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Verfahren zur Gewinnung von Cyanocobalamin
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von Cyanocobalamin, das in einer kombinierten aufeinanderfolgenden Behandlung von vitamin B12-enthahenden Rohstoffen, wie Lösungen bzw. Konzentraten, mit Sulfitund Cyanid-Ionen besteht.
Bekanntlich gibt es verschiedene Formen oder Modifikationen des Vitamin B12, die sich dadurch voneinander unterscheiden, dass verschiedene anorganische oder organische Verbindungen am zentralen Kobaltatom koordinativ (komplex) oder auch ionogen (dissoziierbar) gebunden sind. Unter. diesen Modifikationen oder Formen des Vitamins B12 ist am wichtigsten der mit
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delsülb1iche Form des Vitamins B12 vorstellt. In natürlichen Substraten liegt das Vitamin B12 ganz überwiegend in Protein-oder Peptid-Bindung vor. Zu seiner Freisetzung aus dieser gebundenen Form ist eine Behandlung der Ausgangsmaterialien, z. B. mit proteolytischen Enzymen oder durch einfaches Erhitzen zwecks Denaturierung und Koagulierung der Eiweissstoffe erforderlich.
Bei dieser Behandlung geht das Vitamin B als Hydroxo-bzw. Aquo-Komplex in Lösung. Um das Enderzeugnis Cyano-cobalamin zu gewinnen, müssen die in der erwähnten Weise erhaltenen Extrakte oder daraus hergestellten Konzentrate mit Cyanid-Ionen behandelt werden. Am zweckmässigsten erwies es sich aber, gleich die Vorbehandlung der Ausgangsstoffe in Gegenwart von Cyanid-Ionen vorzunehmen, weil dadurch die Freisetzung von Vitamin Btg geför- dert wird. Ferner wird die Ausbeute in Gegenwart von Cyanid-Ionen auch deshalb erhöht, weil die Cyano-Form des Vitamins Bu2 gegenüber Erhitzen bedeutend stabiler ist, als die ansonsten vorliegende Hydroxo-bzw. Aquo-Form.
Zur Erzielung der mit der Cyanid-Behandlung verbundenen Effekte sind mehrere Verfahren bekannt geworden.
Nach der deutschen Patentschrift Nr. 912743 bzw. der USA-Patentschrift Nr. 2, 530, 416 wer- den Kulturflüssigkeiten, die durch Züchtung von vitamin B12-produzierenden Mikroorganismen in einem geiegneten Medium vergoren wurden, oder Konzentrate solcher Kulturflüssigkeiten mit Cy- anid-lonen behandelt, wodurch die Ausbeute erhöht wird.
Nach dem Verfahren der deutschen Patentschrift Nr. 932981 werden Mikroorganismenmas- sen, wie z. B. Mycel von Streptomyces-Arten, die vitamin B12-aktive Stoffe enthalten, unter vorangehender oder gleichzeitiger Autolyse unmittelbar mit Cyaniden behandelt.
Ferner werden nach der brit. Patentschrift Nr.
693, 125 Konzentrate, die Vitamine der B12-Grup- pe enthalten, einer Behandlung mit Cyaniden usw. unterworfen, wobei evtl. während dieser Behandlung eine enzymatische Verdauung (z. B. mit Papain) vorgenommen wird.
Nach der brit. Patentschrift Nr. 727, 146 wird in der Weise vorgegangen, dass ein Rohmaterial, das wenigstens l"/o Vitamin B enthält, in wässeriger Lösung mit Cyanid-Ionen behandelt und der so gebildete Vitamin B-Cyanid-Komplex in Gegenwart von Ammonsulfat in n-Butanol aufgenommen wird.
In der deutschen Patentschrift Nr. 897316 bzw. in der gleichlautenden USA-Patentschrift Nr. 2, 650, 896 wird beschrieben, die Ausbeute an Vitamin B12 dadurch zu erhöhen, dass man bereits die zur B12-Erzeugung dienende Fermentation in Gegenwart eines Stoffes ausführt, der in der Lage ist, an den Organismus die Cyan-Gruppe abzugeben. Man verwendet dabei entweder ein ionisierbares Cyanid oder eine CyankomplexVerbindung, wie Kaliumferrocyanid oder Kali- umferricyanid.
