JP6806297B2 - 半連続培養法 - Google Patents

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関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる２０１４年１０月１６日に出願された米国仮特許出願番号６２／０６４，６６８に対する優先権を主張する。

Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ種を含む微生物の従属栄養発酵は高付加価値の油及びバイオマスの製品を生成する効率的な方法である。特定の培養条件下では、微生物は細胞内油を合成し、それを抽出し、使用してバイオ燃料（バイオディーゼル、バイオジェット燃料等）及び栄養脂質（ポリ不飽和脂肪酸、たとえば、ＤＨＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ）を製造することができる。Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ種のような微生物のバイオマスはまた、高含量のＰＵＦＡ及びタンパク質ゆえに大きな栄養価があり、動物飼料の栄養補給剤として使用することができる。

微生物の発酵工程はほとんど回分工程または流加工程で実施される。通常、回分工程は閉鎖系の培養を意味し、発酵槽において特定の条件下（たとえば、栄養素、温度、圧力等）で固定された容量の栄養培養培地の中で細胞を特定の密度まで増殖させ、回分として回収し、処理する。典型的な流加工程では、１以上の栄養素が発酵槽に送り込まれ、または供給され、それらは培養工程の終了まで留まる。流加培養工程は、栄養素［単数］（または栄養素［複数］）の濃度を制御することが所望の生成物の収率または活性に影響を及ぼす場合、回分培養工程よりも優れている可能性がある。そのような発酵工程は通常、２つの培養段階からなり、細胞増殖段階（無制限の細胞増殖に対して必要な栄養素すべてが利用できる）に続いて油蓄積段階（過剰な炭素栄養が提供されて油合成に導かれる一方で、重要な増殖栄養素（通常、窒素）が意図的に培地で制限される）とで構成される。標的の細胞濃度及び油含量が達成されると、発酵工程が止められ、油が豊富なバイオマスが回収される。次いで発酵槽容器を清掃し、滅菌し、新鮮な培地で再び回分処理しなければならず、種系列は生産容器に再び播種する準備が出来ている必要がある（たとえば、回分発酵／流加発酵の間での「方向転換」操作）。そのような方向転換操作は時間とエネルギーを消費することが多く、確立された生産工程用の生産容器の総利用操作時間を制限する。或いは、微生物は、新鮮な培地が連続して発酵槽に加えられる一方で、培養液が連続して取り除かれて培養容量を一定に保持する連続法を用いて培養することができる。連続培養工程は特定の増殖率または生理的な定常状態で微生物を維持することができるが、中断なく維持することが困難である可能性があり、通常研究目的に使用される。流加培養または回分培養はより良好な結果（たとえば、油の高い収率）を提供する傾向があるので、大規模生産目的で使用し易い。

本明細書で提供されるのは、半連続工程を用いて微生物を培養する方法及び油を生産し、長期のバイオマス生産性を増進する方法である。該方法には、第１の炭素対窒素の比を含む培地にて１以上の微生物を含む容器を提供することと、培養物が閾値指標に達するまで微生物を培養することと、容器の培養物の大半を維持しながら培養物の一部を回収することと、微生物を含む培養物の大半を含む容器に第２の炭素対窒素の比を含む新鮮な培地を加えることとが含まれる。

典型的な微生物のＳ字型増殖曲線を説明するグラフである。瞬間的なバイオマス／油の生産性は工程の後半であるが培養が定常期に達する前の最高レベルであり、それはＳ曲線の最も急勾配の傾きによって示すことができる。 半連続条件下で増殖させたＯＮＣ−Ｔ１８の全体のバイオマス（■）及び油（▲）の生産性を示すグラフである。図２で示す高い生産性の値は典型的な回分または流加工程で達成可能な値をはるかに超えた。 ＯＮＣ−Ｔ１８における連続発酵法の効果を示すグラフである。連続発酵では、発酵が持続不能となり、バイオマスが低下し、及び排液のグルコース濃度が上昇した。経路の目詰まりのために発酵を中断した。 連続条件下で増殖させたＯＮＣ−Ｔ１８の全体のバイオマス（■）及び油（▲）の生産性を示すグラフである。連続発酵では発酵が持続不能となり、バイオマスと油の生産性が低下した。 半連続発酵及び連続発酵のもとで増殖させたＯＮＣ−Ｔ１８のバイオマス生産性を示すグラフである。半連続発酵は持続性のバイオマス生産性を生じた。 連続及び半連続の発酵条件下で増殖させたＯＮＣ−Ｔ１８の瞬間的なバイオマス生産性（所与の時点で測定された）を示すグラフである。 連続及び半連続の発酵条件下で増殖させたＯＮＣ−Ｔ１８の瞬間的な油の生産性（所与の時点で測定された）を示すグラフである。

