CN110241033B - 一株胶红酵母js2018及其在发酵糖蜜生产虾青素中的应用 - Google Patents

一株胶红酵母js2018及其在发酵糖蜜生产虾青素中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株胶红酵母JS2018及其在发酵糖蜜生产虾青素中的应用。所述胶红酵母JS2018于2019年5月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.17871。本发明从土壤中筛选得到一株高产虾青素的胶红酵母JS2018，并对其进行了形态学、代谢学和遗传学方面的鉴定，鉴定为胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)。该菌株能在含有糖蜜、硝酸钠、硫酸亚铁、磷酸氢二钠的发酵体系中高产虾青素，并优化了发酵工艺，最终生物量可达51.5g/L，其虾青素含量为4％～6％干菌体，可用于工业化生产虾青素，有很好的应用前景。

Description

一株胶红酵母JS2018及其在发酵糖蜜生产虾青素中的应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵工程技术领域，具体地，涉及一株胶红酵母JS2018及其在发酵糖蜜生产虾青素中的应用。
背景技术
虾青素是一种非维生素A源的酮式类胡萝卜素。动物试验表明虾青素有抗肿瘤、抗紫外辐射、增强免疫功能的作用，是水生动物的强抗氧化剂和脂质过氧化的抑制剂；对眼科疾病、心血管疾病和类风湿性关节炎也有缓解作用。相关研究发现，虾青素有助于消除因时差而产生的身体不适感，其效果比常用的褪黑激素还要明显。总的来说，虾青素在以下几个方面具有应用价值：①水产和禽畜养殖的良好着色剂，同时提高养殖品成活率、增重率和饲料转化率；②食品添加剂(着色剂和抗氧化剂)；③保健品和药物(增强免疫功能和防止脂质过氧化等)；④化妆品(抗紫外辐射和抗氧化等)。
目前市场上虾青素大部分通过化学合成，也有少量天然虾青素。化学合成虾青素主要用途是作为鱼类饲料添加剂，其工业化生产由瑞士罗氏公司，即现在的帝斯曼公司控制，商品名为加丽素粉红(Carophyllpink)，虾青素含量为5～10％，但到目前为止美国食品卫生管理局(FDA)不准任何化学合成新产品进入保健食品市场。部分动植物中含有天然虾青素，尽管提取来源广泛，但含量极低，如在虾、蟹的废壳中的含量只有约80μg/g。相关研究发现，一些微生物菌株能够产生虾青素，如雨生红球藻(Haematococcus Pluvialis)和红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)。但是自然界中能够产生虾青素的微生物菌株并不多；除此之外，其中有些菌生长较慢且虾青素含量低，无工业应用前景。虽然目前也有部分微生物已用于天然虾青素的生产，但现有发酵技术获得的生物量和虾青素产量有限，生产成本居高不下。因此，有必要筛选出一株高产虾青素的微生物新菌株，并研发其发酵工艺，用于工业发酵生产虾青素。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一株胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)JS2018。
本发明的另一目的在于提供上述胶红酵母JS2018在发酵糖蜜生产虾青素中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种利用上述胶红酵母JS2018发酵糖蜜生产虾青素的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明从华南农业大学苗圃土壤中筛选得到一株高产虾青素的胶红酵母JS2018，并对其进行了形态学、代谢学和遗传学方面的鉴定，26S rDNA鉴定结果验证其为胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)。该菌株能在含有糖蜜、硝酸钠、硫酸亚铁、磷酸氢二钠的发酵体系中高产虾青素，培养过程中根据生长状况补加碳源，并调节通风量及转速以控制溶氧，通过优化其发酵工艺，最终生物量可达51.5g/L，其虾青素含量为4％～6％干菌体，可用于工业化生产虾青素，有很好的应用前景。
因此，本发明请求保护一株胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)JS2018，于2019年5月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.17871。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明所述胶红酵母JS2018具有如下形态和生理、生化特性：