Ferner ist es bekannt Kulturflüssigkeiten nach beendeter B12-Fementation zwecks Freisetzung des Vitamins B12 mit Cyankomplexverbindungen wie Ferro- und Ferricyankalium etc. oder Nitri- len zu behandeln.
Allen diesen Verfahren haften, wie nachfolgende Ausführungen zeigen, bestimmte Nachteile an.
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Soweit man'bei. den genannten Verfahren Blausäure bzw. Cyanide auf ein grosses Flüssigkeitsvolumen und überdies unter Erwärmen einwirken
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freizusetzen und ge-gen Zerstörung zu schützen, ist die Handhabung der relativ grossen Mengen an Blausäure bzw.
Cyaniden nicht ungefährlich und daher mit gewissen Schwierigkeiten verbunden. Es sind jedenfalls besondere Vorsichtsmassnahmen erforderlich, die den technischen Betrieb erschweren.
Lässt man aber Blausäure oder Cyanide erst auf Konzentrate einwirken, was infolge des weitaus geringeren Volumens bereits viel einfacher und ungefährlicher ist, so muss man auf den Effekt der Freisetzung und Stabilisierung des Vitamins Big in allen Anfangsstadien des Aufarbeitungsprozesses, also auf die Hauptvorteile der Cyanidanwendung, verzichten, wodurch die Ausbeute beträchtlich vermindert wird.
Will man aber schliesslich die ungefährlichen Cyankomplexverbindungen oder Nitrile an Stelle von Blausäure oder Cyaniden verwenden, so benötigt man weitaus grössere Mengen, wodurch
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Durch das erfindungsgemässe Verfahren wira ein neuer Weg aufgezeigt, durch den alle den oben angeführten Verfahren anhaftenden Nachteile, wie dem Nachstehenden zu entnehmen ist, überwunden werden.
Vitamin B12 findet sich in der Natur entweder gebunden an Proteine oder Peptide oder in freier Form als Hydroxocobalamin (Vitamin Big bzw. Vitamin But). In dieser Form ist es besonders gegen Erhitzen wenig stabil. Es war bereits bekannt,. dass nicht nur Cyanidionen, sondern auch Sulfitionen einen schützenden, also stabilisierenden Einfluss auf Vitamin B12 aufüben, wie
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(J. Ass. Off. Agric. Chem. 35, 169,1952) näher ausgeführt wird. Von dieser stabilisierenden Wirkung der Sulfitionen wurde bereits des öfteren Gebrauch gemacht, so von H. H. Fricke, B. Lanius, A. F. DeRose, M. Lapidus u. D. V. Frost (Fed. Proc. 9, 173,1950) oder R. F. Prier, P. H.
Derse u. C. H. Krieger (Arch. Biochem. Biophys.
40, 474,1952) oder J. S. Chias u. W. H. Peterson (Appl. Microbial 1, 42,1953) bei der Herstellung von Proben für die Durchführung des mikrobiologischen Testes. Ferner suchte man auch bei der Herstellung von Vitamin Big-haltigen Zusatzfuttermitteln die Schutzwirkung der Sulfitionen auszunützen (V. F. Pfeiffer, C. Vojnovich u. E. N. Heger) (Ind. Eng. Chem. 46,843, 1954).
Der in Gegenwart von Sulfitionen entstehende Komplex wurde als Sulfito-cobalamin bezeichnet (s. dazu Loy et al. 1. c. ) und kann in kristallisierter Form gewonnen werden. So erhielt E. A. Kaczka, D. E. Wolf, F. A. Kuehl u. K. Folkers (J. Am. Chem. Soc. 73,3569, 1951) bei der Einwirkung von schwefeliger Säure auf Vitamin Bt2 (Cyanocobalamin) schlanke dunkelrote Nadeln, die wahrscheinlich Sulfito-cobalamin vorstellen.
Durch Einwirken von Cyanidionen werden bekanntlich alle Formen des Vitamins B12 in Cyanocolbalamin umgewandelt. Dies. gilt auch für das Sulfito-cobalamin. So wurden von Chiao u. Peterson (l. c. ) Citratettrakte, die Sulfito-cobalamin enthalten, zum Zweck des mikrobiologischen Testes mit Cyanidionen behandelt.