半連続工程によって微生物を培養する方法及び油を生産する方法が本明細書で提供される。該方法は、典型的な回分、連続及び流加の工程に比べて全体積のバイオマス及び油の高い生産性を生じる。手短には、初期培養（たとえば、種培養）にて微生物が提供され、流加発酵工程を用いて特定の閾値パラメータ（たとえば、高い細胞濃度及び／または高い油含量）までそれを増殖させる（その時点の培地中の窒素源を制限され、または消耗され、炭素源はゼロまたはほぼゼロであり、バイオマス／油の生産性は所与の微生物についてそれらの最大範囲内である）。特定容量の培養ブロス（たとえば、作業容量の１０％）を回収し、事前に定義された濃度の炭素及び窒素の栄養素を他の必要なミネラル栄養素と同様に含有する同一容量の新鮮な培地を発酵槽に加える。供給培地で使用される炭素と窒素の比は培養物にて高い油含量を得て維持するためである。新しく提供された培地を用いて追加のバイオマス及び油を生じる培養物と共に培養を継続する。閾値パラメータが達成される（たとえば、炭素濃度がゼロまたはほぼゼロに低下する）まで培養物を増殖させ、一部のブロス回収と新鮮な培地供給のサイクルを繰り返す。そのような工程を用いて、高含量の油を含有する高密度のバイオマスを半連続の方法で生産、回収することができ、そして工程の総持続時間は、そのような微生物のどんな回分または流加の方法よりもはるかに長い。高含量の油を伴った高密度のバイオマスを半連続的に回収することは、発酵槽の方向転換時間を減らし、発酵容器の方向転換手順及び滅菌手順の必要性を出来るだけ抑えるので、操作コストを減らし、典型的な回分、連続または流加の発酵法によって達成することができるものをはるかに超える、全体積のバイオマス及び油の非常に高い生産性を生じることができる。

微生物
本明細書に記載されている方法には微生物の集団から脂質を抽出することが含まれる。本明細書に記載されている微生物の集団は、藻類（たとえば、微細藻類）、真菌類（酵母を含む）、細菌または原生生物であることができる。任意で、微生物には、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ目のＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ、さらに具体的には、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属のＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓが挙げられる。任意で、微生物の集団には、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５，３４０，５９４号及び同第５，３４０，７４２号にて記載されたようなＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓが挙げられる。微生物は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，１６３，５１５号にて記載されたようなＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６２４５（すなわち、ＯＮＣ−Ｔ１８）として寄託されているＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ種のようなＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ種であることができる。従って、微生物は、配列番号１に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％以上（たとえば、１００％を含む）同一である１８ｓｒＲＮＡを有することができる。

本明細書に記載されている方法で使用するための微生物は種々の脂質化合物を産生することができる。本明細書で使用されるとき、用語、脂質には、リン脂質、遊離脂肪酸、脂肪酸エステル、トリアシルグリセロール、ステロール及びステロールエステル、カロテノイド、キサントフィル（たとえば、オキシカロテノイド）、炭化水素、及び当業者に既知の他の脂質が含まれる。任意で、脂質化合物には不飽和脂質が含まれる。不飽和脂質には、ポリ不飽和脂質（すなわち、少なくとも２つの不飽和炭素／炭素結合、たとえば、二重結合を含有する脂質）または高度に不飽和の脂質（すなわち、４以上の不飽和炭素／炭素結合を含有する脂質）を挙げることができる。不飽和脂質の例には、オメガ−３及び／またはオメガ−６ポリ不飽和脂肪酸、たとえば、ドコサヘキサエン酸（すなわち、ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（すなわち、ＥＰＡ）、及び他の天然に存在する不飽和、ポリ不飽和及び高度に不飽和の化合物が挙げられる。

工程
本明細書で提供されるのは微生物を培養する方法である。該方法には、第１の炭素対窒素の比を有する培地における１以上の微生物の容器を提供することと；培養物が閾値指標に達するまで微生物を培養することと；容器にて培養物の大半を維持しながら、培養物の一部を回収することと；微生物を伴った培養物の大半を含有する容器に第２の炭素対窒素の比を有する新鮮な培地を加えることとが含まれる。

方法は小規模発酵と同様に大規模発酵にも適用できる。大規模発酵は、本明細書で使用されるとき、上部にできる空間に適当な余地を残して少なくともおよそ１，０００Ｌの体積収容能力（すなわち、作業容量）である発酵槽における発酵を指す。小規模発酵は一般に、およそ１００Ｌ、たとえば、５Ｌ、１０Ｌ、５０Ｌまたは１００Ｌ以下の体積収容能力である発酵槽における発酵を指す。現在の流加発酵工程の実証された利点は、５〜１０Ｌの発酵槽規模での油の生産にそれが利用されてもよく、制限なく任意の容量、たとえば、１００Ｌ、１５０Ｌ、２５０Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ以上に拡張できることである。

全体を通して議論されるように、本明細書で提供されるのは、第１の炭素対窒素の比を含む培地にて１以上の微生物を伴った容器を提供することを含む、微生物を培養する方法である。通常、培地は約５ｇ／Ｌ〜約２００ｇ／Ｌの濃度で炭素源を含み、約１：１〜約４０：１の間のＣ：Ｎ（炭素対窒素）のモル比を有する。提供される方法では、第１の炭素対窒素のモル比は３０：１〜６０：１である。任意で、第１の炭素対窒素のモル比は４０：１〜５０：１である。全体を通してさらに詳細に議論されるように、炭素源には、脂肪酸、脂質、グリセロール、トリグリセロール、炭水化物、ポリオール及びアミノ糖が挙げられるが、これらに限定されない。任意で、炭素源はグルコース、フルクトースまたはグリセロールである。全体を通してさらに詳細に議論されるように、窒素源には、アンモニウム溶液、アンモニウム塩またはアミン塩、ペプトン、トリプトン、酵母抽出物、麦芽抽出物、魚粉、グルタミン酸ナトリウム、ダイズ抽出物、カザミノ酸、及び醸造カスが挙げられるが、これらに限定されない。任意で、窒素源は硫酸アンモニウムである。

