CN114134049B - 一株联产DHA和β-胡萝卜素的裂殖壶菌SL-916及其应用 - Google Patents

一株联产DHA和β-胡萝卜素的裂殖壶菌SL-916及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物诱变育种技术领域，具体涉及一株联产DHA和β‑胡萝卜素的裂殖壶菌SL‑916及其应用。所述的裂殖壶菌(Schizochytriumlimacinum)SL‑916于2021年9月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M20211197。本发明采用ARTP诱变，并通过平板初筛、摇瓶发酵筛选得到发酵生物量高、油脂含量高，同时能够高效联产DHA、β‑胡萝卜素的裂殖壶菌SL‑916。该菌株能够用于禽畜养殖及饲料开发，能提高禽畜农产品品质。

Description

一株联产DHA和β-胡萝卜素的裂殖壶菌SL-916及其应用
技术领域
本发明涉及微生物诱变育种技术领域，具体涉及一株联产DHA和β-胡萝卜素的裂殖壶菌SL-916及其应用。
背景技术
不饱和脂肪酸作为人和动物必需的营养成分，对降低血液粘稠度，改善血液微循环以及维持机体细胞膜的相对流动性，保证细胞的正常生理功能方面具有显著生理功效。裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)，也称为裂壶藻，属于卵菌纲(Oomycetes)、水霉目(Saprolegniales)、破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)、裂殖壶菌属(Schizosporum)的一类单细胞、球形的海洋真菌。裂殖壶菌具备非常好的油脂合成能力，其含量可达细胞干重的50-60％，其中脂肪酸组成简单，不饱和脂肪酸主要为二十二碳六烯酸(Docosahexaenoicacid，DHA)，其含量可占总油脂的20-45％，饱和脂肪酸多为C16，约占20-30％，其它脂肪酸含量很低。DHA作为一种极其重要的ω-3不饱和脂肪酸，具有促进智力发育、保护视力和降血脂等多种重要生理功能，已被开发成各种药品、功能性食品和化妆品等，呈现巨大市场。不仅如此，裂殖壶菌还能合成少量的类胡萝卜素，比如β-胡萝卜素、虾青素和海胆酮等，可以保护DHA不被氧化破坏，有利于提高DHA的稳定性。
类胡萝卜素是一类脂溶性色素的总称，是由八个异戊二烯基本单位构成的碳氢类化合物，该类色素具有抗氧化性功能，属于多烯化合物，广泛存在于植物、动物和微生物中。目前已发现的类胡萝卜素有上百种，其中β-胡萝卜素便是其中重要的一种。β-胡萝卜素作为一类具有颜色的多烯化合物，含有多个共轭双键，具有捕获、淬灭单线态氧和自由基的能力，具有非常好的抗氧化能力，用途广泛。目前，β-胡萝卜素的获得主要通过两种途径：化学合成、植物提取。前者虽然量大但含有很多有毒物质，影响人类健康；后者无污染，但提取量太少。以上的种种原因，促成了微生物产β-胡萝卜素的产业的发展。通过改变微生物代谢流向，结合一定的培养基配方及工艺的控制，来提高微生物油脂合成的同时，改变油脂中脂肪酸的成分以及增加微生物β-胡萝卜素的产量，已经成为当下热门的研究内容之一。
中国专利201210251850.X公开了一种裂殖壶菌(Aurantiochytrium sp.SD116，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No：6208)及利用其高密度发酵生产DHA油脂的方法。该发明从元素供应和发酵控制角度优化菌株发酵条件，并结合补糖操作，实现高密度发酵，最终细胞干重达到70.43g/L，油脂含量达50.1g/L，DHA占总脂肪酸含量高于35％，且含有β-胡萝卜素、虾青素和角鲨烯等生物活性物质，但其DHA占总脂肪酸含量并未高于50％以上，与现有技术中所记载的35％-45％相比，没有显著提升；另外，最终得到的β-胡萝卜素含量也较低。
