DE950675C - Verfahren zur Gewinnung Vitamin-B-aktiver Substanzen aus ihren Loesungen - Google Patents

Description

• Verfahren zur Gewinnung Vitamin-B12-aktiver Substanzen

  aus ihren Lösungen

  Die Erfindung betrifft die Gewinnung von

  Vitamin-B12 aktiven Subsitanzen aus ihren Lösun-

  gen, insbesondere eine neue Gewinnungsmethode

  unter Verwendung von Harzen, deren Adsorptions-

  vermögen auf der Anwesenheit freier Carboxyl-

  gruppen,beruht.

  Mit denn Ausdruck »Virtamin-B12 aktive SubstanZ-

  zen« werden das Vitamin B12 selbst und mit diesem

  eng verwandte »Vi,tamin-B12 an ;logea Substanzen«

  bezeichnet, die sieh bekanntlich vom Vitamin B12

  dadurch unterscheiden, da,ß sie an Stelle der C N-

  Gruppe eine andere charakteristische Gruppe oder

  ein Anion enthalten.

  Eis ist bereits bekannt, d;aß ein Carbons.äure-

  gruppen enthaltendes Austauscherharz eine hohe

  Kapazität für die Adsoarption von. Vitamin B12 be-

  sitzt. Das Austausehemharz wurde dabei zuerst in

  die Natriumfomm umgewandelt, mit Natriu@macetait/

  Es.s,iigsänrre auf ein pIi von 5 abigepuffert und dann

  mit einer Vitamin-B12 Brühe beladen. Es, zeigte

  sich jedoch, daß das angewendete Verfahren völlig

  ungenügend war, reines Vitamin B12 zu gewinnen

  und Vi,tamin-Bl2-aktive Substanzen in technfischem

  Maßstab herzustellen.

  Es wurde nun die überraschende Feststel-

  lung gemacht, daß unter bestimmten Bedingun-

  gen die Carbonsäureaustauscherharze eine außer-

  ordentliche Wirksamkeit zur Adsorption Vitamin-

  13..-aktiver Sur stanzen aus wäßriigen Lösungen. be-

  sitzen und daß durch Verwendung bestimmter

  Eluierunigsmittel die Vitamin-BU-aktiven Substan-

  zen quantitativ vom Harzadsorbat eiluiert werden

  können. Wesentlich isst dabei, d:aß das Carbansäu,re-

  harz vollständig in Wasserstofform vorliegt und

  die wäßrige Lösung mit der Vi:ta@mi.n-B12 aktiven

  Substanz ein PH von etwa 2 bis 3 besitzt. Entischei-

  dend für die quantitative- Elution der Vitamin-B,2-

  aktiven- Substanzen vom Harzads:orbat ist schließ-

  filch, daß ein basisches Eluie@rungsm:ittel verwendet

  wird, um dies Carbonsäureaustauscherharz in die

  Salzform umzuwandeln. Diese Erkenntnis steht in

  direktem Gegensatz zu den seit langem angewende-

  ten Verfahren zur Adsorption und. Elution bei

  Kationenaustauscherharzen; die klassische Arbeits-

  metho,de- bestand diarin, daß man, eine Lösung mit

  einem pii um 7 in. Kontakt mit einem Austau:scher-

  harz in Salzform brachte und das gewonnene

  Adsorhat gewöhnlich mit einer sauren Lösung

  eluierte.

  Typische Vertreter von Carbonsäure@Kationen-

  austamsche.rhar7 sind die durch Mischpolymerisa-

  tion von Divinylbenzol und Acrylsäure oder Meth-

  acrytsäure gebildeten Harze sowie die durch Misch-

  polymerisation von Resomcyl,säure und Formaldehyd

  gebildeten Produkte (z. B. Wofatiit C). DicKationen-

  aus.tauschkap:aizität dieser Harze beruht im wesent-

  lichen auf ihren Carboxylgruppen.