提供される方法には、培養物が閾値指標に達するまで微生物を培養することが含まれる。本明細書で使用されるとき、用語、パラメータは微生物培養の進行をモニターする及び制御するのに使用される指標または変数を指す。そのようなパラメータには、光学密度（ＯＤ）、細胞濃度、二酸化炭素の産生速度、ｐＨ、溶存酸素（ＤＯ）、時間、培養培地における栄養素の濃度、代謝副産物の蓄積、温度、バイオマスの生産性、及び油の生産性が挙げられるが、これらに限定されない。当業者によって理解されるように、且つ本明細書で提供される指針に基づいて好適なパラメータ又はパラメータの組み合わせが使用のために意図される。任意で、パラメータは培養培地における栄養素の濃度である。培養培地にて測定することができる好適な栄養素には炭素及び窒素が挙げられるが、これらに限定されない。

提供される方法には、容器にて培養物の大半を維持しながら、培養物の一部を回収することが含まれる。方法では、回収される一部は培養物の約５％〜約２０％を含む。任意で、回収される部分は培養物の約１０％を含む。

提供される方法にはまた、微生物を伴った培養物の大半を含む容器に第２の炭素対窒素の比を含む新鮮な培地を加えることも含まれる。本明細書で使用されるとき、用語、大半は、微生物を含む培養物の５０％以上が容器に残る一方で、培養物の残りの部分が回収されることを意味する。提供される方法では、第２の炭素対窒素の比は通常、第１の炭素対窒素の比よりも高い。第２の炭素対窒素の比は約６０：１〜約９５：１の範囲であることができる。任意で、第２の炭素対窒素の比は約８０：１〜約９０：１である。全体を通してさらに詳細に議論されるように、炭素源には、脂肪酸、脂質、グリセロール、トリグリセロール、炭水化物、ポリオール及びアミノ糖が挙げられるが、これらに限定されない。任意で、炭素源はグルコース、フルクトースまたはグリセロールである。全体を通してさらに詳細に議論されるように、窒素源には、アンモニウム溶液、アンモニウム塩またはアミン塩、ペプトン、トリプトン、酵母抽出物、麦芽抽出物、魚粉、グルタミン酸ナトリウム、ダイズ抽出物、カザミノ酸、及び醸造カスが挙げられるが、これらに限定されない。任意で、窒素源は硫酸アンモニウムである。

提供される方法には任意で、（ｉ）培養物が閾値指標に達するまで微生物を培養する工程と、（ｉｉ）容器にて培養物の大半を維持しながら、培養物の一部を回収する工程と、（ｉｉｉ）微生物を含む培養物の大半を含む容器に第２の炭素対窒素の比を持つ新鮮な培地を加える工程とを繰り返すことが含まれる。このように、提供される方法は、培養物が高レベルのバイオマス及び／または油の生産性を維持する長い時間にわたって培養物が維持されるのを有利に可能にする。任意で培養物は、数時間、数日、数週間または数カ月の期間維持される。任意で培養物は少なくとも１５０〜５００時間維持される。たとえば、培養物は少なくとも２５０時間維持することができる。任意で培養物は１、２、３、４または５週間維持される。

提供される方法は、高レベルのバイオマス生産性で培養物が維持されるのを可能にする。本明細書で使用されるとき、用語「高レベルのバイオマス生産性」は所与の微生物について平均のバイオマス生産性より高いレベルを指す。通常、平均のバイオマス生産性は４０ｇ／Ｌ−ｄ以下、すなわち、０ｇ／Ｌ−ｄ〜約４０ｇ／Ｌ−ｄの範囲にある傾向があるが、微生物に応じて変化してもよい。任意でバイオマス生産性は６０ｇ／Ｌ−ｄ〜１８０ｇ／Ｌ−ｄを含む。任意でバイオマス生産性は８０ｇ／Ｌ−ｄ〜１３０ｇ／Ｌ−ｄを含む。任意でバイオマス生産性は９０ｇ／Ｌ−ｄ〜１００ｇ／Ｌ−ｄを含む。本明細書で使用されるとき、用語「高い」

提供される方法は、高レベルの油生産性で培養物が維持されるのも可能にする。本明細書で使用されるとき、用語「高レベルの油生産性」は所与の微生物について平均の油生産性より高いレベルを指す。通常、平均の油生産性は２５ｇ／Ｌ−ｄ以下、すなわち、０ｇ／Ｌ−ｄ〜約２５ｇ／Ｌ−ｄの範囲にある傾向があるが、微生物に応じて変化してもよい。任意で油生産性は３５ｇ／Ｌ−ｄ〜１３０ｇ／Ｌ−ｄを含む。任意で油生産性は６０ｇ／Ｌ−ｄ〜９０ｇ／Ｌ−ｄを含む。任意で油生産性は７０ｇ／Ｌ−ｄ〜８０ｇ／Ｌ−ｄを含む。従って、たとえば、微生物の培養物は６０〜８５％の油を含むバイオマスを含む。任意で微生物の培養物は６５〜７５％の油を含むバイオマスを含む。