中国专利201710042270.2公开了一种提高裂殖壶菌生产脂类物质同时提高碳得率的方法，该发明发酵前期利用甘油为碳源，使菌体生物量增加，发酵后期切换碳源为葡萄糖，促进菌体脂类物质积累，包括积累DHA和类胡萝卜素，最大限度提高底物利用率，提高碳得率。其实施例2中记载，初始以甘油为碳源发酵，48h后待碳源浓度降到20g/L以下开始用600g/L葡萄糖为碳源补料发酵，发酵4天，生物量达100g/L，总脂占干重32.35％，DHA产量14.72g/L，类胡萝卜素产量441.75mg/L，消耗葡萄糖235g，消耗甘油262g。经过计算，其DHA产量仅占总油脂含量45.5％，类胡萝卜素产量仅占菌体干重0.44％，相比于现有技术未得到明显提升。
常压室温等离子体(Atmospheric Room Temperature Plasma,ARTP)被称为除气体、液体、固体以外物质的第四态，通过改变激发方式和发生器结构可以产生不同热力学状态的等离子体。等离子体具有臭氧浓度及紫外辐射强度均极低，安全性高、环境友好、诱变快速等特点，常压室温等离子体诱变操作简单，条件温和，菌株突变率高、突变点位和跨度广泛。ARTP工作气源种类、流量、放电功率、处理时间等条件均可控，通过改变仪器操作条件，可以大大提高菌种突变的强度和突变库容量，结合压力筛选和高通量筛选技术，ARTP已经成为高效进化育种的新方法。
目前未见采用ARTP诱变裂殖壶菌的相关报道，因此筛选培育一种新的裂殖壶菌以满足高效联产DHA和β-胡萝卜素的需求，对于微生物资源的高值化利用具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是采用ARTP诱变，并通过平板初筛、摇瓶发酵筛选得到发酵生物量高、油脂含量高，同时能够高效联产DHA、β-胡萝卜素的新型裂殖壶菌，有效促进功能活性成分多优并举，生理活性功能多效叠加的目的，具有极高的现实意义与应用价值。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
一方面，本发明提供一株联产DHA和β-胡萝卜素的裂殖壶菌SL-916，所述的裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)SL-916于2021年9月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M20211197，保藏地址为中国武汉，武汉大学；邮编：430072。
上述裂殖壶菌SL-916的制备方法，包括如下步骤：将出发菌株制备原生质体，并通过常压室温等离子体(ARTP)进行诱变育种，筛选得到菌株细胞中能同时高效积累DHA和β-胡萝卜素的裂殖壶菌菌株。
其中，所述的出发菌株为裂殖壶菌FJU-512(Schizochytrium limacinum FJU-512)，来源于福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心(参考文献：黄建忠,江贤章.DHA高产菌Schizochytrium sp.FJU-512的分离及其18S rRNA基因序列比较分析[J].应用与环境生物学报,2005,11(2):202-207.)。
所述的原生质体的制备，首先是菌株悬液，然后再进行液体活化培养收集菌体细胞，最后在一定条件下进行酶解破壁，制备成原生质体。
具体地，所述的菌株悬液是由固体斜面培养获得，将出发菌株裂殖壶菌FJU-512的甘油菌接种至GYP固体18×180mm试管斜面(GYP斜面培养基配制包括：葡萄糖30g，蛋白胨10g，酵母粉5g，海水晶15g，琼脂15g，pH值6.5，115℃高压蒸汽灭菌15min。)菌种在28℃条件下培养2天，然后用无菌生理盐水将固体斜面中的菌株洗下制备菌株悬液，菌株悬液中活菌数为1.9×107CFU/mL。
具体地，所述的液体活化培养收集菌体细胞是将上述菌株悬液按6％的接种量接种于GYP液体培养基(GYP液体培养基配制包括：葡萄糖30g，蛋白胨10g，酵母粉5g，海水晶15g，自来水1000mL，pH值6.5，115℃高压蒸汽灭菌15min。)，250mL的三角瓶内装液量为30mL，28℃，200r/min的转速恒温振荡器培养24小时，获得液体培养物。8000rpm，离心10min，收集菌体，此即为活化培养的菌体细胞。