Das erfindungsgemässe Verfahren beinhaltet eine bewusste Ausnützung der günstigen stabilisierenden Wirkung von Sulfitionen auf Vitamin B12 im Anfangsstadium d. es Aufa1ibeitungspro- zesses unter gleichzeitiger Kombination mit einer an sich bekannten Cyanideinwirkung in einem Stadium der Aufbereitung, in dem das Vitamin B12 bereits von der Hauptmenge an Verunreini- gungen befreit ist.
Das erfindungsgemässe Verfahren gestaltet sich folgendermassen :
Das zu verarbeitende B12-haltige Rohmaterial wird-wie für die Faulschlammverarbeitung bereits in der deutschen Patentschrift Nr. 922126 näher beschrieben - in wässeriger Suspension in Gegenwart von Sulfitionen (0, 05-0, 2% an SOg) erhitzt, wobei die B12-aktiven StoHe freige-
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undgehen. Anschliessend findet die Adsorption an Montmorillonit und die Elution der B- < aktiven Stoffe gleichfalls in Gegenwart von Sulfitionen statt, wie aus der deutschen Patentschrift Nr.
929987 bekannt ist. Auch die nachfolgende Adsorption an Aktivkohle und Elution der Cabalamine aus dem Adsorbat wird vorteilhafterweise in Gegenwart von Sulfitionen vorgenommen. Dies gilt auch für die Konzentrierung des Kohleeluates durch Vakuumverdampfung. Das Volumen ist nun auf etwa 1/400 des ursprünglichen gesunken. Bei der Verarbeitung von z. B. 100 m3 Faulschlamm mit einer mikrobiologisch ermittelten B12-Aktivität von z.
B. 0, 5 mg/l (entsprechend einer gesamten Big-Aktivität von 50 g in 100 m3) liegt nun nach dem beschriebenen Arbeitsprozess ein Konzentrat von nur noch 2501 vor, das bei einem Trockensubstanzgehalt von zirka 10% eine B12- Aktivität von 140 mg pro 1 besitzt, entsprechend einer Gesamtaktivität von 35 g in 2501, bzw. einer Big-Aktivität von 1, 4 g je kg Trockensubstanz. Die bisher beschriebenen Massnahmen sind aus den deutschen Patentschriften Nr. 922126 und 929987 bereits grundsätzlich bekannt, werden aber in sinnvoller Weise miteinander verknüpft. Das in diesem Stadium des Aufberei- tungsprozesses erhältliche Konzentrat kann nun z.
B. zur Trockne gebracht und in diesem Zustand oder in Mischung mit verschiedenen Futtermitteln als TPF-(Tierproteinfaktor)-Produkt in der Tierfütterung verwendet werden.
Zwecks weiterer Aufbereitung des genannten Konzentrates mit dem Ziel, zu kristallisierten Cyanocobalamin zu gelangen, wie es der Zweck
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der vorliegenden Erfindung ist, kann man die Umwandlung der Sulfitocdbalamine in Cyanocobalamine in verschiedenen Stadien der Aufarbeitung vornehmen. Nachfolgend werden zwei Stadien angeführt, in, denen diese Umwandlung vorteilhafterweise erfolgen kann.
In dem einen Fall geht man bereits von dem in der oben geschilderten Weise erhaltenen wässerigen Konzentrat aus, in dem die B12-AktivitÅat auf das mehr als 200-fache der ursprünglichen, bezogen auf das Volumen, angestiegen ist. In solchen Konzentraten liegen SuJ1fitoCOlbalamine vor und werden nun durch Zusatz von Cyanidionen in Cyanocobalamine umgewandelt. Alle anschliessenden Prozesse führt man in Gegenwart von Cyanidionen durch. Man benützt dabei zur weiteren Reinigung vorteilhafterweise Solventextraktoren und bedient sich z. B. der in den deutschen Patentschriften Nr. 932982 und 940423 beschriebenen Verfahren. Alle diese Prozesse spielen sich bereits in relativ kleinen Volumina ab.
