性的统计学的显著差异比E-score阈值大时，不报告此一致性。
(e)核酸，其包含与编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。
本发明的核酸中所包含的碱基序列包含如下碱基序列，与编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。
由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成的蛋白质及杂交的条件如上所述。作为本发明的核酸中所包含的碱基序列，可列举与编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。
(f)核酸，其包含与由序列号7或序列号12组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且具有编码具有本发明的上述活性的蛋白质的外显子的碱基序列。
由序列号7或序列号12组成的碱基序列分别为编码本发明的MaGPAT4(及MaGPAT4-long)或MaGPAT5的基因组DNA序列。
本发明的核酸中所包含的碱基序列包含如下碱基序列，与由序列号7或序列号12组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且具有编码具有本发明的上述活性的蛋白质的外显子的碱基序列。
上述碱基序列可如下获得，用本领域技术人员公知的方法使用适当的片段制备探针，使用该探针通过菌落杂交法、噬菌斑杂交、Southern印迹法等公知的杂交法，从基因组文库等中获得。杂交条件如上所述。
(g)核酸，其包含与由序列号7或序列号12组成的碱基序列的同一性为70％以上的碱基序列所组成，且具有编码具有本发明的上述活性的蛋白质的外显子的碱基序列。
本发明的核酸中所包含的碱基序列包含如下碱基序列，与由序列号7或序列号12组成的碱基序列有至少70％以上同一性的碱基序列所组成，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。可列举如下碱基序列，优选包含与序列号7或序列号12所示的碱基序列有至少75％以上、进一步优选为80％以上(例如85％以上，更优选为90％以上，进一步为95％、98％或99％以上)同一性的碱基序列，且具有编码具有本发明的上述活性的蛋白质的外显子。2个碱基序列的同一性％可如上所述确定。
此外，序列号7的基因组DNA序列由10个外显子和9个内含子组成，外显子区域为序列号7的第428～744位或第596～744位、第850～924位、第1302～1396位、第1480～1726位、第1854～2279位、第2370～2632位、第2724～3299位、第3390～3471位、第3575～4024位及第4133～4248位。且序列号12的基因组DNA序列由3个外显子和2个内含子组成，外显子区域为序列号12的第1～302位、第457～1676位及第1754～2598位。
在其他方式中，本发明的核酸中所包含的碱基序列可列举如下碱基序列，包含在序列号7或序列号12所示的基因组DNA序列中，内含子区域的碱基序列与序列号7或序列号12所示的序列为100％同一，且外显子区域的碱基序列与序列号7或序列号12所示的序列有至少70％以上，优选为75％以上，进一步优选为80％以上(例如85％以上，更优选为90％以上，进一步为95％以上、98％以上、99％以上)同一性的碱基序列，且具有编码具有本发明的上述活性的蛋白质的外显子。
此外，在另一方式中，本发明的核酸中所包含的碱基序列可列举如下碱基序列，包含在序列号7或序列号12所示的基因组DNA序列中，外显子区域的碱基序列与序列号7或序列号12所示的序列为100％同一，且内含子区域的碱基序列与序列号7或序列号12所示的序列有至少70％以上，优选为75％以上，进一步优选为80％以上(例如85％以上，更优选为90％以上，进一步为95％以上、98％以上、99％以上)同一性的碱基序列，且可通过剪接脱离内含子区域，由此而连接外显子区域并编码具有本发明的上述活性的蛋白质。
进而在其他方式中，本发明的核酸中所包含的碱基序列可列举如下碱基序列，包含在序列号7或序列号12所示的基因组DNA序列中，内含子区域的碱基序列与序列号7或序列号12所示的序列有至少70％以上，优选为75％以上，进一步优选为80％以上(例如85％以上，更优选为90％以上，进一步为95％以上、98％以上、99％以上)同一性的碱基序列，且外显子区域的碱基序列与序列号7或序列号12所示的序列有至少70％以上，优选为75％以上，进一步优选为80％以上(例如85％以上，更优选为90％以上，进一步为95％以上、98％以上、99％以上)同一性的碱基序列，且可通过剪接脱离内含子区域，由此而连接的外显子区域编码具有本发明的上述活性的蛋白质。
2个碱基序列的同一性％可通过上述的方法确定。
此外，本发明的核酸中还包含如下核酸，包含由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列中1或多个的碱基发生缺失、取代或附加的碱基序列所组成，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列的核酸。具体地说，也可使用如下包含(i)～(iv)的碱基序列的核酸：
(i)序列号1、序列号4或序列号8所示碱基序列中1个或多个(优选为1个或数个(例如1～720个、1～600个、1～500个、1～400个、1～300个、1～250个、1～200个、1～150个、1～100个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个，进一步优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个))碱基发生缺失的碱基序列，
(ii)序列号1、序列号4或序列号8所示碱基序列中1个或多个(优选为1个或数个(例如1～720个、1～600个、1～500个、1～400个、1～300个、1～250个、1～200个、1～150个、1～100个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个，进一步优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个))碱基用其他碱基取代的碱基序列，
(ii i)序列号1、序列号4或序列号8所示碱基序列中附加1个或多个(优选为1个或数个(例如1～720个、1～600个、1～500个、1～400个、1～300个、1～250个、1～200个、1～150个、1～100个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个，进一步优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个))其他碱基的碱基序列，或
(iv)组合了上述(i)～(ii i)的碱基序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。
作为本发明的核酸的优选方式，还为含有包含以下(a)～(d)中任一项所述的碱基序列的片段的核酸：
(a)序列号1、序列号4或序列号8表示的碱基序列，
(b)编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列，
(c)序列号3、序列号6或序列号11表示的碱基序列，
(d)序列号7或序列号12表示的碱基序列。
有关(a)序列号1、序列号4或序列号8表示的碱基序列、(b)编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列、(c)序列号3、序列号6或序列号11表示的碱基序列，如表1中所记载。且有关序列号7或序列号12表示的碱基序列如上所述。上述序列的片段包含上述碱基序列中所包含的ORF、CDS、具有生物学活性的区域、作为如下记载的引物而使用的区域、可作为探针的区域，可来自天然，也可由人工制备。
此外，本发明的核酸中还包含以下核酸。
(1)一种核酸，其特征在于，为以下(a)～(g)中任一项所述的核酸：
(a)核酸，其包含编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列；
(b)核酸，其与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交；
(c)核酸，其包含与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列的同一性为70％以上的碱基序列；
(d)核酸，其包含编码与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为70％以上的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列；
(e)核酸，其与编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交；
(f)核酸，其与由序列号7或序列号12组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交；
(g)核酸，其包含与由序列号7或序列号12组成的碱基序列的同一性为70％以上的碱基序列。
(2)根据(1)中所述的核酸，其特征在于，为以下(a)～(g)中任一项所述的核酸：
(a)核酸，其包含编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列中1～80个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列；
(b)核酸，其与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交；
(c)核酸，其包含与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列；
(d)核酸，其包含编码与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为90％以上的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列；
(e)核酸，其与编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交；
(f)核酸，其与由序列号7或序列号12组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交；
(g)核酸，其包含与由序列号7或序列号12组成的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列。
本发明的甘油-3-磷酸酰基转移酶
本发明的蛋白质包含由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成的蛋白质及与所述蛋白质具有同等功能的蛋白质，可来自天然，也可人工制备。对于由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成的蛋白质，如上所述。“具有同等功能的蛋白质”，指如上述“编码本发明的甘油-3-磷酸酰基转移酶的核酸”一项中说明的具有“本发明的上述活性”的蛋白质。
