CH367159A - Verfahren zur Herstellung von Laevanen praktisch einheitlicher Molekülgrössen - Google Patents

Description

  



  Verfahren zur Herstellung von Laevanen praktisch einheitlicher   Molekülgrossen   
In letzter Zeit sind   Laevan-Präparate    für   verschie-    dene pharmazeutische Anwendungsgebiete vorgeschlagen worden   (vgl.    deutsche Patentschriften Nummern 948910 und   1011578,    z. B. als Verdickungsmittel,   Blutersatzflüssigkeiten,    Zuschläge für Tabletten usw.



   Die Verwendung von Laevanen für pharmazeutische und technische Zwecke ist in erster Linie von der Molekülgrösse abhängig.



   Zur Kennzeichnung der Molekülgrösse werden im folgenden die Begriffe     niedermolekulare Laevanep,         Laevane fur Blutersatzzwecke   und   hochmoleku-    lare Laevane   verwendet werden. Wir definieren sie durch ihre   Methanollöslichkeit    und die Ausscheidung aus der Blutbahn des Kaninchens.



       Niedermolekulare Laevanen    sind nach Entfernung von dialysablen Stoffen in   70-80 /oigem    Methanol bei   20     C löslich. 1, 5 g solcher Laevane, in 25   cm    0,   9 /Oiger NaCl-Lösung gelöst,    werden im Kaninchenversuch nach der intravenösen Injektion innerhalb von drei Stunden nahezu quantitativ ausgeschieden.



       Laevane fur Blutersatzzwecke   sind    in 70 bis   80 tigern    Methanol unlöslich. 1, 5 g solcher Laevane, in 25 cm3   0, 9 11/oiger NaCI-Lbsung gel6st,    werden im Kaninchenversuch drei Stunden nach der intravenösen Injektion zu etwa 40 und nach 120 Stunden fast quantitativ aus der Blutbahn ausgeschieden.



       Hochmolekulare Laevane   sind    bereits in niedrigeren Methanol-Konzentrationen als   70-80  /o igem    Methanol unlöslich. 1, 5 g solcher Laevane, in 25 cms 0,   9a/oiger NaCI-Lösung gelöst,    werden drei Stunden nach der intravenösen Injektion am Kaninchen zu etwa   10-20 /Q    aus der Blutbahn ausgeschieden.



       Laevan fur Blutersatzzwecke   hat    ein Molekulargewicht von etwa 65 000. Innerhalb gewisser Grenzen kann man die relative Viskosität gegen Wasser als ungefähres Mass für die Molekülgrösse heranziehen, jedoch ist zu beachten, dass im Falle des Laevans die Viskosität wahrscheinlich auch von der   Molekülgestalt    abhängig ist.



     Niedermolekularem und     hochmolekulare Lae-      vanen können    als Verdickungsmittel, Zuschläge für Tabletten usw. verwendet werden.



   Es ist bekannt, zur Herstellung von Laevanen relativ einheitlicher Molekülgrösse dem Laevansucrase-Rohrzuckergemisch sogenannte     Primer-      Laevane  -das    sind Laevane definierter   Molekül-    grösse-als Fructosylacceptoren zuzusetzen (vgl. Appl.



  Microbiology 3, 321-333 (1955). Ferner ist es   mög-    lich, innerhalb gewisser Grenzen Laevane höherer oder niederer Molekülgrösse durch Variation des pH, der Enzymkonzentration, Rohrzuckerkonzentration und Temperatur des Reaktionsgemisches zu erhalten.



  Mit diesen Verfahren ist es jedoch nicht in jedem Falle möglich, ein Laevan-Präparat mit bestimmter gewünschter Molekülgrösse in brauchbarer Ausbeute zu gewinnen.



   Gegenstand des vorliegenden Patentes ist nun ein Verfahren zur Herstellung von Laevanen von praktisch einheitlicher Molekülgrösse, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einer Kultur laevanbildender Mikroorganismen oder der aus einer solchen Kultur gewonnenen zellfreien Laevansucrase Saccharose und mindestens einen Stoff zusetzt, der Laevansucrase adsorbiert.



   Der Erfindung liegt die Beobachtung zugrunde, dass das laevansynthetisierende Ferment, die Laevansucrase, an verschiedene Stoffe adsorbiert werden und in diesem Zustand in Gegenwart von Rohrzucker Laevan bilden kann, und dass die adsorptive Bindung des Ferments durch z. B. anorganische Ionen gelockert bzw. aufgehoben werden kann. 