用語、高い、さらに高い、増加する、上昇するまたは上昇は、対照を上回る増加を指す。用語、低い、さらに低い、低下するまたは低下は対照を下回る減少を指す。例として、対照のレベルは回分、流加または連続の条件下で増殖させたバイオマス及び／または油の生産性のレベルである。提供される方法は、同一微生物が異なる工程、たとえば、回分、流加または連続の工程を用いて微生物を増殖させる場合のレベルより高いバイオマス及び／または油の生産性のレベルを提供する。バイオマス生産性のレベルは、たとえば、工程の総時間に含まれる２４時間の方向転換時間を想定することによって決定することができ、工程の所与の時点でのバイオマス全体（Ｘ）の生産性は、Ｘ（グラム）／培養容量（リットル）／時間（時間）×２４（時間／日）として算出することができ、最終的な単位はｇ／Ｌ−日である。所与の時点での油全体の生産性は同様に、油（グラム）／培養容量（リットル）／時間（時間）×２４（時間／日）として算出することができる。

発酵
提供される方法は、当該技術で既知の方法に従って微生物を培養する追加の工程を含む、またはそれと併せて使用することができる。たとえば、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ、たとえば、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．は、方法の各工程またはその中で使用される組成物についてその全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開２００９／０１１７１９４または２０１２／０２４４５８４にて記載された方法に従って培養することができる。微生物は増殖培地（「培養培地」としても知られる）で増殖させる。本明細書に記載されている微生物を培養することにおける使用に種々の培地のいずれもが好適である。任意で、培地は微生物のために炭素源及び窒素源を含む種々の栄養成分を供給する。

Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ培養物のための培地は種々の炭素源のいずれかを含むことができる。炭素源の例には、脂肪酸、脂質、グリセロール、トリグリセロール、炭水化物、ポリオール、アミノ糖、及び任意の種類のバイオマスまたは排水流が挙げられる。脂肪酸には、たとえば、オレイン酸が挙げられる。炭水化物には、グルコース、セルロース、ヘミセルロース、フルクトース、デキストロース、キシロース、ラクツロース、ガラクトース、マルトトリオース、マルトース、ラクトース、グリコーゲン、ゼラチン、デンプン（トウモロコシまたはコムギ）、酢酸塩、ｍ−イノシトール（たとえば、コーンスティープリカーに由来する）、ガラクツロン酸（たとえば、ペクチンに由来する）、Ｌ−フコース（たとえば、ガラクトースに由来する）、ゲンチオビオース、グルコサミン、α−Ｄ−グルコース−１−リン酸（たとえば、グルコースに由来する）、セルビオース、デキストリン、α−シクロデキストリン（たとえば、デンプンに由来する）、及びスクロース（たとえば、糖蜜に由来する）が挙げられるが、これらに限定されない。ポリオールには、マルチトール、エリスリトール及びアドニトールが挙げられるが、これらに限定されない。アミノ糖には、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、及びＮ−アセチル−β−Ｄ−マンノサミンが挙げられるが、これらに限定されない。任意で、炭素源はグルコースである。上記で述べたように、提供される方法では、炭素源は高濃度で、たとえば、少なくとも２００ｇ／Ｌで提供される。

任意で、本明細書で提供される微生物は、バイオマス及び／または対象とする化合物の生産（たとえば、油または総脂肪酸（ＴＦＡ）含量）を高める条件下で培養される。Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄは、たとえば、通常、生理食塩水培地で培養される。任意で、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄは、約０．５ｇ／Ｌ〜約５０．０ｇ／Ｌの塩濃度を有する培地で培養することができる。任意で、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄは、約０．５ｇ／Ｌ〜約３５．０ｇ／Ｌ（たとえば、約１８ｇ／Ｌ〜約３５ｇ／Ｌ）の塩濃度を有する培地で培養される。任意で、本明細書に記載されているＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄは低塩条件で増殖することができる。たとえば、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄは約０．５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ（たとえば、約０．５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ）の塩濃度を有する培地で培養することができる。培養培地は任意でＮａＣｌを含む。任意で、培地は天然のまたは人工の海塩及び／または人工の海水を含む。

培養培地はナトリウムの供給源として塩化物非含有のナトリウム塩を含むことができる。本方法に従って使用するのに好適な非塩化物ナトリウム塩の例には、ソーダ灰（炭酸ナトリウムと酸化ナトリウムの混合物）、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、その内容全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５，３４０，７４２号及び同第６，６０７，９００号を参照のこと。培養培地における総ナトリウムの約１００％、７５％、５０％または２５％未満が塩化ナトリウムによって供給されるように、総ナトリウムのかなりの部分を、たとえば、非塩化物塩によって供給することができる。

任意で、培養培地は約３ｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌまたは１２０ｍｇ／Ｌ未満の塩化物濃度を有する。たとえば、提供される方法における使用のための培養培地は約６０ｍｇ／Ｌ〜１２０ｍｇ／Ｌの間及びそれを含む塩化物濃度を有することができる。

Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄの培養物のための培地は種々の任意の窒素源を含むことができる。例となる窒素源には、アンモニウム溶液（たとえば、Ｈ_２Ｏ中のＮＨ_４）、アンモニウム塩またはアミン塩（たとえば、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、（ＮＨ_４）_３ＰＯ_４、ＮＨ_４ＮＯ_３、ＮＨ_４ＯＯＣＨ_２ＣＨ_３（ＮＨ_４Ａｃ））、ペプトン、トリプトン、酵母抽出物、麦芽抽出物、魚粉、グルタミン酸ナトリウム、ダイズ抽出物、カザミノ酸、及び醸造カスが挙げられる。好適な培地における窒素源の濃度は通常、約１ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間の範囲であり、且つそれを含む。

