AT370767B - Verfahren zur herstellung eines pertussisimpfstoffes - Google Patents

Description

   <Desc/Clms Page number 1> 
 



   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Pertussisimpfstoffes zur oralen Verabreichung. 



   Bei der herkömmlich produzierten Vaccine liegt der Schutzwert parallel zur Keimzahl ; höhere Keimzahl bringt grösseren Schutz, ruft gleichzeitig aber auch stärkere Nebenwirkungen hervor. 



  Bei oraler Verabreichung ist eine höhere Antigenität notwendig, da der Verdauungstrakt passiert werden muss und ein Teil des Impfstoffes durch Proteolyse unwirksam wird. Würde man die Keimzahl erhöhen, wäre eine orale Verabreichung an Neugeborene nicht möglich, da die Keimzahl zu hoch wäre. Die Verabreichung soll aber im Neugeborenenalter erfolgen, da die Resorption zu diesem Zeitpunkt optimal ist und der Impfschutz schon sehr früh eintritt. 



   Es wurde daher nach einem Verfahren zur Herstellung eines Pertussisimpfstoffes gesucht, bei welchem bei gleicher Keimzahl eine höhere Antigenität erreicht werden kann. 



   Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung eines Pertussisimpfstoffes, bei welchem Verfahren man Stämme von Bordetella pertussis isoliert, lyophilisiert, aktiviert und daraus Vorkulturen züchtet, die man als Einsaatmaterial einsetzt, und besteht darin, dass man dieses Einsaatmaterial bei 32 bis   370C   in einem aus Aminosäuren,   z.

   B.   aus Casein, Mineralsalzen und Wuchsstoffen bestehenden Nährmedium, das ein die Glutaminsyntheseaktivität der Bordetella pertussis steigerndes Verhältnis zwischen zweiwertigen Kationen und Äthylendiamintetraessigsäure und/oder andern Chelatbildnern, wie Nucleotidphosphat, Tricarbonsäuren und organischen Phosphorsäureestern aufweist, unter Rühren und Belüftung züchtet, wobei man den PH-Wert im Verlaufe der Fermentation auf 7, 0 bis 8, 0 einstellt, anschliessend die Bakteriensuspension inaktiviert, durch Ultrafiltration einengt und auf bekannte Weise aufarbeitet. 



   Vorzugsweise wird während der ersten Fermentationsstunden nur schwach gerührt und nicht belüftet und erst bei fortgeschrittener Fermentation mit der Belüftung begonnen und die Rührgeschwindigkeit erhöht. 



   Es ist bekannt, hochvirulente Stämme von Bordetella pertussis durch Verwendung eines als "Hustenplatten"bezeichneten Nährbodens, abgefüllt in Petrischalen, von an Keuchhusten erkrankten Personen zu isolieren. 



   Diese Stämme werden auf einem bekannten Nährboden vermehrt und bezüglich ihres Agglutinogengehalts, ihrer Toxizität sowie Stabilität und Potenz gemäss WHO-Standard ausgetestet. 



    Toxizität :   
10 Mäuse erhalten i.   p.   je eine Dosis und werden 7 Tage lang kontrolliert. Keines der Tiere darf Erkrankungserscheinungen zeigen. Das Summengewicht am 3. Tag nach der Injektion darf jenes vor der Injektion nicht unterschreiten. Die Tiere müssen sich bis zum 7. Tag normal entwickeln. 



   Agglutinogengehalt :
Austestung erfolgt mittels Standardseren vom WHO-beauftragten GAMALAJA-INSTITUT in Moskau auf positive oder negative Agglutination. 



   Stabilität :
Der Keim behält seine in der Primärisolierung definierten minimalen Eigenschaftserfordernisse auch in den Folgegenerationen. 



   Potenz :
Ein Probeimpfstoff mit dem isolierten Keim bringt die von der WHO empfohlenen Schutzein-   heiten   im Challenge Test nach Kendrick. 



   Stämme, welche die geringste Toxizität und stabilste sowie potenteste orale Vaccine im Tierversuch aufzeigen, werden lyophilisiert und dienen als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemässe Verfahren, bei welchem die entsprechenden lyophilisierten Stämme aktiviert werden, so dass die drei von der WHO empfohlenen verschiedenen Agglutinogene im daraus zu produzierenden Impfstoff enthalten sind. 



   Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel, auf das sie jedoch nicht beschränkt ist, läher erläutert. 
 EMI1.1 
 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 1000 ml Nährlösung, inokuliert. Nach 24 bis 72stündigem Schütteln bei 100 bis 300 Umdr/min bei 370C auf einem Laborschüttler dienen einige dieser Erlenmeyersubmerskulturen als Einsaatmaterial für einen Produktionsfermenter mit 50   l   Nährlösungsinhalt. 



   Die Auswahl der Erlenmeyersubmerskulturen zur Einsaat in den Produktionsfermenter erfolgt nach den Kriterien des Fehlens von Fremdkeimen, des Bestehens der Phase I und des Vorhandenseins der entsprechenden Agglutinogene. 