本发明中，作为与由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质，可列举以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质：
(a)蛋白质，其由序列号2、序列号5或序列号9中1或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有本发明的上述活性；
(b)蛋白质，其为与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为70％以上的氨基酸序列所组成的蛋白质，且具有本发明的上述活性。
上述中，对于序列号2、序列号5或序列号9中1或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列、或与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为70％以上的氨基酸序列，如上述“编码本发明的甘油-3-磷酸酰基转移酶的核酸”一项中的说明。且上述“具有本发明的上述活性的蛋白质”包含如下蛋白质：为由包含序列号1、序列号4或序列号8的碱基序列的核酸编码的蛋白质的突变体、或通过序列号2、序列号5或序列号9所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失或附加等多种修饰而产生突变的蛋白质、或氨基酸侧链等被修饰的修饰蛋白质、与其他蛋白质融合的蛋白质，且为具有GPAT活性、GNPAT活性及/或上述“编码本发明的甘油-3-磷酸酰基转移酶的核酸”一项中所述的i)的活性或上述ii)的活性的蛋白质。
另外，本发明的蛋白质也可人工制备，此时可通过Fmoc法(9-芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法制造。此外，也可利用AdvancedChem Tech公司制、珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司制、Pharmacia公司制、Protein Technology Instruments公司制、Synthecell-Vega公司制、PerSeptive公司制、岛津制作所制等的肽合成仪进行化学合成。
且本发明的蛋白质中还包含以下蛋白质。
(1)一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质：
(a)蛋白质，其由序列号2、序列号5或序列号9中1或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成；
(b)蛋白质，其由与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为70％以上的氨基酸序列所组成。
(2)根据(1)中所述的蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质：
(a)蛋白质，其由序列号2、序列号5或序列号9中1～80个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成；
(b)蛋白质，其由与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为90％以上的氨基酸序列所组成。
本发明的核酸的克隆
本发明的GPAT的核酸，例如可通过使用适合的探针从cDNA文库中筛选来进行克隆。且可使用适合的引物通过PCR反应进行扩增，通过与适合的载体连接来进行克隆。并且也可亚克隆到其他载体中。
例如也可使用pBlue-Script TMSK(+)(Stratagene)、pGEM-T(Promega)、pAmp(TM：Gibco-BRL)、p-Direct(Clontech)、pCR2.1-TOPO(Invitrogene)等的市售的质粒载体。且通过PCR反应进行扩增时，引物可使用上述序列号3、6或11等所示的碱基序列的任何部分。例如，可使用后述的实施例中所述的引物。而后，在从M.alpina菌体中制备的cDNA中，使上述引物及DNA聚合酶等作用而进行PCR反应。上述方法根据《Molecular Cloning，A Laboratory Manual3rd ed.》(Cold Spring Harbor Press(2001))等，只要是本领域技术人员均可容易地进行，作为本发明的PCR反应条件，例如可列举为以下条件：
变性温度：90～95℃
退火温度：40～60℃
延伸温度：60～75℃
循环数：10次以上
所得到的PCR产物的纯化可使用公知的方法。例如使用GENECLEAN(Funakoshi)、QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN)、ExoSAP-IT(GE Healthcare Bio-Sciences)等试剂盒的方法、使用DEAE-纤维素滤纸的方法、使用透析管的方法等。使用琼脂糖凝胶时，可进行琼脂糖凝胶电泳，将碱基序列片段从琼脂糖凝胶切出，通过GENECLEAN(Funakoshi)、QIAquick Gel extraction Kits(QIAGEN)、Freeze&Squeeze法等纯化。
克隆后的核酸的碱基序列可使用碱基序列测序仪来确定。
GPAT表达用载体构建及转化体的制备
本发明还提供包含编码本发明的GPAT的核酸的重组载体。本发明还进一步提供由上述重组载体转化的转化体。
此种重组载体及转化体可如下获得。即将具有编码本发明的GPAT的核酸的质粒用限制性内切酶酶切。作为所使用的限制性内切酶，例如可列举为EcoRI、KpnI、BamHI及SalI等，但不限于此。且也可通过T4聚合酶处理将末端平滑化。将酶切后的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化。将该DNA片段通过使用公知的方法整合到表达用载体中，可得到GPAT表达用载体。将此表达载体导入宿主制备转化体，用于目的蛋白质的表达。
此时，表达载体及宿主只要可表达目的蛋白质，无特别限定，例如作为宿主，可列举真菌、细菌、植物、动物或它们的细胞等。作为真菌，可列举作为脂质生产菌的M.alpina等的丝状菌、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等的酵母等。且作为细菌，可列举大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。且作为植物可列举菜籽、大豆、棉花、红花、亚麻等的油料作物。
作为脂质生产菌，例如可以使用在MYCOTAXON，Vol.XLIV，No.2，pp.257-265(1992)中记载的菌株，具体地说可以列举属于被孢霉属(Mortierella)的微生物、例如长孢被孢霉(Mortierella elongata)IFO8570、微小被孢霉(Mortierella exigua)IFO8571、喜湿被孢霉(Mortierella hygrophila)IFO5941、高山被孢霉(Mortierella alpina)IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS 219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等被孢霉亚属(subgenus Mortierella)的微生物、或深黄被孢霉(Mortierella isabellina)CBS194.28、IFO6336、IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884、矮被孢霉(Mortierella nana)IFO8190、拉曼被孢霉(Mortierella ramanniana)IFO5426、IFO8186、CBS112.08、CBS212.72、IFO7825、IFO8184、IFO8185、IFO8287、葡酒色被孢霉(Mortierella vinacea)CBS236.82等Micromucor亚属(subgenus Micromucor)的微生物等。特别优选高山被孢霉(Mortierella alpina)。
以真菌类为宿主使用时，优选本发明的核酸在宿主中可自主复制、或者是可插入该菌的染色体上的结构。与此同时，优选是包含启动子、终止子的组成。使用M.alpina作为宿主时，作为表达载体，例如可列举pD4、pDuraSC、pDura5等。作为启动子，只要可在宿主中表达，可使用任何启动子，例如可使用histonH4.1基因启动子、GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)基因启动子、TEF翻译延伸因子(Translation elongation factor)基因启动子的来自M.alpina的启动子。
作为向M.alpina等丝状菌内导入重组载体的方法，例如可列举电穿孔法、原生质球法、粒子轰击法及向核内DNA直接显微注射法等。使用营养缺陷型的宿主株时，通过选择在缺少其营养素的选择培养基上生长繁殖的菌株，可获得转化株。此外，转化使用抗药性标记基因时，在包含其药剂的选择培养基上培养，可得到具有抗药性的细胞菌落。
以酵母为宿主使用时，作为表达载体，例如可列举pYE22m等。且也可使用pYES(Invitrogen)、pESC(STRATAGENE)等市售的酵母表达用载体。另外，作为适用于本发明的宿主可列举Saccharomyces cerevisiae EH13-15株(trp1，MATα)等，但不限于此。作为启动子，例如可使用GAPDH启动子、gal1启动子、gal10启动子等来自酵母等的启动子。
作为向酵母内导入重组载体的方法，例如可列举醋酸锂法、电穿孔法、原生质球法、葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、脂质体中的多核苷酸(单数或多数)的包裹、及向核内直接显微注射DNA等。
以大肠杆菌等的细菌为宿主使用时，作为表达载体，例如可列举Pharmacia公司的pGEX、pUC18等。作为启动子，例如可使用trp启动子、lac启动子、PL启动子、PR启动子等来自大肠杆菌、噬菌体等的启动子。作为向细菌内导入重组载体的方法，例如可使用电穿孔法、氯化钙法。
本发明的脂肪酸组合物的制造方法
本发明提供从上述转化体中制造脂肪酸组合物的方法。即：培养上述转化体，从获得的培养物中制造脂肪酸组合物的方法。脂肪酸组合物是包含1种或1种以上的脂肪酸的集合体的组合物。在此，脂肪酸可以是游离脂肪酸，也可以作为包含甘油三酯、磷脂等脂肪酸的脂质而存在。本发明的脂肪酸组合物具体可用以下方法制造。但是，对于本制造方法来说，并不限于该方法，可采用通常公知的其他方法进行。