培地は任意で、たとえば、リン酸カリウムまたはリン酸ナトリウムのようなリン酸塩を含む。培地における無機塩類及び微量栄養素には、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、オルソバナジウム酸ナトリウム、クロム酸カリウム、モリブデン酸ナトリウム、亜セレン酸、硫酸ニッケル、硫酸銅、硫酸亜鉛、塩化コバルト、塩化鉄、塩化マンガン、塩化カルシウム及びＥＤＴＡを挙げることができる。たとえば、ピリドキシン塩酸塩、チアミン塩酸塩、パントテン酸カルシウム、ｐ−アミノ安息香酸、リボフラビン、ニコチン酸、ビオチン、葉酸、及びビタミンＢ１２のようなビタミン類を含めることができる。

培地のｐＨは酸または塩基を用いて３．０〜１０．０の間に、且つ３．０及び１０．０を含んで調整することができる。任意で、培地を上記で定義されたような低いｐＨに調整する。培地は滅菌することができる。

一般に、微生物の培養に使用される培地は液体培地である。しかしながら、微生物の培養に使用される培地は固体培地であることができる。本明細書で議論されているような炭素源及び窒素源に加えて、固体培地は、構造的な支えを提供する、及び／または培地を固体形態にする１以上の成分（たとえば、寒天またはアガロース）を含有することができる。

一定時間にわたって細胞を培養することができる。任意で１日〜６０日のどこかまで細胞を培養することができる。任意で培養物は数時間、数日、数週間または数カ月維持される。任意で、培養物を１５０〜５００時間維持する。任意で、培養物を少なくとも２５０時間維持する。任意で、培養物を１、２、３、４、または５週間維持する。任意で培養は、約４℃〜約３０℃、たとえば、約１８℃〜約２８℃の温度にて実施される。培養には、通気振盪培養、振盪培養、静止培養、回分培養、半連続培養、連続培養、回転回分培養、波動培養等を挙げることができる。培養は、従来の撹拌発酵槽、発泡カラム発酵槽（回分または連続の培養）、気泡ポンプ発酵槽、波動発酵槽等を用いて行うことができる。

培養物は振盪を含む種々の方法の１以上によって通気され得る。任意で、振盪は約１００ｒｐｍから約１０００ｒｐｍに、たとえば、約３５０ｒｐｍから約６００ｒｐｍまたは約１００ｒｐｍから約４５０ｒｐｍに及ぶ。任意で培養物は、バイオマス産生相の間と脂質産生相の間で異なる振盪速度を用いて通気される。代わりにまたはさらに、振盪速度は培養容器の種類（たとえば、フラスコの形状またはサイズ）に応じて変化することができる。

多量の望ましい化合物を得るために１以上の培養条件の転換が関与する方法に従って細胞を培養することによって望ましい脂質の産生を向上させることができる。任意で、細胞は先ず、バイオマスを最大化する条件下で培養され、その後、１以上の培養条件の脂質生産性に有利に働く条件への転換が続く。転換される条件には、酸素濃度、Ｃ：Ｎ比、温度、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。任意で、二段階培養が行われ、その際、第１の段階はバイオマス産生に有利に働き（たとえば、高い酸素（一般的にまたは第２の段階に比べて）、低いＣ：Ｎ比、及び常温の条件を用いて）、脂質産生に有利に働く第２の段階（たとえば、第１の段階に比べて酸素を低下させ、Ｃ：Ｎ比を高め、温度を下げる）がその後に続く。前に記載されている方法とは対照的に、提供される方法は、高レベルの油または脂質の産生の条件下で培養物を長時間維持するのを可能にする。

殺菌
任意で、得られたバイオマスを殺菌してバイオマスに存在する望ましくない物質を不活化する。たとえば、バイオマスを殺菌して化合物を分解する物質を不活化することができる。バイオマスは、発酵培地に存在することができ、または殺菌工程のために発酵培地から単離することができる。殺菌工程は、バイオマス及び／または発酵培地を高温に加熱することによって行うことができる。たとえば、バイオマス及び／または発酵培地を約５０℃〜約９５℃（たとえば、約５５℃〜約９０℃または約６５℃〜約８０℃）の温度に加熱することができる。任意で、バイオマス及び／または発酵培地を約３０分間〜約１２０分間（たとえば、約４５分間〜約９０分間または約５５分間〜約７５分間）加熱することができる。殺菌は、当業者に既知のような好適な加熱手段を用いて、たとえば、直接蒸気圧入法によって行うことができる。

任意で、殺菌工程を実施しない。言い方を変えれば、本明細書で教示される方法は任意で殺菌工程を欠く。

回収及び洗浄
任意で、当業者に現在知られるものを含む種々の方法に従ってバイオマスを回収することができる。たとえば、任意で細胞バイオマスの回収を加速するための沈降剤（たとえば、リン酸ナトリウムまたは塩化カルシウム）と共に、遠心分離（たとえば、固形物−排出遠心分離）または濾過（たとえば、クロスフロー濾過）を用いて発酵培地からバイオマスを回収することができる。

任意で、バイオマスを水で洗浄する。任意でバイオマスを約２０％固形物まで濃縮することができる。たとえば、バイオマスを約５％〜約２０％固形物、約７．５％〜約１５％固形物、または約固形物〜約２０％固形物、または引用される範囲内での任意の比率に濃縮することができる。任意で、バイオマスを約２０％固形物以下、約１９％固形物以下、約１８％固形物以下、約１７％固形物以下、約１６％固形物以下、約１５％固形物以下、約１４％固形物以下、約１３％固形物以下、約１２％固形物以下、約１１％固形物以下、約１０％固形物以下、約９％固形物以下、約８％固形物以下、約７％固形物以下、約６％固形物以下、約５％固形物以下、約４％固形物以下、約３％固形物以下、約２％固形物以下、または約１％固形物以下に濃縮することができる。