具体地，所述的一定条件下酶解破壁是指采用混合的酶解条件进行裂殖壶菌菌株的酶解破壁，其中，采用溶壁酶(购自于广东微生物菌种保藏中心)和蜗牛酶(购自于上海生工)混合的酶解液(高渗溶液配制)，溶壁酶酶解液使用浓度为0.5％-2.5％，最佳酶解浓度为0.5％-1.0％，蜗牛酶酶解液浓度0.5％-2.5％，最佳酶解浓度为0.5％-1.0％，酶解温度范围为24-35℃，最佳酶解温度为26-30℃，酶解时间为2-8h，最佳酶解时间为3-5h，酶解pH为5.0-7.0，最佳酶解pH为6.2-6.8，原生质体采用高渗溶液进行重悬，浓度达到1×107个/mL。
其中，高渗溶液的配制包括：0.2mol/L、pH5.8的磷酸盐缓冲液加上45g/L的KCl，121℃灭菌20min，并经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，4℃保存，备用。
所述的诱变育种是通过常压室温等离子体(Atmospheric and Room TemperaturePlasma，ARTP)诱变育种仪ARTP-ⅡS(购自于无锡源清天木生物科技有限公司)来实现的，该育种仪是通过能够在大气压下产生温度在25-40℃之间的、具有高活性粒子(包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)浓度的等离子体射流，作用于微生物，能够使微生物膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致微生物产生突变。
采用上述诱变育种仪诱变育种的最佳条件为：取10-20μL的原生质体悬液，均匀涂布在金属载片的上表面，干燥后用镊子将原生质体悬液载片转移至载物台。采用高纯氦气作为等离子体的工作气体，设置电源功率80W，照射距离4mm，等离子体的温度26-30℃，气流量10L/min，处理菌物载片，照射时间为15-55s。处理后将载片转移到EP管中，震荡洗脱形成新的原生质体悬液，涂布再生平板后置于24-28℃培养箱内培养。
上述的再生平板是在GYP固体培养基或者液体培养基中添加40-50g/L的氯化钾作为渗透压稳定剂制备而成的。
所述的筛选是通过平板初筛筛选得到菌落较大、生长速度快、红色色素颜色深等特征的裂殖壶菌突变菌株；然后采用96孔微孔板对筛选到的裂殖壶菌突变菌株进行液体发酵培养，然后离心收集菌体，烘干后检测DHA、β-胡萝卜素含量，筛选得到优良的正突变菌株(β-胡萝卜素含量显著提高的裂殖壶菌突变菌株)。
所述的遗传稳定是通过对优良正突变菌株，经过固体斜面传代，再从中挑选进行斜面的反复传代实验，选出形态、颜色稳定的菌株，之后进行摇瓶检测，选取DHA和β-胡萝卜素含量高而且稳定的菌株即为遗传稳定的裂殖壶菌优良变株。
经过上述方法筛选获得的优良变株，编号为Schizochytrium limacinum SL-916，简称为裂殖壶菌菌株SL-916，已于2021年9月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M20211197。
由于裂殖壶菌在液体发酵过程往往容易出现过早“老化”现象，导致裂殖壶菌菌株生长的同步性降低，生物量及油脂的生物合成能力减弱，最终影响裂殖壶菌菌株在发酵罐中合成与积累DHA和β-胡萝卜素的表现，这与裂殖壶菌菌株的种龄有密切关系。强化种子制备培养，大大减少裂殖壶菌菌株的种子“生长周期”，相对延长“油脂合成周期”，获取一定生物量的同时能够保持菌株高活性，对裂殖壶菌菌株的液体发酵来说非常必要。本发明的发明点之一是通过强化种子培养，大大提高裂殖壶菌菌株菌落数及细胞生长的同步性，从而减少发酵级数，缩短发酵周期，节约成本，而且能够非常有效的促进菌株的生长及提高菌体中油脂的含量。
因此，本发明的另一目的在于提供上述裂殖壶菌SL-916在发酵制备富含DHA和β-胡萝卜素的产品中的应用。
