DE1617506C - Verfahren zur Herstellung von Pepton aus menschlicher Placenta für Bakterien-Nährböden - Google Patents

Description

Einfachheit halber als »feuchtes Sediment« bezeichnet) gesammelt wird.

Zu 90 kg dieses feuchten Sedimentes werden 60 1 Wasser zugegeben und danach 1,8 · 10⁵ Gelatineeinheiten eines pflanzlichen Proteolyseenzyms (Papain); der pH-Wert wird auf 6,5 bis 7,5 eingestellt und die gesamte Mischung bei 50 bis 60⁰C 10 bis 12 Stunden lang unter Rühren belassen und nach genügendem Eiweißabbau durch Zugabe von verdünnter Salzsäure auf pH 3,0 angesäuert. Restliches Protein wird durch Aufheizen koaguliert, ausgefällt und abfiltriert. Das Filtrat wird weiter 30 Minuten lang in einem Hochdruckdampfautoklav auf 12l°C aufgeheizt und dann zum Abkühlen stehengelassen. Der resultierende Niederschlag wird durch Filtrieren abgetrennt und das Filtrat in einem Zerstäubungs- oder Trommeltrockner entwässert. Man erhält 6900 g eines getrockneten pulverförmigen Peptons mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 4% oder darunter.

Analysenergebnisse eines so hergestellten Peptons für Bakterienkulturen werden weiter unten angegeben.

Wenn man dieses Pepton in gewöhnlichem Wasser auflöst zur Herstellung einer 2%'ge·¹ Lösung, deren pH-Wert mit schwachem Alkali auf etwa 7,2 eingestellt wird und Staphylokokken, Ruhrbazillen (Salmonella) und Cholerabazillen (Vibrion) nach der Wärmesterilisierung darin kultiviert werden, zeigen alle diese Bakterien ein ausreichend günstiges Wachstum und Vermehrung und keinerlei nachteilige Erscheinungen verglichen mit Kulturen aus Milchcasein, das bisher bekanntermaßen verwendet wurde.

Beispiel 2

60 1 Wasser werden zu 90 kg des in gleicher Weise wie im Beispiel 1 erhaltenen feuchten Sediments gegeben, dessen pH-Wert dann mit Salzsäure auf 3,0 eingestellt wird. Weiter werden 4,5 · 10¹ »Frud«-Einheiten Pepsin zugegeben und die Mischung 7 bis 9 Stunden lang bei 30 bis 39°C gerührt. Das restliche Protein wird durch Wärniekoagulation ausgefällt und filtriert, das Filtrat weitere 30 Minuten lang in einem Hochdruckdampfautoklav auf 12l°C aufgeheizt und zum Abkühlen stehengelassen. Der resultierende Niederschlag wird durch Filtrieren abgetrennt und das Filtrat mit einem Zerstäubungs- oder Trommeltrockner entwässert. Man erhält so 1930 g eines getrockneten pulverförmigen Peptons mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 4°/₀ oder weniger.

Dieses Pepton für Bakterienkulturen wurde in folgender Weise analysiert und untersucht:

20 g dieses Produktes wurden in 1000 ml Wasser zusammen mit 7,5 g Glucose, 0,2 g Cystin, 0,01 g Ka-Humdihydrogenphosphat und 0,01 g wasserfreiem Dinatrivmhydrogenphosphat nach bekannter Vorschrift gelöst; der pH-Wert wurde mit Natriumhydroxid auf 7,3 eingestellt, die Lösung in Flaschen oder Kolben verteilt und mit Paraffin überschichtet und 20 Minuten lang in einem Hochdruckdampfauloklav bei 12l°C zur Herstellung eines allgemein verwendeten Kulturmediums für eine anaerobe Kultur 20 Minuten lang sterilisiert. Dieses Kulturmedium wurde mit Tetanusbazillen (Clostridium tetani) beimpft, die bei 37"C 7 bis 9 Tage lang kultiviert wurden. Die Kühlflüssigkeit wurde dann durch ein Diatomeenerdefilter gegeben und im F ltrat die Tetanustoxinkonzentration in bekannter Weise bestimmt. Dabei wurde bei Bestimmung mit Standard-Tetanusantitoxin eine Virulenz beobachtet, die potentes Toxin mit Z, nicht über 0,035 ml produzieren konnte, und es wurde nicht die geringste Verschlechterung im Vergleich zu Pepton aus Milchcasein festgestellt.

Die Ergebnisse einer chemischen Analyse der Peptone nach Beispiel 1 und 2 sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

Bestimmung

(1) Gesamtstickstoff

(2) primärer Proteosestickstoff

(3) sekundärer Proteosestickstoff

(4) Peptonstickstoff

(5) Ammoniakstickstoff

(6) freier Aminstickstoff .

