BR112017003556B1 - Método em batelada alimentada repetida de cultivo de microorganismos thraustochytrid - Google Patents

Método em batelada alimentada repetida de cultivo de microorganismos thraustochytrid Download PDF

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Abstract

método de cultivo de um micro-organismo. são fornecidos neste documento métodos de cultivo de um micro-organismo. os métodos incluem o fornecimento de um recipiente compreendendo um ou mais micro-organismos em um meio, que tem uma primeira razão de carbono e nitrogênio; cultura de micro-organismos até que a cultura atinja um indicador limite; colheita de uma parte da cultura, mantendo a maior parte da cultura no recipiente; e adição de meio fresco contendo uma segunda razão de carbono e nitrogênio ao recipiente com a maior parte da cultura que consiste nos micro-organismos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO
[001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório US N° 62/064.668, depositado em 16 de outubro de 2014, que é incorporado a este documento por referência na sua totalidade.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] As fermentações heterotróficas dos micro-organismos, incluindo da espécie Thraustochytrid, são formas eficientes de geração de produtos de óleo de alto valor e de biomassa. Em certas condições de cultura, os micro-organismos sintetizam óleo intracelular, que pode ser extraído e usado para produzir biocombustível (biodiesel, bio-jetfuel e similares) e lipídios nutricionais (ácidos graxos poli-insaturados, por exemplo, DHA, EPA, DPA). A biomassa de micro-organismos, como a espécie Thraustochytrid, tem também um grande valor nutricional devido ao teor elevado de PUFA e proteína e pode ser usada como suplemento nutricional para alimentação animal.
[003] Os processos de fermentação por micro-organismo são realizados principalmente em processos em batelada ou batelada alimentada. Os processos em batelada envolvem tipicamente uma cultura em sistema fechado em que as células são cultivadas em um volume fixo do meio de cultura de nutriente em condições específicas (por exemplo, nutrientes, temperatura, pressão e similares) a uma certa densidade em um fermentador, colhida e processada como uma batelada. Em processos em batelada alimentada típicos, um ou mais nutrientes são alimentados ou fornecidos em um fermentador, em que eles permanecem até ao final do processo de cultura. Os processos de cultura em batelada alimentada podem ser superiores aos processos de cultura em batelada quando o controle das concentrações de um nutriente (ou nutrientes) afeta o rendimento ou a atividade de um produto desejado. Esses processos de fermentação consistem normalmente em duas fases de cultivo, uma fase de proliferação celular, durante a qual todos os nutrientes necessários estão disponíveis para o crescimento ilimitado da cultura, seguido por uma fase de acúmulo de óleo, durante a qual um nutriente de crescimento chave (normalmente, nitrogênio) é propositadamente limitada no meio enquanto nutriente de carbono excedente é fornecido e canalizados para a síntese de óleo. Quando a concentração da célula alvo e o teor de óleo são alcançados, o processo de fermentação é interrompido e a biomassa rica em óleo é colhida. Em seguida, o recipiente do fermentador deve ser limpo, esterilizado e redividido com meio fresco e uma série de sementes precisa estar pronta para inocular o recipiente de produção novamente (por exemplo, uma operação de “reorganização” (turnaround) entre fermentações em batelada/batelada alimentada). Essa operação de reorganização é muitas vezes demorada e consome muita energia e limita as horas de operação totais disponíveis do recipiente de produção para um processo de produção estabelecido. Alternativamente, os micro-organismos podem ser cultivados usando métodos contínuos onde o meio fresco é continuamente adicionado ao fermentador, enquanto o líquido da cultura é continuamente removido para manter o volume da cultura constante. Os processos de cultura contínuos podem ser usados para manter o micro-organismo a uma taxa de crescimento específica ou estado estacionário fisiológico, mas pode ser difícil manter sem interrupção e são normalmente usados para fins de pesquisa, uma vez que as culturas em batelada alimentada ou batelada tendem a fornecer melhores resultados (por exemplo, maior rendimento de óleo) e são mais fáceis de usar para fins de produção em grande escala.
BREVE SUMÁRIO
[004] São fornecidos neste documento métodos aprimorados de cultura de um micro-organismo e métodos de produção de óleo e promoção da produtividade de biomassa prolongada usando um processo semicontínuo.Os métodos incluem o fornecimento de um recipiente compreendendo um ou mais micro-organismos em um meio contendo uma primeira razão de carbono e nitrogênio, cultura de micro-organismos até que a cultura atinja um indicador limite, colheita de uma parte da cultura, mantendo a maior parte da cultura no recipiente e adição de meio fresco contendo uma segunda razão de carbono e nitrogênio ao recipiente que compreende a maior parte da cultura que consiste nos micro-organismos.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[005] A Figura 1 é um gráfico que ilustra a curva de crescimento microbiana em forma de S típica. A produtividade instantânea de biomassa/óleo está no seu nível mais elevado no final do processo, mas antes que a cultura atinja uma fase estacionária, o que pode ser indicado pela inclinação mais acentuada na curva em S.
[006] A Figura 2 é um gráfico que mostra a biomassa total (■) e a produtividade de óleo (▲) de ONC-T18 cultivado em condições semicontínuas. Os valores elevados de produtividade mostrados na Figura 2 ultrapassaram o valor atingível em processo em batelada ou batelada alimentada típico.
[007] A Figura 3 é um gráfico que mostra os efeitos dos métodos de fermentação contínua em ONC-T18. A fermentação contínua resultou em fermentação insustentável, diminuição na biomassa e aumento na concentração de glicose no efluente. A fermentação foi interrompida em virtude de entupimento da linha.
[008] A Figura 4 é um gráfico que mostra a biomassa total (■) e a produtividade de óleo (▲) de ONC-T18 cultivado em condições contínuas. A fermentação contínua resultou em fermentação insustentável e em redução da biomassa e da produtividade de óleo.
[009] A Figura 5 é um gráfico que mostra a produtividade de biomassa de ONC-T18 cultivado em fermentação semicontínua e contínua. A fermentação semicontínua resultou na produtividade de biomassa prolongada.
[0010] A Figura 6 é um gráfico que mostra a produtividade instantânea de biomassa (determinada em certos momentos) de ONC-T18 cultivado em condições de fermentação contínua ou semicontínua.