本发明还提供了一种富含DHA和β-胡萝卜素的裂殖壶菌发酵菌剂的制备方法，是采用上述裂殖壶菌SL-916经过活化培养，种子强化培养，发酵罐培养，收集发酵菌体，烘干制得。
其中，所述的活化培养是采用GYP固体培养基培养进行活化，具体为：接种甘油菌至GYP固体培养基平皿，培养箱中于28℃避光培养2天，再用5mL无菌生理盐水洗下菌体细胞，制备菌株细胞悬液，此即为活化后的菌株悬液。
所述的种子强化培养是指将活化的菌株悬液，转接于含种子强化培养基斜面的茄子瓶中，制成表面积大、通气量好且易于菌株繁殖的培养基，于培养箱中28℃培养1天，进一步提高菌株的数量，同时促进细胞的同步繁殖，强化菌株活力，达到菌株种子强化培养的目的。
优选地，所述的种子强化培养基的配制方法为：葡萄糖50.0g/L、蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、硫酸镁0.5g/L、海水晶30g/L、50000U/L糖化酶，pH自然，制得营养液；再将籼米与营养液按照质量体积比为1:1混合均匀，隔水蒸30min，然后进行高温高压灭菌，条件为121℃灭菌20-30min，即得种子强化培养基。
所述的发酵罐培养是采用强化种子培养物直接接种发酵罐，接种量为每35L发酵液体培养基(即装液量70％的50L发酵罐)接种100g强化种子培养物；在发酵培养起始阶段，控制发酵罐通气量为150-200mL/min，搅拌控制为150-200rpm，温度控制在24-28℃，初始葡萄糖的浓度控制在20-30g/L，并通过流加70％的葡萄糖控制发酵体系中的残糖(以葡萄糖计)为0.8-2.0g/100mL；发酵前24h，通过流加20％氨水，控制pH为5.5-6.0，24h至放罐，pH自然，全过程控制溶解氧(DO)为25-45％；发酵周期控制在3天以内。停止发酵后，将发酵液进行离心，收集发酵菌体，60-80℃烘干，并测定烘干菌体中DHA和β-胡萝卜素的含量。
优选地，所述的发酵液体培养基配方为：葡萄糖100.0g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，酵母浸粉10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，海水晶15.0g/L，KH2PO4 2.5g/L，MgSO4 0.4g/L，维生素B10.005g/L，维生素B12 0.005g/L，20％氨水调节pH值为6.5。
又一方面，本发明还请求保护上述裂殖壶菌SL-916在提高禽畜生产性能及肉蛋品质中的应用。
上述发酵菌体中DHA的检测：参照GB 26400-2011食品安全国家标准食品添加剂二十二碳六烯酸油脂(发酵法)。
上述发酵菌体中β-胡萝卜素的检测：参照GB 28310-2012食品安全国家标准食品添加剂β-胡萝卜素(发酵法)。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明采用ARTP诱变，并通过平板初筛、摇瓶发酵筛选得到发酵生物量高、油脂含量高，同时能够高效联产DHA、β-胡萝卜素的裂殖壶菌SL-916。该菌株能够用于禽畜养殖及饲料开发，能提高禽畜农产品品质，具有较高的经济应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1裂殖壶菌SL-916的选育
1、出发菌株活化培养及菌体收集
将出发菌株裂殖壶菌FJU-512(Schizochytrium limacinum FJU-512)的甘油菌接种至GYP固体斜面培养基，28℃培养2天后，用无菌生理盐水将斜面菌株洗脱，制备细胞悬液，并按5-10％(具体为6.0％)接种量转接于GYP液体培养基培养(GYP液体培养基组分包括：葡萄糖30g，蛋白胨10g，酵母粉5g，海水晶15g，自来水1000mL，pH值6.5，115℃高压蒸汽灭菌15min)，于恒温振荡器28℃，200rpm，培养24h，培养结束后，获得液体培养物，8000rpm离心10min收集菌体，并用无菌生理盐水重悬洗涤二次，离心、无菌滤纸吸干水分，最后收集的菌体细胞，备用。2、裂殖壶菌SL-916原生质体悬液的制备