用于培养使GPAT表达的生物的培养基，只要是具有适当的pH及渗透压，包含各宿主增殖所必需的营养素、微量成分、血清、抗生素等生物材料的培养液(培养基)，可使用任意的培养液。例如转化酵母使GPAT表达时，可使用SC-Trp培养基、YPD培养基、YPD5培养基等，但并不限于这些。作为具体的培养基的组成，以SC-Trp培养基为例：每1l中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)为6.7g、葡萄糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、亮氨酸1.8g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、尿嘧啶0.6g的混合物)为1.3g。
培养条件，只要是适合宿主增殖、且适于生成的酶保持稳定的条件，可以为任意的条件，具体可调节厌氧度、培养时间、温度、湿度、静置培养或振荡培养等各种条件。培养方法，可以为同一条件下的培养(1段培养)，也可以为使用2个以上不同培养条件即2段培养或3段培养，进行大量培养时，优选培养效率良好的2段培养等。
作为宿主使用酵母进行2段培养时，本发明的脂肪酸组合物的制造方法可如下进行。作为预培养，将转化体的菌落接种到上述的SC-Trp培养基等中，30℃下振荡培养2天。其后，作为主培养，在YPD5(2％酵母膏、1％多聚蛋白胨、5％葡萄糖)培养基10ml中添加预培养液500μl，30℃下振荡培养2天。
本发明的脂肪酸组合物
本发明还提供在本发明的GPAT已表达的细胞中的1种或1种以上作为脂肪酸的集合体的脂肪酸组合物。优选为培养本发明的GPAT已表达的转化体而得到的脂肪酸组合物。脂肪酸可以是游离脂肪酸，也可以以包含甘油三酯、磷脂等脂肪酸的脂质的形态存在。
作为本发明脂肪酸组合物中包含的脂肪酸，是指长链烃的链状或分支状的单羧酸，例如可列举肉豆蔻酸(myristic acid)(十四烷酸)(14:0)、肉豆蔻油酸(myristoleic acid)(十四碳烯酸)(14:1)、棕榈酸(十六烷酸)(16:0)、棕榈油酸(9-十六碳烯酸)(16:1)、硬脂酸(十八烷酸)(18:0)、油酸(顺式-9-十八碳烯酸)(18:1(9))、异油酸(11-十八碳烯酸)(18:1(11))、亚油酸(顺式，顺式-9，12十八碳二烯酸)(18:2(9，12))、α-亚麻酸(9，12，15-十八碳三烯酸)(18:3(9，12，15))、γ-亚麻酸(6，9，12-十八碳三烯酸)(18:3(6，9，12))、亚麻油酸(6，9，12，15-十八碳四烯酸酸)(18:4(6，9，12，15))、花生酸(二十烷酸)(20:0)、(8，11-二十碳二烯酸)(20:2(8，11))、Mead酸(5，8，11-二十碳三烯酸)(20:3(5，8，11))、二高γ-亚麻酸(8，11，14-二十碳三烯酸)(20:3(8，11，14))、花生四烯酸(5，8，11，14-二十碳四烯酸)(20:4(5，8，11，14))、二十碳四烯酸(8，11，14，17-二十碳四烯酸)(20:4(8，11，14，17)、二十碳五烯酸(5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)(20:5(5，8，11，14，17))、山萮酸(二十二烷酸)(22:0)、(7，10，13，16-二十二碳四烯酸)(22:4(7，10，13，16))、(7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸)(22:5(7，10，13，16，19))、(4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸)(22:5(4，7，10，13，16))、(4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸)(22:6(4，7，10，13，16，19))、木质素酸(二十四烷酸)(24:0)、神经酸(顺式-15-二十四碳单烯酸)(24:1)、蜡酸(二十六烷酸)(26:0)等，但并不限于这些。此外，上述物质名称是采用IUPAC生物化学命名法定义的通用名称，括号内记载了组织名及表示碳原子数量和双键位置的数值)。
本发明的脂肪酸组合物只要是为上述脂肪酸中1种或1种以上的脂肪酸的组合，也可为由任何数量任何种类的脂肪酸组成的组合物。
在测定本发明的脂肪酸组合物的组成时，可利用本说明书中的“编码本发明的甘油-3-磷酸酰基转移酶的核酸”一项中所记载的脂肪酸组成或脂肪酸含有率的测定方法。
包含本发明的脂肪酸组合物的食品等
此外，本发明还提供包含上述脂肪酸组合物的食品。本发明的脂肪酸组合物，根据常用方法，例如可用于包含油脂的食品、工业原料(化妆品、医药(例如皮肤外用药)、肥皂等的原料)的制造等用途中。作为化妆品(组合物)或医药(组合物)的剂型，可列举溶液状、糊状、凝胶状、固体状、粉末状等任意的剂型，但并不限于这些。此外，作为食品的形态，可列举胶囊等医药制剂的形态，或在蛋白质、糖类、脂肪、微量元素、维生素类、乳化剂、香料等中配合了本发明的脂肪酸组合物的自然流食、半酶切状态营养食品以及成分营养食品、保健饮料、经肠营养剂等加工形态。
进而，作为本发明的食品的例子，可以列举营养辅助食品、保健食品、功能性食品、幼儿用食品、婴儿用配方奶、早产儿用配方奶、老人用食品等，但并不限于这些。在本说明书中，食品是固体、流体、液体以及它们的混合物，是可摄取食用的物质的总称。
营养辅助食品是指强化了特定营养成分的食品。保健食品是指被认为是健康的或对健康有益的食品，包括营养辅助食品、天然食品、减肥食品等。功能性食品是指用来补充发挥机体调节功能的营养成分的食品，与特定保健用食品同义。幼儿用食品是指供给约6岁以下的儿童用的食品。老人用食品是指处理成比未处理食品易消化和吸收的食品。婴儿用配方奶是指供给约1岁以下的儿童用的配方奶。早产儿用配方奶是指供给早产儿出生后到约6个月为止所用的配方奶。
作为这些食品，可以列举肉、鱼、坚果等天然食品(用油脂处理过的食品)；中国菜、拉面、汤等在制作时加入油脂的食品；天妇罗、油炸食品、油炸豆腐、炒饭、甜甜圈、花林糖等用油脂作为热介质的食品；黄油、人造黄油、蛋黄酱、调味汁、巧克力、方便面、奶糖、饼干、曲奇、蛋糕、冰淇凌等油脂食品或在加工时添加了油脂的加工食品；(烤)年糕片、硬饼干、豆沙面包等在加工完成时用油脂喷雾或涂布的食品等。但是，本发明的食品并不限于包含油脂的食品，例如还可以是面包、面条类、米饭、点心类(糖果、口香糖、橡皮糖、压片糖、日式点心)、豆腐及其加工品等农产品；清酒、药酒、甜料酒、食醋、酱油、黄酱等发酵食品；酸奶、火腿、培根、香肠等畜产食品；鱼糕、炸鱼糕、鱼肉山芋饼等水产食品；果汁饮料、清凉饮料、运动饮料、酒精饮料、茶等。
使用编码本发明的GPAT的核酸或GPAT蛋白质的菌株的评价·选择方法
本发明还提供使用编码本发明的GPAT的核酸或GPAT蛋白质进行脂质生产菌的评价和选择的方法。具体如下所示：
(1)评价方法
作为本发明的一个实施方式，可列举使用编码本发明的GPAT的核酸或GPAT蛋白质，进行脂质生产菌评价的方法。作为本发明的上述评价方法，首先可列举使用基于本发明的碱基序列设计的引物或探针，对作为被测菌株的脂质生产菌株的本发明的上述活性进行评价的方法。此种评价方法的通常方法为公知，例如在国际专利申请WO01/040514号公报、日本特开平8-205900号公报等中均有记载。以下对该评价方法进行简单说明。
首先制备被测菌株的基因组。制备方法可使用Hereford法、醋酸钾法等任何公知的方法(例如参照Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，p130(1990))。
基于本发明的碱基序列、优选基于序列号1、序列号4或序列号8设计引物或探针。上述引物或探针可使用本发明碱基序列的任意部分，且其设计可使用公知方法进行。作为引物使用的多核苷酸的碱基数，通常为10个碱基以上，优选为15～25个碱基。此外，夹在两引物间的碱基数通常以300～2000碱基为宜。
使用上述制备的引物或探针，检测上述被测菌体的基因组中是否存在本发明碱基序列的特异性序列。本发明碱基序列的特异性序列的检测可采用公知方法进行。例如，将包含本发明碱基序列的特异性序列的一部分或全部的多核苷酸或者包含上述碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸作为一个引物使用，作为另一个引物使用包含该序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸、或包含上述碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸，例如通过PCR法等扩增被测菌株的核酸，可测定扩增产物的有无、扩增产物分子量的大小等。
适合本发明方法的PCR法的反应条件无特别限定，例如可列举以下条件，
变性温度：90～95℃
退火温度：40～60℃
延伸温度：60～75℃
循环数：10次以上
等的条件。将获得的反应生成物通过使用琼脂糖凝胶等的电泳法等进行分离，可测定扩增产物的分子量。因此通过确认扩增产物的分子量是否是包含相当于本发明碱基序列的特异性区域的核酸分子的大小，可预测或评价被测菌株的本发明的上述活性。而且通过用上述方法等分析上述扩增产物的碱基序列，还可进一步更正确地预测或评价本发明的上述活性。另外，本发明的上述活性的评价方法如上所述。
且作为本发明的上述评价方法，通过培养被测菌株，测定序列号1或序列号6等本发明的碱基序列编码的GPAT的表达量，也可评价被测菌株的本发明的上述活性。且GPAT的表达量，可通过在适当条件下培养被测菌株，对GPAT的mRNA或蛋白质定量来测定。mRNA或蛋白质的定量可使用公知的方法进行。mRNA的定量，例如可通过Northern杂交法、定量RT-PCR进行，蛋白质的定量例如可通过Western印迹法进行(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons 1994-2003)。
(2)选择方法
作为本发明的其他方式，可列举使用编码本发明的GPAT的核酸或GPAT蛋白质进行脂质生产菌选择的方法。作为本发明的上述选择方法，通过培养被测菌株，测定序列号1、序列号4或序列号8等本发明的碱基序列编码的GPAT的表达量，选择目的表达量的菌株，可选择出具有期望活性的菌株。此外，设定作为标准的菌株，分别培养该标准菌株和被测菌株，测定各菌株的上述表达量，比较标准菌株和被测菌株的表达量，也可选择出所期望的菌株。具体地说，例如可在适当的条件下培养标准菌株及被测菌株，测定各菌株的表达量，通过选择与标准菌株相比被测菌株为高表达或低表达的被测菌株，来选择具有期望活性的菌株。对于所期望的活性，如上所述，可列举测定GPAT的表达量及GPAT产生的脂肪酸组合物的组成的方法。
且作为本发明的上述选择方法，通过培养被测菌株，选择本发明的上述活性高或低的菌株，也可选择出具有期望活性的被测菌株。对于所期望的活性，如上所述，可列举测定GPAT的表达量及GPAT产生的脂肪酸组合物的组成的方法。
作为被测菌株或标准菌株，例如可使用上述导入本发明的载体的菌株、上述本发明的核酸表达受到抑制的菌株、进行诱变处理的菌株、自发突变的菌株等，但并不限于此。且本发明的上述活性，例如可通过本说明书中的“编码本发明的甘油-3-磷酸酰基转移酶的核酸”一项中记载的方法进行测定。作为诱变处理，例如可列举紫外线照射、放射线照射等物理方法，EMS(甲基磺酸乙酯)、N-甲基-N-亚硝基胍等药剂处理的化学方法等(如参照大嶋泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法、p67-75、学会出版中心等)，但不限于此。