   Ist durch Zugabe entsprechender Mengen des Adsorptionsmittels das Ferment nahezu quantitativ adsorbiert, so erhält man ein Laevan mit extrem hoher Molekülgrösse.



   Sehr niedermolekulares Laevan erhält man mit nicht adsorbierter Laevansucrase.



   Zur Erzeugung von Laevanen einer   Molekül-    grösse, wie sie für Blutersatzzwecke geeignet ist, ist es erforderlich, nur einen Teil der Laevansucrase zu adsorbieren, indem man entweder entsprechende Mengen an adsorbierenden Stoffen oder entsprechende Mengen an Laevansucrase-Adsorbentien und an Ionen bzw. weiteren Ionen zugibt.



   An Polysaccharide, die für Blutersatzpräparate benötigt werden, sind die höchsten Anforderungen in bezug auf Reinheit zu stellen. Unter konsequenter Anwendung kolloidchemischer Verfahren ist es   mög-    lich, das erfindungsgemäss hergestellte Laevan so weit zu reinigen, dass alle Träger unerwünschter biologischer Reaktionen entfernt werden. An solchen Stoffen sind in erster Linie zu nennen : Pyrogene, Antigene, unspezifische stickstoffhaltige Verbindungen, Schwermetalle usw. Eine 6,   0"/G ige Lösung    von reinem Laevan in Tyrode-Lösung oder physiologischer Kochsalzlösung wird von folgenden Versuchstieren ohne jede Reaktion vertragen : Hund, Katze, Kaninchen, Meerschweinchen, Ratte, Maus.



   Die Stoffe, welche Laevansucrase adsorbieren, können ausserordentlich verschiedenartiger Natur sein.



  Sehr geeignet ist frisch gefälltes Calciumphosphat-Gel.



  Beispiele von Adsorptionsmitteln für Laevansucrase, durch die die   Laevanbildung    spezifisch beeinflusst wird, sind in der Tabelle des Beispiels 5 dargestellt.



  Weiter besitzen   complexe,    denaturierte Eiweissstoffe, wie sie z. B. beim Erhitzen neutralisierten Maisquellwassers ausflocken, ein gutes Adsorptionsvermögen für Laevansucrase. Abgestufte Mengen dieses denaturierten Eiweisses in einer Maisquellwasser enthaltenden Nährlösung kann man leicht dadurch erhalten, dass man einen Teil des Maisquellwassers vor der Herstellung der Nährlösung nach einer separaten Sterilisation filtriert.



   Das erfindungsgemässe Verfahren kann unter Verwendung wachsender Kulturen von Mikroorganismen, die Laevansucrase ausscheiden, oder entsprechender zellfreier Enzymlösungen durchgeführt werden. In der Praxis wird man allerdings berücksichtigen müssen, dass in wachsenden Kulturlösungen von Laevanbildnern komplexe und sich ständig ändernde Reaktionsverhältnisse vorliegen.



   Beispiel 1
Eine Nährlösung folgender Zusammensetzung wird 40 Minuten bei   110"C    sterilisiert :   1 O/o    ige Maisquellwasserlösung (bezogen auf Trocken substanz), vor der Herstellung der Nährlösung mit KOH auf pH 6, 8-7, 0 eingestellt, 20 Minuten auf 120 C zur Eiweissdenaturierung erhitzt und nach Abkühlung durch   Seitz-Klärschichten    (Markenprodukt) filtriert :
16 Liter   =      LZ ; sung A    1    < Voige Maisquellwasserlösung    (bezogen auf Trocken substanz) mit KOH auf pH 6, 8-7, 0 eingestellt :
4 Liter = Ldsung B Rohrzucker..... 2, 0 kg Magnesiumsulfat... 20 g sekundäres Kaliumphosphat 30 g Ammoniumsulfat.. 30 g
Diese sterilisierte Nährlösung wird nach Abkühlung mit einer Suspension von Bac. subtilis beimpft.



  Nach der Beimpfung des Fermentationsansatzes wird   1,      0 /a CaCO3    in Form einer   50 böigen    sterilen Suspension in Wasser zugesetzt. Nach 16stündiger Kultivierung bei 28,   Sa    C mit Belüftung erfolgt ein unsteriler Zusatz von 2, 0 kg trockenen Rohrzuckers, und das auf 5,   4-5,    6 abgesunkene pH der Kultur wird von diesem Zeitpunkt an durch häufige Zusätze von   25 böiger NaCO-Losung    auf pH 6, 3-6, 6 gehalten.