  Bei Durchführung der Erfindung empfiehlt es

  siech, ein Harz zu verwenden, welches durch Misch-

  polymerisation von Acryl- oder Metharryls-äu:re und

  Divinylb,einzol gewonnen wird, vorzugsweise ein

  solches mit einer verhältnismäßig parösenStruktu:r.

  Die durch Kondensation von Phenol und Form-

  aldehyd gewonnenen Harze erhalten eine poröse

  Struktur, wenn man in an sich bekannter Weise die

  Kondensationsreaktion die; Stufe eines wäßrigen

  Gels. durchschreiten läßt. Bei Mischp.olymerfsaten

  aus polymeris.ierbaren Säuren und Di:vnylverbin-

  dunggen hängt die Porosität großenteils von dem

  Grad der Vernetzung mit der Divinylkomponnente

  ab. Die Divinylkomponente trägt zwar zurr Wasseir-

  unlösliehkeit und in einem gewissen Grade auch

  zur Härte das Harzes, beisetzt aber gleichzeitig

  auch die Porosität herab. Es ist deshalb zweck-

  mäßig, ein Harz zu verwenden, das die geri:ngst-

  mögl:iche, für die verlangten physikalischen. Eigen-

  schaften eines Katiicnenaus.tanschers jedoch noch

  ausreichende Menge an Divinylbenzol enthält.

  Am besten geeignet sind Kopolymere von Acryl-

  oder Methacryls,äure und Divinylbenzod, wobei der

  Divinylbenzoilantei,l 21/2 bis 511/9 des Harzes aus-

  machen sohl. Größere Mengen. von, Divinylbenzol

  verursachen einen Kapazi@tätsverhsst des Harzes.

  Es empfiehlt isich, die Harze vor dem Gebrauch

  zunächst mit einer Alkal.ilösung zu behandeln und

  dann durch Waschen mit Säure vollständig in: seine

  Wasserstofform umzuwandeln.

  Das Verfahren- wird durchgeführt, indem die wäß-

  rigeVitamin-B12-aktive Substanzen, wie VitaminB12,

  Vitamin Blza enthaltende Lösung bei einem

  pH-Wert von etwa .2 bis 3 in innigen: Korntakt mit

  einem Carbo:nsäureaustanscherharz gebracht wird.

  Das pH der wäßrigen Lösung muß im Bereich von

  etwa 2 blis 3 gehaflten werden, da pH-Werte, merk-

  lich unterhalb z oder oberhalb 3 die Adsorption

  von Vitamin-B12 aktLiven Substanzen durch das

  Harz wesentlich herabsetzen. Die Adsorption kann

  entweder durch Au.fschlämmiunig des Harzeis. in der

  Lösung erfolgen: oder man kann die Lösung des

  Vitamin-B12 aktiven Materials durch eine Säule des

  Carbonsäu.reaustauscherhairzes leisten. Für eine

  optimale Adsorpti.an sind gewöhnlich ro bis

  30 Minuten ex-forderlich.

  Das Adsorptions-(Extraktions-) Verfahren ist all-

  gemein auf die Gewinnung Vitamin-B12 aktiver

  Substanzen aus wäßrigen: Lösungen anwendbar,

  wie z. B. wäßrige Fermentationsflüssigkeiten, wäß-

  rige Konzentrate derVi,tamin-B12 aktiven Substanz

  u. dgl. Bei der eirfindungsglemäßen Verwendung von

  Carbonsäureaustauscherharzen empfiehlt es sich,

  Fermentationsflüssigkeiten als am meisten ver-

  wendetes Rohgut zu verwenden. Die Vitamin-B12-

  aktiven Substanzen. können 'dabei durch Feirmenta-

  tion der üblichen; Nährmedien mit Mikroorganismen

  gewonnen werden, z. B Streptomyces griseus, Bacil-

  lus megatherium, Alkaligenes faecadis, Alternaria

  alevaeca, Pseudomo:nas sp., Mycobacterium sme-

  gmatifs. Streptomyces fradiiiae und anderem:. In

  gleicher Weise können auch Viitamin-B12 aktive

  Substanzen aus wäßrigen Extrakten und Ver-

  dauungsprodukten von Zellen von. Mikroorganes-

  men, Rieselfeldsch:lämmen u. dgl. emtfernt werden.