Im zweiten Fall führt man auch noch die extraktiven Reinigungsprozesse in Gegenwart von
Sulfitionen durch. Man muss sich dann eines be- sonderen Verfahrens bedienen, das von den bisher noch nicht beschriebenen besonderen Eigen- schaften der Sulfitocobalamine Gebrauch macht, nämlich von dem Farbumschlag von Gelb oder Orangerot in Rot bis Violett beim Zusatz von
Cyanidionen zu Lösungen von Sulfit-cobalaminen.
Bei der extraktiven Reinigung der Coiba1amine in
Gegenwart von Sulfitionen ist es nämlich schwieri- ger, den Verlauf der Reinigung visuell festzustel- len, weil die meisten Verunreinigungen gelb bis gelbbraun gefärbt sind und sich daher von den röt- lichgelb bis rotorange gefärbten Lösungen der
Sulfitcobalamine rein äusserlich nur schwer un- terscheiden lassen. Wenn man aber Proben aus den verschiedenen Extraktionsphasen entnimmt, und mit Cyanidionen beim pis 6, 5 versetzt, so zeigt ein Farbumschlag in Rot bis Violett sofort an, in welchen Fraktionen die Cobalamine je- weils vorliegen. Dadurch ist man in der Lage, die Extraktionsprozesse leicht zu kontrollieren.
Man kann in dieser Weise in Gegenwart von
Sulfitionen praktisch ebenso arbeiten, wie es sonst in Gegenwart von Cyanidionen üblich ist.
Anschliessend gewinnt man ein mit den Sulfito- cobalaminen beladenes Kieselgurpräparat, im
Prinzip nach der von W. Friedrich und K. Bern- hauer (Z. Naturforschg. 9b, 755,1954) beschrie-
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Berfindungsgemäss während der anschliessenden chromatographischen Reinigung und Trennung der verschiedenen Vitamin Bis-Faktoren durch Anwendung von Cyanidionen bei der Chromatographie in Cyanocobalamine umgewandelt. Man bedient sich dabei z.
B. des in der deutschen Patentschrift Nr. 930651 geschilderten Verfahrens, bei dem man Zellulosesäulen benützt und die Trennung mit wasserhaltigem Butanol in Gegenwart von Cyanidionen bewerkstelligt, wonach schliesslich die erhaltenen Fraktionen auf kristallisierte Cyanocobalamine verarbeitet werden.
Das Wesen der Erfindung besteht demnach in einer Kombination, derzufolge man die gesamten ersten Stufen des Aufarbeitungsprozesses, bei denen grosse Volumina zu bewältigen sind, in Gegenwart von Sulfitionen durchführt, erst in einem Stadium, in dem bereits kleine Volumina vorliegen, die Sulfitocobalamine in Cya. nocobalamine umwandelt und schliesslich die weitere Reinigung und Endfertigung bis zur Gewinnung von kristallisierten Cyanocobalaminen In Gegenwart von Cyanidionen vornimmt.
Zur Abgrenzung des erfindungsgemässen Prozesses von den bisher bekannt gewordenen Verfahren mögen noch folgende Ausführungen dienen :
Bei allen bisherigen Verfahren werden Cyanide oder Cyankomplexverfbindungen bzw. Nitrile auf Kulturflüssigkeiten oder Konzentrate einwirken gelassen, in denen die Cobalamine als Proteinkomplexe oder in der Hydroxoform vorliegen, keinesfalls aber in der Sulfitoform, da es sich um natürliche Substrate handelt, die keine Sulfitionen enthalten. In allen diesen Fällen wird demnach unter, der Einwirkung, der Cyanidionen usw. vor allem eine Umwandlung der Hydroxoform in die Cyanoform bewerkstelligt.
Zum Unterschied von allen diesen Verfahren wird bei dem erfindungsgemässen Prozess die natürliche Hy- droxoform zunächst in die Sulfitoform und erst diese in die Cyanoform umgewandelt. Zum Unterschied von jenen Methoden, bei denen eine Umwandlung von Sulfitocobalaminen in Cyanocobalamine noch im Stadium der ursprünglichen nicht vorgereinigten Lösungen erfolgt, wie dies z. B. beim mikrobiologischen Test der Fall sein kann, wird bei dem erfindungsgemässen Prozess die Umwandlung von Sulfito- in Cyanocobala- mine erst in einem Stadium der Reinigung vorgenommen, bei dem die Big-Aktivität im Verlauf der Reinigung bereits auf das mehr als 200-fache der ursprünglichen angestiegen ist, was besondere verfahrensmässige Vorteile mit sich bringt.