以步骤1制备的菌体为原料，用渗透压稳定剂重悬细胞，采用溶壁酶(购自于广东微生物菌种保藏中心)和蜗牛酶(购自于上海生工)混合的酶解液，其中溶壁酶酶解液使用浓度为0.5％-2.5％，最佳酶解浓度为0.5％-1.0％，蜗牛酶酶解液浓度0.5％-2.5％，最佳酶解浓度为0.5％-1.0％，酶解温度范围为24-35℃，最佳酶解温度为26-30℃，酶解时间为2-8h，最佳酶解时间为3-5h，酶解pH为5.0-7.0，最佳酶解pH为6.2-6.8，此即为制备裂殖壶菌FJU-512原生质体制备的最佳条件，制备原生质体的效率最高，原生质体的再生率也较好(再生率＝再生菌落数/原生质体总数×100％)，达到25-35％。原生质体采用高渗溶液进行重悬，浓度达到1×107个/mL。
其中，高渗溶液组成包括：0.2mol/L、pH5.8的磷酸盐缓冲液加上45g/L的KCl，121℃灭菌20min，并经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，4℃保存，备用。
3、裂殖壶菌原生质体的常压室温等离子体(ARTP)诱变处理
采用ARTP进行裂殖壶菌FJU-512原生质体诱变育种前，首先进行预实验，并对致死率进行计算。诱变前预实验及致死率的计算方法如下：取10-20μL的步骤2制备的原生质体悬液，均匀涂布在金属载片的上表面，干燥后用镊子将载片转移至载物台。采用高纯氦气作为等离子体的工作气体，设置电源功率80W，照射距离4mm，等离子体的温度26-30℃，气流量10L/min，处理菌物载片，处理时间为0(对照)、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55s。处理后将载片转移到1.5mL的EP管中，震荡洗脱形成新的菌悬液，涂布再生平板后置于28℃培养箱内培养。培养2-3天后对平板菌落进行计数，计算致死率：
致死率％＝(未经诱变处理菌落数-经诱变处理菌落数)/未经诱变菌落数×100％，每个处理组三个平行样，选择致死率为75-85％的处理时间。
裂殖壶菌FJU-512原生质体ARTP诱变的具体处理方式为：将15μL菌悬液涂布在金属载体上，置于ARTP诱变系统托盘上，电源功率80W，气流量10L/min，处理时间20s。样品处理完毕后，用无菌镊子将载片放至装有1mL再生培养基的EP管中。在振荡器上再生培养45min，把附着在载片上的微生物洗脱到再生培养基中，形成新的菌悬液。
4、优良高效积累DHA和β-胡萝卜素的裂殖壶菌突变株的筛选
对步骤3形成的新菌悬液进行一定的稀释，取100-300μL稀释液涂布到再生培养基平板培养，取样过程中请注意轻微震荡菌液以保持均匀。将在再生平板上生长快速的突变菌株划到普通的GYP固体平板转接培养一次，然后再次挑选菌落生长快、颜色呈现微红或红色的菌落再次转接至GYP斜面培养基28℃培养。将上述诱变所得突变菌株接种到装有1mL摇瓶发酵培养基(摇瓶发酵培养基按照称量体积计为：葡萄糖100.0g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，酵母浸粉10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，海水晶15.0g/L，KH2PO4 2.5g/L，Mg2SO4 0.4g/L，维生素B10.005g/L，维生素B12 0.005g/L。20％的氢氧化钠调pH为6.5，115℃高压灭菌15min)的96孔微孔板振荡培养，培养条件28℃，200rpm，培养3天，离心收集菌体，65℃烘干至水分7％左右，检测菌体细胞DHA、β-胡萝卜素的含量。收集β-胡萝卜素含量明显提高的正突变菌株，继续进行摇瓶复筛，250mL摇瓶，装液量30mL，培养条件为28℃，200rpm，培养3天，收集菌体，65℃烘干，检测其生物量(菌体干重)、DHA含量、β-胡萝卜素含量，综合选择生物量、DHA含量、β-胡萝卜素含量最好的菌株进行斜面保存及甘油保种，获得优良能高效积累DHA、β-胡萝卜素的裂殖壶菌突变株，编号SL-916，简称裂殖壶菌SL-916。