[0011] A Figura 7 é um gráfico que mostra a produtividade instantânea de óleo (determinada em certos momentos) de ONC-T18 cultivado em condições de fermentação contínua ou semicontínua.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0012] São fornecidos neste documento métodos de cultivo de microorganismos e métodos de produção de óleo por um processo semicontínuo. Os métodos resultam em maior biomassa volumétrica total e produtividade de óleo em comparação com os processos em batelada, contínuo e batelada alimentada típicos. Em resumo, os micro-organismos são fornecidos em uma cultura inicial (por exemplo, cultura de sementes) e são cultivados usando um processo de fermentação semidescontínuo até um determinado parâmetro limite, por exemplo, concentração celular elevada e/ou teor de óleo elevado, momento em que a fonte de nitrogênio está limitada ou esgotada no meio, a fonte de carbono é zero ou perto de zero e a produtividade de biomassa/óleo estão dentro do seu alcance máximo para certo micro-organismo. Um certo volume de caldo de cultura é colhido (por exemplo, 10% do volume útil) e o mesmo volume de meio fresco contendo uma concentração predefinida de nutrientes de carbono e nitrogênio, assim como todos os outros nutrientes minerais necessários são adicionados ao fermentador. A razão de carbono e nitrogênio usada no meio de alimentação é tal para obter e manter o teor de óleo elevado na cultura. O cultivo continua com a cultura que desenvolve biomassa adicional e óleo usando o meio recém-fornecido. A cultura é desenvolvida até que um parâmetro limite seja atingido (por exemplo, a concentração de carbono é reduzida a zero ou próximo a zero) e o ciclo parcial de colheita de caldo e fornecimento de meio é repetido. Ao usar esse processo, a biomassa de alta densidade contendo teor de óleo elevado pode ser produzida e colhida de maneira semicontínua e a duração total do processo é muito mais longa do que qualquer cultivo de modo em batelada ou batelada alimentada desses micro-organismos. A colheita semicontínua da biomassa de alta densidade com teor de óleo elevado reduz significativamente o tempo de reorganização do fermentador, minimiza a necessidade de um procedimento de resposta do recipiente do fermentador e procedimento de esterilização reduzindo, assim, o custo da operação, e pode resultar em uma produtividade volumétrica total de biomassa e óleo muito elevada, ultrapassando o que pode ser conseguido pelos métodos de fermentação em batelada, contínuo ou batelada alimentada típicos.
Micro-organismos
[0013] Os métodos descritos neste documento incluem extração de lipídios a partir de uma população de micro-organismos. A população de micro-organismos aqui descrita pode ser de algas (por exemplo, microalgas), fungos (incluindo levedura), bactérias ou protistas. Opcionalmente, o microorganismo inclui Thraustochytrids da ordem Thraustochytriales e, mais especificamente, Thraustochytriales do gênero Thraustochytrium. Opcionalmente, a população de micro-organismos inclui Thraustochytriales, como descrito na Patente US n° 5.340.594 e 5.340.742, que estão incorporadas integralmente neste documento por referência. O microorganismo pode ser uma espécie Thraustochytrium, tal como a espécie Thraustochytrium depositada como n° de acesso ATCC PTA-6245 (isto é, ONC-T18) como descrito na Patente U.S. n° 8.163.515, que está incorporado integralmente neste documento por referência. Assim, o micro-organismo pode ter uma sequência de rRNA 18s que é, pelo menos, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% ou mais (por exemplo, inclusive 100%) idêntica à SEQ ID NO: 1.
[0014] Os micro-organismos para utilização nos métodos descritos neste documento podem produzir uma variedade de compostos lipídicos. Tal como utilizado neste documento, o termo lipídio inclui fosfolipídios, ácidos graxos livres, ésteres de ácidos graxos, triglicerídeos, esteróis e ésteres de esteróis, carotenoides, xantofilas (por exemplo, oxicarotenoides), hidrocarbonetos, e outros lipídios conhecidos por um versado na técnica. Opcionalmente, os compostos de lipídios incluem lipídios insaturados. Os lipídios insaturados podem incluir lipídios poli-insaturados (isto é, lipídios contendo, pelo menos, 2 ligações insaturadas carbono-carbono, por exemplo, ligações duplas) ou lipídios altamente insaturados (isto é, lipídios contendo 4 ou mais ligações insaturadas carbono-carbono). Exemplos de lipídios insaturados incluem ácidos graxos poli-insaturados ômega 3 e/ou ômega 6, como ácido docosa-hexaenoico (isto é, DHA), ácido eicosapentanoico (isto é, EPA) e outros compostos insaturados, poli-insaturados e altamente insaturados de ocorrência natural.
Processos
[0015] É fornecido neste documento um método de cultura de um micro-organismo. O método inclui o fornecimento de um recipiente de um ou mais micro-organismos em um meio, contendo uma primeira razão de carbono e nitrogênio; cultura de micro-organismos até que a cultura atinja um indicador limite; colheita de uma parte da cultura, mantendo a maior parte da cultura no recipiente; e adição de meio fresco contendo uma segunda razão de carbono e nitrogênio ao recipiente que contém a maior parte da cultura que consiste nos micro-organismos.
[0016] Os métodos são aplicáveis à fermentação em grande escala, bem como à fermentação em pequena escala. A fermentação em larga escala, conforme usada aqui, se refere à fermentação em um fermentador que tem pelo menos cerca de 1000 L de capacidade volumétrica (isto é, volume útil), deixando espaço adequado para headspace. A fermentação em pequena escala se refere, geralmente, à fermentação em um fermentador que tem geralmente, no máximo, cerca de 100 L de capacidade volumétrica, como 5 L, 10 L, 50 L e 100 L. Uma vantagem demonstrada do processo de fermentação em batelada alimentada presente é que ele pode ser utilizado para a produção de óleo na escala do fermentador de 5-10 L e é escalável para qualquer volume, por exemplo, 100 L, 150 L, 250 L, 500 L, 1000 L ou mais, sem limitação.