Wie leicht ersichtlich, wird durch das vorliegende Verfahren ein bedeutender Fortschritt. 1'- zielt der sich vor allem bei der Gewinnung von Cyanocobalamin im grosstechnischen Massstab auswirkt. Das Verfahren ist einfach zu handhaben, da Sulfitionen in den angewendeten Mengen völlig ungefährlich sind, und die Umwandlung der Sulfitocobalamine in Cyanocobalamine erst in einem Stadium erfolgt, bei dem nur noch relativ kleine Volumina zu verarbeiten sind. Die allen bisherigen Verfahren anhaftenden Nachteile werden durch das erfindungsgemässe Verfahren beseitigt.
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zum Zweck der Vitamin B12-Gewinnung hergestellt werden, auf Faulschlamm. bzw. Rückstän- de der Methangärung, auf Belebtschlamm, Fischpresswasser usw..
Ferner können zur Überführung der Sulfito- in die Cyano-Formen an Stelle von Cyanidionen auch komplexe Cyanverbindungen, wie Ferro- oder Ferricyanide, oder auch Nitrile od. dgl. verwendet werden, doch bieten diese Verbindungen in der Regel keine Vorteile,
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man sie in grösserer Mengefahrens wird an Hand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert : Beispiel l : 4 m3 Faulschlamm mit einem Trockensubstanzgehalt von 7 /o und einer Vitamin Big-Aktivität von O, 5rng/l, also insgesamt 2 g (ermittelt mit der E. coli-Mutante 113-3) werden mit 8 kg (0, 20/o) Natriumbisulfit versetzt, bei PH 6, 5 auf 800 erwärmt und 30 Minuten auf dieser Temperatur gehalten, dann gekühlt und zentrifugiert.
Es werden 3 m3 Zentrifugat mit einer Vitamin Big-Aktivität von insgeasmt 1,7 g erhalten. Man arbeitet dabei im Prinzip nach dem in der deutschen Patentschrift Nr. 922126 näher beschriebenen Verfahren.
Das Zentrifugat wird mit Salzsäure auf pa 2, 5 eingestellt und zur Abtrennung der ausge- flocken eiweissartigen Substanzen unter Verwen- dung einer Schnellzentrifuge nochmals geklärt.
In dem so erhaltenen Zentrifugal werden die Vitamine der Bit-Gruppe an 0, 50/0 Bentonit (z. B. "Frankinol KL") adsorbiert. Nach Abtrennung des Ben. ton tadsorbates mittels einer Siebschleuder wird es mit einer wässerigen Lösung von 20/o Natriumbicarbonat und 0, 10/o Natriumbisulfit bei 500 unter Rühren eluiert (pil 8, 5). Das Eluatvolumen beträgt bei dreimaliger Elution 3001 mit einer Vitamin Big-Aktivität von 5 mg/l, also insgesamt 1, 5 g. Dieses Eluat wird durch Zusatz von Säure auf PH 7, 0 eingestellt und zur Adsorption der Vitamine der B12-Gruppe mit 1% Aktivkohle unter Rühren versetzt.
Nach Abtrenung des Kohleadsorbates mittels einer Zentrifuge wird es mit einem AlkoholTasser-Gemisch in üblicher Weise eluiert. Es werden 501 Eluat mit einer Vitamin B12-Akti- vität von 27 mg je 1, also insgesamt 1, 35 g erhal- ten. Man arbeitet dabei im Prinzip nach dem in der deutschen Patentschrift Nr. 929987 näher beschriebenen Verfahren.
Das Eluat wird nun durch Vakuumverdampfung konzentriert. Man erhält dabei 101 Eluatkonzentrat mit einer Vitamin Big-Aktivität von
135 mgll, also insgesamt 1, 35 g. Bis zu diesem Stadium der Verarbeitung ist demnach eine Kon- zentrierung der Big-Aktivität auf das zirka 270fache erreicht worden (vom 4. 000l auf 101 un- ter Berücksichtigung der Verluste). In diesem Konzentrat liegen die Vitamine der B12-Gruppe als Sulfitokomplexe vor. Zur überführung der Sulfitocobbalamine in die Cyanocobalamine wird das Konzentrat mit 10 g (0, 10/o) Kaliumcyanid versetzt und auf pH 6, 5 eingestellt. Die weitere Aufarbeitung des Konzentrates bis zu den krist.