(7) Monoaminstickstoff

(8) Diaminstickstoff

(9) Tryptophan

(10) Tyrosin

(U) Cystin

(12) Asche

(13) ätherlösliches Extrakt

(14) Wasser

Pepton nach Beispiel 1

13,01 0,18

1,24 10,71 0,88 4,10 8,85 3,11 0,89 0,71 0,35 11,98 0,95 3,5

Pepton nach Beispiel 2

«ι

la

11,30 1,25

5,72 3,46 0,87 2,21 7,30 2,75 0,53 2,07 0,28 25,0 0,43 4,0

Die in der vorstehenden Tabelle angegebenen Werte wurden folgendermaßen bestimmt:

Der Gesamtstickstoff (1) wurde nach Kjeldahl erhalten; der primäre Proteosestickstoff (2) wurde ebenfalls nach Kjeldahl bei einer Fraktion bestimmt, die durch 50%ige Sättigung mit Zinksulfat ausgefällt wurde; der sekundäre Proteosestickstoff (3) wurde wiederum nach K j e 1 d a h I bei einer Fraktion bestimmt, die durch 100%ige Sättigung mit Zinksulfat ausgefällt wurde; der Ammoniakstickstoff (5) wurde durch Bestimmung des bei Destillation der unveränderten (nicht irgendwie zersetzten) Probe mit Alkali aufgefangenen Ammoniaks erhalten; der freie Aminstickstoff wurde nach Van-SIyke untersucht und der Peptonstickstoff (4) wurde durch Subtraktion der Summe der Werte von (2), (3) und (5) vom Wert (I) erhalten.

Wenn eine geringe Menge der nach Beispiel I und 2 erhaltenen Peptone wiederholt beim Kaninchen injiziert und das von diesem Kaninchen 3 Wochen nach der letzten Injektion erhaltene Imnuinserum mit Seren von anderen Tieren und wasserlöslichen Muskelextrakten vom Menschen, vom Pferd, von der Kuh, vom Schaf und von der Ziege nach der bekannten Fällungsreaktion untersucht wurde, konnten bisweilen schwache Fällungslinien beim menschlichen Serum beobachtet werden, die Reaktionen mit Proteinen von anderen Tieren waren dagegen stets negativ. Trotz dieses Ergebnisses einer solchen Untersuchung in vitro ist jedoch, da das Ausgangsmaterial menschliches Placenta ist, kein artfremdes Eiweiß für den Menschen enthalten, und demgemäß sind in Impfstoffen und Toxoiden für die Präventivimpfimg. die unter Verwendung der aus menschlicher Placenta hergestellten Peptone als Kulturmedium erzeugt werden, kein? Ursachen für irgendeine Fremdeiweißreaktion enthalten (mit Ausnähme von Spuren von Hiweiß, das vom Schwein herstammt und mit dem Pepsin eingebracht wird), so daß keinerlei Gefahr hinsichlich schädlicher Sekundärreaktionen durch artfremde Eiweißstoffe, besteht.

Claims (2)

1 2 wenn auch selten, beobachtet. Eine besonders ernst- Patentansprüche: hafte Gefahr besteht bei der Injektion von Antidiph- therieserum und Antitetanusserum, die hauptsächlich.

1. Verfahren zur Herstellung von Pepton aus aus Pferdeserum gewonnen werden, wenn von der menschlicher Placenta für Bakterien-Nährböden, 5 Proteolyse von Eiweißbestandteilen des Pferdekörpers dadurch gekennzeichnet, daß man aus . herrührende Komponenten als Materialien für die Erfeinzerkleinerter Placenta durch Behandeln der- zeugang der Impfstoffe verwendet werden. Durch das selben mit physiologischer Kochsalzlösung die »Department of Public Weifare« wurde daher die Ver-Zellbestandteile gewinnt, hierauf die Zellbestand- wendung von Muskelfleisch vom Pferd für Kulturteile durch enzymatische Proteolyse zu Peptonen in io medien für die Erzeugung von Keuchhusten-Impfansich bekannter Weise abbaut und nach dem übli- stoffen, Diphtherietoxoiden und Tetanustoxoiden unchen Ausfällen des koagulierbaren Eiweißes mit tersagt.

Hitze die Peptone aus der Flüssigkeit gewinnt. Ziel der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Her-

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- stellung von Peptonen für Bakterienkulturen aus Eizeichnet, daß als Proteolyseenzym Pepsinhydro- 15 weißstoffen, die keinerlei artfremde Proteine für den chlorid oder Papain verwendet werden. menschlichen Körper enthalten.

Bei der Suche nach nicht artfremden Eiweißstoffen, die vom menschlichen Körper vertragen wurden,

wurde nun in der nach der Entbindung erhaltenen

20 menschlichen Placenta, die üblicherweise als Abfall beseitigt wird, eine sehr brauchbare Peptonquelle ge-

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur funden. Die menschliche Placenta wiegt im Mittel

Herstellung von Pepton aus menschlicher Placenta für 600 g; sie enthält etwa 10% Protein und besteht zu

Bakterien-Nährböden. etwa 85% aus Wasser. Aus diesem Ausgangsmaterial

Peptone werden für Bakterien-Nährböden insbe- 25 kann durch geeignete. Proteolyse Pepton für Bakterien-

sondere für pathogene Keime oder zur Gewinnung von kulturen gewonnen werden.