(1)形态学特征
胶红酵母JS2018在显微镜下个体呈圆形或椭圆形，出芽生殖；在PDA培养基上，菌落圆形，粉橙色，隆起，边缘整齐，表面光滑，易于挑起。
(2)生理生化特性
胶红酵母JS2018适宜生长温度为22～35℃。胶红酵母JS2018可利用葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖、棉子糖、木糖、松三糖、核糖、甘油、海藻糖、阿拉糖作为碳源进行发酵。
所述胶红酵母JS2018的26S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还请求保护所述胶红酵母JS2018在发酵糖蜜生产虾青素中的应用。
本发明通过研究发现传统的间歇式培养，如果初始碳源添加量不够高，则获得的生物量和虾青素产量均较低；但如果初始碳源添加量太高，则会造成细胞在前期大量生长，溶解氧不足，通气搅拌设备无法适应的弊病，虾青素合成受到很明显的抑制作用，从而使最终的生物量和虾青素产量提高不明显，原料利用率很低。本发明通过对残糖浓度进行监测，采用中间补料的方法对胶红酵母进行培养，避免一次性投料过多的同时又能保证较高的总投入量，另根据菌体生长状况调节转速及通风量，以保证全程溶氧供给充足，可以明显提高生物量和虾青素产量。
因此，本发明请求保护一种利用上述胶红酵母JS2018发酵糖蜜生产虾青素的方法，包括如下步骤：
S1.采用大容量发酵罐，将胶红酵母JS2018接种于发酵培养基中培养，所述发酵培养基含有总糖量为30g/L的糖蜜、10g/L硝酸钠、0.1g/L FeSO4·7H2O、4.5g/L Na2HPO4·12H2O；
S2.当发酵培养基中残糖浓度低于10g/L时，补加糖蜜继续培养；
整个发酵周期控制温度26～32℃，pH4.5～7.0，转速30～100r/min，通气量50～120m3/h，溶氧40％～55％，发酵48～72h后分离提纯获得虾青素。
优选地，步骤S1所述胶红酵母JS2018的接种量为3％～8％(v/v)。
更优选地，步骤S1所述胶红酵母JS2018的接种量为6％(v/v)。
优选地，所述整个发酵周期控制温度30℃，pH5.0。
优选地，所述整个发酵周期控制转速60～80r/min，通气量80～100m3/h，溶氧45％。
优选地，所述大容量是指发酵罐的体积为1000～5000L。
更优选地，所述大容量是指发酵罐的体积为5000L。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明从土壤中筛选得到一株高产虾青素的胶红酵母JS2018，并对其进行了形态学、代谢学和遗传学方面的鉴定，鉴定为胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)。该菌株能在含有糖蜜、硝酸钠、硫酸亚铁、磷酸氢二钠的发酵体系中高产虾青素，培养过程中根据生长状况补加碳源，并调节通风量及转速以控制溶氧，通过优化其发酵工艺，最终生物量可达51.5g/L，其虾青素含量为4％～6％干菌体，可用于工业化生产虾青素，有很好的应用前景。
附图说明
图1为PCR扩增结果。
图2为胶红酵母JS2018的形态学特征。其中，a为胶红酵母JS2018在PDA培养基上的生长情况，b为胶红酵母JS2018在显微镜下的形态。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1高产虾青素的胶红酵母的筛选和鉴定
从华南农业大学苗圃土壤中分离到一株新菌株，编号为JS2018。
采用26S rDNA序列分析法等技术对该菌株进行分类学鉴定，鉴定为胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)，如图1和表1所示。
表1基因序列比对结果
Figure BDA0002110728040000041
所述胶红酵母JS2018具有如下形态和生理、生化特性：
(1)形态学特征
胶红酵母JS2018在显微镜下个体呈圆形或椭圆形，出芽生殖；在PDA培养基上，菌落圆形，粉橙色，隆起，边缘整齐，表面光滑，易于挑起(如图2所示)。
(2)生理生化特性
胶红酵母JS2018适宜生长温度为22～35℃。该菌株可利用葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖、棉子糖、木糖、松三糖、核糖、甘油、海藻糖、阿拉糖作为碳源进行发酵。如表2所示。