  Die Eluierung der Vitamin-1312-aktiven Stoffe

  wurde bisher mittels saurer Lösungen vorgenom-

  men, wobei jedoch gewöhnlich nur etwa die Hälfte

  des Materials vorn- Harzadsorbat abgetrennt wer-

  den konnte. Es wurde nun gefunden, daß stark

  basische Lösungen die Vitaxnin-B12 aktiven Sub-

  stanzen quantitativ vom Ionenausbauscherharz

  eluieren. Es wurde ferner feststellt, daß das

  Eluierungsmittel eine, genügende Basemmenge ent-

  halten m:u:ß, damit die Umwandlung des Carbon-

  säureh:airzes in die Salzform vollständig erfolgt.

  Außerdem soll das pli des. Eluierungsmittels ober-

  halb etwa r o, vorteilhaft beii: 13 oder darüber liegen.

  Als E.luierungsmittel kann man in an sich be-

  kannte- Weise Lösungen organischer Basen ver-

  wenden, z. B. wäß.riges Pyridin, wäßrigies Picalin

  u. d'gl. Es empfiehlt sich jedoch, Lösungen an-

  organischer Basen:, wie: wäßrige Natronlauge, Kali-

  lauge, wäß,riges Trinatriumphosphat, Ammonium-

  :hydroxyd u.. dgl. zu verwenden. Bei diesen Lösun-

  gen erreicht man nicht nur die quantitative Elution

  der Vitamin-B12 aktiv en Substanzen, sonndeTn man

  erhält auch minimaile Eluatmengen. Sie verhindern

  zudem die Korrosionsbildung und lassen. das

  Problem der Lösungsmittelrückgewinnung und der

  Beseitigung der Abfälle nicht in Erscheinung

  treten.