単離及び抽出
提供される方法には任意で、当業者に現在知られるものを含む種々の方法を用いてバイオマスまたは微生物に由来するポリ不飽和脂肪酸を単離することが含まれる。たとえば、ポリ不飽和脂肪酸を単離する方法は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，１６３，５１５号に記載されている。任意で、ポリ不飽和脂肪酸の単離に先立って培地は滅菌されない。任意で滅菌は温度の上昇を含む。任意で、微生物によって産生され、提供される方法から単離されるポリ不飽和脂肪酸は中鎖脂肪酸である。任意で、１以上のポリ不飽和脂肪酸は、α−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、γ−リノレン酸、リノール酸、リノレン酸、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。

生成物
本明細書に記載されている方法に従って産生されるポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）及び他の脂質を含む油はその生物学的、栄養学的または化学的特性を活用する種々の応用のいずれかで利用することができる。従って、提供される方法には任意で、回収された培養物から油を単離することが含まれる。任意で、油を用いて、燃料、たとえば、バイオ燃料を製造する。任意で、油は、医薬品、食品、サプリメント、動物飼料添加剤、化粧品等で使用することができる。本明細書に記載されている方法に従って産生される脂質は他の化合物の製造における中間体としても使用することができる。

例として、提供される方法を用いて培養される微生物によって産生される油は脂肪酸を含むことができる。任意で、脂肪酸は、α−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、γ−リノレン酸、リノール酸、リノレン酸、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。任意で、油はトリグリセリドを含む。任意で、油は、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１（ｎ−７））、シス−バクセン酸（Ｃ１８：１（ｎ−７））、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５（ｎ−６））、ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６（ｎ−３））、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される脂肪酸を含む。任意で、単離された脂肪酸におけるドコサヘキサエン酸の濃度は脂肪酸総濃度の２０％以下である。

任意で、本明細書に記載されている方法に従って産生される脂質は最終製品（たとえば、食品または飼料補完剤、特殊調整粉乳、医薬品、燃料等）に組み込むことができる。脂質が組み込まれる好適な食品または飼料補完剤には、たとえば、乳、水、スポーツ飲料、エネルギー飲料、茶及びジュースのような飲料；たとえば、キャンディ、ゼリー及びビスケットのような菓子；たとえば、乳製品のような脂肪含有の飲食物；粥（またはポリッジ）のような加工された食品；特殊調整粉乳；朝食シリアル等が挙げられる。任意で、１以上の産生された脂質を、たとえば、ビタミン剤または総合ビタミン剤のような栄養補助食品に組み込むことができる。任意で、本明細書に記載されている方法に従って産生される脂質は、食品または食事の成分（たとえば、食品サプリメント）に直接組み込むことができる。

本明細書に記載されている方法によって産生される脂質を組み込むことができる飼料の例には、たとえば、キャットフード、ドッグフード等のようなペットフード、鑑賞魚、飼育魚または甲殻類等用の飼料、飼育場・養殖場の動物（家畜及び水産養殖で育てられた魚類または甲殻類を含む）用の飼料が挙げられる。本明細書に記載されている方法に従って産生される脂質を組み込むことができる食品または飼料の材料は好ましくは、意図されるレシピエントである生物にとって口当たりが良い。この食品または飼料の材料は食品材料について現在知られる物性（たとえば、固体、液体、軟らかい）を有することができる。

任意で、１以上の産生された化合物（たとえば、ＰＵＦＡ）を栄養補助食品または医薬品に組み込むことができる。そのような栄養補助食品または医薬品の例には、種々の型の錠剤、カプセル剤、飲料剤等が挙げられる。任意で、栄養補助食品または医薬品は局所塗布に好適である。剤形には、たとえば、カプセル剤、油剤、顆粒、細粒剤、粉剤、錠剤、丸薬、トローチ剤等を挙げることができる。

本明細書に記載されている方法に従って産生される油または脂質は、種々の他の作用剤との組み合わせで本明細書に記載されているような製品に組み込むことができる。たとえば、そのような化合物は、１以上の結合剤または充填剤、キレート剤、色素、塩、界面活性剤、保湿剤、粘度調節剤、増粘剤、皮膚軟化剤、香料、保存剤等、またはそれらの組み合わせと組み合わせることができる。

開示されるのは、開示される方法及び組成物の製品で使用することができる、それと併せて使用することができる、それを調製するのに使用することができる、または開示される方法及び組成物の製品である物質、組成物及び成分である。これらの及び他の物質が本明細書で開示され、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等が開される場合、これらの化合物のそれぞれ種々の個々の及び集合的な組み合わせ並びに並べ替えの具体的な参照が明白に開示されなくてもよい一方で、本明細書ではそれぞれが具体的に熟考され、記載されることが理解される。たとえば、方法が開示され、議論され、方法を含む多数の分子に対して為され得る多数の修飾が議論されるのであれば、方法のそれぞれの及びあらゆる組み合わせ及び並べ替え、ならびに考えられる修飾が、特に反対に指示されない限り、具体的に熟考される。同様に、これらのサブセットまたは組み合わせも具体的に熟考され、開示される。この概念は、開示されている組成物を用いる方法における工程を含むが、これらに限定されない本開示の態様すべてに適用される。従って、実施することができる種々の追加の工程があるならば、開示されている方法の特定の方法工程または方法工程の組み合わせと共にこれら追加の工程のそれぞれを実施することができ、且つ、各そのような組み合わせまたは組み合わせのサブセットが具体的に熟考され、開示されたと見なされるべきであることが理解される。