表2菌株JS2018生理生化鉴定结果(碳源同化)
碳源 结果 碳源 结果
葡萄糖 + 果糖 +
乳糖 _ 麦芽糖 +
半乳糖 + 蔗糖 +
乙酰胺 _ 鼠李糖 _
甘露醇 _ 棉子糖 +
纤二糖 _ 蜜二糖 _
山梨醇 _ 木糖 +
松三糖 + 核糖 +
肌醇 _ 甘油 +
海藻糖 + 阿拉糖 +
所述胶红酵母JS2018的26S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
将所述胶红酵母JS2018于2019年5月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.17871。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
实施例2
一种利用上述胶红酵母JS2018发酵糖蜜生产虾青素的方法，包括如下步骤：
S1.采用5000L发酵罐中间补料培养，将胶红酵母JS2018按照6％(v/v)的接种量接种于3500L发酵培养基中，所述发酵培养基含有总糖量为30g/L的糖蜜、10g/L硝酸钠、0.1g/L FeSO4·7H2O、4.5g/L Na2HPO4·12H2O；
S2.当发酵培养基中残糖浓度低于10g/L时，补加糖蜜继续培养；补糖方式为控制流速连续补加，使糖浓度保持在15g/L左右，直至总糖量达到120g/L(以初始培养基体积为基础)；
整个发酵周期控制温度30℃，pH5.0，转速60～80r/min，通气量80～100m3/h，溶氧45％，发酵72h后分离提纯获得虾青素。
结果表明，最终生物量可达51.5g/L，其虾青素含量为6％干菌体。
实施例3
一种利用上述胶红酵母JS2018发酵糖蜜生产虾青素的方法，包括如下步骤：
S1.采用5000L发酵罐中间补料培养，将胶红酵母JS2018按照3％(v/v)的接种量接种于3500L发酵培养基中，所述发酵培养基含有总糖量为30g/L的糖蜜、10g/L硝酸钠、0.1g/L FeSO4·7H2O、4.5g/L Na2HPO4·12H2O；
S2.当发酵培养基中残糖浓度低于10g/L时，补加糖蜜继续培养；补糖方式为控制流速连续补加，使糖浓度保持在15g/L左右，直至总糖量达到120g/L(以初始培养基体积为基础)；
整个发酵周期控制温度26℃，pH4.5，转速30～60r/min，通气量50～80m3/h，溶氧40％，发酵72h后分离提纯获得虾青素。
结果表明，最终生物量可达42.5g/L，其虾青素含量为5％干菌体。
实施例4
一种利用上述胶红酵母JS2018发酵糖蜜生产虾青素的方法，包括如下步骤：
S1.采用5000L发酵罐中间补料培养，将胶红酵母JS2018按照8％(v/v)的接种量接种于3500L发酵培养基中，所述发酵培养基含有总糖量为30g/L的糖蜜、10g/L硝酸钠、0.1g/L FeSO4·7H2O、4.5g/L Na2HPO4·12H2O；
S2.当发酵培养基中残糖浓度低于10g/L时，补加糖蜜继续培养；补糖方式为控制流速连续补加，使糖浓度保持在15g/L左右，直至总糖量达到120g/L(以初始培养基体积为基础)；
整个发酵周期控制温度32℃，pH6.0，转速80～100r/min，通气量100～120m3/h，溶氧55％，发酵72h后分离提纯获得虾青素。
结果表明，最终生物量可达49.3g/L，其虾青素含量为4％干菌体。
实施例5
一种利用上述胶红酵母JS2018发酵糖蜜生产虾青素的方法，包括如下步骤：
S1.采用5000L发酵罐中间补料培养，将胶红酵母JS2018按照5％(v/v)的接种量接种于3500L发酵培养基中，所述发酵培养基含有总糖量为30g/L的糖蜜、10g/L硝酸钠、0.1g/L FeSO4·7H2O、4.5g/L Na2HPO4·12H2O；
S2.当发酵培养基中残糖浓度低于10g/L时，补加糖蜜继续培养；补糖方式为控制流速连续补加，使糖浓度保持在15g/L左右，直至总糖量达到120g/L(以初始培养基体积为基础)；
整个发酵周期控制温度28℃，pH7.0，转速60～80r/min，通气量80～100m3/h，溶氧50％，发酵72h后分离提纯获得虾青素。
结果表明，最终生物量可达45.6g/L，其虾青素含量为5％干菌体。
对比例1
一种利用上述胶红酵母JS2018发酵糖蜜生产虾青素的方法，包括如下步骤：
采用5000L发酵罐分批培养(不进行中间补料)，将胶红酵母JS2018按照6％(v/v)的接种量接种于3500L发酵培养基中，所述发酵培养基含有总糖量为120g/L的糖蜜、10g/L硝酸钠、0.1g/L FeSO4·7H2O、4.5g/L Na2HPO4·12H2O；整个发酵周期控制温度30℃，pH5.0，转速60～80r/min，通气量80～100m3/h，溶氧45％，发酵72h后分离提纯获得虾青素。