  Arbeitet man ein einer Kolonne, se leitest riian das

  Eluierungsmittel mit einer geeigneten Geschwin-

  digkeit zweckmäßig aufwärts durch dies Harz-

  adsorbat, bis. die abströmende Flüssigkeit ein pH von über etwa 9 hat und nicht mehr gefärbt ist. Bei ab@s.atzweiisem Betrieb werd die Eluierung in entsprechender Weise fortgesetzt, bis das pH der Flüssigkeit oberhalb 9 liegt und das Eluat nicht mehr gefärbt ist. Es isst zweckmäßig, die Vitam.in-B12 aktivenSubstanzen nicht al:lzulange im Kontakt mit einer Lösung, deren pli über etwa 12 liegt, zu belassen, da in solch. stark beisischen Lösungen dass Vitamin zerfällt. Beispiel i Ein körniges Mischpolymerisat aus Methacrylsäure und. etwa 5 % Divinylbenzol wird im Verhältnis i : i zweimal mit io°/aiger wäßri@ger Natroin,lau:ge aufgeschlämmt, das, Harz in eine Adsarptionssäule eingebracht und mit dem gleichen Anteil io%igeir wäß:riger Natronlauge bieschickt. Nun werden 3 Volumteile, bezogen auf das eingesetzte Harz, io%-ige wäßrigeSalzsäure durch das Harz geleitet und dieses zwecks Entfernung von Natriumchlorid und. übarschüs,siger Salzsäure anschließend mit Wasser gewaschen. Das.sobeh.andel:te, Harz liegt in Was,serstoform vor.
• Eine Fermentaitionsflüssigkeit, die durchFermentation eines. üblichen Nährmediums mit einem Vita,min-B12 erzeugenden Stamm von Streptomyces griiseus gewonnen wurde, wird filtriert und mit Mineralsäure auf ein pH von etwa 3 eingestellt. Der Gehalt der filtrierten Flüssigkeit an Vita-min-B12-aktiven Substanzen beträgt etwa 0,00004 bis o,ooo2 Volumprozent und etwa o,oo2 bis o,oo8%, bezogen auf gelöste Feststoffe. Es werden nun 6o Volumenanteile, bezogen, auf das eingesetzte Harz, dieser Brühe durch die Harzsäule geleitet,, wobei dein Oberflächenkontakt 2o Minuten beträgt. Die Säule wird anschließend mit Wasser gespült, um die restlichen Anteile der Brühe zu entfernen. Der Durchbruch von Vi.taimi:n-B12 aktiven Sübstanzen liegt in der Größenordnung von 40/0.
• Eine 3%ige wäßrige Natronlauge (die eine geringe Menge, etwa o,o i %, Na C N enthalten kann, um die Vitamin-B12 analogen Substanzen in Vitamin B12 umzuwandeln) wird bei einer Ver.weidzeit von 6o Minuten durch dass. Harz geleitet, bis die abströmende Flüssigkeit ein pH über 9 hat 'und nicht mehr gefärbt Ist. Gewöhnlich sind hierfür mehrere Volumina Lösung erforderlich. Dieses Verfahren führt zu einer fast quantitativen Eluierung des Vitamin-B12-aktiven Materials vom Harz. Die Vitamin-B12-#aktiven Substanzen im Eluat haben eine Reinheit vorn etwa o,2 bis o,8°/0, bezogen auf den Feststoffgehalt des Eluates. Beispiel 2 Das in Beinspiel i beschriebene Verfahren wird mit der Maßgabe wiederholt, diaß zwei Haxzs.äulen: in Reihe geschaltet sind, deren jede dus gleiche Volumen Harz enthält, wie es in. Beispiel i für die Füllung der Säule verwendet wurde. Die doppelte Menge der filtrierten. Brühe, wie sie in Beispiel i verwendet wiird, wird hintereinander durch die beiden Harzsäulen geleitet Unter diesen Arbeitsbeding u-ngen beträgt der Durchbruch von Vitam:in-B12 aktiven Material nur etwa i 0/0. Etwa 85 bis 90°/o der Vitam.in-B12 -aktivem: Substanzen weir en in der ersten Harzsäule ad-sorbient, der restliche Anteil in der zweiten. Die zweite Säule kann dann beim nächsten Mal an erster Stelle: geschaltet werben, bis .sie genügend beladen ist. Die Vitamin-Substanzen, werden. dann vorn den Säulen. in der oben beschriebenen Weise eluiert; die Reinheit der Vitaimiin-B12 aktivem Substanz im Eluat beträgt ebenfalls etwa o,2 bis o,80io.

  Beispiel 3

  Ein Elwat, welches Vitamin-B12 aktive Substan-

  zen enthält und gemäß Beispiel i erhalten wurde,

  wird durch Zusatz von Minerallsäure auf PH 3 ein-

  gestellt und die ausgefallenen VeTunreinigungen

  abfiltriert. Die filtrierte, Lösung wiird durch eine

  Säule geleitet, die das in Beispiel i verwendete Harz

  in Wasserstofform enthält. Die Harzmenge beträgt

  nur ein Zehntetl des: dort verwendeten H.arzvo@lumens

  und die Kontaktzeit etwa 40 Minuten.: Das Vit-

  amin-Bl2-aktive Material wird von dem Harz mittels

  wäß.riger Natronlauge gemäß Beispiel i elu@iert. Das

  Eluat wird mit Mineralsäure auf PH 3 eingestellt

  und die ausgefallenen Verunreinigungen abfltriert.

  Die filtrierte Lösung wird dreimal mit 1/1o Volumen

  eines. Gemisches von Kresol-Tetrachlorkothlenstof

  (i :2) extrahiert. Zu, den vereinigten Auszügen

  setzt man 2 Volumina (bezogen auf d;as Volumen

  der Extrakte) Aceton: und 2 Volumina D:iäthyl-

  äther. Die entstandene Awsfällu.ng wird filtriert

  und getrocknet. Man erhält ein Konzentrat von

  etwa io bis 15% Vi.taimin-B121akti@vem Material.