5、优良裂殖壶菌突变菌株的遗传稳定性
将筛选得到的优质裂殖壶菌突变菌株SL-916进行传代培养以考察其遗传稳定性，每2天传代一次，传代10代，每隔一代进行摇瓶发酵测定菌株生物量、DHA和β-胡萝卜素的含量，结果显示裂殖壶菌SL-916传代过程中发酵DHA、β-胡萝卜素及生物量均无明显变化，具有良好的遗传稳定性。
将获得遗传稳定的、能够同时高效积累DHA和β-胡萝卜素的的裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)菌株SL-916于2021年9月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M20211197。
实施例2高效积累DHA和β-胡萝卜素的裂殖壶菌SL-916的发酵应用
为了提高裂殖壶菌的发酵效率，缩短发酵周期，本实施例提供了一种种子强化培养方法，并利用种子强化培养物直接接种发酵罐，直接进行液体发酵，能够有效的减少发酵级数，提高菌株生物量和β-胡萝卜素、DHA的合成与积累。具体步骤是：
1、裂殖壶菌SL-916的种子强化培养
(1)种子强化培养基的制备
种子强化培养基：葡萄糖50g，蛋白胨10g，酵母粉5.0g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.5g，海水晶30g，100000U/mL的糖化酶0.5mL，定容1000mL，制成营养液，再以质量体积比1:1的量称取商用籼米(如1000mL营养液，称取1000g籼米)，混合均匀，隔水蒸30min，蒸好之后称取蒸好后的籼米营养液培养基100g于茄子瓶中，按常规方法进行高温高压灭菌，121℃，20-30min。此即为制备好的种子强化培养基。
(2)裂殖壶菌SL-916种子强化培养
种子强化培养首先需要将裂殖壶菌进行斜面活化培养，具体是接种甘油菌至GYP固体斜面培养基(18×180mm试管斜面)，于培养箱中28℃避光培养2天，通过5mL无菌生理盐水洗脱制备菌悬液，并按照一支试管斜面菌悬液转接一个茄子瓶的接种量，将菌悬液转接于含种子强化培养基的茄子瓶中，于培养箱中28℃培养1天，得到强化种子培养物。
2、裂殖壶菌SL-916液体深层发酵培养
(1)液体发酵培养基，按称量体积计为：葡萄糖60.0g/L，甘油70.0g/L，(NH4)2SO40.5g/L，酵母浸粉10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，海水晶15.0g/L，KH2PO42.5g/L，Na2SO4 0.3g/L，维生素B1 0.005g/L，维生素B12 0.005g/L。调pH为6.5，115℃高压灭菌15min。
(2)发酵培养
采用50L发酵罐，装液量为35L，将上述步骤1制备的强化种子培养物接入发酵罐，培养时间为3-5天(通过控制流加70％的葡萄糖水溶液，维持发酵罐中的葡萄糖含量为0.8-1.5g/100mL)，溶氧(DO)25-45％，温度28℃，具体为培养时间为3天，溶氧(DO)25-45％，维持发酵罐中的葡萄糖含量为0.8-1.0g/100mL，温度28℃，发酵前24h，通过流加20％氨水，控制pH范围为5.5-6.0，24h至放罐，pH自然。发酵结束，控制发酵罐中的还原糖浓度为0.01-0.1g/100mL。
3、裂殖壶菌SL-916发酵培养物菌体的分离
采用平板式密闭离心机LB800(购自于江苏赛德力机械制造有限公司)将上述得到的发酵培养物3000rpm离心，同时用自来水清洗管道在离心机的清洗口进水进行一边清洗一边离心，常温下离心洗涤30min，最后关闭自来水进水，常温离心30min，去除上清液，收集沉淀物，此即为裂殖壶菌菌体，65℃烘干，菌体干重得率约为8-15％(即8.0-15g/100mL)，更具体的为11.5g/100mL。
4、对照菌株菌体的制备