全体を通して使用されるとき、約所与の値（たとえば、約１〜約１０）に対する範囲（たとえば、１〜１０）及び参照は引用された値（単数）または値（複数）（たとえば、１及び／または１０）を含む。

本明細書で引用されている出版物及びそれらが引用される物質は、その全体が参照によって本明細書に具体的に組み入れられる。

以下の実施例は、本明細書に記載されている方法及び組成物の特定の態様をさらに説明するように意図されるのであって、クレームの範囲を限定するように意図されるものではない。

バイオマス及び油の産生のための半連続発酵
微生物による油の産生の分野では、従属栄養の暗所発酵は、工程の効率性と生成物の収率という点で光合成独立栄養の微生物培養よりも一般に優れていると見なされている。しかしながら、それは高い固定資本費（容器に基づく発酵プラントを建設するコストは開放池と管路の型の培養系の資本コストよりも一般にはるかに高い）によって妨げられることが多い。本明細書に記載されているような半連続の生産工程を用いて、低い操作コスト（生産発酵槽容器方向転換手順と容器滅菌手順を最小化する）によって高い全体的な生産性を達成することができる。このことは、固定資本投資（発酵槽及び関連する資本設備）のさらに良好な利用及びさらに高い年間生産能を意味する。

微生物の流加培養の間、培養細胞／油の濃度は典型的な微生物のＳ字型増殖曲線（図１）に従い、瞬間的なバイオマス／油の生産性は工程の後半、しかし、培養物が定常期に達する前に最高レベルにあり、それはＳ曲線の最も急勾配の傾きによって示すことができる（図１）。しかしながら、培養物が高い瞬間的な生産性の相を通過した直後に典型的な流加培養を止め、高い瞬間的な生産性の相が達成され得る前に培養物が低い瞬間的な生産性の相を経る工程時間を多く費やしたので、全体的な生産性は非常に高いわけではない。半連続工程は、培養物の能力を利用して、新しく均衡の取れた培地を供給して培養物が高い比率でバイオマス及び油を繰り返し生成するのを可能にする一方で、高い濃度で特定容量のブロスを繰り返し回収することによって高い瞬間的な生産性の相の間にバイオマスを増殖させ、油を合成する。

提供される半連続工程は培養物のピーク生産性のレベルで増殖及び油の産生を延長する。工程総時間に含められる２４時間の方向転換時間を想定して、工程の所与の時点でのバイオマス全体（Ｘ）の生産性は、Ｘ（グラム）／培養容量（リットル）／期間（時間）×２４（時間／日）として算出することができ、最終単位はｇ／Ｌ−日である。所与の時点での油全体の生産性は、油（グラム）／培養容量（リットル）／期間（時間）×２４（時間／日）として同様に算出することができる。バイオマスと油の生産性の全体的なプロットで見られるように、典型的な流加工程の終了時（６７時間での図面内線分によって示される）、バイオマス及び油の生産性はそれぞれ４２ｇ／Ｌ−ｄ及び２８ｇ／Ｌ−ｄにすぎない（図２）。提供される半連続方式のもとで発酵を４５３時間（１９日）に延長することによって、バイオマス及び油の全体的な生産性は徐々に増加し、それぞれ９６ｇ／Ｌ−ｄ及び７２ｇ／Ｌ−ｄのプラトーに達した（図２）。これらの高い生産性の値は、典型的な回分工程または流加工程のもとで達成できる値をはるかに超えた。

手短には、ＯＮＣ−Ｔ１８細胞を先ず流加発酵工程を用いて高い細胞濃度及び高い油含量に増殖させ、その時点で事前に定義された窒素源は培地で使い尽されており、炭素源をゼロ近くまたはゼロのレベルに制御し、容積測定上の瞬間的なバイオマス／油の生産性はその最大領域の範囲内である。特定容量の培養ブロスを回収し（１０％）、他の必要なミネラル栄養素と同様に事前に定義された濃度の炭素及び窒素の栄養素を含有する同一容量の培地を発酵槽に加え、回収したブロスに取って代えた。供給培地における炭素及び窒素は、培養物にて高い油含量を得て、維持するために特定の比であることも必要である。図２について、８８：１（モル比）の炭素（Ｃ）対窒素（Ｎ）の比に相当する供給培地にてそれぞれ３００ｇ／Ｌ及び７．５ｇ／Ｌのグルコース及び硫酸アンモニウム（（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）の濃度を用いた。新しく提供された培地を用いてもう少し多くのバイオマス及び油を生じる培養物と共に培養を継続する。いったん炭素源が枯渇したら、一部のブロス回収と新鮮培地供給のサイクルを繰り返した。そのような工程を用いて、高含量の油を含有する高密度のバイオマスを半連続法で生産し、回収することができ、工程の総持続時間は、そのような微生物の培養の回分法または流加法よりもはるかに長くすることができる。