  Beispiel q.

  5oVo,lumenanteile (bezogen .auf dieMengeH.arz)

  einer durch Ferrnei.tieren eines, üblichen Nähr-

  mediums unter Verwendung eines Vi,tamin B12 er-

  zeugenden Stammes von Baci:llus. megatherium bzw.

  Alkaligenes faecalis gewonnenen, filtrierten und

  mit Mineralsäure auf ein pli von etwa 3 eingestell-

  ten Fermentationsbrühe mit einem Gehalt von etwa

  o,oooo2 bis o,ooo1 % an Vitamin-B12-akti:ven Sub-

  stanzen, bezogen auf das Volumen der Brühe, wer-

  den bei einer Oberflächenkontaktzeit von io Minu-

  ten durch eine nach Beinspiel i verbereitete Harz-

  säule geleitet; anschließend wird die Hairzsä ule, mit

  Wasser gereinigt. Der Durchbruch der Vitamin-

  Bi.-aktiven Substanzen liegt in der Größenordnung

  von q.0/0.

  Es wiird nunmehr eine 3%ige wäßrige Kalilauge

  bzw. 3%iiges wäßriges Ammoniurnihydiro@xyd (die

  Lösungen können eine geringe Menge, etwa o,oi %,

  NaCINT enthalten, um die Vitamin-B12=analogen

  Stoffe in Vitamin. B12 umzuwandeln) durch dies

  Harz bei, einer Kontaktzeit von 6o Minuten gei

  leitet, bis die abströmende Flüssigkeit ein pli von

  über 9 halt und nicht mehr gefärbt is-t. Gewöhnlich

  sind: mehrere Harzvolumina Lösung erforiderlich.

  Dieses Verfahren führt ebenfalls zu einer fast

  quarntitatixen Elution des Vitaniin-B12 ,aktiven

  Materials vom Harz; dieVitamin-B" aktiven Su'b-

  stanzen im Eluat haben eine Reinheit von etwa o,2 bis o,8%, bezogen auf den Fesfisitoffgehalt des Eluates.

Claims (1)

1. PATENTANSPRÜCHE: i. Verfahren zur Gewinnung Vitamin-B12- aktiven MateriaIs aus wäßrigen, Vitamin B12 enthaltenden Lösungen, dadurch gekennzeich- net, daß man die, Lösungen bei einem p,1 von etwa z bis 3 mit einem Kationenaustauscher- harz, dessen. Austauschkapazität auf der An- wesenheit von in Wasserstofform vorliegenden Carboxylgruppen beruht, in Kontakt bringt und das gewonneneHarrzadsoTb,ait mit einerwäß.rigen alkalischen Lösung mit einen PH oberhalb io, vorzugsweise 13, eluiert. z. Verfahren nach Ansprach i, dadurch ge- kennzeichnet, daß man einKationenan:stauscher- harz verwendet, das durch Mischpolymerisa- tion aus Divinylbenzol und Acrylsäure bzw. Merh@acryls;äu.re her-gestellt worden ist. 3. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, da:B man ein Kationennustau-scherh,arz verwendet, das durch Kondensation eines Phenols und eines Aldehydes., von denen eines eine Carboxylgruppe enthält, hergestellt worden isst. q.. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsgut ein Nährmedium verwendet, in welchem das Vitamin B12 mit Hilfe von Streptomyces gezüchtet worden ist, das pti dieses Kulturmediums auf etwa 3 eins-teUt und es dann miteinem Kationenaustauscherharz in: Kontakt bringt, das durch Mieahpolymerisation von a1/2 bis 5 Teilen Divinylbeizol und 95 bis 97,5 Teilen Methacrylsäure hergestellt worden ist und in Wasserstoff fffonn vorliest. 5. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsgut eine Fermentationsbrühe des Vitamin-B12 aktiven Materials verwendet.