Kulturprodukten von Mikroorganismen seit langer Das erfindungsgemäße Verfahren ist demgemäß da-Zeit verwendet und durch Abbau natürlicher Eiweiß- durch gekennzeichnet, daß man aus feinzerkleinerter stoffe, wie Milchcasein oder Fleisch usw., erhalten. Placenta durch Behandeln derselben mit physiologi-Die Hauptkomponente dieser gebrauchsfertigen Pro- 30 scher Kochsalzlösung die Zellbestandteile gewinnt, dukte ist nicht Pepton im chemisch engeren Sinnj, hierauf die Zellbestandteile durch enzymatische ProteosonJern es sind Stickstoffverbindungen, die von ver- lyse zu Peptonen in an sich bekannter Weise abbaut und schiedenen Stufen der Proteinhydrolyse stammen und nach dem üblichen Ausfällen des koagulierbaren Eivon Proteosen mit hohen Molekulargewichten bis zu weißes mit Hitze die Peptone aus der Flüssigkeit geAminosäuren mit vergleichsweise geringem Moleku- 35 winnt.
largewicht reichen. Aus der deutschen Patentschrift 545 287 ist zwar die

Peptone, die für Bakterienkulturen bzw. die dafür Gewinnung eines Bakteriennährmediums ausgehend

erforderlichen Nährböden verwendet werden, müssen von menschlicher Placenta bekannt. Hierbei handelt

verschiedenen unterschiedlichen Anforderungen ge- es sich jedoch um einen Extrakt, der durch Auskochen

nügen. So weiß man beispielsweise, daß für Kultur und 40 von Placenten mit Wasser erhalten wird, also mit dem

Vermehrung einer Mehrzahl von Kn;n'<heitskeimen erfindungsgemäß aus den Zellbestandteilen gowon-

Peptonc geeignet sind, die durch Proteolyse bis zur nen Abbauprodukt nicht vergleichbar ist.

Aminosäurestufe erhalten werden, wobei insbeson- Als Proteolyseenzym: werden beim, erfindungs-

dere Tryptophan und ein hoher Cystingehalt für die gemäßen Verfahren Pepsin-hydrochlorid oder Papain

biologische Differenzierung von Bakterien von. Bedeu- 45 bevorzugt.

U-.ng ist, während proteoserciche Peptone, die durch Aus der nach dem Eiweißabbau und der Druck-Begrenzung der Proteolyse auf eine peptische Hydro- erhitzung erhaltenen überstehenden Flüssigkeit kann lyse hergestellt werden, eher für die Erzeugung von das Pepton durch Verdampfen des Wassers etwa in Ektotoxinen bevorzugt werden. einem Sprüh- oder Trommeltrockner gewonnen wer-

Da eine gewisse Kontamination des Kulturmediums 5° den.

mit Komponenten des Ausgan^smaterials unvermeid- Es folgen Beispiele zur Erläuterung der Erfindung,

lieh ist, gelangen diese Stoffe bei der Herstellung von . .

irgendwelchen bakteriellen Impfstoffen oder Toxoiden Beispiel!

die sich von Bakterientoxinen ableiten, in das Fndpro- Frischgewonnene menschlicho Placenta wird zur

dukt und werden bei der Injektion, wenn auch übli- 55 Verhinderung von Faul- oder Verwesungserscheinun-

cherwcisc nur in Spuren, parenteral in den menschli- gen sobald wie möglich in einem Kälteaggregat ge-,

chen Körper eingebracht. Wenn nvn als Ausgangsma- froren. Von solcher gefrorenen, in Krankenhäusern

terialien für die Herstellung der Peptone Milchcasein, und Entbindungsheimen gesammelten Placenta wer-

Rindfleisch, Muskelfleisch von Pferd oder Wal, Fisch- den 500 Stück entnommen, in einer Eismühle grob

fleisch oder Sojabohn-jnsiwciß verwendet werden, ge- 60 zerkleinert und mit einem Flcischschneider fein zer-

ben diese Eiweißstoffe oder deren Hydrolysate, d. h. teilt. Die feinzerteilte Masse wird in 500 1 physiologi-

natürliche Albumoscn, als artfremde Eiweißstoffe eine scher Kochsalzlösung (0,85- bis 0,9%igc Salzlösung)

immunologische Reaktion im menschlichen Körper heftig gerührt und das sich absetzende Material durch

und können möglicherweise Ursache für Allergien und Zentrifugieren gesammelt. Extrazellulare Anteile, wie

Anuphylaxien sein. In der Tat werden nach der lnj;k- 65 Blut, amniotischc Flüssigkeit usw., werden durch

tion von Impfstoffen oder Toxoiden, die zum Zwecke Waschen entfernt, während das hauptsächlich aus

der Vorbeugung oder Behandlung von Krankheiten Zellgewebe bestehende und in physiologischer Koch-

verabreicht werden, schwere Sekundärreaktionen, salzlösung unlösliche Material (im nachfolgenden der