提供される半連続法が連続発酵法よりも良好であるかどうかを判定するために、８８：１のＣ：Ｎ比を用いて連続培養条件下で細胞を増殖させた。結果を図３〜７にて示す。具体的には、図３及び図４は、連続発酵が発酵を持続できなくなり、バイオマスの減少及び排液にグルコース濃度の上昇を生じたことを示す。経路の目詰まりのために発酵を停止した。図５、６及び７は、半連続発酵条件下と連続発酵条件下で増殖させたＯＮＣ−Ｔ１８のバイオマスと油の生産性の比較を示す。半連続発酵は、バイオマス及び油の高い生産性を生じ、高い生産性の条件下で培養物がさらに長い時間維持されるのを可能にした。実際、この実験では、連続発酵法は半連続発酵よりもおよそ１６０時間短い持続となった。

Claims (33)

1. Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ微生物の培養方法であって、
   （ａ）３０：１〜６０：１の第１の炭素対窒素のモル比を含む培地にて１以上のＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ微生物を含む容器を提供する工程と、
   （ｂ）培養物が閾値指標に達するまで前記Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ微生物を培養する工程と、
   （ｃ）前記容器における前記培養物の大半を維持しながら、前記培養物の一部を回収する工程であって、回収された前記一部が前記培養物の５％〜２０％を含む工程と、
   （ｄ）前記微生物を含む前記培養物の大半を含む前記容器に、前記第１の炭素対窒素のモル比よりも高い、６０：１〜９５：１である第２の炭素対窒素のモル比を含む新鮮な培地を、前記培養物の前記回収された一部と同一容量で加える工程とを含み、
   前記閾値指標が、光学密度（ＯＤ）、細胞濃度、培養培地における栄養素の濃度、バイオマス生産性、油生産性、またはそれらの組み合わせから成る群から選択される、前記培養方法。
2. 前記第１の炭素対窒素のモル比が４０：１〜５０：１である請求項１に記載の方法。
3. 前記第２の炭素対窒素のモル比が７０：１〜９５：１である請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記第２の炭素対窒素のモル比が８０：１〜９０：１である請求項１又は２に記載の方法。
5. 回収された前記一部が前記培養物容量の５〜２０％を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
6. 回収された前記一部が前記培養物容量の１０％を含む請求項５に記載の方法。
7. 前記栄養素が炭素または窒素である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. （ｉ）前記培養物が閾値指標に達するまで前記微生物を培養する工程と、（ｉｉ）前記容器にて前記培養物の大半を維持しながら、前記培養物の一部を回収する工程と、（ｉｉｉ）前記微生物を含む前記培養物の大半を含む前記容器に前記第２の炭素対窒素の比を含む新鮮な培地を加える工程とを繰り返すことを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記炭素が、脂肪酸、脂質、グリセロール、トリグリセロール、炭水化物、ポリオール及びアミノ糖から成る群から選択される炭素源である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記炭素源がグルコース、フルクトースまたはグリセロールである請求項９に記載の方法。
11. 前記窒素が、アンモニウム溶液、アンモニウム塩またはアミン塩、ペプトン、トリプトン、酵母抽出物、麦芽抽出物、魚粉、グルタミン酸ナトリウム、ダイズ抽出物、カザミノ酸、及び醸造カスから成る群から選択される窒素源である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記窒素源が硫酸アンモニウムである請求項１１に記載の方法。
13. 前記回収された培養物から油を単離することをさらに含む請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記油が、α−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、γ−リノレン酸、リノール酸、リノレン酸、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される脂肪酸を含む請求項１３に記載の方法。
15. 前記油がトリグリセリドを含む請求項１３に記載の方法。
16. 前記油が、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１（ｎ−７））、シス−バクセン酸（Ｃ１８：１（ｎ−７））、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５（ｎ−６））、ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６（ｎ−３））、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される脂肪酸を含む請求項１３に記載の方法。
17. 前記単離された油におけるドコサヘキサエン酸の濃度が、前記単離された油中の脂肪酸総濃度の２０％以下である請求項１３に記載の方法。
18. 前記培養物が高レベルのバイオマス生産性で維持される請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記バイオマス生産性が６０ｇ／Ｌ−ｄ〜１８０ｇ／Ｌ−ｄを含む請求項１８に記載の方法。
20. 前記バイオマス生産性が８０ｇ／Ｌ−ｄ〜１３０ｇ／Ｌ−ｄを含む請求項１８に記載の方法。
21. 前記バイオマス生産性が９０ｇ／Ｌ−ｄ〜１００ｇ／Ｌ−ｄを含む請求項１８に記載の方法。
22. 油生産性が３５ｇ／Ｌ−ｄ〜１３０ｇ／Ｌ−ｄを含む請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 油生産性が６０ｇ／Ｌ−ｄ〜９０ｇ／Ｌ−ｄを含む請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
24. 油生産性が７０ｇ／Ｌ−ｄ〜８０ｇ／Ｌ−ｄを含む請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
25. 微生物の前記培養物が、６０％〜８５％の油を含むバイオマスを含む請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 微生物の前記培養物が、６５％〜７５％の油を含むバイオマスを含む請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記培養物が長時間にわたって維持される請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
28. 前記培養物が、数時間、数日、数週間または数カ月の期間維持される請求項２７に記載の方法。
29. 前記培養物が少なくとも１５０〜５００時間維持される請求項２７に記載の方法。
30. 前記培養物が少なくとも２５０時間維持される請求項２７に記載の方法。
31. 前記培養物が、１、２、３、４、または５週間維持される請求項２７に記載の方法。
32. 前記Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ微生物がＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属のものである請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
33. 前記Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ微生物が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６２４５として寄託されたＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ種である請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。