Vitamin Big-Faktoren erfolgt in üblicher Weise.
Beispiel 2 : 4m3 Faulschlamm werden in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 beschrieben, aufgearbeitet. Dabei erhält man 101 Konzentrat mit einer Vitamin Big-Aktivität von 140 mg/l, also insgesamt 1,4 g. Die vitamine der B12-Grup- pe liegen dabei als Sulfitokomplexe vor.
Das Konzentrat wird zur Stabilisierung der B12JVitamine mit 10 g (0,1%) Natiumbisulfit versetzt. Zur weiteren Reinigung werden nun die Sulftiocobalamine in ein organisches Medium, z. B. o-Dichlorbenzol + Phenol, übergeführt. Die organische Phase wird mit einer Pufferlösung gewaschen, worauf die Vitamine der Big-Gruppe durch Zusatz von etwas Butanol aus der orga-
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geführt werden. Die wässerige Lösung wird sodann mit o-Dichlorbenzol nachgereinigt. Alle 4 Stufen des Extraktionsprozesses werden in Extraktionszentrifugen durchgeführt.
Man arbeitet im Prinzip nach den in den deutschen Patentschriften Nr. 932982 und 940423 näher beschriebenen Verfahren, wobei aber die Vitamin B12Faktoren in ihrer Sulfitform vorliegen.
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10. 1 mit einer Vitamin Big-Aktivität von 137 mg je l, also insgesamt 1, 37g. Dieser Extrakt wird mit 100 g Kieselgur versetzt und auf PH 2, 5 eingestellt. Durch Einrühren von 220 g p-Chlorphe- nol werden die Vitamine der Big-Gruppe an Kieselgur ausgefällt. Das mit den Sulfitocobalaminen beladene Kieselgurprodukt wird abgesaugt, zur Beseitigung von p-Chlorphenol mit Aceton gewaschen und schliesslich getrocknet.
Es wer- den zirka 100 g Kieselgurpräparat mit einer Vitamin B19-Aktivität von 13, 5 mg je g, also insgesamt 1, 35 g erhalten. Man arbeitet dabei im Prinzip nach dem in der Veröffentlichung von W. Friedrich u. K. Bernhauer (Z. Naturforschg. 9b, 755,1954) beschriebenen Verfahren. Das Volumen ist nun von 4 m3 auf 100 g (rund 100 cm3) gesunken. Wenn man berücksichtigt, dass in 4 m3 Rohstoff 2 g Big-Aktivität vorlagen und in 100 g Kieselgurprodukt eine Big-Aktivität von 1, 35 g vorhanden ist, so hat bis zu diesem Stadium der Verarbeitung unter Berücksichtigung der Verluste eine Konzentrierung der Big-Aktivität auf das zirka. 27. 000-fache stattgefunden.
In dem in der geschilderten Weise gewonnenen Kieselgurprodukt liegen die Vitamine der Big- Gruppe als Sulfitokomplexe vor. Die Überfüh-
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während derdet man Zellulosebrei, der mit Cyanidionen adsorptiv gesättigt ist. Als Entwickler dient wassergesättigtes n-Butanol mit 0,05% Blausäure.
Man arbeitet dabei im Prinzip nach dem in der deutschen Patentschrift Nr. 930651 beschriebenen Verfahren. Bei der erwähnten Konzentration an Cyanidionen gehen während der Chromatogra- phie die Sulfitocdbalamine in Cyanochobalamine über. Die weitere Verarbeitung bis zu den kristallisierten Vitamin B-Faktoren erfolgt in üblicher Weise.