[0017] Como discutido ao longo do documento, é fornecido um método de cultura de um micro-organismo que inclui o fornecimento de um recipiente com um ou mais micro-organismos em um meio que compreende uma primeira razão de carbono e nitrogênio. Normalmente, os meios incluem fontes de carbono em uma concentração de cerca de 5 g/L a cerca de 200 g/L e têm uma razão molar C: N (carbono para nitrogênio) entre cerca de 1:1 e cerca de 40:1. Nos métodos fornecidos, a primeira razão molar de carbono e nitrogênio é de 30:1 a 60:1. Opcionalmente, a primeira razão molar de carbono e nitrogênio é de 40:1 a 50:1. Como discutido com mais detalhes ao longo do documento, as fontes de carbono incluem, entre outros, ácidos graxos, lipídios, gliceróis, trigliceróis, carboidratos, polióis, açúcares aminados. Opcionalmente, a fonte de carbono é a glicose, frutose ou glicerol. Como discutido com mais detalhes ao longo do documento, as fontes de nitrogênio incluem, entre outros, soluções de amônio, sais de amônio ou de amina, peptona, triptona, extrato de levedura, extrato de malte, farinha de peixe, glutamato de sódio, extrato de soja, ácidos de casamino e grãos do destilador. Opcionalmente, a fonte de nitrogênio é sulfato de amônio.
[0018] Os métodos fornecidos incluem a cultura de micro-organismos até que a cultura atinja um indicador limite. Como usado aqui, o termo parâmetro se refere a um indicador ou variável usada para monitorar e controlar o progresso de uma cultura de micro-organismo. Esses parâmetros incluem, entre outros, densidade óptica (DO), concentração celular, taxa de produção de dióxido de carbono, pH, oxigênio dissolvido (OD), tempo, concentração de nutrientes no meio de cultura, acúmulo de subprodutos metabólicos, temperatura, produtividade de biomassa e produtividade de óleo. Qualquer parâmetro ou combinação de parâmetros adequados são contemplados para uso como seria entendido pelos versados na técnica e com base na orientação aqui apresentada. Opcionalmente, o parâmetro é uma concentração de nutrientes no meio de cultura. Os nutrientes adequados que podem ser medidos no meio de cultura incluem, entre outros, carbono e nitrogênio.
[0019] Os métodos fornecidos incluem a colheita de uma parte da cultura, mantendo a maior parte da cultura no recipiente. Nos métodos, a parte colhida compreende de cerca de 5 a cerca de 20% da cultura. Opcionalmente, a parte colhida compreende cerca de 10% da cultura.
[0020] As composições fornecidas incluem também a adição de meio fresco que compreende uma segunda razão de carbono e nitrogênio para o recipiente que compreende a maior parte da cultura com os microorganismos. Como usado aqui, o termo maior parte significa que 50% ou mais da cultura compreendendo os micro-organismos permanecem no recipiente, enquanto que a parte restante da cultura é colhida. Nos métodos fornecidos, a segunda razão de carbono e nitrogênio é tipicamente maior do que a primeira razão de carbono e nitrogênio. A segunda razão de carbono e nitrogênio pode variar de cerca de 60:1 a cerca de 95:1. Opcionalmente, o segundo carbono a proporção de nitrogênio é de cerca de 80: 1 a cerca de 90: 1. Como discutido com mais detalhes ao longo do documento, as fontes de carbono incluem, entre outros, ácidos graxos, lipídios, gliceróis, trigliceróis, carboidratos, polióis, açúcares aminados. Opcionalmente, a fonte de carbono é a glicose, frutose ou glicerol. Como discutido com mais detalhes ao longo do documento, as fontes de nitrogênio incluem, entre outros, soluções de amônio, sais de amônio ou de amina, peptona, triptona, extrato de levedura, extrato de malte, farinha de peixe, glutamato de sódio, extrato de soja, ácidos de casamino e grãos do destilador. Opcionalmente, a fonte de nitrogênio é sulfato de amônio.
[0021] Os métodos fornecidos incluem, opcionalmente, a repetição das etapas de (i) cultivo de micro-organismos até que a cultura atinja um indicador limite; (ii) colheita de uma parte da cultura, mantendo a maior parte da cultura no recipiente; e (iii) adição de meio fresco com a segunda razão de carbono e nitrogênio ao recipiente que compreende a maior parte da cultura que compreende os micro-organismos. Desta forma, os métodos fornecidos possibilitam, de forma vantajosa, que a cultura seja mantida por um longo período de tempo durante o qual a cultura mantém um nível elevado de biomassa e/ou produtividade de óleo. Opcionalmente, a cultura é mantida por um período de horas, dias, semanas ou meses. Opcionalmente, a cultura é mantida por pelo menos 150 a 500 horas. Por exemplo, a cultura pode ser mantida por pelo menos 250 horas. Opcionalmente, a cultura é mantida por um, dois, três, quatro ou cinco semanas.
[0022] Os métodos fornecidos possibilitam que a cultura seja mantida em um alto nível de produtividade de biomassa. Como usado aqui, o termo "nível elevado de produtividade de biomassa" se refere a um nível que é mais elevado do que a produtividade de biomassa média de um determinado microorganismo. Tipicamente, os níveis médios de produtividade tendem a variar de 40 g/L-d ou menos, ou seja, de 0 g/L-d a cerca de 40 g/L-d, mas podem variar dependendo do micro-organismo. Opcionalmente, a produtividade de biomassa compreende 60 g/L-d a 180 g/L-d. Opcionalmente, a produtividade de biomassa compreende 80 g/L-d a 130 g/L-d. Opcionalmente, a produtividade de biomassa compreende 90 g/L-d e 100 g/L-d. Como usado aqui, o termo "elevado"
[0023] Os métodos fornecidos permitem também, de forma vantajosa, que a cultura seja mantida em um nível elevado de produtividade de óleo. Como usado aqui, o termo "nível elevado de produtividade de óleo" se refere a um nível que é mais elevado que a produtividade de óleo média de um determinado micro-organismo. Tipicamente, os níveis médios de produtividade tendem a variar de 25 g/L-d ou menos, ou seja, de 0 g/L-d a cerca de 25 g/L-d, mas podem variar dependendo do micro-organismo. Opcionalmente, a produtividade de óleo compreende 35 g/L-d a 130 g/L-d. Opcionalmente, a produtividade de óleo compreende 60 g/L-d a 90 g/L-d. Opcionalmente, a produtividade de óleo compreende 70 g/L-d a 80 g/L-d. Assim, por exemplo, a cultura de micro-organismos compreende uma biomassa que compreende 60% a 85% de óleo. Opcionalmente, a cultura de micro-organismos compreende uma biomassa que compreende 65% a 75% de óleo.