  Nach einer Kulturdauer von 23 Stunden erfolgt ein weiterer Zusatz von 3, 0 kg Rohrzucker. Nach einer Kulturdauer von insgesamt 39 Stunden ist die Fermentation beendet.



   Die Kulturlösung wird über Kieselgur filtriert und das Laevan nach üblichen Methoden rein dargestellt und getrocknet.



   Die relative Viskosität gegen Wasser einer 6,   0  /Oigen Lösung    dieses Präparates in 0,   911/piger    NaCl-Lösung bei 21  betrug 5, 2.



   Einem Kaninchen wurden 25 cm3 dieser Lösung i. v. gespritzt. Drei Stunden nach der Injektion waren   40 /o    des insgesamt gespritzten Laevans aus der Blutbahn ausgeschieden.



   Beispiel 2
Versuchsanordnung wie im Beispiel 1 beschrieben, jedoch unter Verwendung von 20 Liter Maisquellwasserlösung B und ohne Maisquellwasserlösung A.



   Die relative Viskosität gegen Wasser einer   6  /o igen    Lösung dieses Präparates in   0, 9  /o    iger NaCl-Lösung bei   21 C    betrug 19, 1, die einer   3 /0igen Lösung    in 0,   9"/ (tiger NaCl-Lösung    4, 7.



   Einem Kaninchen wurden 50 cm3 der   3 /0igen    Lösung i. v. gespritzt. Drei Stunden nach der Injektion waren   16 duo    des insgesamt gespritzten Laevans aus der Blutbahn ausgeschieden.



   Beispiel 3
1 Liter eines zellfreien, Laevansucrase enthaltenden Kulturfiltrats vom Bac. subtils (= Enzymlösung) wird mit 200 cm3 abgeschleudertem, frisch gefälltem, durch mehrfaches Zentrifugieren und Resuspendieren in Wasser gewaschenem Calciumphosphat-Gel etwa 10 Minuten ausgerührt. Die so gewonnene Suspension wird wiederum zentrifugiert, die überstehende Lösung verworfen und der Niederschlag in 1 Liter Wasser resuspendiert. In dieser Suspension werden 300 g Rohrzucker gelöst und der Ansatz 20 Stunden bei   29"C    gehalten. Das durch das entstandene Laevan stark viskos gewordene Reaktions gemisch wird wie die Kulturlösung gemäss Beispiel   1    auf trockenes Laevan aufgearbeitet.



   Die relative Viskosität gegen Wasser einer   3 Zeigen Lösung    dieses Präparates in 0, 9% iger NaCl-Lösung bei   21 C    betrug 7, 7.



   Einem Kaninchen wurden 50 cm3 einer   2 feigen    Lösung in 0,   9  /0iger NaCl-Lösung    i. v. gespritzt.



  Drei Stunden nach der Injektion waren   110/o    des insgesamt gespritzten Laevans aus der Blutbahn ausgeschieden.



   Beispiel 4
In der gleichen Versuchsanordnung wie im Beipiel 3 angegeben wurde eine Reihe weiterer Substanzen zur Anwendung gebracht. Die genaueren Versuchsbedingungen und die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt :   Adsorptionsmittel g Adsorptionsmittel g Rohrzucker Relative Viskosität einer @@@@@@@@@@@ pro Liter Enzym- pro Liter Adsorbat- 3- bzw. 6% igen L¯sung des    f r Laevansucrase l¯sung Suspension isolierten Laevans   Aktivbentonit 40 150 6 0/o. :    4, 0 Aktivkohle 30 300 3%:

   8, 1   Asbest 5 300 6  /o :    15, 3   Zellulosepulver 80 300 3  /o :    8, 0   Kieselgur 40 150 6  /o :    3, 5   Silicagel 40 150 3  /o :    3, 1   Al-Hydroxyd 80 150 3 o/a :    8, 1   Stärke801506"    7, 5   Sojamehl 80 150 6 /e :    7, 3   Mg-Phosphat 40 150 6  /e :    6, 4   La-Ribonucleat401506"/o    6, 2
Beispiel   5   
Versuchsanordnung wie im Beispiel 3 angegeben ; jedoch enthÏlt der Ansatz zusätzlich 50 g NaCl. Es entsteht ein relativ niederviskoses Reaktionsgemisch, welches wie die Kulturlösung gemäss Beispiel 1 auf trockenes Laevan aufgearbeitet wird.