Beispiel 3 : Durch Züchtung von Streptomyces griseus gewinnt man in üblicher Weise 1 m3 einer Fermentationsbrühe, die eine Vitamin Big- Aktivität von 1, 5 mg je 1 enthält. Diese Fermentationsbrühe wird mit 2 kg (0,2%) Natriumbisulfit bei pg 6, 5 auf 800 erwärmt und 30 Minuten auf dieser Temperatur gehalten. Dann wird gekühlt und zentrifugiert. Die abzentrifugierte Lösung, die unter Mitverwendung des Waschwassers 1000 1 beträgt, wird, wie im Beispiel 1 beschrie- ben, weiter behandelt. Dadurch wird das Volumen beträchtlich vermindert und die relative B12-Aktivität stark erhöht.
Man erhält schliesslich in der gleichen Weise wie im Beispiel l 3, 5 l Eluatkonzentrat mit einer Vitamin B12-Aktivi- tät von 340 mg per 1, also insgesamt mit 1, 2 g.
Bis zu diesem Stadium der Verarbeitung ist demnach eine Verminderung des Volumens auf den 270. Teil des ursprünglichen (von 10001 auf 3, 5 1) und zugleich eine Konzentrierung der Vitamin B12-Aktivität unter Berücksichtigung der Verluste auf das zirka 225-fache (von 1, 5 mg je 1 auf 340 mg je 1) erfolgt. In diesem Konzentrar liegt das Vitamin B12 als Sulfito-Komplex vor.
Zur überführung des Sulfitocobalamins in das Cyanocobalamin versetzt man das Konzentrat mit 3, 5 g (0,1%) Kaliumcyanid und stellt den pil-Wert auf 6, 5 ein. Die weitere Verarbeitung .der Lösung bis zu krist. Vitamin B12 erfolgt in üblicher Weise.
Beispiel 4 : Durch Gärung mittels Propionibacterium freudenreichii gewinnt man in üblicher Weise eine Fermentationsbrühe, die eine Vitamin Bia-Aktivität von 1,9 mgl/ enthäht. Diese Gärlbrühe wird zentrifugiert, wobei man 25 kg feuchte Bakterienmasse erhält, die praktisch die gesamte Vitamin B-Aktivität, nämlich insgesamt 1, 8 g, besitzt. Diese Bakterienmasse wird in 251 einer Mischung von Isopropanol-Wasser (im Verhältnis 1 : 1) suspendiert, mit 100 g Natriumsulfit versetzt und auf PH 6, 5 eingestellt. Die Suspension wird unter Rühren auf 60-70 etwa 1/2 Stunde erhitzt und abgesaugt.
Dieser Prozess wird mit kleineren Mengen der gleichen Extraktionsflüssigkeit (Isopropanol-Wasser + Natriumsulfit) so oft wiederholt, bis die Extraktion der vitamin B12-aktiv, en Substanz vollständig ist.
Man erhält in dieser Weise 10 1 eines Extraktes, der durch Vakuum-Destillat : on von Isopropanol befreit und dabei zugleich eingeengt wird. Man erhält so 4 1 eines wässerigen Konzentrates mit einer Vitamin B12-Aktivität von 425 mg je Liter, also insgesamt 1, 7 g. Bis zu diesem Stadium der Verarbeitung ist eine Verminderung des Volumens auf 1/250 (von 1000 1 auf 4 1) bzw. unter Berücksichtigung der Verluste eine Konzentrie-
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9 mg je lVitamine liegen in diesem Konzentrat als SulfitoKomplexe vor. Zur überführung der Sulfitocobalamine in die Cyanocobalamine wird das Konzentrat mit 4 g (0,1%) Kaliumcyanid versetzt und PH 6, 5 eingestellt. Die weitere Verarbeitung
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Konzentrates bis zu krist.
Vitamin Big erfolgtRohprodukten in Form von Suspensionen oder Lösungen, dadurch gekennzeichnet, dass man zunächst die gesamten in den Rohlösungen- bzw. -suspensionen enthaltenen Vitaminsubstanzen der B12-Gruppe durch an sich bekannte Behandlung mit Sulfiten in Sulfitocobalamine überführt, so- dann - zweckmässig durch Adsorptionsverfahren-eine Anreicherung auf mindestens das 200-fache der ursprünglichen Konzentration bzw. wenigstens auf 1 g je kg Trockengewicht unterwirft und danach, gegebenenfalls nach extraktiver Reinigung in üblicher Weise in Cyanocobalamine überführt und diese schliesslich in kristallisierter Form isoliert.