[0024] Os termos elevado, mais elevado, aumenta, elevar ou elevação se referem a aumentos acima de um controle. Os termos baixo, inferior, reduz ou redução se referem a qualquer redução abaixo dos níveis de controle. A título de exemplo, os níveis de controle são níveis de produtividade de biomassa e/ou óleo cultivado em condições de batelada, batelada alimentada ou contínuas. Os métodos fornecidos fornecem níveis de produtividade de biomassa e/ou óleo que são mais elevados do que os níveis quando os mesmos micro-organismos são cultivados usando um processo diferente, por exemplo, processo descontínuo, semidescontínuo ou contínuo. Os níveis de produtividade de biomassa podem ser determinados, por exemplo, presumindo um tempo de reorganização de 24 horas a ser incluído ao tempo total do processo, a produtividade (X) de biomassa total em qualquer momento do processo pode ser calculada como: X (grama)/Volume da Cultura (litro)/Tempo (hora) x 24 (horas/dia) com a unidade final sendo g/L- dia. A produtividade de óleo em geral em qualquer ponto no tempo pode ser calculada de forma semelhante como: Óleo (grama)/Volume da Cultura (litros)/Tempo (horas) x 24 (horas/dia).
Fermentação
[0025] Os métodos providos incluem ou podem ser usados em conjunto com etapas adicionais para a cultura de micro-organismos de acordo com métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, um Thraustochytrid, por exemplo, um Thraustochytrium sp., pode ser cultivado de acordo com métodos descritos nas Publicações de Patente US Nos 2009/0117194 ou 2012/0244584, as quais são incorporadas a este instrumento por referência na sua totalidade, para cada etapa dos métodos ou composição neles usadas. Os micro-organismos são cultivados em um meio de crescimento (também conhecido como "meio de cultura"). Qualquer variedade de meios pode ser adequada para uso na cultura dos micro-organismos aqui descritos. Opcionalmente, o meio provê vários componentes nutricionais, incluindo uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio, para o microrganismo.
[0026] O meio para cultura Thraustochytrid pode incluir qualquer um de uma variedade de fontes de carbono. Exemplos de fontes de carbono incluem ácidos graxos, lipídios, gliceróis, trigliceróis, carboidratos, polióis, açúcares aminados, e qualquer tipo de biomassa ou fluxo de resíduos. Os ácidos graxos incluem, por exemplo, ácido oleico. Os hidratos de carbono incluem, entre outros, glicose, celulose, hemicelulose, a frutose, dextrose, xilose, lactulose, galactose, maltotriose, maltose, lactose, glicogênio, gelatina, amido (milho ou trigo), acetato, m-inositol (por exemplo, derivado de licor de milho), ácido galacturônico (por exemplo, derivado de pectina), L-fucose (por exemplo, derivado de galactose), gentiobiose, glucosamina, alfa-D-glicose-1- fosfato (por exemplo, derivados de glicose), celobiose, dextrina, alfa- ciclodextrina (por exemplo, derivado de amido), e a sacarose (por exemplo, a partir de melaço). Os polióis incluem, entre outros, maltitol, eritritol e adonitol. Açúcares aminados incluem, entre outros, N-acetil-D-galactosamina, N-acetil-D-glucosamina e N-acetil-beta-D-manosamina. Opcionalmente, a fonte de carbono é a glicose. Como mencionado acima, nos métodos providos, a fonte de carbono é provida numa alta concentração, por exemplo, pelo menos 200 g/L.
[0027] Opcionalmente, os micro-organismos aqui providos neste documento são cultivados sob condições que aumentam a biomassa e/ou a produção de um composto de interesse (por exemplo, óleo ou teor de ácido graxo total (TFA)). Thraustochytrids, por exemplo, são normalmente cultivados em meio salino. Opcionalmente, Thraustochytrids podem ser cultivados em meio com uma concentração de sal de cerca de 0,5 g/L a cerca de 50,0 g/L. Opcionalmente, Thraustochytrids são cultivados em meio com uma concentração de sal de cerca de 0,5 g/L a cerca de 35 g/L (por exemplo, de cerca de 18 g/L a cerca de 35 g/L). Opcionalmente, os Thraustochytrids descritos neste documento podem ser cultivados em condições de baixo sal. Por exemplo, os Thraustochytrids podem ser cultivados num meio que tem uma concentração de sal de cerca de 0,5 g/L a cerca de 20 g/L (por exemplo, de cerca de 0,5 g/L a cerca de 15 g/L). O meio de cultura inclui, opcionalmente, NaCl. Opcionalmente, o meio inclui sal marinho natural ou artificial e/ou água do mar artificial.
[0028] O meio de cultura pode incluir sais de sódio que não contêm cloreto como uma fonte de sódio. Os exemplos de sais de sódio sem cloreto adequados para uso, de acordo com os presentes métodos, incluem, entre outros, carbonato de sódio (uma mistura de carbonato de sódio e óxido de sódio), carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, sulfato de sódio e suas misturas. Ver, por exemplo, Patente US Nos. 5.340.742 e 6.607.900, sendo que o conteúdo total de cada uma está incorporado a este documento por referência. Uma porção significativa do sódio total pode ser provida, por exemplo, por sais que não contém cloreto, de tal modo que menos de cerca de 100%, 75%, 50% ou 25% do sódio total no meio de cultura é provido por cloreto de sódio.
[0029] Opcionalmente, o meio de cultura tem concentrações inferiores a cerca de 3 g/L, 500 mg/L, 250 mg/L ou 120 mg/L. Por exemplo, o meio de cultura para uso nos métodos fornecidos pode ter concentrações de cloreto entre e incluindo cerca de 60 mg/L e 120 mg/L.
[0030] O meio para cultura de Thraustochytrid pode incluir qualquer variedade de fontes de nitrogênio. Fontes de nitrogênio exemplares incluem soluções de amônio (por exemplo, NH4 em H2O), sais de amônio ou de amina (por exemplo, (NH4)2SO4, (NH4)3PO4, NH4NO3, NH4OOCH2CH3 (NH4Ac)), peptona, triptona, extrato de levedura, extrato de malte, farinha de peixe, glutamato de sódio, extrato de soja, ácidos de casamino e grãos do destilador. As concentrações das fontes de nitrogênio em meio adequado variam, normalmente, incluindo cerca de 1 g/L a cerca de 25 g/L.