此外，作为本发明的标准菌株、被测菌株使用的菌株，可列举上述脂质生产菌或酵母等，但并不限于这些。具体地说，标准菌株、被测菌株，可将属于不同属、种的任意菌株组合使用，被测菌株也可同时使用1种或1种以上的菌株。
以下根据实施例更加具体地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。
实施例
实施例1：M.alpina的基因组分析
将M.alpina 1S-4株接种到100ml的GY2∶1培养基(2％葡萄糖、1％酵母膏pH6.0)中，在28℃下振荡培养2天。通过过滤收集菌体，使用DNeasy(QIAGEN)制备基因组DNA。
使用Roche 454 GS FLX Standard来确定上述基因组DNA的碱基序列。此时，片段文库的碱基序列的确定进行2个run，末端配对文库的碱基序列的确定进行3个run。通过将得到的碱基序列拼接，得到300个超级重叠群。
实施例2：cDNA的合成和cDNA文库的构建
将M.alpina 1S-4株接种到4ml的培养基(2％葡萄糖、1％酵母膏、pH6.0)，在28℃下培养4天。通过过滤回收菌体，使用Rneasy plant kit(QIAGEN)提取RNA。通过用于RT-PCR的第一链合成试剂盒(SuperScript First-strand Synthesis System for RT-PCR)(Invitrogen)合成cDNA。此外，使用Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit(TaKaRa Bio)，从总RNA中进行poly(A)+RNA的纯化。使用ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE)构建cDNA文库。
实施例3：GPAT同源物的搜索
首先，将作为来自大肠杆菌(Escherichia coli)的GPAT的plsB的氨基酸序列(GenBank accession No.BAE78043)相对于M.alpina 1S-4株的基因组碱基序列通过tblastn进行搜索的结果，包含序列号7的超级重叠群匹配。另一方面，作为来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的GPAT的SCT1(YBL011W)或GPT2(YKR067W)的氨基酸序列相对于M.alpina 1S-4株的基因组碱基序列通过tblastn进行搜索的结果，包含序列号12、序列号13、序列号14或序列号15的超级重叠群匹配。
序列号13为MaGPAT1的基因组序列、序列号15为MaGPAT2的基因组序列(W02008/156026)。序列号14为本发明者预先另行鉴定的MaGPAT3的基因组序列(在申请本申请时未公开)。
认为与序列号7和序列号12相关的基因为新型基因。将与序列号7相关的基因命名为MaGPAT4，将与序列号12相关的基因命名为MaGPAT5。
实施例4：MaGPAT4及MaGPAT5的克隆
(1)MaGPAT4的cDNA的克隆
为克隆MaGPAT4的cDNA，制备以下引物。
将包含序列号4的超级重叠群的碱基序列进行BLAST分析，与已知的GPAT同源物相比较时，认为序列号4的第4246-第4248位的TAA是终止密码子。另一方面，起始密码子难于从与已知同源物的比较中推断。因此，通过5’-RACE法，尝试进行cDNA的5’端的克隆。即使用Gene Racer Kit(Invitrogen)，将引物GPAT4-S：5’-CAAGGATGTTGTTGATGAGGAAGGCGAAG-3’(序列号16)作为5’基因特异性引物，尝试由上述引物进行5’上游的cDNA的克隆。其结果，所得到的序列包含序列号3的第93位-第595位的碱基序列。但是，也考虑到了没有认为是起始密码子的序列和根据与其他GPAT同源物的比较，所得到的序列也有不包含MaGPAT4的起始密码子可能性。因此，将作为基因组序列的序列号7与序列号3的第93位-第595位的序列相比较，在详细分析一致的区域的5’上游时，发现了在认为是编码基因组序列上的MaGPAT4的读框上最初出现的终止密码子的下游，可成为起始密码子的ATG有第596-598位和第428-430位的2处。首先将第596-598位的ATG作为起始密码子，为克隆MaGPAT4的CDS，制备了以下引物。
引物SacI-GPAT4-1：5’-GAGCTCATGCCCATCGTTCCAGCTCAGC-3’(序列号17)
引物Sal-GPAT4-2：5’-GTCGACTTATAATTTCGGGGCGCCATCGC-3’(序列号18)
以cDNA为模板，通过引物SacI-GPAT4-1和引物Sal-GPAT4-2的组合，使用ExTaq(TaKaRa Bio)，进行94℃2分钟之后，进行(94℃ 1分钟、55℃ 1分钟、72℃ 1分钟)30个循环的PCR反应。将经过扩增的约2.5kbp的DNA片段使用TOPO-TA克隆试剂盒(Invitrogen)进行克隆，确定插入部分的碱基序列，将具有序列号3的碱基序列的质粒作为pCR-MaGPAT4。将编码MaGPAT4的CDS的碱基序列表示为序列号3，将ORF的碱基序列表示为序列号1，将由这些碱基序列推导出的MaGPAT4的氨基酸序列表示为序列号2。
另一方面，将第428-430位的ATG作为起始密码子时，标记为MaGPAT4-long。将编码MaGPAT4-long的CDS的碱基序列表示为序列号6，将ORF的碱基序列表示为序列号4，由这些碱基序列推导出的MaGPAT4-long的氨基酸序列表示为序列号5。
(2)MaGPAT5的cDNA的克隆
为克隆MaGPAT5的cDNA，制备以下引物。
引物GPAT5-1F：5’-TTCCCTGAAGGCGTATCGAGCGACGATT-3’(序列号19)
引物GPAT5-3R：5’-CAAATGTTGACAGCAGCCAGAACG-3’(序列号20)
以如上所述构建的文库为模板，通过引物GPAT5-1F和引物GPAT5-3R的组合，使用ExTaq(TaKaRa Bio)，进行94℃2分钟之后，进行(94℃ 1分钟、55℃ 1分钟、72℃ 1分钟)30个循环的PCR反应。将所得到的约0.9kbp的DNA片段使用TOPO-TA克隆试剂盒(Invitrogen)进行克隆，确定插入部分的碱基序列。将具有序列号8的第1503-2385位的碱基序列的质粒作为pCR-MaGPAT5-P。
而后，以该质粒为模板，使用上述引物通过PCR制备探针。反应中使用ExTaq(TaKaRa Bio)，替换附带的dNTP混合物使用PCR标记混合物(Roche Diagnostics公司)，制备将经过扩增的DNA进行地高辛(DIG)标记的探针，作为MaGPAT5探针。使用这些探针，筛选cDNA文库。
杂交条件如下。
缓冲液：5xSSC、1％SDS、50mM Tris-HCl(pH7.5)、50％甲酰胺；
温度：42℃(一夜)；
洗涤条件：在0.2x SSC、0.1％SDS溶液中(65℃)、20分钟×3次。
使用DIG核酸检测试剂盒(Roche Diagnostics公司)进行检测。从筛选得到的噬菌体克隆中，通过使用体内切割技术切割质粒，得到各质粒DNA。用MaGPAT5探针筛选后得到的质粒中插入片段长度最长的质粒包含序列号11的碱基序列，命名为质粒pB-MaGPAT5。进行序列号11的碱基序列中的ORF搜索。其结果，存在序列号11的第225-227位为起始密码子、第2589-2591位为终止密码子的CDS。根据由该序列推导的氨基酸序列的blastp搜索结果等，认为该CDS编码MaGPAT5。将编码MaGPAT5的基因的CDS表示为序列号10，将ORF表示为序列号8，将由这些碱基序列推导出的MaGPAT5的氨基酸序列表示为序列号9。
(3)序列分析
在比较MaGPAT4基因的基因组序列(序列号7)和CDS序列(序列号3)时，认为本基因的基因组序列由10个外显子、9个内含子组成，编码由825个氨基酸残基组成的蛋白质(图1及图2)。另一方面，在比较MaGPAT5基因的基因组序列(序列号12)和CDS序列(序列号10)时，认为本基因的基因组序列由3个外显子、2个内含子组成，编码由788个氨基酸残基组成的蛋白质(图3、图4)。
比较MaGPAT4、MaGPAT5和已知的来自高山被孢霉的GPAT同源物。将CDS序列和由CDS序列推导出的氨基酸序列的同一性分别表示为表2及表3。
表2：来自被孢霉属的GPAT同源物CDS的同一性(％)
Figure BPA00001624107100481
表3：来自被孢霉属的GPAT同源物氨基酸序列的同一性(％)
Figure BPA00001624107100482
将MaGPAT4的推定氨基酸序列(序列号2)相对于在GenBank nr注册的氨基酸序列使用BLASTp程序进行同源性分析时，相对于该序列E-value最低的、即同一性高的氨基酸序列为来自子囊菌(球毛壳菌Chaetomium globosum CBS 148.51)的推定蛋白质的氨基酸序列(GenBank accession No.XP 001224211)，同一性为39.3％。此外，还与来自动物的甘油磷酸-O-酰基转移酶(Glyceronephosphate O-acyltransferase)(GNPAT)具有同源性，与来自人的GNPAT(GenBankaccession No.AAH00450)的同一性为22.6％。而且，与作为来自大肠杆菌E.coli的GPAT的plsB蛋白质的氨基酸序列(GenBank accession No.BAE78043)同一性为17.6％。MaGPAT4和这些氨基酸序列的比对如图5所示。
另一方面，将MaGPAT5的推定氨基酸序列(序列号9)相对于在GenBank nr注册的氨基酸序列使用BLASTp程序进行同源性分析时，相对于该序列E-value最低的、即同一性高的氨基酸序列为来自担子菌(玉蜀黍黑粉菌Ustilago maydis521)的推定蛋白质UM03369的氨基酸序列(GenBank accession No.XP 759516)，同一性为15.4％。MaGPAT5和这些氨基酸序列的比对如图6所示。
MaGPAT4、MaGPAT5均保存有在酰基转移酶中保守的区域，特别是保存了认为在酰基转移酶活性上重要的用*印表示的甘氨酸残基(G)和脯氨酸残基(P)。而且还保存了认为与G3P结合上重要的用+印表示的丝氨酸残基(S)(图5及图6)。
实施例5：MaGPAT4的功能分析
(1)MaGPAT4的酵母用表达载体的构建
将用限制性内切酶EcoRI和SalI酶切酵母表达用载体pYE22m(Biosci.Biotech.Biochem.，59，1221-1228，1995)的DNA片段与用限制性内切酶EcoRI和限制性内切酶SalI酶切质粒pCR-MaGPAT4而得到的约2.1kbp的DNA片段用ligation high(TOYOBO)连接，构建质粒pYE-MaGPAT4。
此外，为进行比较，对于MaGPAT1、MaGPAT2及MaGPAT3也构建了酵母用表达载体。有关MaGPAT1及MaGPAT2的酵母用表达载体，按照WO2008/156026中所记载而构建，分别作为pYE-MaGPAT1及pYE-MaGPAT2。有关MaGPAT3的酵母用表达载体，如下制备。将MaGPAT1(ATCC #16266)的氨基酸序列作为查询序列，相对于如上述实施例1得到的M.alpina 1S-4株的基因组碱基序列，通过tblastn搜索的结果，得到与MaGPAT1具有同源性的基因，将其命名为MaGPAT3(在申请本申请时未公开)。制成如下引物：