   Die relative Viskosität gegen Wasser einer   6"/eigen Lösung    dieses Präparates in 0, 9% iger NaCl-Lösung bei   21     C betrug 3, 8.



   Einem Kaninchen wurden 25   cmS    dieser Lösung i. v. gespritzt. Drei Stunden nach der Injektion waren 69% des insgesamt gespritzten Laevans aus der Blutbahn ausgeschieden.



   Beispiel 6
In 1 Liter   Enzymlösung,    wie sie gemäss Beispiel 3 verwendet wurde, werden 40 cm3 gewaschenes, zentrifugiertes Calciumphosphat-Gel suspendiert und in der erhaltenen Suspension 300 g Rohrzucker gelöst.



  Der Ansatz wird 20 Stunden bei 29¯C gehalten. Das Reaktionsgemisch wird wie die Kulturlösung gemäss Beispiel   1    auf trockenes Laevan aufgearbeitet.



   Die relative Viskosität gegen Wasser einer 6  /o igen Lösung dieses Präparates in 0,   9 /0iger NaCl-Lösung    bei   21  C    betrug 4, 9.



   Einem Kaninchen wurden 25   cms    dieser Lösung   i.    v. gespritzt.



   Drei Stunden nach der Injektion waren   460/o    des insgesamt gespritzten Laevans aus der Blutbahn ausgeschieden.



   Beispiel 7
Der Fermentationsansatz wird wie im Beispiel 1 angegeben, jedoch statt im 20 Liter-Massstab in einem 200 Liter-Ansatz durchgeführt. Nach Beendigung der Fermentation wird der Kulturlösung die gleiche Volumenmenge Methanol zugesetzt. Das Volumen beträgt nun etwa 400 Liter. Diese Lösung wird mit etwa 10 Liter abgeschleudertem, frisch gefälltem, durch mehrfaches Zentrifugieren und Resuspendieren in Wasser gewaschenem Calciumphosphatgel ausgerührt und über ein   Kieselgurfilter    filtriert. Die so geklärte Lösung wird so lange unter Rühren mit weiterem Methanol versetzt, wie noch Laevan ausfällt. Der Niederschlag wird isoliert, in 200 Liter Wasser gelöst und nacheinander über einen Kationen-und Anionen Austauscher entsalzt.

   Aus der ionenfreien Lösung gewinnt man das Laevan als weisses, trockenes Pulver nach dem Sprühtrocknungsverfahren oder durch erneutes Fällen mit Methanol.



   60 g des gewonnenen Laevans werden mit Tyrodelösung auf 1, 0 Liter aufgefüllt. Nach Lösung des Präparates wird sterilisiert.



   Die relative Viskosität gegen Wasser dieser Lösung beträgt 4, 8.



   Im Kaninchenversuch wurden nach Injektion von 25   cm3      38"/o    des insgesamt je Tier verabfolgten Laevans nach drei Stunden aus der Blutbahn ausgeschieden.



   Dieses Gesamtverfahren wird durch die folgende Figur verdeutlicht :
Das Impfgut gelangt aus dem Kulturgefäss 1 in den Fermenter 2. Von dort wird die Kulturbrühe nach beendeter Fermentation in den Kessel 3 geleitet, und dort mit Calciumphosphatgel und Methanol gerührt. Das Gemisch wird sodann über das Kieselgur filter 4 in den Fällkessel 5 übergeführt. Es wird mit Methanol gefällt und das Sediment nach Entfernung der überstehenden Lösung im gleichen Kessel in Wasser gelöst. Die Lösung gelangt über die Ionenaustauscher 6 und 7 in die Sprühtrocknungsapparatur 8. Schliesslich wird das getrocknete Produkt konfektioniert (9).

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Laevanen von praktisch einheitlicher Molekülgrösse, dadurch gekennzeichnet, dass man einer Kultur laevanbildender Mikroorganismen oder der aus einer solchen Kultur gewonnenen zellfreien Laevansucrase Saccharose und mindestens einen Stoff zusetzt, der Laevansucrase adsorbiert.

   UNTERANSPRUCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man in Maisquellwasser dispergierte Laevansucrase-Adsorbentien verwendet.

   2. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dal3 man ausserdem der genannten Kultur oder der daraus gewonnenen Laevansucrase Ionen bzw. weitere Ionen zusetzt.