[0031] O meio inclui opcionalmente um fosfato, tal como fosfato de potássio ou fosfato de sódio. Os sais inorgânicos e micronutrientes no meio podem incluir sulfato de amônio, bicarbonato de sódio, ortovanadato de sódio, cromato de potássio, molibdato de sódio, ácido selenoso, sulfato de níquel, sulfato de cobre, sulfato de zinco, cloreto de cobalto, cloreto de ferro, cloreto de manganês, cloreto de cálcio, e EDTA. Vitaminas, tais como cloridrato de piridoxina, cloridrato de tiamina, pantotenato de cálcio, ácido p- aminobenzoico, riboflavina, ácido nicotínico, biotina, ácido fólico e vitamina B12 podem ser incluídas.
[0032] O pH do meio pode ser ajustado para estar entre e incluir 3,0 e 10,0 com o uso de ácido ou base, se necessário, e/ou uso da fonte de nitrogênio. Opcionalmente, o meio é ajustado para um pH baixo, tal como definido acima. O meio pode ser esterilizado.
[0033] Geralmente um meio utilizado para a cultura de um microorganismo é um meio líquido. No entanto, o meio utilizado para a cultura de um micro-organismo pode ser um meio sólido. Além das fontes de carbono e de nitrogênio, tal como discutido neste documento, um meio sólido pode conter um ou mais componentes (por exemplo, ágar ou agarose) que proporcionam suporte estrutural e/ou permitem que o meio esteja na forma sólida.
[0034] As células podem ser cultivadas ao longo de um período de tempo. Opcionalmente, as células são cultivadas para qualquer lugar a partir de 1 dia a 60 dias. Opcionalmente, a cultura é mantida por um período de horas, dias, semanas ou meses. Opcionalmente, a cultura é mantida por pelo menos 150 a 500 horas. Opcionalmente, a cultura é mantida por pelo menos 250 horas. Opcionalmente, a cultura é mantida por um, dois, três, quatro ou cinco semanas. O cultivo é opcionalmente realizado a temperaturas desde cerca de 4°C a cerca de 30°C, por exemplo, desde cerca de 18°C a cerca de 28°C. O cultivo pode incluir a cultura de aeração por agitação, cultura de agitação, cultura estacionária, cultura em batelada, cultura semicontínua, cultura contínua, cultura em batelada rolante, cultura em movimentos ondulares, ou semelhantes. O cultivo pode ser realizado usando um fermentador por agitação convencional, fermentador de coluna de bolhas (culturas em batelada ou contínuas), fermentador de transporte de ar (airlift), fermentador em ondas e similares.
[0035] As culturas podem ser areadas por um ou mais de uma variedade de métodos, incluindo a agitação. Opcionalmente, a agitação varia de cerca de 100 rpm a cerca de 1000 rpm, por exemplo, desde cerca de 350 rpm a cerca de 600 rpm ou desde cerca de 100 a cerca de 450 rpm. Opcionalmente, as culturas são areadas por uso de diferentes velocidades de agitação durante as fases de produção de biomassa e durante as fases de produção de lipídios. Alternativamente ou adicionalmente, as velocidades de agitação podem variar em função do tipo de recipiente de cultura (por exemplo, formato ou tamanho do frasco).
[0036] A produção de lipídios desejáveis pode ser aumentada por cultura de células de acordo com métodos que envolvem uma mudança de uma ou mais condições de cultura, a fim de obter quantidades maiores de compostos desejáveis. Opcionalmente, as células são cultivadas em primeiro lugar sob condições que maximizam a biomassa, seguido por uma troca de uma ou mais condições de cultura para condições que favorecem a produtividade de lipídios. Condições que são trocadas podem incluir concentração de oxigénio, razão C: N, temperatura, e suas combinações. Opcionalmente, uma cultura de duas fases é realizada, na qual uma primeira fase favorece a produção de biomassa (por exemplo, usando condições de oxigênio elevado (por exemplo, geralmente ou em relação à segunda fase), razão C:N baixa e temperatura ambiente), seguida por uma segunda fase, que favorece a produção de lipídios (por exemplo, em que o oxigênio diminui, a razão C:N aumenta e a temperatura diminui, em comparação com a primeira fase). Em contraste com os métodos anteriormente descritos, os métodos fornecidos possibilitam a manutenção da cultura por um período prolongado em condições em níveis elevados de produção de óleo ou de lipídios.
Pasteurização
[0037] Opcionalmente, a biomassa resultante é pasteurizada para inativar substâncias indesejáveis presentes na biomassa. Por exemplo, a biomassa pode ser pasteurizada para inativar substâncias que degradam compostos. A biomassa pode estar presente no meio de fermentação ou isolada do meio de fermentação para a etapa de pasteurização. A etapa de pasteurização pode ser realizada por aquecimento da biomassa e ou meio de fermentação a uma temperatura elevada. Por exemplo, o meio de biomassa e/ou fermentação pode ser aquecido a uma temperatura de cerca de 50°C a cerca de 95°C (por exemplo, de cerca de 55°C a cerca de 90°C ou de cerca de 65°C a cerca de 80°C). Opcionalmente, o meio de biomassa e/ou fermentação pode ser aquecido de cerca de 30 minutos a cerca de 120 minutos (por exemplo, de cerca de 45 minutos a cerca de 90 minutos ou de cerca de 55 minutos a cerca de 75 minutos). A pasteurização pode ser realizada através de um meio de aquecimento adequado tal como conhecido aos versados na técnica, como por injeção direta de vapor.
[0038] Opcionalmente, nenhuma etapa de pasteurização é realizada.Dito de outra forma, o método ensinado neste documento opcionalmente carece de uma etapa de pasteurização.
Colheita e Lavagem
[0039] Opcionalmente, a biomassa pode ser colhida de acordo com uma variedade de métodos incluindo aqueles atualmente conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, a biomassa pode ser coletada a partir do meio de fermentação, utilizando por exemplo, centrifugação (por exemplo, centrífugas de ejeção de sólidos) ou filtração (por exemplo, filtração de fluxo cruzado), opcionalmente com um agente de precipitação para a coleta acelerada da biomassa celular (por exemplo, fosfato de sódio ou cloreto de cálcio).