   Zusammensetzung und Zubereitung der Nährlösung : 
 EMI2.1 
 
<tb> 
<tb> 15 <SEP> g/l <SEP> Caseinhydrolysat
<tb> 4 <SEP> g/l <SEP> Hefeextrakt
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> g/1 <SEP> Mg <SEP> Cl,-6H, <SEP> 0 <SEP> 
<tb> 0, <SEP> 2 <SEP> g/l <SEP> KCl <SEP> 
<tb> 0, <SEP> 2 <SEP> g/l <SEP> KH <SEP> 2 <SEP> PO. <SEP> 
<tb> 



  0,2 <SEP> g/l <SEP> Nikotinsäure
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> g/I <SEP> Glutathion
<tb> 
 werden in doppelt destilliertem Wasser gelöst und nach Zusatz von 6   g/l   Aktivkohle auf   100 C   erhitzt und für 15 min auf dieser Temperatur gehalten. Nach Abkühlung erfolgt die Einstellung des PH-Wertes auf 7, 2 mittels NaOH und Abfiltrieren der Aktivkohle über Faltenfilter. Das Filtrat wird über einen Seitzfilter sterilfiltriert und bis zur weiteren Verwendung kühl und dunkel gelagert. 



   Für die Fermentation selbst werden sterilfiltrierte Lösungen von EDTA (Äthylendiamintetraessigsäure) sowie Metallionen in entsprechenden Mengen der Nährlösung zugesetzt, so dass ein für die Steigerung der Glutaminsyntheseaktivität der Bordetella Pertussis optimales Verhältnis zwischen zweiwertigen Kationen und EDTA vorliegt.

   Folgende Konzentrationen gelangen zum Einsatz : 
 EMI2.2 
 
<tb> 
<tb> 5-10-'M-5-10-'M <SEP> EDTA <SEP> (Äthylendiamintetraessigsäure)
<tb> 1. <SEP> 10-3 <SEP> M <SEP> -1#10-3 <SEP> M <SEP> Mo+++
<tb> 5-10-'mum <SEP> Cd++
<tb> 1. <SEP> 10"''M-1-10-6'M <SEP> Mn++
<tb> 1-10-'M-1-10-'M <SEP> Cr++ <SEP> 
<tb> 1-10"''M-1. <SEP> 10-6'M <SEP> Ni <SEP> ++ <SEP> 
<tb> 1. <SEP> 10-3'M-1. <SEP> 10-5'M <SEP> Fe++
<tb> 1. <SEP> 10-3'M-1. <SEP> 10-5 <SEP> M <SEP> Fe+++ <SEP> 
<tb> 
 
Nach der Einsaat der Erlenmeyerkolbensubmersvorkulturen in den Fermenter (2 bis 3 1/50 1) erfolgt eine genaue Vorgangsweise für die Rührung, Belüftung und PH-Kontrolle. Als Fermenter wird ein Rührkessel aus Edelstahl mit Doppelmantel zur Temperaturkonstanthaltung und diversen Sonden, wie   PH -,-O ; -, Antischaum-und   Drucksonde, zur Kontrolle der Fermentation eingesetzt. 



   Während der ersten 2 bis 12 Fermentationsstunden wird nur schwach gerührt (100 bis 300 Umdr/min) und nicht belüftet. 



   Während der 12.-48.-72. Fermentationsstunde wird mit 0, 5 bis 1 Vol. Luft/Vol. Nährlösung belüftet und die Rührgeschwindigkeit zwischen 300 und 700 Umdr/min gehalten. 



   Während der   12.-48-72.   Fermentationsstunde wird der PH-Wert durch Zusatz von Glutaminsäure auf p = 7, 2 eingeregelt, um optimale Bedingungen für die Steigerung der Glutaminsyntheseaktivität zu erhalten. 



   Nach Beendigung der Fermentation (nach 48 bis 72 h, wobei hier als Kriterium die Zelldichte und das mikroskopische Bild gilt) erfolgt schonende Inaktivierung (1/2 h bei 56 C unter Merthiolatzusatz 1 : 20000) im Fermenter. Sodann wird das Ultrafiltrationsgerät direkt an den Fermenter angeschlossen und unter Kühlung die Bakteriensuspension von 50 1 schonend auf 5 1 eingeengt. 

 <Desc/Clms Page number 3> 

 



   Nach dieser Prozedur erfolgt die bekannte Aufarbeitung wie Waschen und Einstellen auf die erforderliche Aktivität. Die Wirksamkeit wird durch orale Immunisierung von neugeborenen Mäusen mit anschliessender intrazerebraler Challenge ausgetestet. 



   Nach den übrigen bekannten Testungen betreffend Identität, Sterilität, PH-Wert und Toxizität erfolgt die Abfüllung in Kunststoffbehälter als Einzeldosis. 



    PATENTANSPRÜCHE :    
1. Verfahren zur Herstellung eines Pertussisimpfstoffes, bei welchem Verfahren man Stämme von Bordetella pertussis isoliert, lyophilisiert, aktiviert und daraus Vorkulturen züchtet, die man als Einsaatmaterial einsetzt, dadurch gekennzeichnet, dass man dieses Einsaatmaterial bei 32 bis   37 C   in einem aus Aminosäuren,   z.

   B.   aus Casein, Mineralsalzen und Wuchsstoffen bestehenden Nährmedium, das ein die Glutaminsyntheseaktivität der Bordetella pertussis steigerndes Verhältnis zwischen zweiwertigen Kationen und Äthylendiamintetraessigsäure und/oder andern Chelatbildnern, wie Nucleotidphosphat, Tricarbonsäuren und organischen Phosphorsäureestern aufweist, unter Rühren und Belüftung zündet, wobei man den   % -Wert   im Verlaufe der Fermentation auf 7, 0 bis 8, 0 einstellt, anschliessend die Bakteriensuspension inaktiviert, durch Ultrafiltration einengt und auf bekannte Weise aufarbeitet.

Claims (1)

1. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man während der ersten Fermentationsstunden schwach rührt, ohne zu belüften.

   3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man bei fortgeschrittener Fermentation die Rührgeschwindigkeit erhöht und die Belüftung aufnimmt.