Eco-MaGPAT3-F：5’-GAATTCATGGGTCTCCAGATCTATGACTTCGTCTC-3’(序列号26)
Sal-MaGPAT3-R：5’-GTCGACTTATGCCTCCTTAGACTTGACTGCATCC-3’(序列号27)
以上述实施例2中记载的cDNA为模板，通过这些引物使用KOD-Plus-(东洋纺)进行PCR时，扩增了约2.2kbp的DNA片段。将该片段使用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen)克隆，将所得到的质粒作为pCR-MaGPAT3。将用限制性内切酶EcoRI和SalI酶切质粒pCR-MaGPAT3而得到的约2.3kbp的DNA片段插入酵母表达用载体pYE22m的EcoRI、SalI位点，得到质粒pYE-MaGPAT3。
(2)转化株的获得
分别使用质粒pYE22m、pYE-MaGPAT4、pYE-MaGPAT1、pYE-MaGPAT2、pYE-MaGPAT3通过醋酸锂法转化酿酒酵母(S.cerevisiaeEH13-15株)(trp1，MATα)(Appl.Microbiol.Biotechnol.，30，515-520，1989)。转化株筛选在SC-Trp(每1l中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)6.7g、葡萄糖20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、亮氨酸1.8g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、尿嘧啶0.6g的混合物)1.3g)琼脂培养基(2％琼脂))上生长繁殖的菌株。
(3)酵母的培养
将使用质粒pYE22m转化而得到的任意的2株作为C-1株、C-2株，且将使用质粒pYE-MaGPAT4转化而得到的任意的2株作为MaGPAT4-1株、MaGPAT4-2株，供给以下的培养实验。此外，为了进行比较，将使用质粒pYE-MaGPAT1转化而得到的任意的2株作为MaGPAT1-1株、MaGPAT1-2株，将使用质粒pYE-MaGPAT2转化而得到的任意的2株作为MaGPAT2-1株、MaGPAT2-2株，及将使用质粒pYE-MaGPAT3转化而得到的任意的2株作为MaGPAT3-1株、MaGPAT3-2株，与MaGPAT4-1株及MaGPAT4-2株同样供给以下的培养实验。
作为预培养，从培养板中取1白金耳酵母接种到SC-Trp培养基10ml中，30℃下振荡培养1天。主培养为在SC-Trp培养基或YPD(酵母膏2％、多聚蛋白胨1％、葡萄糖2％)培养基10ml中添加预培养液500μl，30℃下振荡培养2天。
(4)菌体的脂肪酸分析
通过离心分离酵母的培养液而回收菌体。用10ml灭菌水洗涤，通过离心分离再次回收菌体，冷冻干燥。在冷冻干燥菌体中添加4ml氯仿∶甲醇(2∶1)，剧烈搅拌后，70℃下处理1小时。通过离心分离分离菌体，回收溶剂。在剩余菌体中再次添加4ml氯仿∶甲醇(2∶1)，同样回收溶剂。用离心浓缩仪将脂质干固后，添加2ml的氯仿溶解脂质。从试样中取200μl，通过盐酸甲醇法将菌体的脂肪酸衍生成甲酯后，用己烷提取，馏去己烷，通过气相色谱法进行分析。
结果如表4、表5、表6及表7所示。
表4：菌体内脂肪酸组成(％)(培养基：YPD)
Figure BPA00001624107100511
Figure BPA00001624107100512
表5：菌体内脂肪酸组成(％)(培养基：SD-Trp)
表6：
菌体内脂肪酸含有率(％)
Figure BPA00001624107100514
(培养基：YPD)
表7：
菌体内脂肪酸含有率(％)
Figure BPA00001624107100521
(培养基：SD-Trd)
如表4及表5所示，与仅导入载体的对照株相比，构成使MaGPAT4高表达菌株的菌体内脂质的脂肪酸组成，棕榈酸(16:0)的比率上升，棕榈油酸(16:1)的比率下降。该趋势与使用来自高山被孢霉的其他作为GPAT的MaGPAT1、MaGPAT2、及MaGPAT3时的趋势不同。因此，本发明的MaGPAT4具有与来自其他高山被孢霉的GPAT不同的底物特异性。
此外，如表6及表7所示，与对照株相比，菌体内的脂肪酸含有率在使MaGPAT4高表达的菌株中约提高到2倍。
实施例6：MaGPAT4-long及MaGPAT4的功能分析
(1)半乳糖诱导型表达载体的构建
为了将MaGPAT4-long或MaGPAT4用半乳糖表达诱导，如以下构建具有半乳糖诱导型启动子的质粒。
以用实施例2制备的cDNA为模板，通过引物Not-MaGPAT4-F1和引物Bam-MaGPAT4-R或引物Not-MaGPAT4-F2和引物Bam-MaGPAT4-R的组合，使用ExTaq(TaKaRa Bio)，进行94℃ 2分钟之后，进行(94℃ 1分钟、55℃ 1分钟、72℃1分钟)30个循环的PCR反应。将经过扩增的约2.7kbp或约2.5kbp的DNA片段使用TOPO-TA克隆试剂盒(Invitrogen)进行克隆，确认分别具有序列号6的GPAT4-long的CDS序列或序列号3的GPAT4的CDS序列，分别作为质粒pCR-MaGPAT4-long-1或质粒pCR-MaGPAT4-1。将用限制性内切酶NotI和BglII酶切载体pESC-TRP(Stratagene)而得到的约6.5kbp的DNA片段与用限制性内切酶NotI和BamHI酶切质粒pCR-MaGPAT4-long-1或质粒pCR-MaGPAT4-1而得到的约2.7kbp或2.5kbp的DNA片段使用ligation high(TOYOBO)连接，得到质粒pESC-T-MaGPAT4-long或质粒pESC-T-MaGPAT4。
引物Not-MaGPAT4-F1：5’-GCGGCCGCATGACAACCGGCGACAGTACCG-3’(序列号28)
引物Not-MaGPAT4-F2：5’-GCGGCCGCATGCCCATCGTTCCAGCTCAG-3’(序列号29)
引物Bam-MaGPAT4-R：5’-GGATCCTTATAATTTCGGGGCGCCATCG-3’(序列号30)
(2)转化株的获得
分别使用pESC-TRP、pESC-T-MaGPAT4-long、pESC-T-MaGPAT4通过醋酸锂法转化酵母(酿酒酵母S.cerevisiae)EH13-15株。转化株筛选在SC-Trp琼脂培养基上生长繁殖的菌株。
(3)酵母的培养
作为预培养，将用各质粒转化而得到的各任意4株分别接种到SD-Trp液体培养基10ml中，30℃下振荡培养1天。作为主培养，将所得到的预培养液中的1ml分别在SG-Trp(每1l中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)6.7g、半乳糖20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、亮氨酸1.8g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、尿嘧啶0.6g的混合物)1.3g)液体培养基10ml中接种2株各菌株，30℃下振荡培养2天，诱导MaGPAT4-long或MaGPAT4的表达。
(4)脂质分析
将酵母的培养液通过离心分离回收菌体。用10ml灭菌水洗涤，通过离心分离再次回收菌体，冷冻干燥。将各菌株的1株菌体的脂肪酸通过盐酸甲醇法衍生为甲酯，通过气相色谱法，分析菌体内所含有的总脂肪酸(表8)。
另一方面，从各菌株的剩余的1株菌体中如下提取脂质。即加入1ml的氯仿∶甲醇(2∶1)和玻璃珠，用珠磨式组织研磨器破碎菌体后，离心分离回收上清。在剩余的菌体中进一步加入1ml的氯仿∶甲醇(2∶1)，同样回收上清，重复该操作，用总量4ml的氯仿∶甲醇(2∶1)回收脂质。使用离心浓缩仪，馏去溶剂，将残渣溶于少量的氯仿中。在硅胶60培养板(默克(Merck))、展开溶剂己烷∶二乙醚∶醋酸70∶30∶1的条件下进行薄层色谱分析，分离脂质。将樱草灵溶液喷雾，通过照射紫外线检测脂质。分别刮取三酰甘油(TG)组分、游离脂肪酸(FFA)组分、二酰基甘油(DG)组分和磷脂(PL)组分收集到试管中，通过盐酸甲醇法将脂肪酸衍生为甲酯，通过气相色谱法进行脂肪酸分析(表9、图7)。
以下表示各基因导入株的分析结果。将作为载体的pESC-TRP导入株作为对照。
表8：菌体内的总脂肪酸量(SG-Trp培养)
Figure BPA00001624107100541
平均±SD
表9：脂质组分的脂肪酸量(SG-Trp培养)
Figure BPA00001624107100542
平均±SD
与对照相比，总脂肪酸量在MaGPAT4-long或MaGPAT4的表达株中分别增加到1.7倍、2.0倍(表8)。
相对于对照，即使在MaGPAT4-long、MaGPAT4的表达株中，PL的量也分别为1.1倍、1.2倍，几乎无差异。另一方面，在MaGPAT4-long或MaGPAT4的表达株中，与对照相比，TG量在MaGPAT4-long、MaGPAT4的表达株中大幅增加，为2.8倍、3.5倍。即通过使MaGPAT4-long或MaGPAT4表达，可激活脂肪酸的生物合成，提高作为储存脂质的TG的生产率。进而，与对照相比，DG、FFA在MaGPAT4-long、MaGPAT4的表达株中也增加了(表9)。
各脂质组分的脂肪酸组成如图7所示。FFA组分的组成在对照和MaGPAT4-long或MaGPAT4表达株中几乎无差异。相对于此，其他的组分在MaGPAT4-long或MaGPAT4的表达株中，具有饱和脂肪酸增加，不饱和脂肪酸减少的趋势，特别是16:0(棕榈酸)增加，16:1(棕榈油酸)减少。
另外，作为主培养，对代替SG-Trp液体培养基使用SC-Trp液体培养基的情况进行了探讨。因SC-Trp液体培养基不含半乳糖，所以在使用该培养基进行主培养时，通过转化而导入的MaGPAT4-long或MaGPAT4的表达未被诱导。在使用SC-Trp液体培养基的实验中，菌体的总脂肪酸的量、组成在对照和MaGPAT4-long、MaGPAT4导入株之间均未发现差异(表10、图8)。由此也可以说，MaGPAT4-long或MaGPAT4的表达为由半乳糖诱导的结果，在SG-Trp培养基中，菌体内的脂肪酸增加。
表10：菌体内的总脂肪酸量(SG-Trp培养)
Figure BPA00001624107100551
实施例7：酿酒酵母S.cerevisiae Δsct1、Δgpt2互补实验
在酵母(酿酒酵母S.cerevisiae)中，已知有作为承担GPAT活性的基因SCT1和GPT2，并已知同时缺失这些基因时会致死。为确认来自高山被孢霉的MaGPAT4、MaGPAT4-long的产物是否具有GPAT活性，进行了Δsct1、Δgpt2的互补实验。表11中归纳了如下制备的菌株的基因型。
表11
Figure BPA00001624107100552
(1)GP-1株的制备