[0040] Opcionalmente, a biomassa é lavada com água. Opcionalmente, a biomassa pode ser concentrada até cerca de e incluindo 20% de sólidos. Por exemplo, a biomassa pode ser concentrada até cerca de
[0041] De 5% a cerca de 20% de sólidos, a partir de cerca de 7,5% a cerca de 15% de sólidos ou de cerca de sólidos até cerca de 20% de sólidos ou qualquer percentagem dentro das faixas referidas. Opcionalmente, a biomassa pode ser concentrada até cerca de 20% de sólidos ou menos, cerca de 19% de sólidos ou menos, cerca de 18% de sólidos ou menos, cerca de 17% de sólidos ou menos, cerca de 16% de sólidos ou menos, cerca de 15% de sólidos ou menos, cerca de 14% de sólidos ou menos, cerca de 13% de sólidos ou menos, cerca de 12% de sólidos ou menos, cerca de 11% de sólidos ou menos, cerca de 10% de sólidos ou menos, cerca de 9% de sólidos ou menos, cerca de 8% de sólidos ou menos, cerca 7% de sólidos ou menos, cerca de 6% ou menos, cerca de 5% de sólidos ou menos, cerca de 4% de sólidos ou menos, cerca de 3% de sólidos ou menos, cerca de 2% de sólidos ou menos, ou cerca de 1% de sólidos ou menos.
Isolamento e Extração
[0042] Os métodos fornecidos, opcionalmente incluem o isolamento de ácidos graxos poli-insaturados a partir da biomassa ou micro-organismos utilizando uma variedade de métodos, incluindo aqueles atualmente conhecidos aos versados na técnica. Por exemplo, métodos de isolamento de ácidos graxos poli-insaturados são descritos na Patente US n° 8, 163, 515, que é incorporada neste documento por referência na sua totalidade. Opcionalmente, o meio não é esterilizado antes do isolamento dos ácidos graxos poli-insaturados. Opcionalmente, a esterilização compreende um aumento na temperatura. Opcionalmente, os ácidos graxos poli-insaturados produzidos pelos micro-organismos e isolados dos métodos providos são os ácidos graxos de cadeia média. Opcionalmente, o um ou mais ácidos graxos poli-insaturados são selecionados a partir do grupo que consiste em ácido alfa linolênico, ácido araquidônico, ácido docosa-hexanenoico, ácido docosapentaenoico, ácido eicosapentaenoico, ácido gama-linolênico, ácido linoleico, ácido linolênico e suas combinações.
Produtos
[0043] Ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) de petróleo e outros lipídios produzidos de acordo com o método descrito neste documento podem ser utilizados em qualquer de uma variedade de aplicações explorando suas propriedades biológicas, nutricionais ou químicas. Assim, os métodos fornecidos incluem opcionalmente isolar o óleo da cultura colhida. Opcionalmente, o óleo é usado para produzir combustível, por exemplo, biocombustível. Opcionalmente, o óleo pode ser usado em produtos farmacêuticos, suplementos alimentares, aditivos para alimentação animal, produtos cosméticos e similares. Os lipídios produzidos de acordo com os métodos descritos neste documento também podem ser usados como intermediários na produção de outros compostos.
[0044] A título de exemplo, o óleo produzido pelos micro-organismos cultivados utilizando os métodos proporcionados podem compreender ácidos graxos. Opcionalmente, os ácidos graxos são selecionados a partir do grupo que consiste em ácido alfa linolênico, ácido araquidônico, ácido docosa- hexanenoico, ácido docosapentaenoico, ácido eicosapentaenoico, ácido gama- linolênico, ácido linoleico, ácido linolênico e suas combinações. Opcionalmente, o óleo compreende triglicerídeos. Opcionalmente, o óleo compreende ácidos graxos selecionados a partir do grupo consistindo em ácido palmítico (C16:0), ácido mirístico (C14:0), ácido palmitoleico (C16:1(n-7)), ácido cis-vaccênico (C18:1(n-7)), ácido docosapentaenoico (C22:5(n-6)), ácido docosa-hexaenoico (C22:6(n-3)) e suas combinações. Opcionalmente, a concentração de ácido docosa-hexaenoico nos ácidos graxos isolados é de 20% ou menos da concentração total de ácidos graxos.
[0045] Opcionalmente, os lipídios produzidos de acordo com os métodos descritos neste documento podem ser incorporados em um produto final (por exemplo, um alimento ou suplemento alimentar, uma fórmula infantil, um produto farmacêutico, um combustível, etc.) suplementos de alimento ou alimentação adequados nos quais os lipídios podem ser incorporados incluem bebidas como leite, água, bebidas esportivas, bebidas energéticas, chás e sucos; confecções, como balas, geleias e biscoitos; alimentos e bebidas contendo gordura, tais como produtos lácteos; produtos alimentícios processados, tais como o arroz macio (ou mingau); fórmulas infantis; cereais do café da manhã; ou semelhantes. Opcionalmente, um ou mais lipídios produzidos podem ser incorporados em um suplemento dietético, como por exemplo, uma multivitamina. Opcionalmente, um lipídio produzido de acordo com o método descrito neste documento pode ser incluído em um suplemento alimentar e, opcionalmente, pode ser diretamente incorporado em um componente de alimentação ou alimento (por exemplo, um suplemento alimentar).
[0046] Exemplos de alimentos em que os lipídios produzidos pelos métodos descritos neste documento podem ser incorporados incluem alimentos para animais, como alimentos para gatos; alimentos para cães e artigos semelhantes; alimentos para peixes de aquário, peixes cultivados ou crustáceos, etc; alimentos para animais de fazendas (incluindo gado e peixe ou crustáceos criados em aquacultura). Alimentos ou material para alimentação em que os lipídios produzidos de acordo com os métodos descritos neste documento podem ser incorporados são preferencialmente aceitáveis para o organismo que é o receptor a que se destinam. Este alimento ou material de alimentação pode ter quaisquer propriedades físicas conhecidas atualmente para um material de alimentação (por exemplo, sólido, líquido, suave).
[0047] Opcionalmente, um ou mais dos compostos produzidos (por exemplo, PUFA) podem ser incorporados em um nutracêutico ou farmacêutico. Exemplos de tais produtos nutracêuticos e farmacêuticos incluem vários tipos de comprimidos, cápsulas, agentes bebíveis, etc. Opcionalmente, o produto nutracêutico ou farmacêutico é adequado para aplicação tópica. As formas de dosagem podem incluir, por exemplo, cápsulas, óleos, granula, granula subtilae, pós, tabellae, pílulas, trocisco ou semelhantes.