将裂殖壶菌FJU-512代替裂殖壶菌SL-916进行步骤1、2、3的实验，收集裂殖壶菌FJU-512菌体(对照液菌株菌体)，生物量为12.0g/100mL。
5、DHA及β-胡萝卜素含量的测定
将上述步骤3中获得的菌体按照GB 26400-2011食品安全国家标准食品添加剂二十二碳六烯酸油脂(发酵法)和GB 28310-2012食品安全国家标准食品添加剂β-胡萝卜素(发酵法)分别检测生物量、DHA和β-胡萝卜素的含量。检测结果如下：裂殖壶菌SL-916菌株生物量为115.0g/L，油脂含量为56.1g/L，占菌体干重48.8％，DHA含量为27.3g/L，占菌体干重23.7％，β-胡萝卜素的含量为0.93g/L，占菌体干重0.81％；出发菌株裂殖壶菌FJU-512菌株的生物量为120.0g/L，油脂含量为55.5g/L，占菌体干重的46.3％，DHA含量为27.5g/L，占菌体干重的22.9％，β-胡萝卜素的含量为0.03g/L，占细胞干重的0.25％。
结果表明：本发明选育的裂殖壶菌SL-916菌株较出发菌株来说，虽然生物量略有降低，但DHA含量的占比略有提高，合成与积累DHA的能力有所增强，特别是β-胡萝卜素的含量得到显著提升，具备优异的同时合成DHA及β-胡萝卜素的能力。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一株联产DHA和β-胡萝卜素的裂殖壶菌SL-916，其特征在于，所述的裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)SL-916于2021年9月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M20211197。
2.权利要求1所述的裂殖壶菌SL-916在发酵制备富含DHA和β-胡萝卜素的产品中的应用。
3.一种富含DHA和β-胡萝卜素的裂殖壶菌发酵菌剂的制备方法，其特征在于，是采用权利要求1所述的裂殖壶菌SL-916经过活化培养，种子强化培养，发酵罐培养，收集发酵菌体，烘干制得；
所述的种子强化培养是指将活化后的菌株悬液，转接于含种子强化培养基斜面的容器中，于培养箱中28℃培养1天，得强化种子培养物；
所述的种子强化培养基的配制方法为：葡萄糖50.0g/L、蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、硫酸镁0.5g/L、海水晶30g/L、50000U/L糖化酶，pH自然，制得营养液；再将籼米与营养液按照质量体积比为1:1混合均匀，隔水蒸30min，然后进行高温高压灭菌，条件为121℃灭菌20-30min，即得种子强化培养基；
所述的发酵罐培养是采用强化种子培养物直接接种发酵罐，接种量为每35L发酵液体培养基接种100g强化种子培养物；在发酵培养起始阶段，控制发酵罐通气量为150-200mL/min，搅拌控制为150-200rpm，温度控制在24-28℃，初始葡萄糖的浓度控制在20-30g/L，并通过流加70％的葡萄糖控制发酵体系中的残糖为0.8-2.0g/100mL；发酵前24h，通过流加20％氨水，控制pH为5.5-6.0，24h至放罐，pH自然，全过程控制溶解氧为25-45％；发酵周期控制在3天以内。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵液体培养基配方为：葡萄糖100.0g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，酵母浸粉10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，海水晶15.0g/L，KH2PO42.5g/L，MgSO4 0.4g/L，维生素B1 0.005g/L，维生素B120.005g/L，20％氨水调节pH值为6.5。
5.权利要求1所述的裂殖壶菌SL-916在提高禽畜生产性能及肉蛋品质中的应用。
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