如以下破坏Yeast knock out strain collection(Open Biosystems)的Δgpt2纯合2倍体酵母(商品目录(catalog)No.YSC1021-663938)的SCT1基因。首先从S.cerevisiae S288C株的菌体中使用Dr.GenTLE(酵母用)(TaKaRaBio)提取DNA。以此为模板，通过引物Xba1-Des-SCT1-F：5’-TCTAGAATGCCTGCACCAAAACTCAC-3’(序列号31)和引物Xba1-Des-SCT1-R：5’-TCTAGACCACAAGGTGATCAGGAAGA-3’(序列号32)使用KOD-Plus-(东洋纺)进行PCR(「PCR」？)，扩增SCT1基因的部分序列。将所扩增的约1.3kbp的DNA片段使用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen)进行克隆，将所得到的质粒作为pCR-SCT1P。而后，将用限制性内切酶SalI和XhoI酶切质粒YEp13而得到的包含LEU2基因的CDS的约2.2kbp的DNA片段、与用SalI酶切质粒pCR-SCT1P而得到的约4.4kbp的DNA片段通过ligation high(东洋纺)连接，将相对于SCT1基因、LEU2基因被反向插入的质粒作为pCR-Δsct1:LEU2。将其用限制性内切酶XbaI酶切，将上述Δgpt2纯合2倍体酵母通过醋酸锂法转化，筛选可在SD-Leu(每1L中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)6.7g、葡萄糖20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、色氨酸1.2g、尿嘧啶0.6g的混合物)1.3g)琼脂培养基(2％琼脂))中生长繁殖的菌株。从所得到的转化株的菌体中用上述方法提取DNA。使用(a)引物SCT1outORF-F：5’-AGTGTAGGAAGCCCGGAATT-3’(序列号33)和引物SCT1inORF-R：5’-GCGTAGATCCAACAGACTAC-3’(序列号34)(0.5kbp)、(b)引物SCT1outORF-F和引物LEU2inORF-F：5’-TTGCCTCTTCCAAGAGCACA-3’(序列号35)(1.2kbp)的组合，通过进行PCR，来确认基因型，即确认为SCT1/Δsct1:LEU2，作为GP-1株。
(2)以URA3为标记的半乳糖诱导型表达载体的构建
将用限制性内切酶NotI和BglII酶切载体pESC-URA(Stratagene)而得到的约6.6kbp的DNA片段、与用限制性内切酶NotI和BamHI酶切质粒pCR-MaGPAT4-long-1或质粒pCR-MaGPAT4-1而得到的约2.7kbp或2.5kbp的DNA片段使用ligation high(TOYOBO)连接，得到质粒pESC-U-MaGPAT4-long或质粒pESC-U-MaGPAT4。
(3)转化株的获得
分别使用pESC-URA、pESC-U-MaGPAT4-long或pESC-U-MaGPAT4，通过醋酸锂法转化酵母GP-1株。转化株筛选可在SC-Ura(每1L中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)6.7g、葡萄糖20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、色氨酸1.2g、亮氨酸1.8g的混合物)1.3g)琼脂培养基(2％琼脂)中生长繁殖的菌株。将用pESC-URA转化而得到的菌株作为C-D株，将用pESC-U-MaGPAT4-long、pESC-U-MaGPAT4转化而得到的菌株分别作为MaGPAT4-long-D株、MaGPAT4-D株。
(4)孢子形成和四分子分析
将C-D株、MaGPAT4-long-D株和MaGPAT4-D株分别涂布在YPD琼脂培养基上，30℃下培养1天。将生长繁殖了的菌体涂布在孢子形成用琼脂培养基(0.5％醋酸钾、2％琼脂)上，20℃下培养7天。适量刮取所得到的菌体，悬浮在100μl的酵母裂解酶溶液(0.125mg/ml酵母裂解酶100T、1M山梨醇、40mM磷酸钾缓冲液(pH6.8))中，室温下孵育30分钟后，将孵育管移入冰中。显微镜下确认形成子囊孢子后，在YPGal(酵母膏2％、蛋白胨1％、半乳糖2％)琼脂培养基上通过显微操作分离出4个子囊孢子，30℃孵育2天，得到来自各个孢子的菌落。将所得到的孢子克隆在SG-Ura(每1L中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)6.7g、半乳糖20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、色氨酸1.2g、亮氨酸1.8g的混合物)1.3g)琼脂培养基(2％琼脂)、及SG-Leu(每1L中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)6.7g、半乳糖20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、色氨酸1.2g、尿嘧啶0.6g的混合物)1.3g)琼脂培养基(2％琼脂)影印，30℃下孵育3天，分析尿嘧啶缺陷型和亮氨酸缺陷型。因在显示尿嘧啶缺陷型时，认为导入的质粒脱落，所以从以下的分析中去除。
从C-D株分离的4个子囊孢子中，可在YPGal琼脂培养基上生长繁殖的均为2个，所有菌株均为亮氨酸缺陷型。另一方面，从MaGPAT4-long-D株和MaGPAT4-D株分离的4个子囊孢子均有4个可在YPGal琼脂培养基上生长繁殖。在分析亮氨酸缺陷型时，亮氨酸缺陷型株和亮氨酸非缺陷型株均分别为2个。
在分析所得到的菌株的基因型时，从菌体中如上所述提取DNA，通过(a)引物SCTloutORF-F和引物SCT1inORF-R、(b)引物SCT1outORF-F和引物LEU2in ORF-F的组合进行PCR。其结果，在亮氨酸非缺陷型株中，(a)中未发现通过PCR的扩增，(b)中发现了扩增，因此，可确认这些菌株为具有Δsct1:LEU2等位基因的菌株。此外，亮氨酸缺陷型株中，(a)中发现了通过PCR的扩增，(b)中未发现扩增，所以，可确认这些菌株为具有SCT1等位基因的菌株。
进而，将来自从MaGPAT4-long-D株和MaGPAT4-D株分离的4个子囊的孢子的菌株涂布在YPD琼脂培养基上时，生长繁殖良好的菌株和生长繁殖显著不良的菌株分别为2个，生长繁殖不良的菌株与具有Δsct1:LEU2等位基因的亮氨酸非缺陷型株一致。
由此，破坏酵母的承担GPAT活性的2个基因的Δsct1、Δgpt2株虽会致死，但通过使MaGPAT4-long或MaGPAT4表达，可确认出可生长繁殖。即强烈示意出MaGPAT4-long蛋白质及MaGPAT4蛋白质具有GPAT活性。
实施例8：高山被孢霉中的GPAT4的超表达
(1)M.alpina用表达载体的构建
为了使GPAT4在M.alpina中表达，如下构建载体。
首先用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切载体pUC18，插入使寡聚DNA MCS-for-pUC18-F2和MCS-for-pUC18-R2退火的接头，构建质粒pUC18-RF2。MCS-for-pUC18-F2：5’-AATTCATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATTCTAGACTAGGTCGACGGCGCGCCA-3’(序列号36)
MCS-for-pUC18-R2：5’-AGCTTGGCGCGCCGTCGACCTAGTCTAGAATAGTTTAGCGGCCGCATTCTTATG-3’(序列号37)
将以M.alpina的基因组为模板，使用引物Not1-GAPDHt-F和引物EcoR1-Asc1-GAPDHt-R，通过使用KOD-plus-(TOYOBO)的PCR扩增的约0.5kbp的DNA片段使用Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(Invitrogen)进行克隆。在确认插入部分的碱基序列后，将用限制性内切酶NotI和EcoRI酶切而得到的约0.9kbp的DNA片段插入质粒pUC18-RF2的NotI、EcoRI位点，构建质粒pDG-1。
引物Not1-GAPDHt-F：5’-AGCGGCCGCATAGGGGAGATCGAACC-3’(序列号38)
引物EcoR1-Asc1-GAPDHt-R：5’-AGAATTCGGCGCGCCATGCACGGGTCCTTCTCA-3’(序列号39)
将以M.alpina的基因组为模板，使用引物URA5g-F1和引物URA5g-R1，通过使用KOD-plus-(TOYOBO)的PCR扩增的DNA片段使用Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(Invitrogen)进行克隆。在确认插入部分的碱基序列后，将用限制性内切酶SalI酶切而得到的约2kbp的DNA片段插入质粒pDG-1的SalI位点，将以URA5基因的5’侧成为载体的EcoRI侧的朝向插入的质粒作为质粒pDuraG。
引物URA5g-F1：5’-gtcgaccatgacaagtttgc-3’(序列号40)
引物URA5g-R1：5’-GTCGACTGGAAGACGAGCACG-3’(序列号41)
而后，将以M.alpina的基因组为模板，使用引物hisHp+URA5-F和引物hisHp+MGt-F，通过使用KOD-plus-(TOYOBO)的PCR扩增的约1.0kbp的DNA片段与以pDuraG为模板，使用引物pDuraSC-GAPt-F和引物URA5gDNA-F，将通过使用KOD-plus-(TOYOBO)的PCR扩增的约5.3kbp的DNA片段使用In-Fusion(注册商标)Advantage PCR Cloning Kit(TaKaRa Bio)连接，得到质粒pDUra-RhG。
引物hisHp+URA5-F：5’-GGCAAACTTGTCATGAAGCGAAAGAGAGATTATGAAAACAAGC-3’(序列号42)
引物hisHp+MGt-F：5’-CACTCCCTTTTCTTAATTGTTGAGAGAGTGTTGGGTGAGAGT-3’(序列号43)
引物pDuraSC-GAPt-F：5’-TAAGAAAAGGGAGTGAATCGCATAGGG-3’(序列号44)
引物URA5gDNA-F：5’-CATGACAAGTTTGCCAAGATGCG-3’(序列号45)
以质粒pDUra-RhG为模板，使用引物pDuraSC-GAPt-F和引物pDurahG-hisp-R，通过使用KOD-plus-(TOYOBO)的PCR扩增约6.3kbp的DNA片段。
引物pDurahG-hisp-R：5’-ATTGTTGAGAGAGTGTTGGGTGAGAGTG-3’(序列号46)
以质粒pCR-MaGPAT4-1为模板，使用引物MaGPAT4+hisp-F和引物MaGPAT4+MGt-R，通过使用KOD-plus-(TOYOBO)的PCR扩增约2.5kbp的DNA片段。
引物MaGPAT4+hisp-F：5’-CACTCTCTCAACAATATGACAACCGGCGACAGTACCGC-3’(序列号47)