[0048] Os lipídios ou óleos produzidos de acordo com os métodos descritos neste documento podem ser incorporados em produtos, tal como descrito neste documento, por combinações com qualquer um de uma variedade de outros agentes. Por exemplo, tais compostos podem ser combinados com um ou mais aglutinantes ou agentes de preenchimento, agentes quelantes, pigmentos, sais, agentes surfactantes, hidratantes, modificadores de viscosidade, espessantes, emolientes, fragrâncias, conservantes, etc. ou qualquer combinação dos mesmos.
[0049] São divulgados materiais, composições e componentes que podem ser usados para, podem ser usados em conjunto com, podem ser usados em preparação para ou são produtos dos métodos e composições divulgados. Estes e outros materiais são divulgados neste documento, e compreende-se que quando combinações, subconjuntos, interações, grupos, etc. destes materiais são divulgados que, enquanto referência específica das várias combinações individuais e coletivas e permutação desses compostos não pode ser explicitamente divulgada, cada uma é especificamente contemplada e descrita neste documento. Por exemplo, se um método é divulgado e discutido e um certo número de modificações que podem ser feitas a uma série de moléculas incluindo o método são discutidas, cada uma e todas as combinações e permutações do método e as modificações que são possíveis são especificamente contempladas, a menos especificamente indicado em contrário. Da mesma forma, qualquer subconjunto ou combinação destes também é especificamente contemplado e divulgado. Este conceito aplica-se a todos os aspectos desta divulgação, incluindo, mas não se limitando a, etapas nos métodos usando as composições divulgadas. Assim, se houver uma variedade de etapas adicionais que podem ser executadas, compreende-se que cada uma dessas etapas adicionais pode ser realizada com qualquer método específico ou combinação de etapas de método dos métodos divulgados, e que cada tal combinação ou subconjunto de combinações é especificamente contemplada e deve ser considerada divulgada.
[0050] Como utilizado ao longo deste documento, os intervalos (por exemplo, 1-10) e as referências a cerca de um determinado valor (por exemplo, cerca de 1 ou cerca de 10) incluem o valor ou valores citados (por exemplo, 1 e/ou 10).
[0051] As publicações citadas neste documento e os materiais citados são especificamente incorporados em suas totalidades por referência.
[0052] Os exemplos a seguir destinam-se a ilustrar ainda certos aspectos dos métodos e composições aqui descritos e não se destinam a limitar o escopo das reivindicações.
Exemplos Fermentação Semicontínua para Produção de Biomassa e Óleo
[0053] No campo da produção de óleo microbiano, a fermentação heterotrófica (escura) é geralmente considerada superior ao cultivo microbiano fototrófico em termos de eficiência do processo e rendimento do produto. No entanto, é muitas vezes impedida pelo maior custo de capital fixo (o custo da construção de uma instalação de fermentação baseada em recipientes é geralmente muito maior do que o custo financeiro de sistemas de cultivo dos tipos tanque aberto e condutor). Usando tais processos de produção semicontínua, como descrito neste documento, uma maior produtividade global pode ser conseguida com custo operacional reduzido (minimizando o procedimento de reorganização de recipiente fermentador de produção e o procedimento de esterilização de recipiente). Isto significa uma melhor utilização dos investimentos de capital fixo (fermentadores e equipamentos de capital associados) e maior capacidade de produção anual.
[0054] Durante o cultivo de micro-organismos em batelada alimentada, a concentração de células de cultura/óleo segue uma curva de crescimento em forma de S típica microbiana (FIG. 1) e a produtividade de biomassa/óleo instantânea está no seu nível mais alto mais tarde no processo, mas antes a cultura atinge uma fase estacionária, que pode ser indicada pela inclinação mais acentuada na curva em S (FIG. 1). No entanto, um cultivo típico em batelada alimentada é interrompido logo após a cultura ter passado da fase de alta produtividade instantânea e a produtividade global não pode ser muito alta, porque a cultura tinha passado a maior parte do tempo do processo de atravessar a fase mais baixa de produtividade instantânea antes de que a fase de alta produtividade instantânea possa ser alcançada. O processo semicontínuo tira proveito da capacidade da cultura crescer e sintetizar óleo durante a fase de alta produtividade instantânea por colheita repetida de um certo volume de caldo em concentração elevada, enquanto o fornece o meio recentemente equilibrado para permitir que a cultura gere biomassa e óleo repetidamente na taxa mais alta.
[0055] O processo semicontínuo fornecido estende o crescimento e produção de óleo no nível de produtividade de pico da cultura. Presumindo um tempo de reorganização de 24 horas a ser incluído ao tempo total do processo, a produtividade (X) de biomassa total em qualquer momento do processo pode ser calculada como: X (grama)/Volume da Cultura (litro)/Tempo (hora) x 24 (horas/dia) com a unidade final sendo g/L-dia. A produtividade de óleo em geral em qualquer ponto no tempo pode ser calculada de forma semelhante como: Óleo (grama)/Volume da Cultura (litros)/Tempo (horas) x 24 (horas/dia). Como pode ser visto na representação gráfica total da produtividade de biomassa e de óleo, ao final de um processo em batelada alimentada (indicado pela linha divisória em 67 horas), a biomassa e a produtividade de óleo são apenas 42 g/L-d e 28 g/L-d, respectivamente (FIG. 2). Ao aumentar a fermentação sob o modo semicontínuo fornecido para 453 horas (19 dias), a produtividade de biomassa total e de óleo aumentou gradualmente e atingiu um patamar de 96 g/L-d e 72 g/L-d, respectivamente (FIG. 2). Estes valores elevados de produtividade excederam muito o valor realizável em processos típicos em batelada ou batelada alimentada.