结果表明，最终生物量可达28g/L，其虾青素含量为2％干菌体。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一株胶红酵母JS2018及其在发酵糖蜜生产虾青素中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 621
<212> DNA
<213> 胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)
<400> 1
tccttccgta ggtgaacctg cggaaggatc attagtgaat ataggacgtc caacttaact 60
tggagtccga actctcactt tctaaccctg tgcacttgtt tgggatagta actctcgcaa 120
gagagcgaac tcctattcac ttataaacac aaagtctatg aatgtattaa attttataac 180
aaaataaaac tttcaacaac ggatctcttg gctctcgcat cgatgaagaa cgcagcgaaa 240
tgcgataagt aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga acgcaccttg 300
cgctccatgg tattccgtgg agcatgcctg tttgagtgtc atgaatactt caaccctcct 360
ctttcttaat gattgaagag gtgtttggtt tctgagcgct gctggccttt acggtctagc 420
tcgttcgtaa tgcattagca tccgcaatcg aacttcggat tgacttggcg taatagacta 480
ttcgctgagg aattctagtc ttcggactag agccgggttg ggttaaagga agcttctaat 540
cagaatgtct acattttaag attagatctc aaatcaggta ggactacccg ctgaacttaa 600
gcatatcaat aaggcgggag g 621

Claims (7)

1.一株胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)JS2018，其特征在于，所述胶红酵母JS2018于2019年5月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No .17871。
2.权利要求1所述胶红酵母JS2018在发酵糖蜜生产虾青素中的应用。
3.一种利用权利要求1所述胶红酵母JS2018发酵糖蜜生产虾青素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.采用1000～5000L发酵罐，按照体积比为3％～8％接种量，将胶红酵母JS2018接种于发酵培养基中培养，所述发酵培养基含有总糖量为30g/L的糖蜜、10g/L硝酸钠、0.1g/LFeSO4·7H2O、4.5g/L Na2HPO4·12H2O；
S2.当发酵培养基中残糖浓度低于10g/L时，补加糖蜜继续培养；整个发酵周期控制温度26～32℃，pH4.5～7.0，转速30～100r/min，通气量50～120m3/h，溶氧40％～55％，发酵48～72h后分离提纯获得虾青素。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，按体积比，步骤S1所述胶红酵母JS2018的接种量为6％。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述整个发酵周期控制温度30℃，pH5.0。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述整个发酵周期控制转速60～80r/min，通气量80～100m3/h，溶氧45％。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵罐的体积为5000L。
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