引物MaGPAT4+MGt-R：5’-CACTCCCTTTTCTTATTATAATTTCGGGGCGCCATCGC-3’(序列号48)
将所得到的2.5kbp片段与上述6.3kbp的DNA片段使用In-Fusion(注册商标)Advantage PCR Cloning Kit(TaKaRa Bio)连接，得到质粒pDUraRhG-GPAT4。
(2)M.alpina转化株的获得
根据专利文献(WO2005/019437、发明名称：“脂质生产菌的育种方法”)中所记载的方法，将由M.alpina 1S-4株衍生的尿嘧啶缺陷型株Δura-3作为宿主，用颗粒轰击法，使用质粒pDUraRhG-GPAT4，分别进行转化。转化株的选择使用SC琼脂培养基(酵母氮源(无氨基酸与硫酸铵)(Yeast Nitrogen base w/oamino acids and Ammonium Sulfate)(Difco)0.5％、硫酸铵0.17％、葡萄糖2％、腺嘌呤0.002％、酪氨酸0.003％、蛋氨酸0.0001％、精氨酸0.0002％、组氨酸0.0002％、赖氨酸0.0004％、色氨酸0.0004％、苏氨酸0.0005％、异亮氨酸0.0006％、亮氨酸0.0006％、苯丙氨酸0.0006％、琼脂2％)。
(3)转化M.alpina的评价
将所得到的转化株接种到GY培养基4ml中，28℃下振荡培养2天。通过过滤回收菌体，使用Rneasy plant kit(QIAGEN)提取RNA。通过用于RT-PCR的第一链合成试剂盒(SuperScript First-strand Synthesis System for RT-PCR)(Invitrogen)合成cDNA。为确认导入的构建物中的各基因的表达，用以下引物的组合进行RT-PCR。
引物GPAT4-RT1：5’-gagtgcttcatcgagggcacC-3’(序列号49)
引物GPAT4-RT2：5’-TCCTTCACTGTCAACCTCGATCAC-3’(序列号50)
将可确认超表达的菌株中的1株接种到GY培养基(葡萄糖2％、酵母膏1％)10ml中，28℃、300rpm下振荡培养3天。将其全部移入GY培养基500ml(2L摇瓶)中，28℃、120rpm下振荡培养。此后的3日后、7日后、10日后、12日后分别各取5ml、10ml，过滤。将菌体在120℃下干燥，通过盐酸甲醇法将脂肪酸衍生为甲酯，通过气相色谱法进行脂肪酸分析。分析单位干燥菌体的花生四烯酸生产量的经时变化。另外，将作为转化的宿主的Δura-3株作为对照。结果如图9所示。
使GPAT4在M.alpina中超表达时，与对照相比，单位菌体的花生四烯酸(AA)量增加了。
序列表部分的自由文字内容(Sequence Listing Free Text)
序列16：引物GPAT4-S
序列17：引物SacI-GPAT4-1
序列18：引物Sal-GPAT4-2
序列19：引物GPAT5-1F
序列20：引物GPAT5-3R
序列26：引物Eco-MaGPAT3-F
序列27：引物Sal-MaGPAT3-R
序列28：引物Not-MaGPAT4-F1
序列29：引物Not-MaGPAT4-F2
序列30：引物Bam-MaGPAT4-R
序列31：引物Xba1-Des-SCT1-F
序列32：引物Xba1-Des-SCT1-R
序列33：引物SCT1outORF-F
序列34：引物SCTlinORF-R
序列35：引物LEU2inORF-F
序列36：寡聚DNAMCS-for-pUC18-F2
序列37：寡聚DNAMCS-for-pUC18-R2
序列38：引物Not1-GAPDHt-F
序列39：引物EcoR1-Asc1-GAPDHt-R
序列40：引物URA5g-F1
序列41：引物URA5g-R1
序列42：引物hisHp+URA5-F
序列43：引物hisHp+MGt-F
序列44：引物pDuraSC-GAPt-F
序列45：引物URA5gDNA-F
序列46：引物pDurahG-hisp-R
序列47：引物MaGPAT4+hisp-F
序列48：引物MaGPAT4+MGt-R
序列49：引物GPAT4-RT1
序列50：引物GPAT4-RT2
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Claims (15)

1.一种核酸，其特征在于，为以下(a)～(g)中任一项所述的核酸：
(a)核酸，其包含编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；
(b)核酸，其包含与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；
(c)核酸，其包含与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列的同一性为70％以上的碱基序列所组成，且编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；
(d)核酸，其包含编码与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为70％以上的氨基酸序列所组成，且具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；
(e)核酸，其包含与编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；
(f)核酸，其包含与由序列号7或序列号12组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且具有编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列；
(g)核酸，其包含与由序列号7或序列号12组成的碱基序列的同一性为70％以上的碱基序列所组成，且具有编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列。
2.根据权利要求1中所述的核酸，其特征在于，为以下(a)～(g)中任一项所述的核酸：
(a)核酸，其包含编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列中1～80个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；
(b)核酸，其包含与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；
(c)核酸，其包含与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列所组成，且编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；
(d)核酸，其包含编码与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为90％以上的氨基酸序列所组成，且具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；
(e)核酸，其包含与编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；
(f)核酸，其包含与由序列号7或序列号12组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且具有编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列；
(g)核酸，其包含与由序列号7或序列号12组成的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列所组成，且具有编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列。
3.一种核酸，其特征在于，为以下(a)～(d)中任一项所述的核酸：
(a)核酸，其包含序列号1、序列号4或序列号8表示的碱基序列或其部分序列；
(b)核酸，其包含编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列或其部分序列；
(c)核酸，其包含序列号3、序列号6或序列号11表示的碱基序列或其部分序列；
(d)核酸，其包含序列号7或序列号12表示的碱基序列或其部分序列。
4.一种核酸，其特征在于，为以下(a)～(g)中任一项所述的核酸：
(a)核酸，其包含编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列所组成，且具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油即TG量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酿酒酵母的甘油-3-磷酸酰基转移酶缺陷即“GPAT缺陷”互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(b)核酸，其包含与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油即TG量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酿酒酵母的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(c)核酸，其包含与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列的同一性为70％以上的碱基序列所组成，且编码具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油即TG量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酿酒酵母的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(d)核酸，其包含编码与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为70％以上的氨基酸序列所组成，且具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油即TG量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酿酒酵母的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(e)核酸，其包含与编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油即TG量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酿酒酵母的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(f)核酸，其包含与由序列号7或序列号12组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且具有编码具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的外显子的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油即TG量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酿酒酵母的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(g)核酸，其包含与由序列号7或序列号12组成的碱基序列的同一性为70％以上的碱基序列所组成，且具有编码具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的外显子的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油即TG量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酿酒酵母的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