[0056] Resumidamente, as células ONC-T18 foram cultivadas primeiramente usando um processo de fermentação em batelada alimentada para concentração celular elevada e elevado teor de óleo, altura em que a fonte de nitrogênio predefinida foi esgotada no meio, a fonte de carbono é controlada a nível próximo de zero e a produtividade volumétrica de biomassa/óleo instantânea está dentro de sua região máxima. Um certo volume de caldo de cultura foi colhido (10%) e o mesmo volume de meio fresco contendo uma concentração predefinida de nutrientes de carbono e nitrogênio, assim como todos os outros nutrientes minerais necessários foi adicionada ao fermentador para substituir o caldo coletado. O carbono e o nitrogênio no meio de alimentação também precisam estar em uma determinada proporção, a fim de obter e manter o alto teor de óleo na cultura. Para a Figura 2, as concentrações de glucose e o sulfato de amônio ((NH4)2SO4) de 300 g/L e 7,5 g/L, respectivamente, foram utilizados no meio de alimentação correspondente a razão de carbono (C) para nitrogênio (N) de 88: 1 (razão molar). O cultivo continua com a cultura desenvolvendo mais biomassa adicional e óleo usando o meio recém-fornecido. Uma vez que a fonte de carbono tenha sido esgotada, a colheita de caldo parcial e ciclo de fornecimento de meio fresco foi repetida. Ao usar esse processo, a biomassa de alta densidade contendo teor de óleo elevado pode ser produzida e colhida de maneira semicontínua e a duração total do processo é muito mais longa do que qualquer cultivo de modo batelada ou batelada alimentada desses microorganismos.
[0057] Para determinar se o método semicontínuo fornecido é melhor do que os métodos de fermentação contínua, as células foram cultivadas sob condições de cultura contínua usando uma razão C:N de 88:1. Os resultados são mostrados nas Figuras 3-7. Especificamente, as Figuras 3 e 4 mostram a fermentação contínua que resultou em fermentação insustentável, uma diminuição na biomassa e um aumento na concentração de glicose no efluente. A fermentação foi interrompida em virtude de entupimento da linha. As Figuras 5, 6 e 7 mostram comparações da produtividade de biomassa ou óleo ONC-T18 cultivadas sob condições de fermentação contínuas e semicontínuas. A fermentação semicontínua resultou em maior produção de biomassa e de óleo e foi deixada para a cultura a ser mantida sob condições de alta produtividade por um longo período de tempo. Na verdade, neste experimento, o método de fermentação contínua durou cerca de 160 horas a menos do que a fermentação semicontínua.

Claims (35)

1. Método em batelada alimentada repetida de cultivo de micro-organismos Thraustochytrid, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) fornecimento de um recipiente que compreende um ou mais micro-organismos Thraustochytrid em um meio compreendendo uma primeira razão de carbono e nitrogênio de 30:1 a 60:1; (b) cultivo de micro-organismos até que a cultura atinja um indicador limite, em que o indicador limite é a concentração de nutriente no meio de cultura, em que o nutriente é carbono e em que a concentração de carbono é reduzida a zero ou próximo a zero; (c) colheita de uma parte da cultura, mantendo a maior parte da cultura no recipiente, em que a parte coletada compreende de 5% a 20% da cultura; e (d) adição de meio fresco que compreende uma segunda razão de carbono e nitrogênio de 60:1 a 95:1 ao recipiente que compreende a maior parte da cultura compreendendo os micro-organismos, em que o meio fresco compreende carbono e nitrogênio.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira razão de carbono e nitrogênio é de 40:1 a 50:1.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a segunda razão de carbono e nitrogênio é de 70:1 a 95:1.
4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a segunda razão de carbono e nitrogênio é de 80:1 a 90:1.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a parte colhida compreende 10% da cultura.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente a determinação de densidade óptica (DO), concentração celular, concentração celular, taxa de produção de dióxido de carbono, pH, oxigênio dissolvido (OD), tempo, concentração de nutriente no meio de cultura, produtividade de biomassa, produtividade de óleo ou qualquer combinação destes.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o nutriente é carbono ou nitrogênio.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende a repetição das etapas de (a)-(d).
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono é selecionada a partir do grupo que consiste em ácidos graxos, lipídios, gliceróis, trigliceróis, carboidratos, polióis, e açúcares aminados.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono é a glicose, frutose ou glicerol.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o nitrogênio é uma fonte de nitrogênio selecionada a partir do grupo que consiste em soluções de amônio, sais de amônio ou de amina, peptona, triptona, extrato de levedura, extrato de malte, farinha de peixe, glutamato de sódio, extrato de soja, ácidos de casamino e grãos do destilador.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a fonte de nitrogênio é o sulfato de amônio.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o isolamento de óleo da cultura colhida.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o óleo compreende ácidos graxos selecionados do grupo consistindo em ácido alfa-linolênico, ácido araquidônico, ácido docosa- hexaenoico, ácido docosapentaenoico, ácido eicosapentaenoico, ácido gama- linolênico, ácido linoleico, ácido linolênico, e combinações dos mesmos.
15. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o óleo compreende triglicerídeos.
16. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o óleo compreende ácidos graxos selecionados do grupo consistindo em ácido palmítico (C16:0), ácido mirístico (C14:0), ácido palmitoleico (C16:1(n-7)), ácido cis-vacênico (C18:1(n-7)), ácido docosapentaenoico (C22:5(n-6)), ácido docosa-hexaenoico (C22:6(n-3)) e suas combinações.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a concentração de ácido docosa-hexaenóico nos ácidos graxos isolados é de 20% ou menos da concentração total de ácidos graxos.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a cultura é mantida em um nível elevado de produtividade de biomassa.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a produtividade de biomassa compreende 60 g/L-d a 180 g/L- d.
20. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a produtividade de biomassa compreende 80 g/L-d a 130 g/L- d.
21. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a produtividade de biomassa compreende 90 g/L-d a 100 g/L- d.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a cultura é mantida em um nível elevado de produtividade de óleo.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a produtividade de biomassa compreende 35 g/L-d a 130 g/L- d.
24. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a produtividade de óleo compreende 60 g/L-d a 90 g/L-d.
25. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a produtividade de óleo compreende 70 g/L-d a 80 g/L-d.
26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que a cultura de micro-organismos compreende uma biomassa compreendendo 60% a 85% de óleo.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que a cultura de micro-organismos compreende uma biomassa compreendendo 65% a 75% de óleo.
28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que a cultura é mantida por um período de tempo.
29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a cultura é mantida por um período de horas, dias, semanas ou meses.
30. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a cultura é mantida por pelo menos 150 a 500 horas.
31. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a cultura é mantida por pelo menos 250 horas.
32. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a cultura é mantida por uma, dois, três, quatro ou cinco semanas.
33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é do gênero Thraustochytrium.
34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é do gênero Thraustochytriacaea.
35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo tem n° de acesso ATCC PTA-6245.
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