5.根据权利要求4中所述的核酸，其特征在于，为以下(a)～(g)中任一项所述的核酸：
(a)核酸，其包含具有编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列中1～80个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的外显子的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油即TG量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酿酒酵母的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(b)核酸，其包含与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且具有编码具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的外显子的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油即TG量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酿酒酵母的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(c)核酸，其包含与由序列号1、序列号4或序列号8组成的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列所组成，且具有编码具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的外显子的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油即TG量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酿酒酵母的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(d)核酸，其包含具有编码与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为90％以上的氨基酸序列所组成，且具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的外显子的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油即TG量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酿酒酵母的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(e)核酸，其包含与编码由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且具有编码具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的外显子的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油即TG量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酿酒酵母的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(f)核酸，其包含与由序列号7或序列号12组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且具有编码具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的外显子的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油即TG量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酿酒酵母的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(g)核酸，其包含与由序列号7或序列号12组成的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列所组成，且具有编码具有以下i)～v)中任一种活性的蛋白质的外显子的碱基序列：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油即TG量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酿酒酵母的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
6.一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质：
(a)蛋白质，其由序列号2、序列号5或序列号9中1或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性；
(b)蛋白质，其为与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为70％以上的氨基酸序列所组成的蛋白质，且具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性。
7.一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质：
(a)蛋白质，其由序列号2、序列号5或序列号9中1～80个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性；
(b)蛋白质，其为与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为90％以上的氨基酸序列所组成的蛋白质，且具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性及/或甘油磷酸酰基转移酶活性。
8.一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质：
(a)蛋白质，其由序列号2、序列号5或序列号9中1或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有以下i)～v)中任一种活性：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油即TG量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酿酒酵母的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(b)蛋白质，其为与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为70％以上的氨基酸序列所组成的蛋白质，且具有以下i)～v)中任一种活性：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油即TG量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酿酒酵母的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
9.一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质：
(a)蛋白质，其由序列号2、序列号5或序列号9中1～80个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有以下i)～v)中任一种活性：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油即TG量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酿酒酵母的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
(b)蛋白质，其为与由序列号2、序列号5或序列号9组成的氨基酸序列的同一性为90％以上的氨基酸序列所组成的蛋白质，且具有以下i)～v)中任一种活性：
i)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸组成可形成棕榈酸的比率高、棕榈油酸的比率低的脂肪酸组成的活性；
ii)与未表达所述蛋白质的宿主的脂肪酸含有率相比，表达所述蛋白质的酵母的脂肪酸含有率实现高含有率的活性；
iii)与未表达所述蛋白质的宿主的三酰甘油即TG量相比，表达所述蛋白质的酵母的TG量实现高TG量的活性；
iv)与酿酒酵母的GPAT缺陷互补的活性；
v)可使通过含有编码所述蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主中的花生四烯酸生产量比未用所述载体转化的宿主中的生产量提高了的活性。
10.一种蛋白质，其特征在于，由序列号2、序列号5或序列号9表示的氨基酸序列组成。
11.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求1～5中任一项所述的核酸。
12.一种转化体，其特征在于，由权利要求11中所述的重组载体转化。
13.一种脂肪酸组合物，其特征在于，包含培养权利要求12中所述的转化体而得到的脂肪酸或脂质。
14.一种脂肪酸组合物的制造方法，其特征在于，从培养权利要求12中所述的转化体而得到的培养物中提取脂肪酸或脂质。
15.一种食品，其特征在于，包含权利要求13中所述的脂肪酸组合物。
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